Depuis l'apparition du terme "biosensor" à travers un article de Lyons et Clark en 1962, les biocapteurs ont connu un véritable essor tant au niveau académique qu'industriel. Le principal objectif de ce travail de thèse était de créer une surface permettant l'immobilisation spécifique par liaison covalente de simple ou double brin d'ADN puis d'étudier les interactions pouvant exister entre une protéine donnée et l'ADN. Pour préparer la surface à cette immobilisation, nous avons opéré une réduction électrochimique de sel d'aryldiazoniums. Ce type de modification nous a permis de fixer de manière covalente sur la surface conductrice des fonctions de type Ar-SO2Cl. Par l'utilisation de la QCM et de l'AFM, nous avons pu par la suite détailler les mécanismes de fonctionnement de protéines (HsRad51 et Transposase) en interaction avec l'ADN simple ou double brin fixé, que ce soit d'un point de vue cinétique ou bien structural. / Since the emergence of the term "biosensor" through an article of Clark and Lyons in 1962, such devices have experienced a tremendous activity both in the academic and industries. The main objective of this thesis work was to create a surface allowing the specific immobilization of single or double DNA strand by covalent bonding and then study the interactions that may exist between a given protein and DNA. To functionalize the surface, we firstly investigated the electrochemical reduction of aryldiazoniums salt. This kind of methodology has allowed us to covalently graft Ar-SO2Cl functions over the conductive surface which can further react with DNA to immobilize it. By using the QCM and AFM methodologies, we are able to kinetically or structurally detail the intimate mechanisms of interactions between two proteins (HsRad51 and Transposase) and single or double strand DNAs.

Le système de réparation des mésappariements de l'ADN (MMR) est impliqué dans la cytotoxicité de l'agent anticancéreux cisplatine en activant une voie apoptotique. La déficience de ce système de réparation est reliée in vivo à une chimiorésistance des cellules cancéreuses au cisplatine. Afin de définir le lien entre la cytotoxicité du cisplatine et le fonctionnement du système MMR, nous avons étudié l'interaction de la protéine MutS du système MMR bactérien avec un composé de lésion du cisplatine (formé lorsqu'une base non complémentaire est incorporée en face de l'une des deux guanines platinées appartenant à l'adduit intrabrin d(GpG)). Mon travail a porté essentiellement sur i) une étude des propriétés biochimiques ATP-dépendantes de MutS en présence d'un composé de lésion du cisplatineii) une étude d'interaction entre plusieurs composés de lésion du cisplatine et la protéine HMGB1 qui est bien connue comme pouvant inhiber l'accessibilité des lésions majoritaires du cisplatine à des protéines de réparation. Notre étude a été réalisée par des techniques de biologie moléculaire, de biochimie et de spectroscopie (résonance plasmonique de surface). Nous montrons qu'un composé de lésion du cisplatine module les propriétés ATP-dépendantes de MutS, un résultat inattendu étant qu'il inhibe le relargage de MutS de l'ADN. Un composé de lésion pourrait donc jouer un rôle dans la signalisation MMR-dépendante en modulant les stades précoces de l'initiation de la réparation ce qui est en accord avec le modèle dit « de signalisation directe MMRdépendante».

Depuis l'apparition du terme "biosensor" à travers un article de Lyons et Clark en 1962, les biocapteurs ont connu un véritable essor tant au niveau académique qu'industriel. Le principal objectif de ce travail de thèse était de créer une surface permettant l'immobilisation spécifique par liaison covalente de simple ou double brin d'ADN puis d'étudier les interactions pouvant exister entre une protéine donnée et l'ADN. Pour préparer la surface à cette immobilisation, nous avons opéré une réduction électrochimique de sel d'aryldiazoniums. Ce type de modification nous a permis de fixer de manière covalente sur la surface conductrice des fonctions de type Ar-SO2Cl. Par l'utilisation de la QCM et de l'AFM, nous avons pu par la suite détailler les mécanismes de fonctionnement de protéines (HsRad51 et Transposase) en interaction avec l'ADN simple ou double brin fixé, que ce soit d'un point de vue cinétique ou bien structural.

