Les sarcomes sont des cancers rares touchant toutes les zones du corps humain, caractérisés par une grande diversité de nature, de comportement clinique et de réponse aux thérapies existantes, certains étant de bon pronostic, d’autres très difficilement curables.Leur traitement de référence est la chirurgie ; la radiothérapie et les protocoles de chimiothérapie n’ayant que peu évolué lors des 30 dernières années.Récemment des caractéristiques génétiques leur étant propres ont été découvertes, prédictives de leur agressivité et contre lesquelles il est possible de diriger des drogues spécifiques pouvant améliorer le pronostic et diminuer les effets secondaires des thérapies conventionnelles.C’est sur l’inhibition d’Aurora Kinase A et B et CHK1 que s’est focalisé ce travail avec le test des effets de deux nouvelles drogues sur 9 types de cellules cancéreuses sarcomateuses avec des résultats très prometteurs, qu’il conviendra de conforter par d’autres expériences, notamment sur l’animal. / Sarcomas are rare cancers, which may arise in all parts of human body. They are characterized by great diversity in their nature, clinical behavior and response to existing therapeutics. Some are of good prognosis and others hard to cure.Their treatment essentially relies on surgery and radiotherapy or chemotherapy haven’t know major breakthrough over the last 3 decades.Recently new genetics abnormalities linked to sarcomas have been discovered. Their analysis can predict their aggressiveness and it is now possible to develop targeted therapies against them. This could help improving cancer prognosis and/or limiting conventional drugs adverse effects.Our work focused on Aurora Kinase A and B and CHK1 inhibition, testing the effects of 2 new drugs on 9 types of sarcoma cells with promising results, which we will confort by other experiments, including on the animal.

A descoberta de inibidores seletivos é extremamente importante para o desenvolvimento de novos fármacos que possam ser usados no tratamento de pacientes diagnosticados com a doença de Alzheimer (DA). Neste contexto, o desenvolvimento de métodos de triagem para a identificação de novos compostos biologicamente ativos se torna interessante. Butirilcolinesterase (BChE, EC 3.1.1.8) é uma serina hidroxilase que está classicamente associada à hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ACh) formando colina e ácido acético. Este trabalho descreve a imobilização covalente da BChE de soro humano nas paredes internas de capilares de sílica fundida utilizando o agente espaçador glutaraldeído, e sua aplicação na triagem de inibidores seletivos. O ICER-BChE resultante foi conectado a um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência com monitoramento on line da atividade catalítica, envolvendo detecção UV. Após os estudos das melhores condições cromatográficas, variações de pH e vazão e a influência de solventes orgânicos na atividade enzimática o método foi validado com o uso de inibidores padrões. O maior valor obtido com o ICER-BChE no parâmetro cinético, constante de Michaelis KM = 33,6 ± 6,9 mM, comparado com a enzima em solução, KM = 0,12 ± 0,02 mM, evidencia o efeito da imobilização sobre a afinidade pelo substrato. No entanto, houve retenção da atividade catalítica e seletividade frente a inibidores padrão. O método foi aplicado na triagem de novos ligantes utilizando cinco coleções de diferentes classes de compostos, entre derivados cumarínicos, complexos metálicos com cobre (Cu), complexos metálicos com cobalto (Co) e zinco (Zn), glicosídeos, e derivados de fenilpropanóides e ácido barbitúrico. Desta triagem foram selecionados sete compostos promissores com os quais foram realizados os estudos sobre a potência mínima inibitória (IC50) e destes quatro foram escolhidos para estudos de mecanismos de ação utilizando o ICER-BChE. Dos complexos metálicos os melhores compostos foram o HPTBCu (IC50 = 8,74 ± 1,5 µM, Ki = 9,6 ± 0,5 M), o NarBCu (IC50 = 8,0 ± 1,4 µM, Ki = 2,0 ± 0,1 M) ambos com mecanismo competitivo o HesFCu (IC50 = 13,6 ± 2,9 µM), o NNINABCu (IC50 = 94,8 ± 16) e o NarFCu (IC50 = 81,7 ± 13). Dos derivados cumarínicos os compostos 17 (IC50 =109 ± 21 µM, Ki = 108 ± 10 M) e 19 (IC50 =128 ± 28 µM, Ki =36.0 ± 5.0 M) apresentaram mecanismo incompetitivo. Os resultados demonstraram que a abordagem proposta é útil na triagem on line de inibidores seletivos, pois fornece resultados rápidos, precisos e reprodutíveis. / The discovery of selective inhibitors is extremely important for the development of drugs that can be used in the treatment of patients diagnosed with the Alzheimer disease (AD). In this