Malgré les progrès réalisés dans les différentes stratégies thérapeutiques, l’efficacité des principales approches antitumorales a atteint un plateau critique dans le traitement de plusieurs cancers. Il y a donc un besoin urgent de découvrir de nouveaux composés anticancéreux innovateurs et efficaces. Surexprimée dans la plupart des cancers et indétectable dans la majorité des tissus normaux, la Survivine est une protéine multifonctionnelle qui joue un rôle clé dans le contrôle de la division cellulaire et de l’apoptose. Malgré son immense potentiel thérapeutique dans le traitement des cancers, le portfolio de la Survivine est très mince. Dans le but de développer des inhibiteurs sélectifs de la Survivine deux approches différentes ont été utilisées dans ce projet : 1) une approche par design rationnel à partir d’un ligand et 2) une approche combinatoire. Un point critique dans les fonctions de la Survivine dans les cancers est son association avec la protéine du choc thermique 90kDa (Hsp90). La Shepherdine est un peptide inhibiteur de l’interaction entre la Survivine et la Hsp90. Malheureusement, elle est dégradée rapidement et possède une perméabilité cellulaire très faible. Pour contourner ce problème, la Shepherdine a été utilisée comme référence dans une approche de design rationnel pour réaliser des études de relation structure-activité et ultimement développer des analogues synthétiques possédant des propriétés pharmacologiques améliorées. L’approche combinatoire «one-bead-one-compound» (OBOC) possède un grand potentiel pour découvrir de nouveaux ligands de la Survivine, car elle permet d’exploiter de manière optimale la diversité moléculaire accessible avec les peptides cycliques. Par contre, leur utilisation dans cette approche est limitée par les problèmes associés avec la détermination de la séquence peptidique des composés après le criblage. Pour contourner ce problème, une nouvelle approche par réouverture de cycle a été mise au point pour la synthèse et le décodage de chimiothèques OBOC de peptides cycliques. Cette nouvelle méthode servira pour la préparation d’une chimiothèque OBOC de peptides cycliques qui seront criblés pour découvrir des ligands de la Survivine et de potentiels inhibiteurs.

Les interactions protéine-protéine (PPI) sont à la base du fonctionnement cellulaire de tous les organismes. Regroupées en deux catégories, les méthodes pour étudier les PPI permettent soit d’identifier les protéines composant le complexe, soit de déterminer les relations entre les protéines. Il existe peu de méthodes hybrides permettant d’obtenir ces deux informations et ces méthodes comportent plusieurs limitations. Le but de ce projet était de développer une nouvelle méthode hybride en modifiant la complémentation de fragments protéiques (DHFR PCA) chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Le principe de la DHFR PCA repose sur l’association de deux fragments rapporteurs complémentaires en présence d’une interaction protéine-protéine. Les fragments rapporteurs sont fusionnés aux protéines via un connecteur peptidique. La longueur du connecteur limite la distance maximale à laquelle il est possible de détecter une interaction entre deux protéines. Notre hypothèse était qu’en augmentant la longueur du connecteur, nous serions en mesure de détecter des interactions plus éloignées. Nous avons d’abord vérifié que l’augmentation de la longueur du connecteur permettait de modifier notre capacité à détecter des interactions sans toutefois perdre la spécificité de la méthode. De nouvelles interactions ont été détectées à l’intérieur d’un même complexe protéique et entre deux complexes. Nous avons ensuite validé notre capacité à mieux disséquer l’architecture des complexes protéiques en approfondissant le cas de cinq complexes protéiques à l’aide de plusieurs combinaisons de longueurs de connecteurs. Enfin, nous avons confirmé que la méthode permettait effectivement de détecter des interactions entre protéines plus distantes en comparant les résultats obtenus aux distances calculées à partir des structures du protéasome disponibles. La variation apportée à la DHFR PCA permet de moduler la résolution de l’étude des PPI et ainsi de mieux définir l’architecture des complexes protéiques. / Protein-protein interactions (PPI) are central to all cellular processes in all organisms. Grouped in two categories, methods to study PPI allow either to identify proteins composing protein complexes or to determine relationships between proteins. Only a few hybrid methods can be used to obtain both of those informations and these methods present many limitations. The goal of this project was to develop a new hybrid method by modifying the Protein-fragment complementation assay (DHFR PCA) in the yeast Saccharomyces cerevisiae. DHFR PCA is based on the association of two complementary reporter fragments in presence of an interaction. Both fragments are fused to proteins with a peptide linker. Linker length limits the maximal distance at which it is possible to detect an interaction between two proteins. Our hypothesis was that increased linker length would allow the detection of more distant interactions. We first verified if the augmentation of linker length modified our capacity to detect interactions without losing specificity. New interactions were detected inside and between complexes. Then, we validated our capacity to better dissect protein complexes architecture by studying five protein complexes with different linker length combinations. Finally, we confirmed that the method allowed the detection of interactions that were further in space by comparing our results with distances calculated with available proteasome structures. This variation of DHFR PCA allows to modulate the resolution of PPI study and thus better define protein complexes architecture.

