Während meiner Dissertation beschäftigte ich mich mit der Synthese von polyhalogenierten Carbazolderivaten. Das Carbazolgerüst wurde über den Palladiumvermittelten, bestehend aus Buchwald-Hartwig-Aminierung und oxidativer Cyclisierung, aufgebaut. Die Halogensubstituenten wurden entweder am Carbazol eingeführt oder bereits über die Startmoleküle in die Synthese eingebracht. Somit konnten verschiedene halogenierte halogenierte Derivate synthetisiert werden. Diese Verbindungen konnten in einer Kooperation mit Herrn Prof. Gutzeit aus der Fachrichtung Biologie der TU Dresden auf ihre Aktivität in der Inhibierung der Myosin ATPase untersucht werden. Dabei wurde ein tribromiertes 1-Hydroxycarbazol als wirksamer Inhibitor identifiziert. Der zweite Teil der Promotion umfasst die Darstellung der Amaryllisalkaloide Pratosin und Hippadin, sowie der auf diesem Weg ebenfalls zugänglichen Naturstoffe Assoanin, Oxoassoanin, Anhydrolycorin-7-on und deren Naturstoffanaloga Anhydrolycorin. Die Synthese wurde auf zwei verschiedenen Wegen durchgeführt und beinhaltet als Schlüsselreaktionen die Eisenvermittelte C-C und C-N Bindungsbildung, sowie die Palladiumvermittelte Biarylkupplung. / This thesis is about my research study of the synthesis of polyhalogenated carbazoles. The skeletal structure of the carbazoles are easily assembled by palladium(0)-catalyzed Buchwald-Hartwig coupling and palladium(II)-mediated oxidative cyclisation. Through cooperation with Prof. Gutzeit many different halogenated carbazole derivatives could be analyzed concerning the activity of the inhibition of myosin ATPase. The tribrominated 1-Hydroxycarbazole was identified as sn effective inhibitor. The second part of my thesis includes the total synthesis of amaryllidaceae alkaloids pratosine, oxoassoanine, assoanine, hippadine, anhydrolycorinone and anhydrolycorine. The synthesis was accomplished by two different pathways which include the Iron-mediated C-C and C-N bond formation and intramolecular palladium-catalysed biaryl coupling reaction as the key steps.

Hintergrund und Fragestellung: Seit der Zulassung des Tyrosinkinase-Inhibitors (TKI) Imatinib im Jahre 2001 hat sich die Therapie der chronisch myeloischen Leukämie (CML) grundlegend verändert. Imatinib inhibiert die konstitutiv aktive Tyrosinkinase BCR-ABL, welche die verstärkte Proliferation der leukämischen Zellen und die Entwicklung der CML bedingt. Das sehr gute klinische Ansprechen auf eine Imatinib-Behandlung resultierte in einer beschleunigten Zulassung dieses TKI auch bei pädiatrischen Patienten im Jahre 2003. Aufgrund von Punktmutationen und/oder strukturellen Änderungen innerhalb des BCR-ABL Fusionsproteins können sich Resistenzen gegenüber Imatinib entwickeln. Deshalb wurden Zweit- und Drittgenerations TKI wie Dasatinib und Bosutinib entwickelt. Imatinib wirkt nicht hoch spezifisch und hemmt neben BCR-ABL auch weitere Tyrosinkinasen, wie z.B. c-KIT, PDGF-R und c-FMS, welche am Knochenstoffwechsel beteiligt sind. Die Stimulation des Rezeptors c-FMS bewirkt die Differenzierung monozytärer Vorläuferzellen in knochenabbauende Osteoklasten. Zusätzlich unterliegt die Entwicklung der knochenaufbauenden Osteoblasten spezifischen Signalkaskaden an denen PDGF-R und c-Abl beteiligt sind. Als Nebenwirkung einer TKI-Therapie beeinträchtigt die Inhibition dieser Signaltransduktionswege somit das Knochen-“Remodelling“, indem die Entwicklung und funktionelle Aktivität von Osteoklasten reduziert wird. Gleichzeitig wird die Aktivität von Osteoblasten gestärkt, aber deren Proliferation inhibiert. Diese Dysbalance von Knochenaufbau und -abbau mit gestörter Kalziumhomöostase bedingt bei erwachsenen CML-Patienten veränderte endokrinologische Parameter des Kalziumhaushaltes, eine vermehrte Knochenmineralisation und eine erhöhte trabekuläre Knochendichte. Dagegen wurden bei pädiatrischen CML-Patienten unter Imatinib-Therapie Längenwachstumsstörungen beobachtet, welche bezüglich des Wirkmechanismuses von Imatinib auf den wachsenden Knochen bis heute noch nicht im Detail geklärt sind. Spekulativ ist auch, ob Zweit- und Drittgenerations-TKI ebenso wie Imatinib den Knochenstoffwechsel bei pädiatrischen Patienten stören. Angelehnt an ein erfolgreiches Applikationsschema bei erwachsenen CML-Patienten steht zusätzlich die Frage im Raum, ob eine intermittierende Gabe von TKIs (einen Monat Therapie, einen Monat Pause) eine Minderung der Nebenwirkung auf den Knochen bewirken könnte, ohne die Wirkung auf die CML-Behandlung zu beeinträchtigen. Vor diesem Hintergrund wurde ein Nagermodel etabliert, um Nebenwirkungen auf den Knochenstoffwechsel unter TKI-Exposition zu analysieren. Junge, wachsende Ratten wurden hierzu vom präpubertären Alter bis zur Adoleszenz kontinuierlich oder intermittierend mit den TKIs Imatinib, Dasatinib und Bosutinib exponiert und die Wirkung auf das wachsende Skelettsystem untersucht. Methoden: 4 Wochen alte männliche Wistar Ratten wurden über einen Zeitraum von 10 Wochen chronisch mit jeweils einem der drei im Trinkwasser gelösten TKIs exponiert. Neben einer unbehandelten Kontrollkohorte erhielt eine Gruppe jeweils eine Standarddosis und eine hohe Dosis (entsprechend der doppelten Standarddosis) des entsprechenden TKIs kontinuierlich. Eine weitere Gruppe erhielt die hohe Dosis intermittierend (an drei aufeinanderfolgenden Tagen TKI, danach vier Tage nur Wasser). Die Konzentrationen im Trinkwasser betrugen für Imatinib 1 mM und 2 mM und für Dasatinib und Bosutinib jeweils 50 µM und 100 µM. Nach zweiwöchiger (präpubertär), vierwöchiger (pubertäres Stadium) und zehnwöchiger Exposition (postpubertär) wurden die Tiere aller Gruppen nekropsiert und Röhrenknochen, Lendenwirbel und Blut asserviert. Zur