L’influenza est un problème majeur de santé publique dans le monde. Malgré des symptômes bénins chez les sujets immunocompétents, la grippe saisonnière peut entrainer la mort de personnes dites à risques (enfants, personnes âgées, immunosupprimés, femmes enceintes). Jusqu’à maintenant, seuls les inhibiteurs de la neuraminidase (INA) étaient recommandés pour le traitement des infections grippales. En 2018, le baloxavir marboxil (BXM), un inhibiteur de l’endonucléase de la polymérase acide (PA) des virus influenza A et B, est venu compléter la liste des antiviraux disponibles. Dès les études cliniques de phase 2, la substitution I38T dans le gène PA est apparue comme un marqueur important de la résistance à cet inhibiteur. Au cours de ma maitrise, nous avons démontré in vitro que la présence de la mutation I38T dans une souche circulante A(H1N1) n’altérait pas l’activité de la polymérase virale ni la capacité réplicative du virus mutant. Nous avons aussi démontré, dans un modèle murin, que la virulence du virus mutant était semblable à celle du virus sauvage et que le mutant I38T pouvait dominer la population virale dans un contexte de compétition virale. L’arrivée de ce nouvel inhibiteur a permis d’évaluer si la combinaison thérapeutique, surtout celle ciblant des fonctions virales différentes, pouvait être une stratégie potentielle pour bonifier le traitement antiviral. Pour cela, nous avons évalué in vitro les effets des combinaisons entre le baloxavir acide (BXA), le composé actif du BXM, et d’autres antiviraux approuvés contre les virus A(H1N1) et A(H3N2) contemporains. Les combinaisons BXA-INA (oseltamivir, zanamivir ou peramivir) et BXA-favipiravir (un autre inhibiteur de la polymérase) avaient une activité synergique sur la réplication virale, mesurée par la viabilité cellulaire, contre les deux sous-types d’influenza A. En revanche, la combinaison BXA-ribavirine avait un effet antagoniste sur la réplication virale, et ce, contre les deux virus. / Influenza viruses represent a major public health problem in the world, affecting 5 to 20% of the population each year. Despite mild symptoms in immunocompetent individuals, seasonal influenza can result in death of people at risk (children, the elderly, immunosuppressed or pregnant women). For two decades, only neuraminidase inhibitors (NAIs) have been recommended for treatment of severe cases. In 2018, baloxavir marboxil (BXM), an inhibitor of cap-dependent endonuclease of the influenza polymerase acid (PA), was approved as a new influenza treatment of influenza A and B viruses. Since phase 2 clinical studies, the I38T substitution in PA gene emerged as a major marker of resistance. During my master’s degree, we demonstrated in vitro that the mutation I38T did not alter the viral polymerase activity neither the kinetics of replication of a mutant A(H1N1) virus. In vivo, we showed that the mutant virus had a similar virulence compared to the wild type virus. In a competitive context, the I38T virus could dominate the viral population if initially present in 50% of viral population. As prolonged NAIs treatment can lead to emergence of resistance, we considered the use of combination therapy as a potential and rapid strategy to improve antiviral treatment. We combined baloxavir acid (BXA) and several approved drugs. In vitro, we demonstrated that the combination of BXA and NAIs (oseltamivir, zanamivir and peramivir) or with another polymerase inhibitor (favipiravir) had a synergistic activity in reducing viral replication as measured as cell viability against both viruses. In contrast, BXA combined with ribavirin, another polymerase inhibitor, led to an antagonist effect against both viral subtypes. Our results suggest that BXA stands to be a good candidate for combination therapy with several existing drugs to improve antiviral activity and eventually delay drug resistance of influenza type A viruses.