Les protéines sont les machines moléculaires permettant à la cellule d’accomplir des fonctions biologiques. Pour accomplir ces fonctions, les protéines interagissent souvent entre elles de manière réversible et régulable, ce qui permet à la cellule de s’adapter rapidement à un environnement souvent instable en modulant ces interactions. Par conséquent, l’étude de la dynamique des interactions protéine-protéine est essentielle pour comprendre comment les cellules s’adaptent à diverses perturbations. Les deux chapitres de ce mémoire illustrent respectivement le développement d’une méthode pour identifier et quantifier des modulations d’interactions protéine-protéine en réponse à des perturbations environnementales et comment ces interactions peuvent être utilisées pour disséquer le réseau de régulation d’une protéine phosphatase, la calcineurine, à l’aide de perturbations génétiques. Ensemble, ces deux chapitres illustrent comment l’utilisation d’approches de perturbation du réseau d’interactions protéine-protéine permet de disséquer des processus cellulaires complexes. / Proteins are the molecular machines allowing the cell to accomplish a myriad of biological functions. To do so, proteins physically interact with each other in a reversible and tunable way, providing the cell a mechanism to quickly adapt to a changing environment. Thus, studying the dynamics of protein-protein interactions is key in understanding how cells adapt to various perturbations. The chapters included in this thesis illustrate the development of a method to identify and quantify changes in protein-protein interactions in response to environmental perturbations and how protein-protein interactions can be used as reporters to dissect the regulatory network of a protein phosphatase, calcineurin, using a network perturbation approach. Together, these two chapters illustrate the utility of network perturbation approaches to dissect complex cellular processes.

Streptococcus thermophilus est la seconde bactérie lactique la plus utilisée en transformation laitière. Comme toutes les bactéries, elle peut être infectée par des virus appelés bactériophages ou phages. Les phages représentent un risque significatif en transformation laitière puisqu'ils sont ubiquitaires et peuvent mener à des produits fermentés de qualité inférieure. L'étude de la biologie des phages lactiques et de leurs mécanismes de réplication est nécessaire à la prévention et au contrôle de leur prolifération dans les procédés industriels. En général, les gènes viraux qui sont exprimés dès le début de l'infection sont les plus susceptibles d'encoder des protéines qui interagissent avec des composantes de la bactérie. Chez le phage 2972, plus de la moitié de ces gènes dits précoces n'ont pas de fonction connue. Le principal objectif de cette maîtrise était donc de débuter la caractérisation des protéines virales encodées par certains de ces gènes. Puisque la nature du ou des partenaires d'interaction d'une protéine est souvent directement liée à la fonction de cette dernière, nous avons travaillé au développement de méthodes servant à investiguer les interactions protéine-protéine entre le phage 2972 et sa souche hôte S. thermophilus DGCC7710. Les méthodes adaptées sont basées sur la purification d'affinité avec les étiquettes de type Strep-III® ou s'inspirent de la méthode du BioID. Pour la réalisation de certaines approches, le phage 2972 a dû être modifié génétiquement à l'aide du système CRISPR-Cas de type II-A naturellement présent chez sa bactérie hôte. La caractérisation de quelques-uns de ces phages modifiés génétiquement nous a permis de vérifier ou de formuler des hypothèses qui concernent les relations phage-hôte et la résistance aux phages chez S. thermophilus. L'extraction du protéome bactérien est une étape importante dans l'étude des interactions protéine-protéine. La lyse de notre bactérie