Beurteilung des Knochenmetabolismus wurden folgende Parameter erhoben: Knochenlängen, Knochendichten mittels pQCT, trabekuläre Strukturen mittels µCT, Knochenfestigkeit mittels des 3-Punkt-Biege-Test und endokrinologische Parameter im Serum mittels ELISA. Zusätzlich wurde der jeweilige TKI Serum-Spiegel bestimmt. Ergebnisse: Die Gewichtsentwicklung, körperliche Entwicklung und das Sozialverhalten zeigten keine Unterschiede beim Vergleich von Kontrollkohorten mit exponierten Tieren. Die kontinuierliche Exposition mit Imatinib und Dasatinib bewirkte dosisabhängig eine Reduktion der Knochenlängen der Femura und der Tibiae. Bosutinib zeigte diesen Effekt nicht. Die intermittierende Exposition mit hoher Dosis resultierte in einer Knochenlängenreduktion, welche exakt dem Effekt der Standarddosis entsprach. Weiterhin resultierte aus der Exposition mit Imatinib oder Dasatinib eine Verminderung der trabekulären Knochendichten der Femura und Tibiae im präpubertären Stadium. Ratten, welche hoch dosiert Imatinib erhielten, zeigten diese Reduktion ebenfalls im pubertären Stadium, nicht jedoch unter Dasatinib- und Bosutinib-Exposition. Postpubertär unterschieden sich die trabekulären Dichten von Femura und Tibiae der exponierten Gruppen nicht von den Kontrollkohorten. Auf die kortikale Knochendichte und die kortikale Dicke dieser Röhrenknochen zeigte sich kein messbarer Effekt der TKI. Dennoch trat - nur nach Exposition der hohen Imatinibdosis - eine signifikant verminderte femorale Bruchfestigkeit postpubertär auf. Am Lendenwirbelkörper war pubertär und postpubertär die Höhe unter Imatinib-Exposition vermindert, während die Gesamt- und kortikale Knochendichte präpubertär erhöht war bei tendenziell erniedrigter trabekulärer Knochendichte. Die kortikale Dicke wurde durch alle TKI nicht beeinflusst. Dasatinib und Bosutinib bewirkten keinen Effekt auf die Wirbelhöhe, aber eine tendenzielle Minderung der trabekulären Knochendichte. Der serologisch erfassbare Knochenresorptionsmarker „tatrate resistant acidic phosphatase“ (TRAP) war unter kontinuierlicher Exposition mit hoher Dosis von Imatinib zu allen Zeitpunkten erniedrigt. Postpubertär zeigte sich dieser Effekt auch unter Standard- und Hochdosis von Bosutinib. Der Knochenformationsmarker Osteocalcin war unter Imatinib bei allen Kohorten zu allen Analysezeitpunkten erniedrigt, während Dasatinib und Bosutinib keinen Effekt auf diesen Parameter zeigten. Die erfassten Serum-Hormonparameter (Wachstumshormon, Parathormon) lagen unter der Exposition mit Imatinib als erhöhte Wachstumshormonspiegel pubertär und als verminderte Parathormonspiegel prä- und pubertär vor. Unter der Exposition mit Dasatinib kam es ebenfalls pubertär zu einer Erhöhung der Wachstumshormonspiegel und präpubertär zu einer tendenziellen Erhöhung der Parathormonspiegel. Postpubertär normalisierten sich beide Parameter unter der Exposition mit Imatinib und Dasatinib wieder. Unter Bosutinib konnte nur postpubertär erniedrigte Parathormonspiegel ermittelt werden. Eine intermittierende TKI-Exposition resultierte in einem Aufholwachstum und einer teilweise Normalisierung der knochenspezifischen Serumparameter. Als wichtige unerwartete Nebenwirkung zeigte sich unter Langzeitexposition mit Imatinib und Dasatinib eine Zunahme des Herzgewichtes. Unter Imatinib resultierten daraus keine klinischen Auffälligkeiten, während unter Dasatinib eine Herzinsuffizienz zum Tod eines Tieres führte. Bosutinib zeigte keine weiteren makropathologisch erfassbaren Nebenwirkungen. Bis heute sind keine kardialen Nebenwirkungen bei pädiatrischen Patienten nach mehrjähriger TKI-Therapie publiziert. Schlussfolgerung: Das etablierte juvenile Nagertiermodell ist gut geeignet, um die Nebenwirkungen einer Langzeitexposition von TKI auf den wachsenden Knochen zu erfassen. Bei Kindern und Adoleszenten klinisch beschriebene Wachstumsretardierungen unter Imatinib ließen sich zweifelsfrei bei Ratten verifizieren. Bei fehlenden klinischen Daten von Kindern zu Dasatinib präjudiziert das Modell, dass Dasatinib so wie Imatinib den gleichen, Bosutinib hingegen kaum einen Effekt auf den Knochen ausübt. Eine intermittierende Gabe der TKI scheint die Nebenwirkungen auf den Knochen abzumildern und könnte eine neue Möglichkeit der TKI-Therapie für pädiatrische Patienten darstellen. Aus dem Tiermodell der Langzeit-exponierten juvenilen Ratte lässt sich ableiten, dass beim wachsenden Kind unter jahrelanger TKI-Therapie klinisch sorgfältig der Knochenstoffwechsel und das Längenwachstum überwacht und unter Dasatinib zusätzlich kardiale Nebenwirkungen beachten werden sollten.:I. Abkürzungsverzeichnis II. Abbildungsverzeichnis III. Tabellenverzeichnis IV. Tabellenverzeichnis des Anhangs 1. Einleitung 1.1 Die chronisch myeloische Leukämie 1.1.1 Pathogenese 1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild der chronisch myeloischen Leukämie 1.1.3 Die chronisch myeloische Leukämie im Erwachsenenalter 1.1.4 Die chronisch myeloische Leukämie im Kindes- und Jugendalter 1.1.5 Entwicklung der Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2 Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2.1 Wirkmechanismus von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.2.2 Tyrosinkinase-Inhibitoren der nächsten Generation 1.2.3 „Off-target“ Effekte von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.3 Das menschliche Skelett 1.3.1 „Remodelling“ des Knochens 1.3.2 Knochenstoffwechselparameter 1.3.2.1 Anabole Parameter des Knochenaufbaus Osteocalcin und Amino-terminales-Propeptid des Typ-I-Kollagens 1.3.2.2 Katabole Parameter des Knochenabbaus Carboxy-terminales Telopeptid des Typ-I-Kollagens und Tatrat-resistente saure Phosphatase 1.3.2.3 Endokrine