context, the development of screening methods for the identification of new, biologically active compounds is a challenging task. Butyrylcholinesterase (BChE, EC 3.1.1.8) is a serine hydroxylase that is classically associated with the hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine (ACh), which yields choline and acetic acid. This paper describes the development of capillary enzyme reactors (ICERs) containing BChE from the human serum, covalently immobilized onto silica fused capillaries, using glutaraldehyde as spacer, and its application in the screening of selective inhibitors. The resulting BChE-ICER was connected to a liquid chromatography system high efficiency where monitoring of activity was online involving UV detection. After studying the best chromatographic conditions, pH variations, flow-rate and the influence of organic solvents on enzyme activity method was validated using standard inhibitors. The higher value obtained with the BChE-ICER in kinetic parameter, constant Michaelis KM = 33.6 ± 6.9 mM, compared with the enzyme in solution, KM = 0.12 ± 0.02 mM, shows the effect of immobilized on the affinity substrate. However, there was retention of catalytic activity and selectivity towards standard inhibitors. The method was applied in the screening of new ligands using collections of five different compounds, among coumarin derivatives, metal complexes with copper (Cu) metal complexes with cobalt (Co) and zinc (Zn), glycosides, phenylpropanoids and derivatives, and barbituric acid. These screenings were selected seven promising compounds with which the studies were made on the minimum inhibitory potency (IC50) and these four were chosen for studies of mechanisms of action using the ICER-BChE. Of the compounds metal complexes best were HPTBCu (IC50 = 8,74 ± 1,5 µM, Ki = 9,6 ± 0,5 M), NarBCu (IC50 = 8,0 ± 1,4 µM, Ki = 2,0 ± 0,1 M) both competitive mechanism, the HesFCu (IC50 = 13.6 ± 2.9 µM), NNINABCu (IC50 = 94.8 ± 16 µM) and NarFCu (IC50 = 81.7 ± 13 µM). Of coumarin derivatives, 17 (IC50 =109 ± 21 µM, Ki = 108 ± 10 M) and 19 (IC50 =128 ± 28 µM, Ki =36.0 ± 5.0 M) showed mechanism uncompetitive. The results demonstrated that the proposed approach is useful in screening for selective inhibitors online because it provides quick results, accurate and reproducible.

Mesmo com o grande número de estudos relacionados à proteases do subtipo B e de como suas mutações podem interferir na estrutura, na resistência a inibidores e na eficiência catalítica da enzima, existe ainda uma lacuna de como as mudanças polimórficas de proteases de HIV de outros subtipos de HIV-1 interferem nesses fatores. Nesse contexto insere-se esse trabalho, que utilizou proteases de HIV-1 isoladas de pacientes brasileiros HIV-1 infectados com o subtipo F, e outros dois mutantes, sendo que um do subtipo F e outro do subtipo B para ensaios frente a seis inibidores comercialmente disponíveis: amprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir e saquinavir. Nossos resultados experimentais revelam que os seis inibidores comerciais estudados são significantemente menos ativos para o subtipo F e para as mutantes quando comparados ao subtipo B. Além disso, os valores de vitalidade dessas proteases também são considerados maiores que os obtidos para a proteína selvagem do subtipo B. O acúmulo de mutações comumente detectadas e o polimorfismo natural tornam a protease selvagem do subtipo F cataliticamente suficiente para manter a viabilidade do vírus e garantir alto grau de resistência cruzada frente a todos os inibidores estudados. / Despite years of intense research around the world, HIV continues to represent considerable therapeutical challenge. In order to gain more insights into resistance of polymorphic mutations of existing HIV subtypes toward commercially available pharmaceutics, we studied inhibition of subtypes B and F HIV proteases (PRs) [native and two mutant enzymes clinically identified in Brazilian patients] by six commercial inhibitors (amprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir and saquinavir). Our results show that all these inhibitors have significantly higher Ki values for the subtype F HIV PR (Fwt) and both mutant enzymes than that for the B subtype HIV PR (Bwt). Furthermore, the biochemical fitnesses of these proteases, or their vitalities, are also considerably higher than that of Bwt. The accumulation of commonly detected resistant mutations in HIV PRs with natural polymorphisms turns Fwt sufficiently catalytically active to guarantee the virus viability and confers it a large degree of cross resistance against all studied inhibitors.