modèle, soit DGCC7710, a représenté un défi inattendu dans le développement de notre méthode. En effet, cette bactérie à Gram positif s'est avérée résistante à plusieurs techniques standard de lyse. Toutefois, nous avons démontré que les endolysines, des enzymes utilisées par les phages pour lyser la bactérie en fin d'infection, peuvent être purifiées et utilisées pour la lyse de la souche DGCC7710. Finalement, nous avons travaillé à résoudre la structure de différentes protéines de fonction inconnue du phage 2972 par cristallographie à rayons X. Bien que la structure d'aucune des protéines à l'étude n'ait encore été résolue, nos essais laissent croire qu'une protéine précoce de 2972 interagit avec des acides nucléiques. / Streptococcus thermophilus is one of the most widely used bacterium in the dairy transformation industry. This bacterium is primarily used in the production of yogurt and speciality cheeses such as mozzarella. Like all bacteria, strains of S. thermophilus can be infected by bacterial viruses commonly known as bacteriophages or phages. Phages are ubiquitous and represent a significant risk for the dairy industry as they can greatly impact the quality of fermented dairy products. The study of phage biology is crucial for the development of efficient phage control methods in dairy factories. In general, early expressed phage genes encode viral proteins that are the most likely to interact with host molecules. More than half of such early expressed genes encode proteins of unknown function in lactic phage 2972. The main objective of this thesis was to investigate the function of some of these viral proteins. Because the nature of the binding partner of a given protein often reflects its function, we are developing methods based on affinity purification for the study of protein-protein interactions between the phage 2972 and its host S. thermophilus DGCC7710. Our methods are based on affinity purification with Strep-III® tags or inspired from BioID. In order to achieve some of our objectives, we genetically modified the genome of phage 2972 using the endogenous type II-A CRISPR-Cas system of DGCC7710. The characterization of some of these genetically modified phages gave us insights on phage-host relationships and phage resistance in S. thermophilus. In developing our methods, the proteome extraction of S. thermophilus cells were surprisingly challenging. Indeed, this Gram-positive bacterium was resistant to many standard lysis techniques. Here, we show that purified phage endolysins are very efficient in lysing the strain DGCC7710. Endolysins are phage enzymes that lyse their bacterial host at the end of the phage lytic cycle. Finally, we worked on solving the structure of different proteins of unknown function encoded in the genome of phage 2972 by X-ray crystallography. While we have yet to solve any structure, we observed that one of the early-expressed protein of phage 2972 interacts with nucleic acids.

A l'interface avec la cellule hôte, la vacuole parasitophore du parasite intracellulaire Toxoplasma gondii comprend plusieurs systèmes membranaires, dont un réseau de nanotubes formé suite à la sécrétion de la protéine de granules denses GRA2. Mes travaux ont montré, par des approches biochimiques, que les protéines GRA membranaires forment des complexes oligomériques qui pourraient expliquer leur solubilité dans les granules denses et lors de leur sécrétion dans la vacuole. Par des approches moléculaires et cellulaires, j'ai analysé l'importance relative des trois hélices alpha-amphipatiques de GRA2 dans son association post-sécrétoire au réseau de nanotubes, via la liaison potentielle de la protéine à des phosphoinositides, et dans la tubulation du réseau induite par GRA2. Ces travaux ont permis de proposer un modèle d'interaction de GRA2 avec les membranes et de formation des tubules membranaires du réseau de nanotubes.