Parameter des Knochenstoffwechsels Wachstumshormon und Parathormon 1.4 Einfluss von Tyrosinkinase Inhibitoren auf das Knochen-„Remodelling“ 2. Zielsetzung und Fragestellung 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Versuchstiere 3.1.2 Tierversuchsaufbau 3.1.3 Herstellung der Trinklösungen 3.2 Methoden 3.2.1 Lösungen und Arbeitsmaterialien 3.2.2 Geräte 3.2.3 Knochen-/Organpräparation und Verwendung 3.2.4 Serumgewinnung 3.2.5 Serumspiegelbestimmung der Tyrosinkinase-Inhibitoren 3.2.5.1 Imatinib 3.2.5.2 Dasatinib 3.2.5.3 Bosutinib 3.2.6 Bestimmungen von Knochenstoffwechselmarkern im Serum 3.2.7 Bestimmungen der Längen der Röhrenknochen und der Höhen der Lendenwirbelkörper 3.2.8 Computertomographisch gestützte Untersuchungen der Knochen 3.2.8.1 Knochendichtemessungen der unentkalkten Knochen mittels.. peripherer quantitativer Computertomographie 3.2.8.2 Messungen der unentkalkten Knochen mittels mikro-Computertomographie 3.2.9 Biomechanik am unentkalkten Knochen 3.2.10 Statistik 4. Ergebnisse 4.1 Entwicklung und Sozialverhalten der Versuchstiere unter Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.2 Todesfälle unter 10-wöchiger Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.3 Gewichtsentwicklungen der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.4 Trinkverhalten der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.5 Aufgenommene Mengen an Tyrosinkinase-Inhibitoren und Serumspiegel 4.6 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 4.6.1 Knochenlängen der Femura und Tibiae 4.6.2 Breiten der Epiphysenfugen der Femura und Tibiae 4.6.3 Dichte und Geometrie der unentkalkten Femura und Tibiae 4.6.4 Trabekelstrukturanalyse der unentkalkten Femura 4.6.5 Biomechanik der unentkalkten Femura 4.7 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel L2 4.7.1 Höhen der Lendenwirbelkörper 4.7.2 Dichte und Geometrie der unentkalkten Lendenwirbelkörper 4.8 Serumparameter des Knochenstoffwechsels während der Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.8.1 Parameter des Knochenaufbaus 4.8.2 Parameter des Knochenabbaus 4.9 Längenwachstumsbezogene Serumparameter des Hormonhaushaltes 4.10 Weitere beobachtete Nebenwirkungen während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5. Diskussion 5.1 Das Tiermodell der Ratte 5.2 Chronische Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren über das Trinkwasser..… 5.2.1 Trinkmengen und Entwicklungen der Versuchstiere 5.2.2 Zugeführte Dosis an Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.2.3 Serumkonzentrationen der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.3 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 5.3.1 Längen der Röhrenknochen und Breiten der Epiphysenfugen 5.3.2 Knochendichten und trabekuläre Strukturen der Röhrenknochen 5.3.3 Biomechanik der Femura 5.4 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel 5.5 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf den Knochenstoffwechsel 5.5.1 Veränderungen bei der Knochenresorption 5.5.2 Veränderungen bei der Knochenformation 5.5.3 Spezifische Effekte der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.6 Hormonelle Regulationen des Knochen-„Remodelling“ während der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.7 Nicht skelettbezogene Nebenwirkungen der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.8 Klinischer Bezug zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie im Kindes-und Jugendalter 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Anhang 9. Danksagung / Background: Since its approval in 2001 the tyrosine kinase inhibitor (TKI) imatinib has revolutionized the therapy of chronic myeloid leukaemia (CML). Imatinib inhibits the constitutively active tyrosine kinase (TK) BCR-ABL causing the increased proliferation of the leukemic cells and the progress of CML. According to improved survival rates imatinib has been licensed as frontline therapy also for paediatric CML in 2003. However, due to point mutations or structural changes within the BCR-ABL fusion protein resistance to imatinib occurs. Therefore 2nd and 3rd generation TKI like dasatinib and bosutinib have been developed. Beside BCR-ABL, Imatinib exerts also off-target effects on further TKs like c-KIT, PDGF-R, c-FMS which are involved in bone metabolism. Stimulation of the receptor c-FMS leads to the differentiation of monocytic progenitors to bone resorbing osteoclasts. In addition, the development of bone forming osteoblasts underlies specific signalling cascades involving PDGF-R and c-Abl. As a side effect of TKI therapy these specific signalling cascades are inhibited impairing bone remodelling by reducing the development and functional activity of osteoclasts. Simultaneously osteoblasts’ differentiation is promoted while their proliferation is inhibited. This dysbalance of bone formation and resorption results in altered endocrinological serum markers of the calcium homeostasis, increased bone mineralization, and increased trabecular bone density in adult CML patients. In contrast paediatric CML patients show longitudinal growth retardations under imatinib therapy, however, the detailed action of imatinib on the growing bone is not clarified yet. Additionally, it is unclear if 2nd and 3rd generation TKI will also disturb bone metabolism in paediatric CML patients. Based on an effective treatment strategy in adult CML patients, it is also questioned if intermittent TKI treatment (one month “on”, one month “off”) could minimise side effects on the bone without impairing CML therapy. On this background a rodent model was established to study side effects of TKI treatment on bone metabolism. Juvenile growing rats where exposed from prepubertal age till