O objetivo deste trabalho consiste em avaliar o molibdato de sódio (Na2MoO4), o tungstato de sódio (Na2WO4) e um copolímero a base de silano polioxialquileno e polidimetilsiloxano modificado (CPPM) como inibidores de corrosão para o açocarbono ABNT 1005 em meio de NaCl 3,5%. O estudo compreendeu na exposição do metal no meio proposto na ausência e presença de concentrações crescentes das substâncias estudadas. As técnicas utilizadas foram: ensaios de imersão com medida de perda de massa; medida de potencial de corrosão (Ecorr); espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) e curvas de polarização potenciodinâmicas anódicas e catódicas (Cpol). Os resultados dos ensaios de imersão com medida de perda de massa mostraram que a velocidade de corrosão do aço-carbono ABNT 1005 em meio de água do mar é menor que a velocidade de corrosão em meio de NaCl 3,5%. Os valores de potenciais de corrosão mostraram que o Na2MoO4 e Na2WO4 deslocaram os potenciais para valores mais positivos indicando um comportamento de inibidores anódicos. Os parâmetros obtidos pela técnica de EIE mostraram que para o Na2MoO4 o melhor tempo de imersão foi de 6 horas e para o Na2WO4 foi de 12 horas, com eficiências de 70% e 77%, respectivamente. As Cpol confirmaram os resultados de potenciais de corrosão, ou seja, onde tanto o Na2MoO4 quanto o Na2WO4 comportaram-se como inibidores anódicos para o açocarbono ABNT 1005 em meio de NaCl 3,5%. O valor de perda de espessura com a presença de 1x10-2 mol.L-1 de Na2MoO4 com 24 horas de imersão comparado com o valor obtido em NaCl 3,5% sem inibidor forneceu uma eficiência de 82%, enquanto que na presença de Na2WO4, também com 24 horas de imersão e na concentração de 1x10-2 mol.L-1, a eficiência foi de 65%. Os resultados obtidos com o CPPM mostraram que esta substância não age como inibidor de corrosão para o açocarbono ABNT 1005 em meio de NaCl 3,5%. / The aim of this study is to evaluate the sodium molybdate (Na2Mo4), sodium tungstate (Na2WO4) and polydimethyl-siloxane modified copolymer (CPPM) as corrosion inhibitors for the carbon steel ABNT 1005 in 3,5% NaCl media. The metal substrate was exposed in the media with absence and presence of increasing concentrations of the investigated substances. The techniques used were: mass loss tests; open circuit potential; potentiodynamic polarization (Cpol) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS). For comparative purpose, mass loss testes were carried out in seawater and in 3,5% NaCl. The results showed that carbon steel ABNT 1005 corrosion rate in seawater is lower than the corrosion rate at 3,5% NaCl. The Na2Mo4 and Na2WO4 corrosion potentials showed more positive values than their absence, indicating an anodic inhibitor behavior. The parameters obtained by EIS technique showed that for the Na2MoO4 the best time of immersion was 6 hours and the Na2WO4 was 12 hours, with efficiencies of 70% and 77% respectively. The Cpol results confirmed the anodic behavior as corrosion inhibitors of the Na2MoO4 and Na2WO4 for carbon steel ABNT 1005 in 3,5% NaCl. After 24 hours of immersion in 1,0x10-2 mol.L-1 Na2MoO4 presence, the corrosion inhibition efficiency estimed using Tafel extrapolation was 82%. In the 1x10-2 mol.L-1 Na2WO4 presence after 24 hours of immersion, the efficiency obtained was 65%. The CPPM results showed it not acting as corrosion inhibitor for carbon steel ABNT 1005 in 3.5% NaCl.

A melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos e farmacológicos aliados a métodos modernos de investigação tornaram possível a descoberta e o desenvolvimento de fármacos para diversas doenças e disfunções orgânicas em humanos. Os fármacos desenvolvidos atualmente são resultados de intensos esforços em pesquisa por equipes multidisciplinares, impactando diretamente na qualidade de vida das diversas populações no mundo. Nesse cenário, os grupos de pesquisas estabelecidos em Universidades com foco no planejamento de fármacos para doenças tropicais têm crescido. A Malária e a Doença de Chagas figuram com especial importância, a primeira pela expressiva mortalidade mundial, enquanto a segunda pela morbidade e seus impactos na população brasileira. O tratamento de ambas possui limitações que se agravam, seja pelo baixo número de opções terapêuticas, ou pelo desenvolvimento de cepas resistentes. As enzimas investigadas nesse doutoramento, enolase (PfEnolase) de Plasmodium falciparum e gliceraldeído3fosfato desidrogenase de Trypanosoma cruzi (TcGAPDH), são componentes da via glicolítica destes parasitas e são considerados alvos moleculares atrativos para o desenvolvimento de inibidores enzimáticos, dada a importância destas enzimas no processo de obtenção de energia do parasita. Os estudos fundamentamse na busca por modulação seletiva da atividade biológica dos alvos selecionados através do desenvolvimento de novas moléculas bioativas. O estabelecimento de protocolo de expressão e purificação para enzima Pfenolase permitiu sua obtenção em quantidade e pureza suficiente para condução de estudos cinéticos e de triagem biológica, com a identificação de cinco novas classes químicas bastante promissoras; além de ensaios de cristalização, que culminaram na determinação da enzima em diversos complexos cristalográficos. Os dados estruturais produzidos foram fundamentais para condução da abordagem computacional de triagem virtual, que permitiu a identificação de 31 moléculas candidatas a inibidoras de Pfenolase. Avanços significativos foram obtidos também com a enzima TcGAPDH, destacando-se as adaptações nos processos de obtenção da proteína recombinante e ensaio cinético, condução de ensaio de bioprospecção orientada com a identificação e caracterização da molécula isolada (tilirosídeo). Novas condições de cristalização foram identificadas e poderão ser empregadas no processo de obtenção de complexos cristalográficos futuros. Adicionalmente, desenvolveu-se uma ferramenta computacional, Kinecteasy, para processamento automatizado dos dados produzidos das etapas de triagem biológica. Os trabalhos integrados de biologia estrutural e química medicinal desenvolvidos contribuem significativamente para o avanço no processo de planejamento de novos inibidores para as enzimas selecionadas. / A better understanding of the pathophysiological and pharmacological mechanisms together with the modern research methods made possible the discovery and development of drugs for several humans´ diseases. The drugs currently developed are the result of intense efforts in research of multidisciplinary teams having as a direct consequence a remarkable impact on life quality of populations all over the world. In this scenario, research groups established at universities, with their focus on drug development for tropical diseases, are increasing. Malaria and Chagas disease deserve special attention, the former by the expressive world mortality, while the second by the morbidity and its impact on Brazilian population. Treatment for both has limitations, whether by the low number of therapeutic options, or by development of resistance. The target enzymes for this PhD project, enolase (PfEnolase) of Plasmodium falciparum and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi (TcGAPDH), are essential components of glycolytic pathway and therefore related to the parasite energy production, thus, are considered attractive molecular targets for enzyme inhibitors development. Essentially, the proposed studies seek selective modulation of the target´s biological activity through the development of new bioactive molecules. The expression and purification protocols developed for Pfenolase have allowed us to obtain recombinant protein at suitable yield and purity for conducting screening assays, which has revealed five new chemical classes as Pfenolase inhibitors. Crystallization experiments were successfully conducted and 3D structure were determined for different complexes. Structural data was essential for performing the computational approach of virtual screening, which has allowed us to identify 31 inhibitor candidates for Pfenolase. Significant advances were obtained with TcGAPDH, highlighting the adaptations on recombinant protein protocol and kinetic assay. Assay-guided bioprospecting experiments were successfully performed with identification and characterization of isolated inhibitor (tiliroside). New crystallization conditions were identified and will be employed in future co-crystallization and soaking studies. Additionally, Kinecteasy, a computational tool, were developed for automated data processing of biological screening assays. The structure and medicinal chemistry studies presented here contribute significantly in the process of drug development for the selected enzymes.