Le virus de l'hépatite C (HCV) est un virus à ARN qui synthétise ses nouveaux génomes dans les cellules hôtes infectées grâce à une ARN polymérase ARN dépendante (RdRp), appelée NS5B. Cette polymérase a été pendant longtemps une cible majeure dans la recherche d'antiviraux contre l'hépatite C. Aujourd'hui, de nombreux antiviraux ont été approuvés dans le traitement de l’hépatite C ciblant différentes protéines virales, entre autre, NS5B. Le sofosbuvir qui cible le site actif de NS5B est un antiviral qui a démontré une efficacité extraordinaire dans le traitement anti-HCV.Durant ces dernières années, les recherches sur NS5B ont permis de caractériser cette protéine, à la fois structuralement et biochimiquement. La richesse des connaissances ainsi accumulées fait de NS5B un excellent modèle pour les RdRp des virus à ARN.Toutefois, peu d'études portent sur le mécanisme d’acheminement et de sélection des ribonucléotides au site actif de NS5B, et de façon générale, sur la description atomique du mécanisme de réplication assuré par NS5B, qui implique deux dications magnésium pour la catalyse comme chez toutes les polymérases de cette famille.Durant ce travail, nous avons exploité les données structurales issues de complexes ternaires (NS5B+RNA+nucleotide) obtenus en 2015 par cristallographie à l'échelle atomique. Nous avons utilisé ces structures pour mener des études de modélisation moléculaire, essentiellement par dynamique moléculaire afin d’aborder la question de l'acheminement des nucléotides vers le site actif de NS5B.Nous avons eu recours à la fois à des méthodes de dynamiques moléculaires classiques et des méthodes de dynamiques moléculaires dites biaisées telles que différentes méthodes de dynamiques moléculaires dirigées (SMD et TMD) et la dynamique moléculaire accélérée (aMD).Nos résultats indiquent que l’acheminement du nucléotide au site actif associé à un magnésium Mg(B) est contrôlé tout au long du tunnel par différents éléments de NS5B. Initialement, le nucléotide se lie à une région proche de la boucle qui surplombe le tunnel lui permettant, grâce aux interactions qu’il établit avec sa partie triphosphate, de s’orienter base en avant. Ensuite, le nucléotide atteint un point de contrôle formé essentiellement par le motif F3 (R158) et le motif F1(E143). Le nucléotide reste lié à ce site jusqu’à l’arrivée du second dication magnésium (Mg(A)) qui provoque des réarrangements structuraux, notamment au niveau du motif F3, entrainant l’avancée du nucléotide vers le site actif. Une fois ce point de contrôle passé, le nucléotide interroge alors la base du brin d’ADN matrice sans s’insérer entièrement dans le site actif.Nos simulations ont clairement établi que les dernières étapes d’entrée du nucléotide sont finement régulées par l’arrivée du second dication magnésium qui a donc un rôle de coordinateur en plus de son rôle connu dans la catalyse.Ce mécanisme d’entrée semble être spécifique aux RdRp virales et permet de comprendre pourquoi les analogues de nucléotides peuvent être aussi efficaces contre les virus à ARN. / The hepatitis C virus is an RNA virus that synthesises its new genomes in the infected host cells thanks to an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) termed NS5B. This polymerase has been a prime target for antiviral therapy. Numerous direct antiviral drugs are now approved in the HCV treatment and allow very high rates of treatment success. These drugs target among others the HCV NS5B RdRp with the sofosbuvir being one of the most successful drugs.Tremendous efforts have been made in the past decades to characterize NS5B, in particular structurally and biochemically. However, there is little information about the molecular mechanisms of NS5B ribonucleotides entry and selection and in general on the atomistic details of the RNA replication mechanism, although the involvement of two magnesium dications in catalysis is well established in this family of polymerases. Since 2015, structures of ternary complexes of NS5B have been resolved by crystallography offering very valuable details about the binding of nucleotides at the NS5B active site.In this work, we took advantage of these structural data to address the ribonucleotides entry and to further explore the nucleotide addition cycle in NS5B using molecular modelling and molecular dynamics simulations. We used both conventional molecular dynamics techniques