Au cours des dernières décennies, la méthylation de l'ADN en position 5 de la cytosine est apparue comme une importante modification épigénétique qui joue un rôle essentiel dans le contrôle spécifique de l'expression des gènes. Cependant, les mécanismes impliqués dans la régulation de la méthylation de l'ADN restent incompris. Des études récentes ont montré que des protéines de type oxydases, nommées TET, peuvent catalyser l'oxydation de la 5-méthylcytosine (5mC) et générer des dérivés oxydés de celle-ci ce qui soulève la question du rôle biologique des formes oxydées de la 5mC. L'identification et la caractérisation des protéines interagissant avec ces formes oxydées devraient permettre une meilleure compréhension de la fonction de ces modifications de l'ADN et de la régulation de la méthylation de l'ADN. Dans ce projet, nous avons développé des sondes photoactivables basées sur l'ADN pour capturer, isoler et caractériser les protéines associées à ces modifications épigénétiques de l'ADN. Tout d'abord, nous avons conçu et évalué les propriétés de différentes sondes oligonucléotidiques photoactivables. Nous avons ensuite réalisé une étude méthodologique afin de caractériser au niveau moléculaire les photoadduits obtenus par MALDI-TOF. Enfin, nous avons développé une méthode de pull-down couplé à du photomarquage et associée à une analyse protéomique par spectrométrie de masse afin d’identifier les protéines ayant une affinité spécifique pour ces modifications épigénétiques. / Over the past few decades, DNA methylation at the 5-position of cytosine has emerged as an important epigenetic modification that plays essential roles in the specific control of gene expression. However, the mechanisms involved in the regulation of DNA methylation remain unclear. Recent studies have shown that oxidase proteins, called TETs, can catalyze the oxidation of 5-methylcytosine (5 mC) and generate oxidized derivatives thereof, raising the question of the biological role of the oxidized forms of 5mC. The identification and characterization of proteins interacting with these oxidized forms should allow for a better understanding of the function of these DNA modifications and the regulation of DNA methylation.In this project, we develop DNA-based photoactivatable probes to capture, isolate and characterize the proteins associated with these epigenetic DNA modifications. First, we designed and evaluated the properties of different photoactivatable oligonucleotide probes. We then carried out a methodological study in order to characterize at the molecular level the obtained photoadducts by MALDI-TOF. Finally, we developed a pull-down method coupled to photolabelling and associated with proteomic analysis by mass spectrometry to identify proteins with specific affinity for these epigenetic changes.

Le système de réparation des mésappariements de l'ADN (MMR) est impliqué dans la cytotoxicité de l'agent anticancéreux cisplatine en activant une voie apoptotique. La déficience de ce système de réparation est reliée in vivo à une chimiorésistance des cellules cancéreuses au cisplatine. Afin de définir le lien entre la cytotoxicité du cisplatine et le fonctionnement du système MMR, nous avons étudié l'interaction de la protéine MutS du système MMR bactérien avec un composé de lésion du cisplatine (formé lorsqu'une base non complémentaire est incorporée en face de l'une des deux guanines platinées appartenant à l'adduit intrabrin d(GpG)). Mon travail a porté essentiellement sur i) une étude des propriétés biochimiques ATP-dépendantes de MutS en présence d'un composé de lésion du cisplatine ii) une étude d'interaction entre plusieurs composés de lésion du cisplatine et la protéine HMGB1 qui est bien connue comme pouvant inhiber l'accessibilité des lésions majoritaires du cisplatine à des protéines de réparation. Notre étude a été réalisée par des techniques de biologie moléculaire, de biochimie et de spectroscopie (résonance plasmonique de surface). Nous montrons qu'un composé de lésion du cisplatine module les propriétés ATP-dépendantes de MutS, un résultat inattendu étant qu'il inhibe le relargage de MutS de l'ADN. Un composé de lésion pourrait donc jouer un rôle dans la signalisation MMR-dépendante en modulant les stades précoces de l'initiation de la réparation ce qui est en accord avec le modèle dit « de signalisation directe MMRdépendante».