Melanoma é o câncer mais agressivo e a mutação BRAF V600E é a mais frequente entre os pacientes. O vemurafenibe foi o primeiro inibidor específico desta mutação aprovado pela Food and Drug Administration. Entretanto, após cerca de seis meses há recidiva e superar os mecanismos de resistência responsáveis por este fenômeno ainda é um desafio. A curcumina é um tumérico com características antitumorais e anti-inflamatórias, entretanto sua baixa biodisponibilidade e estabilidade limitam seu uso e por isso impulsionaram a busca por análogos capazes de serem eficientes e comercializados. O DM-1, é um análogo monocetônico que apresentou efeitos antiumorais in vitro e in vivo em estudos anteriores. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos citotóxicos do DM-1 em células de melanoma sensíveis (naive) e resistentes ao vemurafenibe, bem como na modulação de metaloproteinases. As células de melanoma foram tratadas com diferentes concentrações de DM-1, e este composto foi citotóxico para linhagens sensíveis e resistentes ao vemurafenibe, além de induzir parada de ciclo celular em G1/G0 e diminuir o número de colônias, entretanto ele não foi seletivo em ensaios de citotoxicidade realizados com melanócitos e fibroblastos. O tratamento dessas células em doses subtóxicas resultou na modulação de metaloproteinases importantes no processo de invasão celular. O DM-1 reduziu as concentrações das metaloproteinases -1, -2 e -9 (MMP-1, -2 e -9) em um ensaio de quantificação de MMPs e a atividade das MMP-2 e -9 em um ensaio de zimografia de maneira célula dependente. As modulações negativas do inibidor de MMP TIMP-2 e MMP-14 para SKMEL-28 naive foram associadas a diminuição das atividades de MMP-2 e -9, enquanto que as modulações positivas para SKMEL-19 naive foram relacionadas ao aumento de MMP-2. Este composto ainda inibiu a migração das células e a formação de tubos por células endoteliais. / Malignant melanoma is the most aggressive cancer and the BRAF V600E mutation is the most frequent among patients. Vemurafenib was the first specific inhibitor for this mutation approved by Food and Drug Administration. Therefore around six months later there is relapse and overcoming it is still a challenge. Curcumin is a turmeric and it has been deeply researched because of its anti-inflammatory and antitumoral effects. However the low stability limits its use, therefore, encouraged the investigation of analogues capable to be efficient and commercialized. DM-1 is a monoketone curcumin analog and it showed antitumoral effects in vitro and in vivo in previous studies The aim of this project was to evaluate the cytotoxical effects of DM-1 for vemurafenib responsive (naïve) and resistant melanoma cells, as well as metalloproteinases modulation. Melanoma cells were treated with different DM-1 concentrations, and this compound was cytotoxic for responsive and resistant cell lines, besides inducing G1/G0 cell cycle arrest and reducing the number of colonies, nonetheless it was not selective in assays performed with melanocytes and fibroblasts. Subtoxic treatment of those cells modulated important MMPs in the cell invasion process. DM-1 reduced metalloproteinases -1, -2 and -9 (MMP-1,-2 and -9) in a quantification assay, and MMP-2 and -9 activities by zymography in a cell-dependent way. Negative modulations of MMP inhibitor TIMP-2 and MMP-14 for SKMEL-28 naïve were associated with MMP-2 and -9 reduced activities, whereas positive modulations for SKMEL-19 naïve were correlated to MMP-2 increase. Furthermore, this compound reduced migration of those cells and endothelial cell tube formation.

Submitted by DHARA CARLESSO ZAMPIVA (dhara.zampiva@univates.br) on 2018-08-20T17:17:13Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2018EdinaAparecidadosReisBlasi.pdf: 4920714 bytes, checksum: 936b932d7a6e49e5bca50678cab5e1d9 (MD5) 2018Edina_artigo.pdf: 1100636 bytes, checksum: a4919dc64d214daf7c76333e0b77f3a0 (MD5) / Rejected by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br), reason: Inserir o Lattes do autor. on 2018-09-11T18:28:07Z (GMT) / Submitted by DHARA CARLESSO ZAMPIVA (dhara.zampiva@univates.br) on 2018-09-17T17:18:08Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2018EdinaAparecidadosReisBlasi.pdf: 4920714 bytes, checksum: 936b932d7a6e49e5bca50678cab5e1d9 (MD5) 2018Edina_artigo.pdf: 1100636 bytes, checksum: a4919dc64d214daf7c76333e0b77f3a0 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2018-10-03T16:31:01Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2018EdinaAparecidadosReisBlasi.pdf: 4920714 bytes, checksum: 936b932d7a6e49e5bca50678cab5e1d9 (MD5) 2018Edina_artigo.pdf: 1100636 bytes, checksum: a4919dc64d214daf7c76333e0b77f3a0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-03T16:31:01Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2018EdinaAparecidadosReisBlasi.pdf: 4920714 bytes, checksum: 936b932d7a6e49e5bca50678cab5e1d9 (MD5) 2018Edina_artigo.pdf: 1100636 bytes, checksum: a4919dc64d214daf7c76333e0b77f3a0 (MD5) Previous issue date: 2018-08-20 / High levels of Schizotetranychus oryzae phytophagous mite infestation on rice leaves can severely affect pro- ductivity. Physiological characterization showed that S. oryzae promotes a decrease in chlorophyll concentration and the establishment of a senescence process in rice leaves. Late-infested leaves also present high levels of superoxide radical and hydrogen peroxide accumulation, along with high levels of membrane integrity loss, which is indicative