and biased simulations that enhance sampling such as Steered Molecular Dynamics (SMD), Targeted Molecular Dynamics (TMD) or accelerated Molecular dynamics (aMD).Based on our modelling results, we found that the access to the active site through the nucleotides tunnel is checked by successive NS5B elements. First, the entering ribonucleotide together with an associated magnesium Mg(B) binds next to a loop that overhangs the nucleotide tunnel and interactions with its triphosphate moiety orient it base-first towards the active site. Second, the ribonucleotide encounters a checkpoint constituted by the residues of motif F3(R158) and motif F1(E143) where it is blocked until the arrival of a second magnesium ion, the Mg(A). This allowed the motif F3 to undergo small structural rearrangements leading to the advancement of the nucleotide towards the active site to interrogate the RNA template base prior to the complete nucleotide insertion into the active site.Our simulations pointed out that these dynamics are finely regulated by the second magnesium dication, thus coordinating the entry of the correct magnesium-bound nucleotide with shuttling of the second magnesium necessary for the two-metal ion catalysis. This entry mechanism is specific to viral RdRps and may explain why modified ribonucleotides can be so successful as drugs against RNA viruses.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les phospholipides sont à la base de l’architecture de la membrane plasmique bactérienne. La composition de celle-ci est en permanence contrôlée par les conditions extérieures afin d’adapter sa fluidité et maintenir l’homéostasie. Les différentes étapes de la voie de biosynthèse des phospholipides dans la membrane interne de E. coli sont bien connues. En revanche, on connaît peu l’organisation supramoléculaire et la régulation génétique des enzymes, ce qui correspond aux deux grands axes de recherche développés dans cette thèse.Des études par double hybride bactérien ont mis en évidence un réseau d’interactions protéine-protéine,suggérant l’existence d’un complexe formé par les enzymes de la synthèse des phospholipides dans la membrane. Pour tester cette hypothèse, j’ai voulu étudier ces interactions en conditions natives, en utilisant des techniques comme le FRET, le BRET ou la purification TAP. Pour cela, j’ai développé de nouvelles cassettes permettant la construction systématique de souches de E.coli produisant des protéines étiquetées avec des rapporteurs fluorescents ou des tags d’affinité, en condition d’expression physiologique. Ceci m’a permis d’étudier la localisation et la stoechiométrie des enzymes de synthèse des phospholipides dans la membrane.J’ai également étudié la régulation en réponse au stress du gène plsB, qui code pour la première enzyme de la voie de biosynthèse des phospholipides, et de dgkA, qui code pour une diacylglycerolkinase permettant le recyclage des phospholipides. Ces deux gènes, divergents sur le chromosome,sont régulés de façon antagoniste en réponse à trois types de stress : le facteur de réponse au stress extracytoplasmique σE active plsB et inhibe dgkA; le système à deux composants BasRS active dgkAet inhibe plsB ; la réponse stringente active dgkA et inhibe plsB. Ces résultats montrent que le locusplsB-dgkA est finement régulé par toute une série de régulateurs qui intègrent des signaux de stress multiples afin de contrôler l’activité de la voie de biosynthèse des phospholipides / Phospholipids are the building blocks of the bacterial plasmic membrane. The composition of the membrane is continuously controlled by environment conditions, in order to adapt its fluidity and maintain the homeostasis. The enzymatic steps of the phospholipid synthesis pathway in the intermembrane of E. coli are well known. However, little is known about the supramolecular organizationand the genetic regulation of the enzymes catalyzing these reactions, these questions constituting the two main axes developed in this thesis.Two-hybrid studies have evidenced a network of protein-protein interactions, suggesting the existence of a membrane protein complex formed by phospholipid synthesis enzymes. To test this hypothesis, I wanted to assay these interactions in native conditions, by using techniques such as FRET, BRET or Tandem Affinity Purification. Toward this goal, I have developed novel cassettes permitting tosystematically construct