Les enzymes de réparation de l'ADN sont des facteurs essentiels pour assurer l'intégrité du génome. Ainsi, la compréhension de la dynamique de leurs mécanismes d'interaction est capitale. NucS est une nucléase récemment découverte chez l'archée Pyrococcus abyssi, qui interagit avec des structures branchées de l'ADN à simple brin libre, appelées flaps. Sa caractérisation biochimique a mis en évidence une affinité nanomolaire pour l'ADN simple brin, avec l'existence de deux sites de liaison (site I et II) ainsi qu'une activité bidirectionnelle caractérisée par la capacité à cliver les flaps 5' et 3'. Les mécanismes qui sont à l'origine de cette activité, notamment ses modalités de chargement, de localisation et de dissociation, restent toutefois peu connus. Afin de sonder la dynamique des interactions de NucS avec son substrat, nous avons mis en place un microscope à illumination en onde évanescente permettant la détection et le suivi des événements d'interaction individuels entre la protéine marquée avec un fluorophore et un substrat d'ADN attaché à la surface. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique de colocalisation qui permet de positionner une protéine individuelle par rapport à son substrat avec une précision de 50 nm pour des durées arbitraires. Nous avons alors étudié la cinétique d'association et de dissociation des complexes NucS-ADN individuels afin de résoudre les mécanismes qui régulent l'activité de l'enzyme dans différentes conditions. Dans des conditions où le clivage est inhibé, nous avons montré que l'association était dépendante du site I, bidirectionnelle et symétrique pour les flaps 3' et 5' et que la dissociation était orientée avec une affinité supérieure pour les flap 5'. Nous avons également montré que la dissociation suivait une cinétique du premier ordre indépendante de la diffusion de NucS sur le flap. Ceci indique que, dans ces conditions non clivantes, NucS s'associe et/ou se dissocie à des positions arbitraires sur le flap. Par la suite, nous avons étudié la cinétique d'association et de dissociation du complexe NucS-ADN à 45 ◦ C en présence du cofacteur de la réparation PCNA. Nous avons démontré que PCNA augmente la vitesse d'association de NucS avec les substrats 3' et 5'. Ceci indique que PCNA agit comme une plateforme qui facilite la reconnaissance de la lésion, avec un chargement ciblé de NucS à la jonction. De plus, nous avons montré que PCNA déstabilise le complexe NucS-ADN, vraisemblablement en exerçant une force pour plier l'ADN afin d'amener l'extrémité du flap vers le site II. Dans le cas de flaps 5', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme en deux étapes, qui est indépendant de la longueur du flap. Ceci nous a permis de proposer un modèle où NucS se charge par son site I directement à la jonction, courbe le substrat pour capturer l'extrémité simple brin par le site II pour le cliver. Dans le cas d'un flap 3', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme du premier ordre ce qui est probablement dû à la rapidité de la seconde étape dans le mécanisme proposé pour les flaps 5'. Nos résultats constituent ainsi une nouvelle contribution à la caractérisation intramoléculaire des interactions NucS-ADN. Les méthodes que nous avons développées constituent en outre un moyen original pour sonder la cinétique des interactions entre biomolécules et pourront être appliquées à de multiples systèmes.

Les facteurs de transcription NikR et FUR sont impliqués dans l'homéostasie des métaux. Les propriétés de métallation et de liaison à l'ADN de NikR d'E.coli (Ec) et d'H.pylori (Hp) ont été comparées. EcNikR, protéine tétramérique, lie 8 nickels par sous unité dont un nickel dans un site dit de haute affinité ayant un Kd submicromolaire. Les autres sites métalliques, de plus basse affinité, sont impliqués dans le processus l'agrégation Ni- et pH-dépendant. HpNikR, partage des propriétés de métallation avec EcNikR, dont la liaison possible de différents métaux dans son site de haute affinité (Cu(II), Ni(II), Co(II)). Les 4 sites de haute affinité de cette protéine semblent égaux 2 à 2. La métallation des premiers sites faciliterait une « fermeture de la protéine » permettant la métallation des deux derniers sites. La métallation de ces 4 sites semble suffire pour qu'HpNikR puisse lier l'ADN.<br />Cependant cette liaison serait améliorée en présence d'un métal stabilisateur dans d'autres sites. Selon les séquences opératrices, le métal et la technique employée, l‘affinité d'HpNikR métallée pour l'ADN varie. En présence d'un excès de Ni(II), HpNikR se lie à pureA et à pnixA avec un Kd de 2,5 et 1,7 nM mais se lie faiblement à pnikR et pexbB. En présence d'un excès de Ni(II) puis de Mn(II), HpNikR se lie à pnikR et à pexbB avec un Kd de 38 et 24 nM. FUR d'H.pylori (HpFUR), un métallorégulateur Fe dépendant, a aussi été caractérisé dans le but d'étudier sa co-régulation avec HpNikR de la région intergénique nikR-exbB. HpFUR est dimérique et contient au moins deux sites métalliques : un site structural et un site de régulation permettant l'activation pour la liaison à l'ADN.