of cell death. To better understand the rice molecular responses to high levels of mite in-festation, we employed the Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) approach to identify differentially expressed proteins. We identified 83 and 88 proteins uniquely present in control and late-infested leaves, respectively, along with 11 and one proteins more abundant in control and late-infested leaves, re-spectively. S. oryzae infestation induces a decreased abundance of proteins related to translation, protease in-hibition, and photosynthesis. On the other hand, infestation caused increased abundance of proteins involved in protein modification and degradation. Our results also suggest that S. oryzae infestation interferes with in-tracellular transport, DNA structure maintenance, and amino acid and lipid metabolism in rice leaves. Proteomic data were positively correlated with enzymatic assays and RT-qPCR analysis. Our findings describe the protein expression patterns of late-infested rice leaves and suggest several targets which could be tested in future bio-technological approaches aiming to avoid the population increase of phytophagous mite in rice plants.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:38:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guilherme Alves.pdf: 2875856 bytes, checksum: 413e2c96bb5544d5d44d06e0b591a116 (MD5) Previous issue date: 2012-03-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The use of aluminum becomes increasing because of the lightness of this metal and its high corrosion resistance. The anodization of the aluminum is now a well known and is widely used to increase the durability of the metal. This electrochemical technique forces the growth of oxide layer. The anodized layer has the peculiarity of having the nanotubes which allows the insertion of pigments and other compounds within these. The anodizing process, industrially used followed by coloration, according to the literature has been applied a current of 50 mA/cm2, dye concentration approximately 2-5 g / L, 15-18% sulfuric acid and temperature 40C. For these different factors, there is no a rigid control, therefore, there must be an optimization study of the process because the use of many reagents on an industrial scale can lead to an undesirable environmental impact, beyond the gas emission due to concentration of the acid used, even high energy expenditure. In this study it was used an organic dye to be deposited in the aluminum alloy AA6351 electrochemically anodized and studied, using a factorial design in the process to minimize the costs and to improve the metal protection. The experimental techniques used in this study were: chemometrics, anodizing, coloring by immersion, open circuit potential, anodic potentiostatic polarization, charge transfer resistance, electrochemical impedance spectroscopy, optical microscopy, scanning electron microscopy, microanalysis and Raman spectroscopy. The parameters for the experimental design, using chemometrics, were taken from the literature, as follows: current density, time and electrolyte concentration for the anodization, and dye concentration for the coloring. Measurements of charge transfer resistance (RCT) have demonstrated which tests would offer the greater protection. Two of the experimental tests, showed an RCT around by 2.85 x 108.cm2. These tests showed two situations: (1st) when anodization current density is high, less anodization time and dye are needed; (2nd) when anodization current density is low, much time and dye are needed. The polarization curves showed a current density of the samples anodized and colored are very small when compared with aluminum only polished. The electrochemical impedance spectroscopy also showed greater resistance of the layer developed on the colored pieces. The scanning electron microscopy showed that the diameter of the nanopores of the aluminum anodized, in first case, are around by 11.7 nm, so, therefore, less dye is needed to fill the nanoporos layer. In second case, the nanopores diameters are smaller than the first case; it is around by 7.6 nm, requiring higher dye concentration. In optical microscopy it was observed that the parameter also influence the tone of the chosen color. The energy dispersive system and the microanalysis showed have no heavy metals on the surface of aluminum neither in the dye composition. Raman spectroscopy proved that compound is on surface and did not change in the coloring process. / A utilização do alumínio torna-se cada vez maior, devido à leveza do metal e sua elevada resistência a corrosão. A anodização do alumínio é uma técnica bem conhecida e está sendo muito utilizada para o aumento da durabilidade do metal. Esta técnica força eletroquimicamente o crescimento da camada de óxido. A camada anodizada tem a peculiaridade de possuir nanotubos o que permite a inserção de pigmentos e outros compostos no interior destes. O processo de anodização, utilizado industrialmente seguido da coloração, de acordo com a literatura, tem sido aplicado uma corrente de 50 mA/cm2, concentração de corante da ordem de 2-5 g/L, 15-18% de ácido sulfúrico e temperatura de 40C. Nota-se que não há um controle industrial desses diversos fatores que existem no processo, com isso, é preciso que haja um estudo de otimização do processo, pois a utilização de muitos reagentes em escala industrial pode levar a um