E. coli strains that produce proteins tagged with fluorescent or affinity tags,under physiological expression. This allowed me to study the localization and stoechiometry of phospholipid synthesis enzymes in the membrane. Furthermore, I have studied the regulation in response to stress of the plsB gene that codes for the firstenzyme of the phospholipid synthesis pathway, and of dgkA that codes for a diacylglycerol kinase that recycles phospholipids. These two neighboring and divergent genes are inversely regulated in response to three stress responses: the extracellular stress σE factor activates plsB and inhibits dgkA; the two componentsystem BasRS activates dgkA and inhibits plsB; stringent response activates dgkA andinhibits plsB. These results show that the plsB-dgkA locus is regulated by a series of regulators that integrate multiple stress signals, in order to control the activity of the phospholipids synthesis pathway

Les interactions protéine–protéine (IPP) jouent un rôle primordial dans les processus physiologiques. L’inhibition de ces interactions ouvre la voie à la conception de nouvelles molécules à visée thérapeutique. Les structures secondaires en hélice α sont fréquemment impliquées dans les interactions entre protéines auxquelles elles peuvent contribuer de manière significative. La conception de molécules, mimant ce motif de reconnaissance et pouvant interagir avec la protéine cible tout en inhibant la reconnaissance avec le partenaire naturel, représente une voie innovante pour trouver de nouveaux candidats médicaments. Les oligomères d’urée aliphatique, une classe de foldamères qui adoptent une structure secondaire en hélice bien définie et proche de l’hélice α, ont été proposés comme mimes d’hélice α pour inhiber les IPP. Au cours de cette thèse, nous nous sommes d’abord intéressés à la conception de foldamères d’oligourée et de chimères oligoamide/oligourée pour cibler des surfaces de protéine. Nous avons sélectionné le récepteur nucléaire de la vitamine D (VDR) comme modèle d’étude en raison de son intérêt thérapeutique, et des connaissances structurales disponibles. Les protéines partenaires de VDR (coactivateurs) interagissant via une courte région structurée en hélice α, nos recherches ont portés sur des mimes d’hélices inspirés des séquences de coactivateurs. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à la génération et à l’étude de dimères covalents de foldamères, qui pourraient être utilisés pour couvrir des surfaces d’interaction plus larges. En effet, les interactions protéine-protéine montrent souvent un mode d’interaction plus complexe qu’une simple hélice, faisant intervenir des structures tertiaires et quaternaires de type coiled coils, qui peuvent aussi servir de point de départ pour la conception de nouvelles classes d’inhibiteurs. / Protein-protein interactions (PPI) have a key role in physiological processes. The inhibition of these PPI may lead to new therapeutic strategies. Secondary structures in α-helix are frequently involved in protein interactions where they may contribute significantly to binding. Designing molecules which mimic the helical motif for protein surface recognition and inhibition of the natural partner represents an innovative path to discover new drug candidates. Aliphatic urea oligomers, a class of foldamers that adopt a well-defined H-bonded helical secondary structure with good similarity to the α-helix have been proposed as possible α-helix mimics to inhibit protein-protein interactions. The first part of this PhD project was dedicated to the design and synthesis of oligoureas and oligourea/α-peptide chimeras for specific protein surface recognition. We have selected the vitamin D receptor as a potential target, mainly because (i) it is therapeutically relevant; (ii) its protein partner (coactivators) interact through a short region which adopts an α-helical structure upon binding and (iii) structures at atomic resolution were available to enable the design of effective mimetics. In the second part, we investigated methods to generate foldamer covalent dimers that could potentially be used to cover larger interaction surfaces. The rationale is that the binding interface is often more complex than a single helix and may involve tertiary and quaternary structures such as coiled coils which in turns may also serve as a basis for the design of new classes of inhibitors.