Made available in DSpace on 2016-01-07T13:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andressa_martorelli_ioc_mest_2014.pdf: 1406086 bytes, checksum: aa1b67f7a16391a611cf88b0ce6ca128 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-11-23 / Indivíduos infectados pelo HIV têm um risco mais elevado de serem afetados por doenças graves, tais como infecções por vírus respiratórios, incluindo o vírus da influenza. A imunossupressão desses indivíduos pode afetar a sua capacidade de resposta à imunização ativa. A vacinação contra o vírus influenza ainda representa a principal forma de reduzir o impacto deste vírus. Devido à circulação em 2009 do vírus influenza pandêmico A (H1N1) pdm09 e influenza sazonal A (H3N2) e vírus B, a composição atual vacina incluem antígenos destes três agentes em sua formulação. Assim, a análise do impacto da vacina trivalente inativada contra influenza (TIV) em indivíduos infectados pelo HIV merece mais estudos. Uma coorte de 131 indivíduos HIV- 1 positivos, com viremia controlada recebeu duas doses únicas de TIV com 21 dias de intervalo. Os títulos de anti- hemaglutinantes (HA) de seus soros foi avaliada em diferentes pontos de tempo (dias zero, 21 e 42, bem como seis meses pós- vacinação). No que diz respeito à resposta imune ao vírus A(H1N1) pdm09 , observouse que um ano depois de ter recebido a vacina monovalente contra este antígeno , 62,6% dos indivíduos permaneceram soroprotegidos, uma queda de 20% em relação à 6 meses pósvacinação monovalente no ano de 2010. Além disso, após a primeira dose de TIV, títulos soroprotetores foram encontrados em todos os indivíduos A soroproteção de baseline para os antígenos H3N2 e influenza B foi de 67,9% e 27,5%, respectivamente. Em relação à soroconversão, observamos que 19,8% e 21% dos indivíduos apresentavam títulos antihemaglutinantes para o vírus A(H1N1)pdm09, 21 e 42 dias pós-vacinação com TIV, respectivamente. A soroconversão para o antígeno H3N2 foi 15,7% e 16% aos 21 e 42 dias respectivamente. Em relação à Influenza B, 35,7% e 38,6% dos indivíduos soroconverteram aos 21 e 42 dias após a vacinação. Aos seis meses pós-vacinação, os títulos de anti \2013 hemaglutinantes dos soros caiu para abaixo 15,7% para o antígeno A(H1N1)pdm09, 14,4% para H3N2 e 29,1% para antígenos de influenza B. Observamos também que indvíduos com maiores contagem de células CD4 resposram melhor a vacinação frente ao virus influenza B. Em conjunto, nossos resultados indicam que indíviduos HIV-1 positivos apresentam melhores repostas humorais para os antígenos A(H1N1)pdm09, quando comparado com os outros dois antígenos presentes na TIV / HIV - infected individuals have a higher risk of being affected by serious illnesses , such as in fections by respiratory viruses , including influenza virus . Immunosuppression of these individuals can affect their ability to respond to active immunization . Vaccination against influenza is still the main way to reduce the impact of this virus . Due to the movement in 2009 pandemic influenza A (H1N1) pdm09 and seasonal influenza A (H3N2) and B viruses , the current vaccine composition include antigens of these three agents in their formula tion . Thus, analysis of the impact of trivalent inactivated influenza vaccine (TIV ) in HIV - infected individuals deserves further study. A cohort of 131 HIV - 1 positive individuals with controlled viremia received two single dose s of TIV 21 days apart. Th e titers of anti - hemagglutinant (HA ) of their sera was assessed at different time points (zero, 21, 42 days a nd six months post - vaccination) . With re gard to immune to the virus A (H1N1) pdm09 response , it was noted that a year af ter having received the monovalent vaccine against this antigen , 62.6 % of subjects remained seroprotection , a decrease of 20 % compared to 6 monovalent months post - vaccination in 2010 . Moreover, after the first dose of TIV , seroprotective titers were f ound in all individuals . The seroprotection baseline for H3N2 and influenza B antigens was 67.9 % and 27.5 % , respectively . Regarding to seroconversion , we found that 19.8 % and 21 % of subjects had anti - hemag glutinin titles for the A (H1N1)pdm09 , 21 and 42 days post - vaccination with TIV , respectively. Seroconversion for H3N2 antigen was 15.7% and 16 % at 21 and 42 days resp ectively. Regarding Influenza B , 35.7 % and 38.6 % of subjects seroconverted after 21 and 42 days after vaccination. At six months po st - vac cination , the titers of anti - hemagglutinin sera fe ll below 15.7 % for antigen A (H1N1)pdm09 , 14.4% to 29.1 % for H3N2 and influenza B antigens . We also observed that indvíduos with higher CD4 cell counts resposram best vaccination against the influ enza virus B. Together, our results indicate that HIV - 1 positive individuals show better humoral responses to antigens A (H1N1) pdm09 compared with others two antigens present in the TIV. / HIV - infected individuals have a higher risk of being affected by serious illnesses , such as in fections by respiratory viruses , including influenza virus . Immunosuppression of these individuals can affect their ability to respond to active immunization . Vaccination against influenza is still the main way to reduce the impact of this virus . Due to the movement in 2009 pandemic influenza A (H1N1) pdm09 and seasonal influenza A (H3N2) and B viruses , the current vaccine composition include antigens of these three agents in their formula tion . Thus, analysis of the impact of trivalent inactivated influenza vaccine (TIV ) in HIV - infected individuals deserves further study. A cohort of 131 HIV - 1 positive individuals with controlled viremia received two single dose s of TIV 21 days apart. Th e titers of anti - hemagglutinant (HA ) of their sera was assessed at different time points (zero, 21, 42 days a nd six months post - vaccination) . With re gard to immune to the virus A (H1N1) pdm09 response , it was noted that a year af ter having received the monovalent vaccine against this antigen , 62.6 % of subjects remained seroprotection , a decrease of 20 % compared to 6 monovalent months post - vaccination in 2010 . Moreover, after the first dose of TIV , seroprotective titers were f ound in all individuals . The seroprotection baseline for H3N2 and influenza B antigens was 67.9 % and 27.5 % , respectively . Regarding to seroconversion , we found that 19.8 % and 21 % of subjects had anti - hemag glutinin titles for the A (H1N1)pdm09 , 21 and 42 days post - vaccination with TIV , respectively. Seroconversion for H3N2 antigen was 15.7% and 16 % at 21 and 42 days resp ectively. Regarding Influenza B , 35.7 % and 38.6 % of subjects seroconverted after 21 and 42 days after vaccination. At six months po st - vac cination , the titers of anti - hemagglutinin sera fe ll below 15.7 % for antigen A (H1N1)pdm09 , 14.4% to 29.1 % for H3N2 and influenza B antigens . We also observed that indvíduos with higher CD4 cell counts resposram best vaccination against the influ enza virus B. Together, our results indicate that HIV - 1 positive individuals show better humoral responses to antigens A (H1N1) pdm09 compared with others two antigens present in the TIV

Les virus influenza ont toujours eu un impact considérable sur l’humanité. Les virus influenza B (IB) ont longtemps été négligés et sous-estimés par rapport aux virus influenza A (IA). Ils ne représentent que 10 à 20% des infections annuelles par les virus influenza, mais peuvent devenir majoritaire certaines années et entrainer des symptômes similaires à ceux des virus IA. Les inhibiteurs de la neuraminidase (INA) sont les principaux traitements disponibles contre les virus influenza. Cependant, à la suite de mutations, certains virus influenza ont développé des mécanismes de résistance limitant dangereusement les options thérapeutiques. Actuellement, très peu de souches résistantes sont isolées en clinique car le fitness de ces virus résistants, c’est-à-dire leur capacité à se répliquer et se transmettre, est altéré. Or, il a été montré que des virus IA peuvent améliorer leur fitness et propager le phénotype de résistance. L’objectif de ce projet de thèse est de mieux comprendre la résistance des virus influenza B et son impact sur le fitness viral afin de mieux prévenir l’émergence de souches résistantes. Nous avons, dans un premier temps, étudié la résistance des virus influenza A et B au peramivir, le plus récent des INA. Nous avons confirmé que cette molécule est hautement active contre les souches saisonnières A et B. De plus, elle conserve une activité antivirale in vitro contre certaines souches virales ayant une sensibilité réduite ou hautement réduite contre d’autres INA (l’oseltamivir et le zanamivir). Dans un second temps, nous avons étudié le fitness de virus influenza B contemporains résistants in vitro et chez la souris. Nous avons montré que certains virus influenza B, ayant un phénotype de résistance croisée, peuvent maintenir un fitness similaire à celui du virus sauvage in vitro et in vivo. De plus, nous avons pu décrire et analyser un nouveau mécanisme de résistance chez les virus influenza B observé chez un cas clinique. Ces résultats soulignent la dangerosité de notre dépendance aux INA et nous encouragent à faire évoluer les stratégies thérapeutiques.

Les inhibiteurs de neuraminidase (INAs) sont présentement la seule classe d’antiviral disponible commercialement pour traiter et prévenir les infections à virus influenza saisonnières et pandémiques. Le virus pandémique de 2009 était naturellement résistant aux adamantanes, mais sensible à l’oseltamivir et au zanamivir. Toutefois, plus de 1.5% de cas de résistance à l’oseltamivir ont été recensés suite à l’utilisation de l’antiviral en traitement ou en prophylaxie. La plupart d’entre eux possèdent une mutation ponctuelle (cytosine par thymidine) à la position 823, qui est à l’origine de la substitution d’une histidine par une tyrosine à la position 275 dans la séquence d'acides aminés de la neuraminidase (H275Y). Étant donné que le nombre d'antiviraux disponibles pour traiter et prévenir les infections à virus influenza est très limité (le zanamivir est le seul antiviral disponible commercialement pour traiter les souches pandémiques résistantes aux adamantanes et à l'oseltamivir), il est très important de comprendre les mécanismes qui causent la résistance aux INAs et d'établir un programme qui permet de surveiller l'évolution des souches résistantes aux antiviraux. / One class of anti-influenza agents; the neuraminidases inhibitors (NAIs), is the only choice commercially available for treatment and prophylaxis of seasonal and pandemic influenza infections. The pandemic 2009 Influenza virus, A(H1N1)pdm09, was naturally resistant to adamantanes but susceptible to the NAI: oseltamivir and zanamivir. However, more than 1.5% of cases of oseltamivir resistance have been reported during treatment and prophylaxis and most of them carried a single nucleotide mutation (cytosine to thymidine) at position 823 that resulted in a histidine to tyrosine mutation at position 275 in the neuraminidase sequence (H275Y). Considering that the number of available anti-influenza drugs is very restricted (zanamivir is now the only commercially available drug for treatment of the adamantane- and oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 strains), it is important to understand mechanisms of resistance to NAIs and to perform a surveillance program for evolution of such drug-resistant variants.