adolescence continuously or intermittently to imatinib, dasatinib, and bosutinib and the effects on the growing skeleton were analysed. Methods: Four weeks old male Wistar rats were chronically exposed to varying concentrations of one of the three TKIs via the drinking water for 10 weeks. Besides untreated controls a standard dosage group and a high dosage group (equalling the twofold standard dose) received every TKI continuously, while an additional group received the high dosage TKI in an intermittent fashion (3 days per week: “on” TKI; 4 days water without TKI). The concentrations applied were 1 mM and 2 mM for imatinib and 50 µM and 100 µM each for dasatinib and bosutinib, respectively. After 2 weeks (prepubertal), 4 weeks (pubertal stage), and 10 weeks (postpubertal) of exposure, respectively, animals were sacrificed and long bones, lumbar vertebra and blood were isolated. To evaluate bone metabolism the following parameters were analysed: bone length, bone mineral density (BMD) by pQCT, trabecular structure by µCT, bone strength by 3-point bending test, and endocrinological parameters by ELISA. Additionally, serum levels of TKIs were investigated. Results: In comparison to controls no alterations of exposed animals’ bodyweight, overall development and social behaviour were observed. Continuous exposure of imatinib and dasatinib led dose dependently to reduced femoral and tibial length. No such effect was observed under bosutinib. Intermitted exposure of high-dose TKIs resulted in reduced effects on femoral and tibial length identical to the effect observed in groups receiving just standard dose. Furthermore, exposure of imatinib and dasatinib lowered femoral and tibial trabecular BMD prepubertally. Rats receiving high dose imatinib showed reduced femoral and tibial trabecular BMD at pubertal stage, while this effect was not observed under dasatinib and bosutinib exposure. Postpubertally, femoral and tibial trabecular BMD of all exposed groups did not differ from controls. Femoral and tibial cortical BMD and cortical thickness were not affected by TKI exposure. However, under high dose imatinib exposure femoral mechanical breaking strength was reduced postpubertally. In vertebra the height was reduced under imatinib exposure pubertally and postpubertally, while the total and cortical BMD were increased prepubertally and trabecular BMD tended to be reduced. Cortical thickness was not affected by any TKI tested. Dasatinib and bosutinib exhibited no effect on the height of the vertebra but trabecular BMD tended to be reduced. The serum bone resorption marker ‘tartrate resistant acidic phosphatase’ (TRAP) was found reduced under continuous exposure of high dose of imatinib at all time points tested. Postpubertally, the same effect was detected after standard and high dosage of bosutinib. The bone formation marker osteocalcin was reduced in all groups and at all time points tested under imatinib exposure, whereas no such effect was observed for dasatinib and bosutinib. Serum bone related hormone markers (growth hormone (GH) and parathyroid hormone (PTH)) revealed under imatinib exposure increased GH levels pubertally whereas PTH was reduced pre- und pubertally. During dasatinib exposure GH levels were elevated pubertally and PTH levels were increased prepubertally. Postpubertally, both parameters normalised again under imatinib and dasatinib exposure. During bosutinib exposure reduced PTH levels were detected postpubertally only. Intermitted TKI exposure resulted in catch-up growth and partial normalisation of bone specific serum parameters. As major unexpected side effect during exposure increasing heart weights could be observed under long-time imatinib and dasatinib exposure. No clinical changes were observed under imatinib, whereas dasatinib led to cardiac insufficiency leading to death of one animal. Bosutinib showed no additional macrospathologic assessable side effects. To date no cardiac side effects were published in paediatric patients under prolonged TKI therapy. Conclusion: The established juvenile rat model is appropriate to examine side effects of long-term TKI exposure on the growing bone. Published longitudinal growth retardation in children and adolescents under imatinib treatment could be unequivocally mimicked in this rat model. Due to not yet available clinical experience with dasatinib in paediatric patients, this model predicts that dasatinib alters bone metabolism like imatinib whereas bosutinib shows less detectable effects. Intermitted TKI treatment may reduce side effects on the growing bone and therefore could represent a new opportunity of TKI therapy for paediatric patients. Summing up, TKI long-term exposure in this juvenile rat model challenges physicians to diligently monitor bone metabolism in not outgrown paediatric patients during long-term TKI treatment and additionally assess cardiac side effects under dasatinib exposure.:I. Abkürzungsverzeichnis II. Abbildungsverzeichnis III. Tabellenverzeichnis IV. Tabellenverzeichnis des Anhangs 1. Einleitung 1.1 Die chronisch myeloische Leukämie 1.1.1 Pathogenese 1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild der chronisch myeloischen Leukämie 1.1.3 Die chronisch myeloische Leukämie im Erwachsenenalter 1.1.4 Die chronisch myeloische Leukämie im Kindes- und Jugendalter 1.1.5 Entwicklung der Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2 Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2.1 Wirkmechanismus von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.2.2 Tyrosinkinase-Inhibitoren der nächsten Generation 1.2.3 „Off-target“ Effekte von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.3 Das menschliche