Dans cette thèse nous avons étudié quatre aspects fondamentaux de l’interaction ADN-protéine, notamment : l’affinité, la spécificité, l’accessibilité et la cinétique. En particulier, nous avons adressé les questions suivantes : comment un dimer du facteur de transcription NF-kB reconnait spécifiquement sa séquence d’ADN-cible, quelle est la rapidité de ces interactions, comment NF-kB interagit avec son site de fixation dans le contexte de la chromatine? Récemment, la spécificité de l’interaction NF-kB – ADN a reçu une attention particulière après l’observation que NF-kB peut se lier à des séquences qui n’entrent pas dans la classification de ses motifs « consensus ». Nous avons étudié la spécificité d’interaction de sept de ces motifs avec quatre dimers de NF-kB. Nos résultats montrent que le homo-dimer p50 sont les moins discriminatives et peuvent s’associer spécifiquement avec ces sept séquences. Par contre, les homo-dimers RelA se sont révélés hautement discriminatives ne pouvant pas s’associer spécifiquement avec ces séquences. Pour mesurer l’affinité de l’interaction nous avons utilisés deux méthodes distinctes : le traditionnel gel de retard (EMSA) et une nouvelle technique – « l’empreinte » au laser UV. Nos résultats montrent que le deuxième approche est plus approprié pour la mesure des constantes spécifiques de dissociation.Pour étudier la dynamique de l’interaction NF-kB – ADN, nous avons couplé l’empreinte au laser UV avec un appareil de mélange-rapide à façon. Cette combinaison nous a permis d’atteindre une résolution spatiale d’un nucléotide et temporaire de quelques millisecondes. Nous avons montré que l’homo-dimer p50 s’associe avec sa séquence-cible (MHC) H2 en suivant une cinétique à 2 pas. Le premier, de durée ~100 ms, reflète une reconnaissance initiale rapide, tandis que le deuxième, de durée ~1s, reflète une stabilisation lente du complexe. Nos expériences suggèrent aussi que les séquences voisines du site de reconnaissance jouent aussi un rôle dans la stabilisation du complexe.Finalement, nous avons étudié aussi l’accessibilité du nucléosome pour le NF-kB. Nos données in vitro montre que l’invasion spécifique de l’ADN à l’intérieure du nucléosome par NF-kB nécessite une perturbation majeure de la structure du nucléosome telle que l’éviction d’au moins un dimer d’histones H2A-H2B. / In this thesis we have attempted to study four basic aspects of DNA-protein interactions: Affinity, specificity, accessibility and kinetics. With NF-kB as our model transcription factor, we wanted to investigate how a particular dimer recognizes a specific binding sequence? How fast are these interactions? And finally, how does the NF-kB interact with it binding site in the chromatin context? Specificity of NF-kB-DNA interactions has recently come into focus after it was shown that these dimers can bind to the sequences which do not fall into the NF-kB general consensus motif. We studied seven such sequences for their specificity for four NF-kB dimers. Our results show that p50 homodimers are least discriminative and can bind specifically to all these sequences. While as, RelA homodimers were highly discriminative and did not bind to most of these nontraditional sequences. We used two different methods to measure binding affinities: traditional gel mobility shift assay (EMSA) and a novel technique called as UV laser footprinting. Our results show that UV laser footprinting is the better method to determine the binding constants.For studying the dynamics of NF-kB-DNA binding, we combined UV laser footprinting with stopped flow device. This combination, not only give us one base pair resolution but also milli-second time resolution. Using p50 homodimers as a model transcription factor, we showed that the binding of this factor follows a two-step mechanism. First step involves the fast recognition of the sequence and second step follows a slower kinetics most likely for the stabilization of the complex. Our experiments suggest that flanking sequences play a role in the recognition and stabilization process of the complex formation.Finally, we also studied the accessibility of nucleosomes to NF-kB. Our in vitro data sheds light on the in vivo requirements for the alterations in chromatin structure necessary for the productive binding of NF-kB. These include either a removal of H2A-H2B dimers from the nucleosome and/or chromatin remodeler induced relocation of the histone octamer.Our data sheds light on the in vivo requirements for the alterations in chromatin structure necessary for the productive binding of NF-kB. We hypothesize that some factors like PU.1 might be able to target the chromatin remodeling/dimer eviction machinery to particular nucleosomes and lead to productive binding of NF-kB.