Encore aujourd'hui, la prévention de la grippe par la vaccination ou les approches thérapeutiques ne sont que partiellement efficaces. Les caractères d’hypervariabilité et de transmission du virus influenza lui permettent d’infecter les populations du monde entier malgré une immunité préexistante acquise par infection ou vaccination. En 2009 une éclosion de grippe A(H1N1) au Mexique s’est répandue mondialement et est devenue la pandémie A(H1N1)pdm09. Il devenait alors impératif d’étudier davantage ce virus influenza, notamment les sites antigéniques du virus qui sont les éléments clefs dans l’équilibre entre l’immunité des populations et la propagation du virus influenza. Pour étudier les sites antigéniques de la grippe A(H1N1)pdm09 et identifier leurs épitopes, leurs interactions et leurs immunodominances, nous avons créé des anticorps monoclonaux neutralisants (AcMoN) à l’aide de souris immunisées avec l’hémagglutinine recombinante du virus A(H1N1)pdm09. Les AcMoN obtenus ont été utilisés pour créer des mutants d’échappement in vitro. Nous avons ensuite introduit les mutations identifiées au sein des sites antigéniques de la HA1 par génétique inverse dans un virus réassortant (RG1) possédant six gènes du virus A/PR/8/34 (PA, PB1, PB2, M, NP et NS) et deux gènes (HA et NA) du virus pandémique A/Québec/144147/09. Ces virus ont été testés in vitro (par tests IHA et neutralisation) contre des sérums de furets immunisés contre le virus A(H1N1)pdm09 et in vivo (challenge infectieux ) chez des souris immunisées avec le vaccin influenza en vigueur au moment de l’étude puis infectées avec les virus mutants. D’autre part un AcMoN (appelé PN-SIA28) dirigé contre une portion conservée de la sous-unité HA2 responsable de la fusion du virus à la paroi cellulaire a également été testé quant à sa protection 24 heures post-infection sur des souris infectées avec les virus ; pandémique A/Québec/144147/09 (H1N1), A/WSN/33 (H1N1) et A/Victoria/3/75 (H3N2). Ces études ont permis d’obtenir 33 AcMoN qui ont conduit à l‘identification de 11 mutations d’intérêt immunologique, dont 6 au sein de sites antigéniques (T89R, G157E, G172E, N173D, K180E et A212E) et 5 en marge de ceux-ci (F128L, K180E, K256E, R269K, N311T et G478E). L’obtention de trois variants différents au sein du site antigénique ‘Sa’ adémontré l’immunodominance de celui-ci. Les mutations créées au sein des sites antigéniques sur des virus réassortants 6:2 ont démontré un grand potentiel de glissement antigénique. En effet, les souris immunisées avec la souche vaccinale sauvage n’ont pas été protégées suite aux infections par le virus muté aux sites antigéniques de la HA (RG1). L’AcMoN PN-SIA28 dirigé contre la région HA2 a quant à lui démontré une protection sur les souris infectées avec les virus issus des groupe phylogénétiques 1 (H1N1) et 2 (H3N2) de la HA. L’étude des sites antigéniques du virus A(H1N1) tel que menée dans ces travaux nous permet d’anticiper des mutations futures qui pourraient apparaître naturellement et causer des épidémies ne pouvant être freinées par le vaccin actuel protégeant contre la souche A/California/07/2009. De plus, la thérapie basée sur des AcMoN hétéro-sous-typiques dirigés contre des épitopes conservés ouvre une perspective thérapeutique qui complémente l’aspect préventif découlant de l’étude des sites antigéniques du virus influenza. / Presently, our ability to prevent influenza through vaccination or to remediate it therapeutically is still nowadays partially efficient. The hypervariability and the transmission aspects of influenza virus allow it to infect worldwide populations despite pre-existing immunity acquired through exposition or vaccination. In 2009, a new A(H1N1) virus in Mexico spread worldwide and became the A(H1N1)pdm09 pandemic virus. Since then, it was becoming imperative to study more deeply this influenza virus, especially its antigenic sites which are key elements in the equilibrium between population immunity and influenza virus propagation. In order to study the antigenic sites of flu A(H1N1)pdm09 and to identify their epitopes, their interactions and their immunodominances, we have generated neutralizing monoclonal antibodies (NMAbs) with mice immunized with recombinant hemagglutinin from A(H1N1)pdm09. The MAbs obtained were used for in vitro generation of escape mutants. Afterward, we introduced the identified mutations within the antigenic sites of the HA1 through reverse genetics in a reassortant virus (RG1) possessing six genes from virus A/PR/8/34 (PA, PB1, PB2, M, NP and NS) and two genes (HA and NA) from virus A/Quebec/144147/09. These viruses were tested in vitro (by HAI and neutralization) against sera of ferrets immunized with A(H1N1)pdm09 virus and in vivo (infectious challenge) in