Skelett 1.3.1 „Remodelling“ des Knochens 1.3.2 Knochenstoffwechselparameter 1.3.2.1 Anabole Parameter des Knochenaufbaus Osteocalcin und Amino-terminales-Propeptid des Typ-I-Kollagens 1.3.2.2 Katabole Parameter des Knochenabbaus Carboxy-terminales Telopeptid des Typ-I-Kollagens und Tatrat-resistente saure Phosphatase 1.3.2.3 Endokrine Parameter des Knochenstoffwechsels Wachstumshormon und Parathormon 1.4 Einfluss von Tyrosinkinase Inhibitoren auf das Knochen-„Remodelling“ 2. Zielsetzung und Fragestellung 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Versuchstiere 3.1.2 Tierversuchsaufbau 3.1.3 Herstellung der Trinklösungen 3.2 Methoden 3.2.1 Lösungen und Arbeitsmaterialien 3.2.2 Geräte 3.2.3 Knochen-/Organpräparation und Verwendung 3.2.4 Serumgewinnung 3.2.5 Serumspiegelbestimmung der Tyrosinkinase-Inhibitoren 3.2.5.1 Imatinib 3.2.5.2 Dasatinib 3.2.5.3 Bosutinib 3.2.6 Bestimmungen von Knochenstoffwechselmarkern im Serum 3.2.7 Bestimmungen der Längen der Röhrenknochen und der Höhen der Lendenwirbelkörper 3.2.8 Computertomographisch gestützte Untersuchungen der Knochen 3.2.8.1 Knochendichtemessungen der unentkalkten Knochen mittels.. peripherer quantitativer Computertomographie 3.2.8.2 Messungen der unentkalkten Knochen mittels mikro-Computertomographie 3.2.9 Biomechanik am unentkalkten Knochen 3.2.10 Statistik 4. Ergebnisse 4.1 Entwicklung und Sozialverhalten der Versuchstiere unter Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.2 Todesfälle unter 10-wöchiger Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.3 Gewichtsentwicklungen der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.4 Trinkverhalten der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.5 Aufgenommene Mengen an Tyrosinkinase-Inhibitoren und Serumspiegel 4.6 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 4.6.1 Knochenlängen der Femura und Tibiae 4.6.2 Breiten der Epiphysenfugen der Femura und Tibiae 4.6.3 Dichte und Geometrie der unentkalkten Femura und Tibiae 4.6.4 Trabekelstrukturanalyse der unentkalkten Femura 4.6.5 Biomechanik der unentkalkten Femura 4.7 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel L2 4.7.1 Höhen der Lendenwirbelkörper 4.7.2 Dichte und Geometrie der unentkalkten Lendenwirbelkörper 4.8 Serumparameter des Knochenstoffwechsels während der Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.8.1 Parameter des Knochenaufbaus 4.8.2 Parameter des Knochenabbaus 4.9 Längenwachstumsbezogene Serumparameter des Hormonhaushaltes 4.10 Weitere beobachtete Nebenwirkungen während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5. Diskussion 5.1 Das Tiermodell der Ratte 5.2 Chronische Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren über das Trinkwasser..… 5.2.1 Trinkmengen und Entwicklungen der Versuchstiere 5.2.2 Zugeführte Dosis an Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.2.3 Serumkonzentrationen der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.3 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 5.3.1 Längen der Röhrenknochen und Breiten der Epiphysenfugen 5.3.2 Knochendichten und trabekuläre Strukturen der Röhrenknochen 5.3.3 Biomechanik der Femura 5.4 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel 5.5 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf den Knochenstoffwechsel 5.5.1 Veränderungen bei der Knochenresorption 5.5.2 Veränderungen bei der Knochenformation 5.5.3 Spezifische Effekte der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.6 Hormonelle Regulationen des Knochen-„Remodelling“ während der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.7 Nicht skelettbezogene Nebenwirkungen der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.8 Klinischer Bezug zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie im Kindes-und Jugendalter 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Anhang 9. Danksagung

No description available.

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Recent clinical findings in chronic myeloid leukemia (CML) patients suggest that the risk of molecular recurrence after stopping tyrosine kinase inhibitor (TKI) treatment substantially depends on an individual’s leukemia-specific immune response. However, it is still not possible to prospectively identify patients that will remain in treatment-free remission (TFR). Here, we used an ordinary differential equation (ODE) model for CML, which explicitly includes an anti-leukemic immunological effect and applied it to 21 CML patients for whom BCR-ABL1/ABL1 time courses had been quantified before and after TKI cessation. Immunological control was conceptually necessary to explain TFR as observed in about half of the patients. Fitting the model simulations to data, we identified patient-specific parameters and classified patients into three different groups according to their predicted immune system configuration ('immunological landscapes”). While one class of patients required complete CML eradication to achieve TFR, other patients were able to control residual leukemia levels after treatment cessation. Among them were a third class of patients, that maintained TFR only if an optimal balance between leukemia abundance and immunological activation was achieved before treatment cessation. Model simulations further suggested that changes in the BCR-ABL1 dynamics resulting from TKI dose reduction convey information about the patient-specific immune system and allow prediction of outcome after treatment cessation. This inference of individual immunological configurations based on treatment alterations can also be applied to other cancer types in which the endogenous immune system supports maintenance therapy, long-term disease control or even cure.