Le cytosquelette bactérien des homologues d’actine (protéines de la famille MreB) joue un rôle majeur dans la morphogénèse cellulaire. Des homologues de MreB sont retrouvés chez la plupart des espèces bactériennes non sphériques, où ils sont essentiels pour la viabilité cellulaire. Les bactéries à Gram-positif ont généralement plusieurs isoformes. L’organisme modèle Bacillus subtilis en possède trois : MreB, Mbl et MreBH, tous trois impliqués dans la détermination de la forme de la cellule. Le postulat actuel est une organisation, des complexes de synthèse du peptidoglycane, le long des parois latérales par les filaments hélicoïdaux des MreB-like. Cependant, les mécanismes moléculaires et les protéines effectrices impliqués dans cette fonction ne sont pas encore élucidés. Par analogie avec les rôles de l’actine eucaryote, des implications dans d’autres processus cellulaires cruciaux et la présence de partenaires protéiques sont également attendus pour les actines procaryotes. Afin d’explorer les rôles des protéines MreB chez B. subtilis nous avons généré, par des criblages génomiques double hybride chez la levure, un réseau d’interaction protéine-protéine centré sur MreB, Mbl et MreBH. Une vérification systématique et drastique de toutes les interactions obtenues lors des criblages a été réalisée afin d’éliminer les faux positifs. Les interactions identifiées révèlent des liens entre les protéines MreB-like et seize protéines issues de catégories fonctionnelles variées ou de fonction inconnue. Une étude exploratoire a été menée pour huit des protéines partenaires par des approches in silico et in vivo et nous a permis de sélectionner une seule interaction à caractériser plus en détail. Nous nous sommes principalement intéressés à l’interaction physique et directe entre MreB et DapL, une protéine essentielle vraisemblablement impliquée dans la voie de biosynthèse des précurseurs du peptidoglycane, par analogie à DapE d’E. coli. La caractérisation approfondie de DapL a confirmé son essentialité dans la synthèse du peptidoglycane. Bien que l’interaction MreB-DapL ait été confirmée biochimiquement, son rôle biologique exact n’a pas été élucidé. Cependant, nous avons mis en évidence d’autres interactions entre MreB et DapG, LysA et MurE, des enzymes également impliquées dans les étapes précoces de la synthèse du peptidoglycane. L’existence de telles interactions renforce le rôle du cytosquelette MreB de B. subtilis dans l’orchestration des machineries de synthèse de la paroi cellulaire. / Bacterial actin homologues (MreB proteins) play a major role in cell morphogenesis in non-spherical bacteria. The prevailing model postulates that helical, membrane-associated MreB-like filaments organize elongation-specific peptidoglycan-synthesizing complexes along the sidewalls. However, the mechanistic details, as well as the effector proteins of MreBs morphogenetic function, remain to be elucidated. MreB proteins are also involved in DNA segregation, cell polarity, cell motility and, by analogy to eukaryotic actins, possibly in other functions that require the targeting and accurate positioning of proteins and molecular complexes in the cell. Gram-positive bacteria usually have more than one MreB isoform. Our model organism, Bacillus subtilis, has three called MreB, Mbl and MreBH. To explore the roles of the MreB cytoskeleton in B. subtilis, we used genome-wide yeast two-hybrid screens to identify proteins that physically associate with MreB, Mbl and MreBH. Stringent specificity assays were systematically performed to remove false positives and confirm the specificity of all potential interactions identified in the screens. A protein-protein interaction network centered on the three MreBs was generated which includes 16 protein partners. This interaction network provides insights into the links of MreB proteins with proteins belonging to several functional categories as well as proteins of unknown function. An exploratory study was conducted in silico and in vivo for 8 of the partner proteins identified in the network and allowed us to select one interaction for a more in-depth analysis. We next focused in the physical interaction between MreB and DapL, an essential protein presumably involved in the early steps of peptidoglycan biosynthesis. The characterization of DapL confirmed its essential role in cell wall synthesis. The MreB-DapL interaction was confirmed biochemically and we showed that MreB also associates with other proteins involved in the synthesis of the PG precursors (DapG, LysA and MurE). Together, these results suggest that B. subtilis MreB orchestrates the PG biosynthetic cytosolic machineries to achieve and maintain its rod shape.