mice vaccinated with the current vaccine then infected with the mutant viruses. From another perspective, a MAb (named PN-SIA28) directed against a conserved portion of the HA2 subunit responsible for viral fusion to the host cell membrane, was tested for its protective properties 24 hour post-infection in mice infected with A/Quebec/144147/09 (H1N1) virus, A/WSN/33 (H1N1) virus and A/Victoria/3/75 (H3N2) virus. The study allowed us to obtain 33 MAbs and identify 11 mutations of immunological interest, from which 6 were inside antigenic sites (T89R, G157E, G172E, N173D, K180E and A212E), and 5 were outside them (F128L, K180E, K256E, N311T and G478E). The obtaining of three different variants for one single antigenic site ‘Sa’ demonstrates its immunodominance. The mutations created within the antigenic sites in reassortant 6:2 viruses could lead to high antigenic drift potential since mice immunized with the wild-type vaccine strain were not protected following infections with the RG1 virus having its HA antigenic sites mutated. PN-SIA28 MAb directed against the HA2 region showed protection of mice infected with viruses derived from HA phylogenetic groups 1 (H1N1) and 2 (H3N2). Our work, could allow to anticipate future antigenic drift which could appear naturally and cause epidemics not controlled by the actual vaccine directed towards A/California/07/09. Moreover, a therapy based on MAbs directed against conserved epitopes opens a therapeutic perspective that complements the preventive vaccine approach.

Viren haben als Ursache lebensmittelassoziierter Infektionen eine große Bedeutung. Sie können vor allem über rohe oder unzureichend erhitzte Lebensmittel übertragen werden. In diesem Zusammenhang werden grüner Salat, Erdbeeren, Himbeeren, Frühlingszwiebeln, Muscheln, halbgetrocknete Tomaten, fäkal verunreinigtes Trinkwasser, Backwaren und Rohwürste als häufige Infektionsquellen genannt. Vor allem kurzgereifte Rohwürste gehören aus mikrobiologischer Sicht zu Risikoprodukten. Um eine gleichbleibende Qualität der Produkte zu gewährleisten, ist die Verwendung von Starterkulturen unerlässlich. Als sogenannte Schutzkulturen sollen sie gleichzeitig die Vermehrung unerwünschter bakterieller Pathogene unterbinden. Bisher ist allerdings nicht bekannt, inwieweit diese zur Virusinaktivierung in kurzgereiften Rohwürsten führen bzw. beitragen. Aus diesem Grund war es das Ziel dieser Arbeit, den Einfluss von rohwurstrelevanten Starter- und Schutzkulturen sowie deren Metabolite (Bacteriocine, Milchsäure) auf die Tenazität und Inaktivierungskinetik von Viren zu prüfen. Die Untersuchungen erfolgten mit dem murinen Norovirus (MNV) S 99 sowie dem humanen Influenzavirus H1N1 (A/WSN/33). Antivirale Effekte wurden zum einen anhand von in-vitro-Studien, zum anderen anhand von experimentell mit Viren kontaminierten kurzgereiften Rohwürsten (Mettwurst/Teewurst) geprüft. Die Bacteriocine Sakacin A und Nisin zeigten in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) keine viruzide Wirkung gegenüber MNV S 99 und H1N1 (pH 6,2; 24 °C; Exposition: 3 Tage). Weiterhin wurden anhand von in-vitro-Untersuchungen 29 verschiedene zellfreie Kulturüberstände [Milchsäurebakterien, Staphylococcus spp. (S.), Kocuria (K.) varians] hinsichtlich ihrer antiviralen Wirkung geprüft. Dabei konnte eine signifikante Titerreduktion von MNV S 99 bei Exposition mit dem Kulturüberstand eines Lactobacillus (Lb.) curvatus-Isolates festgestellt werden (p < 0,05). In mit dieser Kultur fermentiertem Tee- und Mettwurstbrät zeigte sich jedoch kein Effekt. Die Virustenazität von H1N1 und MNV S 99 konnte mit D,L-Milchsäure unter rohwurstrelevanten Bedingungen (pH 5,0 bis 6,2) sowohl in-vitro als auch im frischen Mettwurstbrät beeinflusst werden. In-vitro erzielte Titerreduktionen lagen bei 2,5 (H1N1) bzw. 3,25 log-Stufen (MNV S 99) nach drei Tagen (24 °C) Lagerung. Im Gegensatz dazu war MNV S 99 im Vergleich zu H1N1 im Mettwurstbrät stabiler. H1N1 konnte unterhalb von pH 5,5 bereits direkt nach dem Einmischen der Influenzaviren in das Wurstbrät nicht mehr nachgewiesen werden. MNV S 99 wurde hingegen erst nach einem Tag Lagerung (22 °C) maximal um 0,7 log-Stufen reduziert (pH 5,2). Die verwendeten Starter- und Schutzkulturen (Lb. sakei, Lb. curvatus, Lb. paracasei, Lb. plantarum, S. carnosus, S. xylosus, K. varians) zeigten im Mett- und Teewurstbrät im Vergleich zur Kontrolle (ohne Starterkultur) keinen zusätzlichen viruziden Effekt auf MNV S 99. Zunehmende Virustiterreduktionen konnten mit pH-Wert-Erniedrigung beobachtet werden. Nach der Reifung (1 Tag, 22 °C, pH 4,9) von Mettwurst mit Starterkulturen wurde das Virus um maximal 1,65 log-Stufen reduziert. In mit Einzel- beziehungsweise Mehrstamm-Mischkulturen fermentierter Teewurst (7 Tage, 22 °C, pH 