<p dir="ltr">In this study, we presented the discovery of the first-in-class covalent inhibitor specific to Src homology 2 domain containing phosphatase 1 (SHP1), an overlooked cancer immunotherapy target. Through high-throughput screening, we identified a chloroacetamide fragment highly selective for SHP1. This fragment was subsequently refined to yield M029, a covalent inhibitor characterized by low-micromolar potency, heightened selectivity, enhanced stability, and improved bioavailability. Notably, M029 targets a cryptic, non-conserved cysteine residue on SHP1, thereby illuminating novel avenues for future drug development focused on SHP1. This presented study also marked the first characterization of SHP1 pharmacology inhibition <i>in vivo</i> using M029 as a tool compound. Consistent to previous genetic studies, SHP1 inhibition was observed to markedly bolster anti-tumor efficacy, primarily through the activation of CD8+ T cells and NK cells, coupled with a reduction in T cell exhaustion. While no synergistic effects were noted in conjunction with anti-PD-1 treatment, M029 as a standalone therapy showcased more favorable responses compared to anti-PD-1 therapy alone, underscoring its potential for clinical application.</p><p dir="ltr">Meanwhile, we also demonstrated the effects of targeting both protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), and T cell protein tyrosine phosphatase (TC-PTP) using proteolysis targeting chimeras (PROTACs). PROTACs are heterobifunctional small molecules comprising a targeted protein ligand, an E3 ligase ligand, and a linker. By recruiting an E3 ligase to the targeted proteins, PROTACs leverages the cell's ubiquitin-proteasome machinery to achieve selective target protein degradation. In contrast to traditional occupancy-based inhibitors, event-driven PROTACs show improved efficacy by promoting target protein degradation in a catalytic mode of action and greater selectivity through the obligatory formation of the target-PROTAC-E3 ternary complex, which is essential for efficient target degradation. Through optimizing the previously reported PROTAC DU-14, we acquired a cereblon (CRBN)-based PTP1B/TC-PTP dual targeting PROTAC X1 of higher bioavailability than DU-14. X1 showed enhanced efficacy than DU-14 in multiple cell lines and manifested anti-cancer efficacy <i>in vivo</i>. Additionally, employing X1 as a tool compound, we validated the anti-cancer potential of PTP1B/TC-PTP degradation in STAT3 dependent malignancies, such as non-Hodgkin’s lymphomas. Treatments with X1 or DU-14 effectively induced tumor cell apoptosis, whereas the dual inhibitor ABBV-CLS-484 failed to produce comparable outcomes.</p>

Die Wanderung von Leukozyten aus dem Gefäßlumen läuft in einer Kaskade ab, die durch verschiedene Adhäsionsmoleküle vermittelt wird. Dabei wird der erste Kontakt der Leukozyten mit dem Endothel durch die Interaktion von L­Selektin mit seinen endothelialen Sialomucinliganden eingeleitet. Neben seiner Adhäsionsfunktion kann L­Selektin intrazelluläre Signalwege aktivieren und wird, induziert durch intrazelluläre Signale, an seinen cytoplasmatischen Serinresten durch Proteinkinase C (PKC) phosphoryliert. Über die Regulation dieser Serinphosphorylierung von L-Selektin ist nur wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der cytoplasmatischen Interaktion von L-Selektin mit dem Proteinphosphatase 2A-Inhibitor PhapII und die Identifizierung noch unbekannter Interaktionspartner der cytoplasmatischen Domäne von L­Selektin. Es konnte gezeigt werden, dass das basische Duplett Lys-365/Arg-366 der cytoplasmatischen Domäne von L-Selektin essentiell für die Bindung von PhapII ist, die über den sauren C­Terminus von PhapII vermittelt wird. In einem Malachitgrün-basierten Phosphataseassay konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatischen Serinreste von L­Selektin durch Protein Phosphatase 2A (PP2A) dephosphoryliert werden. Ferner konnte in Jurkat-Zelllysaten PP2A als ein direkter Interaktionspartner von nicht phosphoryliertem LScyto identifiziert werden. Die Dephosphorylierung von LScyto konnte durch PhapII verhindert werden, was auf eine Regulation der Serinphosphorylierung durch PKC, PP2A und PhapII hindeutet. Mit dem Ziel, die Interaktion von PhapII mit L-Selektin durch Co-Kristallisation zu untersuchen, wurde PhapII rekombinant exprimiert und gereinigt. Mittels chromatographischer Verfahren konnte PhapII als ein Protein mit intrinsischer Unordnung in seiner Sekundärstruktur beschrieben werden. Die Deletion des sauren C-Terminus bzw. die Mutation an Serin-9 von PhapII zeigten einen Einfluss auf die Konformation von PhapII zu einer kompakteren Proteinstruktur hin. / Migration of leukocytes from the lumen occurs in a cascade mediated by different members of adhesion molecules. The first contact of leukocytes to endothelium is initiated by the interaction of L­selectin to its endothelial sialomucin ligands. Besides its role in cell adhesion, L­selectin can induce a set of intracellular signaling pathways and can be a target of serine phosphorylation by protein kinase C (PKC) induced by intracellular signals. But little information on regulation of this serine phosphorylation of L-selectin and therefore regulation of intracellular protein interactions is known. The aim of this thesis was to analyze the cytoplasmic interaction of L-selectin with the inhibitor of protein phosphatise 2A PhapII and searching for other unknown interaction partners of the cytoplasmic domain of L-selectin. Results show that the basic doublet Lys-365/Arg-366 of the cytoplasmic domain of L­selectin (Lscyto) is essential for binding to PhapII which is mediated by the acidic C­terminal tail of PhapII. Using malachite green based assay to detect free phosphate, cytoplasmic serine residues of L­selectin were dephosphorylated by protein phosphatase 2A (PP2A). In addition, it was possible to identify PP2A as a direct interaction partner of the non-phosphorylated domain of L­selectin in Jurkat T cell lysates. The dephosphorylation of Lscyto was prevented by PhapII and points the regulation of serine phosphorylation by PKC, PP2A and PhapII. For analysis of the interaction of PhapII with L-selectin by co-crystallography, PhapII was recombinantly expressed and purified. Using chromatographic techniques PhapII was observed to be a protein with an intrinsic disorder in its secondary structure. Deletion of the acidic C-terminus and in particular mutation of Serine-9 showed an effect on the conformation of PhapII to a globular and compact protein structure.