impacto ambiental indesejável, além da emissão de gases devido a concentração do ácido utilizada e até gasto elevado de energia. Neste trabalho foi utilizado um corante orgânico para ser depositado na liga de alumínio AA6351 anodizada e estudado eletroquimicamente utilizando-se o planejamento fatorial para minimizar custos do processo, e melhorar a proteção do metal. As técnicas experimentais utilizadas neste trabalho foram: quimiometria, anodização, coloração por imersão, potencial de circuito aberto, polarização potenciostática anódica, resistência de transferência de carga, espectroscopia de impedância eletroquímica, microscopia óptica, microscopia eletrônica de varredura, microanálise e espectroscopia Raman. Os parâmetros para o planejamento experimental, utilizando-se da quimiometria, foram retirados da literatura, sendo eles: densidade de corrente, tempo e concentração do eletrólito para a anodização; e concentração do corante para a coloração. As medidas de resistência de transferência de carga (RTC) demonstraram a possibilidade de identificar quais dos ensaios ofereceriam maior proteção. Dois dos ensaios do planejamento experimental mostraram uma RTC por volta de 2,85 x 108 .cm2. Estes ensaios mostraram duas situações: (1º) quando a densidade de corrente de anodização é alta, menos tempo de anodização e corante são necessários; (2) quando a densidade de corrente de anodização é baixa, mais tempo de anodização e corante são necessários. As curvas de polarização mostraram uma densidade de corrente, das amostras anodizadas e coloridas, com valores muito menores quando comparado com o alumínio somente polido. A espectroscopia de impedância eletroquímica também mostrou uma resistência maior da camada desenvolvida nas peças coloridas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que o diâmetro dos nanoporos do óxido de alumínio do ensaio na primeira situação são maiores, da ordem de 11,7 nm, e por isso é necessário menos corante para preencher a camada de nanoporos, enquanto na segunda os nanoporos eram menores, da ordem de 7,6 nm exigindo maior concentração do corante. Na microscopia óptica foi possível observar que os parâmetros também influenciam na tonalidade da coloração escolhida. Os ensaios de sistema de energia dispersiva e de microanálise não apresentaram metais pesados na superfície do alumínio nem na composição do corante. A espectroscopia Raman comprovou que o composto está na superfície e que não sofreu alteração no processo de coloração.

Acute kidney injury (AKI) is a major risk factor for chronic kidney disease (CKD). For patients who recover from AKI, there is a 25% increase in the risk of CKD, and a mortality rate of up to 50% after 10 years. Nuclear factor kappa-B (NF-κB) is a family of transcription factors that regulates the transcription of many proteins that play a key role in inflammation. Inhibitor of IκB kinase (IKK) is directly upstream of NF-κB. My aim was to investigate a) the role of IKK in the progression of AKI to CKD, and b) whether its inhibition attenuates renal fibrosis. In this thesis I used a model of unilateral renal ischaemia-reperfusion injury with contralateral nephrectomy, to firstly map the acute time course of AKI. From the data generated from the time course, I decided to treat the animals at 24 h post reperfusion with the IKK inhibitor, IKK16, as i) this was at the peak of renal dysfunction (24 h post reperfusion), and ii) prior to the activation of NF-κB (48 h post reperfusion). The inhibition of IKK at 24 hours post reperfusion, as a delayed treatment, successfully attenuated renal dysfunction, NF-κB activation and renal structural damage. I subsequently increased the recovery time after ischaemia-reperfusion in my rat model to 28 days to study the development of fibrosis post AKI. The inhibition of IKK at 24 hours post reperfusion successfully attenuated the development of fibrosis, formation of myofibroblasts, macrophage infiltration, the expression of pro-fibrotic markers and the deposition of extracellular matrix components at 28 days post reperfusion. In addition, the delayed inhibition of IKK at days 7-13 post unilateral ureteral obstruction in a rat model, successfully attenuated the development of fibrosis, formation of myofibroblasts, macrophage infiltration, the expression of pro-fibrotic markers and the deposition of extracellular matrix components. These data indicate that the activation of the IKK complex drives tubulointerstitial fibrosis, and suggests that the inhibition of IKK could be a useful pharmacological tool for the creation of therapies to combat AKI and the subsequent development of fibrosis, via the reduction of both inflammation and the prevention of the expression of pro-fibrotic markers.