4,9) betrug die Titerreduktion maximal 1,10 log-Stufen. Das Influenzavirus H1N1 konnte im Rohwurstbrät mit Starterkulturen auch nach Verwendung hoher Ausgangstiter bereits zu Beginn der Untersuchungen nicht mehr nachgewiesen werden. Aus den erzielten Daten kann geschlussfolgert werden, dass die Bacteriocine Sakacin A und Nisin nicht als antivirale Zusatzstoffe in Lebensmitteln (z. B. Rohwürste) geeignet sind. Das antivirale Potential von zellfreien Kulturüberständen war Bakterienstamm-spezifisch und nur in-vitro ersichtlich. Daher muss die Nutzung des Lb. curvatus 1-Stammes nicht anderen rohwurstrelevanten Starterkulturen vorgezogen werden. Die Verwendung von Milchsäure als Zusatzstoff im Rohwurstbrät eignet sich nur zum Ausschluss einer viralen Exposition im Zusammenhang mit H1N1. Frische Mettwurst muss allerdings hierzu adäquat gesäuert (pH < 5,5) werden. Neben dem antiviralen Effekt durch gebildete Säure, konnte keine weitere spezies-spezifische antivirale Wirkung verwendeter Starter- und Schutzkulturen auf MNV S 99 festgestellt werden. Die Säureleistung einzelner Kulturen ist demzufolge für eine Virusinaktivierung entscheidend. Das antivirale Potential verwendeter Starter- und Schutzkulturen in Rohwürsten ist im Zusammenhang mit MNV S 99 als gering einzuschätzen. Unter der Annahme, dass murine und humane Noroviren eine ähnliche Tenazität in kurzgereiften Rohwürsten aufweisen, sollten diese Produkte im Zusammenhang mit Noroviren als Risikoprodukte eingestuft werden.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-20T15:50:30Z No. of bitstreams: 1 Cristiane Maia Alves.pdf: 1063313 bytes, checksum: a48ab6ac753935673b07a64282e7821b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-20T15:50:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane Maia Alves.pdf: 1063313 bytes, checksum: a48ab6ac753935673b07a64282e7821b (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus Influenza é o agente infeccioso que mais afeta o trato respiratório dos seres humanos, resultando em altos índices de morbidade e mortalidade. Este vírus pertence à família Orthomyxovirida, apresenta RNA fita simples, octa-segmentado, de polaridade negativa e possui um envelope lipoproteico no qual estão inseridas as glicoproteínas hemaglutinina e neuraminidase. Já foi demonstrado que a infecção por Influenza gera alterações no metabolismo celular, porém, não foi descrito, até o momento, qual seria o mecanismo de ação relacionado. Em nosso trabalho, decidimos analisar mais a fundo essas alterações metabólicas relacionadas à infecção por Influenza A. Para tal, resolvemos investigar os efeitos da inibição da via glicolítica e do silenciamento da enzima chave de regulação da via, a enzima PFK-1, sobre a replicação viral. Inicialmente, utilizamos células MDCK infectadas com MOI de 5,0 e verificamos o efeito da inibição de umas das etapas finais desta via metabólica sobre a replicação do vírus. Observamos que, em 24 horas pós-infecção, a inibição da glicólise provocou uma redução da replicação do vírus Influenza, porém, em 48 horas pós–infecção, a inibição desta via promoveu um aumento da replicação viral. Verificamos, também, que o silenciamento das isoformas L, M e P da enzima PFK-1, em 24 horas pós-infecção, promoveu uma significativa diminuição do título viral. Diante disto, decidimos investigar quais as etapas do ciclo replicativo estariam sendo afetadas pelo silenciamento desta enzima e observamos que, tanto a adsorção como a penetração de material genético no núcleo celular foram afetadas pelo silenciamento da PFK-1, principalmente pela inibição da isoforma P. Esses resultados sugerem que a enzima PFK-1 tem um importante papel na infecção pelo vírus Influenza podendo, inclusive, ser um possível alvo terapêutico. / The Influenza virus is the major infectious agent that affects the respiratory tract of humans, resulting in high morbidity and mortality. This virus belongs to Orthomyxovirida family and presents single-stranded, octa-segmented, negative polarity RNA and has a lipoprotein envelope in which are inserted the hemagglutinin and neuraminidase glycoproteins. It has been shown that Influenza infection causes changes in cellular metabolism, however, not been described up to now, which would be related mechanism of action. In our work, we decided to further analyze these metabolic changes related to infection with Influenza A. To this end, we decided to investigate the effects of inhibition of glycolytic pathway and the silencing of key regulatory enzyme of this pathway, the enzyme PFK-1, on viral replication. Initially, we used MDCK cells infected with m.o,.i.5.0 to check the effect of inhibition of some final stages of this pathway on virus replication. We observed that, in 24 hours postinfection, the inhibition