Die Cathepsine B, H und L sind lysosomale Enzyme, die zur Gruppe der Cysteinproteasen gehören. Erhöhte Aktivitäten dieser Proteasen fand man in Gewebeproben verschiedener Tumore, vermutlich Hinweis auf eine Beteiligung an Invasion und Metastasierung. Unter physiologischen Bedingungen werden die Cathepsine von endogenen Inhibitoren kontrolliert, eine Verminderung dieser Cysteinprotease-Inhibitoren (CPI) würde die proteolytische Dysbalance verstärken und zur Ausbreitung des malignen Prozesses beitragen. Für das Prostatakarzinom gab es bisher keine Untersuchungen. Die Aktivität der Cathepsine wurde mit Hilfe spezifischer Substrate bestimmt, die zur Bildung fluorogener Produkte führten. Zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivität der CPI wurden die Proben nach einer Hitzeaktivierung gegen reines Cathepsin B getestet. Untersucht wurden Gewebeproben verschiedener Patientengruppen, Primärzellkulturen, die aus normalem und maligne veränderten Prostatagewebe angezüchtet wurden und vergleichend dazu die drei immortalisierten Zellinien LNCaP, PC3 und DU145. Die Ergebnisse der Gewebeproben zeigten höhere Aktivitäten der Cathepsine B und L im nichterkrankten Gewebe, nicht wie erwartet im Tumorgewebe der Prostata. Hingegen waren bei den Primärzellkulturen alle drei Cathepsine und der Quotient Cathepsine/CPI in den Tumorproben erhöht. Die immortalisierten Zellinien zeigten die gleiche Verteilung bei allen Cathepsinen, DU145 mit der höchsten Aktivität, gefolgt von LNCaP und PC3. Anhand der Ergebnisse schlußfolgern wir, daß die Untersuchung von Gewebe-proben der Prostata hinsichtlich der Beteiligung der Cathepsine am Tumor-geschehen keine eindeutigen Erkenntnisse erbringt. Dies ist vermutlich auf die Heterogenität des Gewebes zurückzuführen, das nicht nur epitheliale, sondern auch stromale Zellen enthält. Die aus dem Gewebe angezüchteten Primär-zellkulturen scheinen ein genaueres Bild des Verhältnisses von Cathepsinen und den Inhibitoren zu geben und sind unserer Meinung nach den Bestimmungen in Gewebeproben vorzuziehen. / The cathepsins B, H and L (CB, CH, CL) are lysosomal proteolytic enzymes belonging to the cysteine protease family. Elevated cathepsin levels and decreased concentration of their endogenous inhibitors have been demonstrated in a variety of tumors, suggesting a contribution to invasion and metastasis. The situation for prostate cancer was so far unknown. Using fluorimetric assays, catalytic activities of the cathepsins B, H, L were measured in prostatic tissue samples obtained from different groups of patients, in primary cell cultures established from human prostate and in the immortalized cell lines LNCaP, PC3 and DU145. Inhibitory activities of cysteine protease inhibitors (CPI) were tested against purified cathepsin B. Comparing matched pairs of normal and cancerous tissue samples from the prostate, significantly decreased levels of CB and CL were found in malignant samples. In contrast, primary cell cultures from malignant tissue showed elevated levels of all three cathepsins and increased ratios of cathepsins to CPI when compared to cell cultures from non-malignant prostate. The permanent cell lines showed a similiar distribution of cathepsin levels, DU145 with the highest activity, followed by LNCaP and PC3. These results suggest that elevated cathepsin activities and increased ratios of cathepsins to CPI in malignant cell cultures compared to non-malignant samples may be an indication for a cellular proteolytic imbalance in prostatic cancer cells. Regarding different results, determinations in primary cell cultures should be preferred to tissue samples.

Die aberrante Aktivierung des NOTCH Signalweges trägt entscheidend zu verschiedensten malignen Erkrankungen im Menschen bei. Basierend auf der Analyse von hochdimensionalen Microarray-Datensätzen von klassischen Hodgkin Lymphoma Fällen und nicht-Hodgkin Fällen, haben wir eine Hodgkin Lymphoma-spezifische NOTCH Signatur identifiziert. Diese wird von dem essentiellen NOTCH-Koaktivator Mastermindlike 2 (MAML2) signifikant dominiert. Auf der Grundlage dieses Resultates haben wir die Rolle von MAML2 im Kontext des Hodgkin Lymphoma-spezifischen, aberrant regulierten NOTCH Signalweges weiter untersucht. Die signifikante Überexpression von MAML2 im Hodgkin Lymphom konnte in verschiedenen Hodgkin Lymphom Zelllinien und auch durch die immunhistochemische Analyse von primären Hodgkin Lymphom Fällen verifiziert werden. Mit Hilfe des Knockdowns von MAML2 bzw. der Inhibition des NOTCH Signalweges durch die Verwendung einer kompetitiv, dominant-negativ wirkenden, trunkierten Variante von MAML1 konnte daraufhin gezeigt werden, dass die Überexpression von MAML2 der limitierende Faktor für die Hodgkin Lymphomaspezifische, pathologische Deregulation des NOTCH Signalweges ist. Die MAML2- vermittelte Überaktivierung des NOTCH Signalweges ist darüber hinaus essentiell für die Proliferation von Hodgkin Lymphom Zelllinien und die aberrante Expression der NOTCH Zielgene HES7 und HEY1. Das konstitutive Vorhandensein von aktiviertem, intrazellulären NOTCH1 in Hodgkin Lymphom Zelllinien impliziert darüber hinaus,dass der Signalweg im Hodgkin Lymphom zellautonom aktiviert ist. In dieser Arbeit wird damit ein neuer, pathologisch hochwirksamer Mechanismus der NOTCH Signalweg-Deregulation aufgedeckt. / Inappropriate activation of the NOTCH signaling pathway, e.g. by activating mutations, contributes to the pathogenesis of various human malignancies. Using a bottom up