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-04-10T13:05:43Z No. of bitstreams: 1 FabioCorreiaCarneiroDissertacao2018.pdf: 2306587 bytes, checksum: ed2572dbb41a30ee1c54682a411c833d (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-04-10T13:06:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 FabioCorreiaCarneiroDissertacao2018.pdf: 2306587 bytes, checksum: ed2572dbb41a30ee1c54682a411c833d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-10T13:06:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FabioCorreiaCarneiroDissertacao2018.pdf: 2306587 bytes, checksum: ed2572dbb41a30ee1c54682a411c833d (MD5) Previous issue date: 2018-02-20 / Protease inhibitors have a broad biotechnological application, which goes since the development of several drugs to your utilization as a bioinsecticide, antifungal and as an antibacterial agent. However, those are found in small quantities in their natural sources, which unfeasible it utilization in industrial scale. Therefore, the heterologous production ends up as a method that allows the increase of scale production of those proteins. The Inga laurina Trypsin Inhibitor (ILTI) previously characterized showed an inhibitory effect in proteases extracted from the midgut of insects, besides reducing its larval developments by up to 84%, therefore, boing a candidate to be used as a potential bioinsecticide. Thus, the present work aimed at the heterologous production of ILTI in Komagataella phaffii (Pichia pastoris), followed by the optimization of the culture modes in a bioreactor with the objective of maximizing the production of the recombinant protein. For this, the gene that codifies ILTI were cloned in the expression vector pPIC9K, followed by your insertion on the strain GS115 by electroporation. PCR analysis showed that the recombinant vector was integrated into the genome of the yeast, and all the clones obtained had MutS genotype. The expression was performed for 96 hours by adding 0.5% methanol. An analysis of the proteins on the supernatant of the recombinant strain culture, by SDS-PAGE, confirmed the production of a protein with a size close to 20 KDa. Data from MALDI-TOF confirmed that the obtained protein is, in fact, the recombinant ILTI. Furthermore, inhibitory assays showed that the produced protein had activity against trypsin. Thus, culture in bioreactors was performed to optimize the production of this heterologous protein. In order to increase its expression, fed-batch was performed where on the batch phase the biomass production was favored, and the feeding phase was programmed to continuously supply methanol, based on the methanol specific consumption and its specific growth velocity, using methanol as carbon source. During the fermentations, 351.27 UIT were obtained in the extract of crude fermentation broth, and a specific activity of 2.07 UIT/mg protein. Although widely used as a host for the production of heterologous proteins, studies of the production of protease inhibitors in K. phaffii are still very limited. Until the moment, there is no report in the optimization of the production of serine protease inhibitors in K. phaffii, making this study pioneering and essential for the beginning of scaling up the process of this technology. / Os inibidores de protease possuem uma ampla aplica????o biotecnol??gica que vai desde o desenvolvimento de diversos f??rmacos at?? sua utiliza????o como bioinseticidas, antif??ngicos e como agentes antibacterianos. Por??m, estes s??o encontrados em pequenas quantidades nas suas fontes naturais, o que inviabiliza sua utiliza????o em escala industrial. Sendo assim, a produ????o heter??loga acaba sendo um m??todo que permite o aumento da escala de produ????o dessas prote??nas. O inibidor de tripsina de Inga laurina (ILTI) foi caracterizado previamente e mostrou possuir efeito inibit??rio em proteases extra??das do trato digestivo de insetos, al??m de diminuir em at?? 84% seu desenvolvimento larval, sendo, portanto, um candidato a ser utilizado como um poss??vel bioinseticida. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo a produ????o heter??loga do inibidor ILTI, em Komagataella phaffii (Pichia pastoris), seguido da otimiza????o dos modos de cultivo em biorreator com o objetivo de maximizar a produ????o da prote??na recombinante. Para isso, o gene que codifica o ILTI foi clonado no vetor de express??o pPIC9K seguindo de sua inser????o na cepa GS115 por eletropora????o. An??lises de PCR mostraram que o vetor recombinante foi integrado ao genoma da levedura e que todos os clones obtidos possu??am gen??tipo MutS. A indu????o da express??o foi realizada durante 96 horas por meio da adi????o de metanol ?? 0,5%. A an??lise de prote??nas presentes no sobrenadante da cultura da cepa recombinante, por meio de SDS-PAGE, confirmou a produ????o de uma prote??na com tamanho pr??ximo a 20 KDa. Dados obtidos em MALDI-TOF confirmaram que a prote??na obtida ?? de fato ILTI recombinante. Al??m disso, ensaios inibit??rios mostraram que a prote??na produzida possui atividade contra tripsina. Dessa forma, cultivo em biorreatores foram realizados com a finalidade de otimizar a produ????o dessa prote??na heter??loga. A fim de aumentar sua express??o foram realizadas bateladas alimentadas, onde durante a fase de batelada foi favorecida a produ????o de biomassa, e a fase de alimenta????o programada para fornecer metanol de forma cont??nua, com base nos dados de velocidade espec??fica de consumo de metanol e velocidade de crescimento espec??fica nesta fonte de carbono. Ao longo das fermenta????es realizadas foi obtido 351,27 UIT no extrato bruto do caldo fermentado e uma atividade espec??fica de 2,07 UIT/mg de prote??na. Apesar de ser amplamente utilizada como hospedeira para a produ????o de prote??nas heter??logas, estudos da produ????o de inibidores em K. phaffii ainda s??o muito limitados. At?? o momento n??o existem relatos de otimiza????o da produ????o de inibidores de serinoproteases em K. phaffii, sendo esse estudo pioneiro e essencial para o in??cio do processo de escalonamento dessa tecnologia.