of glycolysis resulted in a reduction of the replication of Influenza viruses, but at 48 hours post-infection, the inhibition of this pathway leads to an increase in viral replication. We also verified that silencing of L, M and P isoforms of PFK-1, at 24 hours post-infection, caused a significant decrease in viral titer. So, we decided to investigate which steps of the replicative cycle were being affected by the silencing of this enzyme and found that both the adsorption and penetration of genetic material in the cell nucleus were affected by the silencing of PFK-1, mainly by inhibiting P isoform. These results suggest that the enzyme PFK-1 plays an important role in the Influenza virus infection and may it also be a potential therapeutic target.

Les travaux effectués au cours de ce mémoire ont permis de développer une alternative aux vaccins présentement utilisés contre le virus de l’influenza. Nous avons utilisé la nucléoprotéine (NP) de l’influenza comme base vaccinale puisque cette protéine est conservée chez les souches d’influenza A et qu’elle possède un potentiel de protection croisée. Nous avons montré que la multimérisation de la NP grâce à un gabarit d’ARN permet d’augmenter son immunogenicité. Cette multimérisation en pseudo-nucléoparticule virale (NLP) a augmenté la réponse humorale et cellulaire spécifique à NP et l’ajout d’un adjuvant (PAL) a permis d’amplifier davantage la réponse humorale contre NP. Une dose du vaccin candidat NLP-PAL n’a pas réussi à protéger des souris contre une infection létale avec une souche homotypique d’influenza. Cependant, des résultats avec un régime de deux immunisations montrent des résultats encourageants qui permettent d’espérer une protection envers une infection virale. / The emergence of the highly pathogenic H5N1 avian influenza and the pandemic of 2009 have pushed scientists to find novel vaccinations strategies such as directing the immune response towards the internal proteins of the influenza. In this study, we have used recombinant nucleoprotein (rNP) as a vaccine basis since it is well conserved among the influenza A strains and it can confer cross-protection. To enhance the low immunogenicity of the rNP, we multimerized it using synthetic RNA as a scaffold to form Nucleocapsid-like-particles (NLP). The multimerization increased the cellular and humoral immunogenicity of NP and addition of the PAL adjuvant increased it even further. The NLP-PAL candidate vaccine was not able to fully protect mice from a lethal challenge after one immunization. A prime-boost immunization increased the humoral and cellular response but further experiments are needed to see if the prime-boost strategy can protect against a lethal influenza challenge.

Les vecteurs permettant la transmission des infections nosocomiales ne sont pas toujours bien identifiés. Les risques représentés par les virus aéroportés dans les milieux de soins doivent être étudié davantage. Ce mémoire présente des méthodologies pour détecter la présence de virus aéroportés et évaluer leur résistance dans cet état. Le virus influenza, le norovirus et le virus respiratoire syncytial y sont à l’étude. Deux techniques d’échantillonnage furent utilisées soit un échantillonnage à sec (NIOSH 251) et un échantillonneur liquide (Coriolis µ®). Les ADNc viraux furent détectés par qPCR. La résistance des norovirus à l’aérosolisation a été démontrée à l’aide d’un virus-modèle, le norovirus murin. La première détection des norovirus dans l’air de milieux de soins y est décrite. La présence du virus influenza dans l’air a aussi été démontrée. Le virus respiratoire syncytial n’a pu être mis en évidence dans l’air. Les virus pathogènes peuvent être aéroportés et représenter un risque infectieux. / The route of transmission of healthcare associated infections is not always well defined. The airborne dissemination of influenza virus, norovirus and respiratory syncytial virus has to be assessed. This thesis presents methodologies to detect airborne viruses and some innovative way to assess their resistance through the airborne route. Two sampling techniques were used, more precisely a dry sampling using a NIOSH 251 impactor and a liquid sampling using a Corriolis µ®. Viral cDNA was detected by real-time PCR. To assess the resistance of norovirus through the air route we used a cultivable experimental model; the murine norovirus. This thesis presents the first detection of airborne norovirus in a healthcare setting. Influenza virus was detected in the air of an emergency department and in the room of influenza positive patient. Respiratory syncytial virus could not be detected in an airborne state. Pathogenic virus can be disseminated through the airborne route and could represent an infectious risk.