approach based on the acquisition of high–dimensional microarray data of classical Hodgkin lymphoma (cHL) and non-Hodgkin B cell lymphomas as control, we identify a cHL specific NOTCH gene-expression signature dominated by the NOTCH co-activator Mastermind-like 2 (MAML2). This set the basis for demonstrating that aberrant expression of the essential NOTCH co-activator MAML2 provides an alternative mechanism to activate NOTCH signaling in human lymphoma cells. Using immunohistochemistry we detected high-level MAML2 expression in several B cell-derived lymphoma types, including cHL cells, whereas in normal B cells no staining for MAML2 was detectable. Inhibition of MAML protein activity by a dominant negative form of MAML or by shRNAs targeting MAML2 in cHL cells resulted in down-regulation of the NOTCH target genes HES7 and HEY1, which we identified as overexpressed in cHL cells, and in reduced proliferation. In order to target the NOTCH transcriptional complex directly we developed short peptide constructs that competitively inhibit NOTCH dependent transcriptional activity as demonstrated by NOTCH reporter assays and EMSA analyses. We conclude that NOTCH signaling is aberrantly activated in a cell autonomous manner in cHL. This is mediated by high-level expression of the essential NOTCH coactivator MAML2, a protein that is only weakly expressed in B cells from healthy donors. Using short peptide constructs we moreover show, that this approach is promising in regard to the development of NOTCH pathway inhibitors that will also work in NOTCH associated malignancies that are resistant to -secretase inhibition.

Hämagglutinin (HA) des Influenzavirus ist eine mögliche Zielstruktur für antivirale Therapeutika. Aus der Menge experimenteller HA-Inhibitoren stechen die kürzlich beschriebenen Q-beta-Sialoside aufgrund ihrer hohen Affinität und akkuraten, multivalenten Abbildung der Rezeptorbindungsstellengeometrie hervor. Anknüpfend an diese Eigenschaften beschreibt die vorliegende Arbeit die Erweiterung der Q-beta-Sialosidplattform durch neuartige Varianten und Anwendungsgebiete. Verschiedene Strategien für die Entfernung von Lipopolysacchariden aus Kapsidproben wurden untersucht, wobei sich das Verfahren der Cloud Point als am besten geeignet herausstellte. Das gereinigte Material war geeignet für in vivo Versuche. Teilsialylierte Kaspidvarianten wurden auf ihre inhibitorische Aktivität untersucht und im Vergleich der Ergebnisse mit statistischen Berechnungen Hinweise auf einen vorherrschend trivalenten Bindungsmodus zwischen Q-beta-Sialosiden und HA gefunden. Die Arbeit beinhaltet die ersten Beispiele heterobifunktionaler Q-beta-Sialoside, die verschiedene Sialinsäureliganden oder Kombinationen aus Zuckern und Fluoreszenzfarbstoffen aufweisen. Die fluoreszenzmarkierten Kapside wurden in Mukus-Mobilitätsstudien angewendet und ihre Undurchgängigkeit der äußeren Mukusbarriere visualisiert. Mehrere Sialinsäureester wurden als potenzielle ladungsmaskierte Liganden für erhöhte Mukusgängigkeit untersucht. Ein zweiter Schwerpunkt der Arbeit war die Entwicklung eines peptidbasierten HA-Inhibitors. Eine Gruppe von aus HA-bindenden Antikörpern und Lactoferrin abgeleiteten Peptiden wurde mit Hilfe der mikroskaligen Thermophorese auf ihre Affinität zu HA oder Influenza A/X31 (H3N2) getestet. Die vorläufigen Resultate weisen auf eine gute Bindung mehrerer Kandidaten hin. Multivalente Peptid-Polymer-Konjugate wurden auf Basis von linearem Polygylcerol niedrigen Molekulargewichts synthetisiert, jedoch zeigte keines eine Inhibierung der getesteten Influenzastämme. / The influenza virus hemagglutinin (HA) attracts much attention as a target widely unexploited by licensed therapeutics. From the numerous experimental HA inhibitors, the recently reported Q-beta sialosides stand out through their affinity and accurate, multivalent reflection of the receptor binding site geometry. Building upon these characteristics, this work expands the variety of the Q-beta sialoside platform with novel variants and explores new areas of application. Several strategies were compared to remove lipopolysaccharides from capsid preparations, determining cloud point extraction as the most suitable. The purified material shown to be suitable for in vivo experiments. The inhibitory activities of partially sialylated capsids were compared to statistical models to obtain evidence for the prevalence of trivalent interactions between Q-beta sialosides and HA. Moreover, this work contains the first examples of heterobifunctional Q sialosides, bearing multiple sialic acid (SA) ligands or combinations of sugars and fluorescent dyes. Fluorescently labeled Q-beta sialosides were applied in mucus mobility studies to visualize their entrapment in the outer mucus layer. Several SA esters were examined as potential masked-charge ligands to increase mucus permeation. A second focal point of the thesis was the design of a novel, peptide-based HA inhibitor. A library of peptides derived from HA-binding antibodies and lactoferrin was investigated using microscale thermophoresis for binding to recombinant HA or influenza A/X31 (H3N2) concentrate. Preliminary results indicated good affinity for some candidates. Multivalent polymer-peptide conjugates of several peptides were synthesized by immobilization on low molecular weight linear polyglycerol. However, none of the conjugates was able to inhibit influenza strains A/X31 (H3N2) or A/PR8 (H1N1) in a hemagglutination inhibition test.