Les inhibiteurs de la neuraminidase (INAs) jouent un rôle central dans le contrôle des infections grippales, tant dans le cas des épidémies et des pandémies comme chez les patients immunosuprimés et d'autres patients à risque. Cependant, le développement et la dissémination de la résistance compromettent l'utilité à long terme de cette intervention. En fait, le problème de la résistance aux INAs a été mis en évidence pendant les épidémies de grippe annuelles de 2007-09, avec la dissémination globale d’une variante de la souche A(H1N1) saisonnière résistante à l'oseltamivir. Dans ce cas, les observations préliminaires ont spéculé avec l'existence d'un ensemble de mutations “permissives” qui auraient facilité cette transmission mondiale. Heureusement, l'émergence et la propagation mondiale de la souche pandémique en 2009 a mené au remplacement de la souche saisonnière A/Brisbane/59/2007 (H1N1) résistante à l'oseltamivir, par le virus A(H1N1)pdm09 naturellement sensible aux INA, et, par conséquent, l'oseltamivir a récupéré son utilité clinique. En fait, la plupart des virus A(H1N1)pdm09, A(H3N2) et B circulants à ce jour restent sensibles à l'oseltamivir, avec seulement 1-2% de souches résistantes. Néanmoins, le nombre croissant de souches résistantes récemment détectées en l’absence de traitement fait craindre que ce problème puisse encore augmenter. À cet égard, l'impact de l'émergence et la dissémination de la résistance sur le choix limité des antiviraux actuellement disponibles renforce la nécessité d’une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à ce phénomène ainsi que de nouvelles approches thérapeutiques. Les différentes études présentées dans le cadre de cette thèse convergent vers l'objectif général de mieux décrire les mécanismes de développement de la résistance aux INAs dans les virus de la grippe. En outre, nous prévoyons que les thérapies combinées pourraient induire une meilleure réponse virologique et immunologique par rapport à la monothérapie antivirale. À la fin, nous nous attendons à ce que notre travail ait un impact sur la gestion des infections grippales en guidant la surveillance mondiale des marqueurs potentiels de résistance, ainsi qu’en proposant des traitements novateurs qui minimisent le développement de souches résistantes. / Neuraminidase inhibitors (NAIs) play a central role in the control of influenza infections, with important implications in the management of outbreaks and pandemics as well as in immunocompromised and other at risk patients, with both prophylactic and therapeutic indications. However, the development and dissemination of antiviral drug resistance represents a major limitation that compromises the long-term usefulness of this intervention. Actually, the problem of resistance to NAIs was highlighted by the worldwide dissemination of the oseltamivir-resistant seasonal A(H1N1) neuraminidase H274Y variant during the 2007-09 annual influenza epidemics. In that case, preliminary observations speculated with the existence of a set of “permissive” mutations that could have facilitated this global transmission. Fortunately, the antigenic shift that enabled the emergence of and global spread of the 2009 pandemic strain meant the replacement of the oseltamivir-resistant seasonal A/Brisbane/59/2007 (H1N1) virus by the naturally NAI-susceptible A(H1N1)pdm09 virus, and, consequently, oseltamivir recovered its clinical utility. In fact, most of the circulating A(H1N1)pdm09, A(H3N2) and B viruses remain susceptible to oseltamivir with only 1-2% of tested strains exhibiting phenotypic or genotypic evidence of resistance. Nevertheless, the growing number of resistant strains recently detected in the absence of therapy raises concern that this problem could increase. In that regard, the impact of the emergence and dissemination of resistance on the limited choice of antivirals currently available underscores a better understanding of the mechanisms underlying this phenomenon as well as the necessity for innovative therapeutic approaches. The different studies presented in this thesis converge to the general objective of better describing the mechanisms underlying the development of resistance to NAIs in influenza viruses. Also, we anticipate that combination therapies will induce better virological and immunological responses compared to antiviral monotherapy. In the end, we expect that our work will have an impact on the management of influenza infections by guiding the global surveillance of potential drug resistance markers, as well as proposing innovative ways to improve the clinical outcome and minimizing the development of drug-resistant strains.