Comprendre les interactions réalisées entre un candidat médicament et sa protéine cible est un enjeu crucial pour orienter la recherche de nouvelles molécules. En effet, ce processus implique de nombreux paramètres qu'il est nécessaire d'analyser séparément pour mieux comprendre leurs effets.Nous proposons ici deux nouvelles approches observant les relations protéine/ligand. La première se concentre sur la comparaison de cavités formées par les sites de liaison pouvant accueillir une molécule. Cette méthode permet d'inférer la fonction d'une protéine mais surtout de prédire " l'accessibilité " d'un site de liaison pour un médicament. La seconde tactique se focalise sur la comparaison des interactions non-covalentes réalisées entre la protéine et le ligand afin d'améliorer la sélection de molécules potentiellement actives lors de criblages virtuels, et de rechercher de nouveaux fragments moléculaires, structuralement différents mais partageant le même mode d'interaction.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les protéines sont au coeur de la vie. Ce sont d'incroyables nanomachines moléculaires spécialisées et améliorées par des millions d'années d'évolution pour des fonctions bien définies dans la cellule. La structure des protéines, c'est-à-dire l'arrangement tridimensionnel de leurs atomes, est intimement liée à leurs fonctions. L'absence apparente de structure pour certaines protéines est aussi de plus en plus reconnue comme étant tout aussi cruciale. Les protéines amyloïdes en sont un exemple marquant : elles adoptent un ensemble de structures variées difficilement observables expérimentalement qui sont associées à des maladies neurodégénératives. Cette thèse, dans un premier temps, porte sur l'étude structurelle des protéines amyloïdes bêta-amyloïde (Alzheimer) et huntingtine (Huntington) lors de leur processus de repliement et d'auto-assemblage. Les résultats obtenus permettent de décrire avec une résolution atomique les interactions des ensembles structurels de ces deux protéines. Concernant la protéine bêta-amyloïde (AB), nos résultats identifient des différences structurelles significatives entre trois de ses formes physiologiques durant ses premières étapes d'auto-assemblage en environnement aqueux. Nous avons ensuite comparé ces résultats avec ceux obtenus au cours des dernières années par d'autres groupes de recherche avec des protocoles expérimentaux et de simulations variés. Des tendances claires émergent de notre comparaison quant à l'influence de la forme physiologique de AB sur son ensemble structurel durant ses premières étapes d'auto-assemblage. L'identification des propriétés structurelles différentes rationalise l'origine de leurs propriétés d'agrégation distinctes. Par ailleurs, l'identification des propriétés structurelles communes offrent des cibles potentielles pour des agents thérapeutiques empêchant la formation des oligomères responsables de la neurotoxicité. Concernant la protéine huntingtine, nous avons élucidé l'ensemble structurel de sa région fonctionnelle située à son N-terminal en environnement aqueux et membranaire. En accord avec les données expérimentales disponibles, nos résultats sur son repliement en environnement aqueux révèlent les interactions dominantes ainsi que l'influence sur celles-ci des régions adjacentes à la région fonctionnelle. Nous avons aussi caractérisé la stabilité et la croissance de structures nanotubulaires qui sont des candidats potentiels aux chemins d'auto-assemblage de la région amyloïde de huntingtine. Par ailleurs, nous avons également élaboré, avec un groupe d'expérimentateurs, un modèle détaillé illustrant les principales interactions responsables du rôle d'ancre membranaire de la région N-terminal, qui sert à contrôler la localisation de huntingtine dans la cellule. Dans un deuxième temps, cette thèse porte sur le raffinement d'un modèle gros-grain (sOPEP) et sur le développement d'un nouveau modèle tout-atome (aaOPEP) qui sont tous deux basés sur le champ de force gros-grain OPEP, couramment utilisé pour l'étude du repliement des protéines et de l'agrégation des protéines amyloïdes. L'optimisation de ces modèles a été effectuée dans le but d'améliorer les prédictions de novo de la structure de peptides par la méthode PEP-FOLD. Par ailleurs, les modèles OPEP, sOPEP et aaOPEP ont été inclus dans un nouveau code de dynamique moléculaire très flexible afin de grandement simplifier leurs développements futurs. / Proteins are at the center of life. They are formidable molecular nanomachines specialized and optimized during million years of evolution for well-defined functions in the cell. The structure of proteins, meaning the tridimensional setting of their atoms, is closely related to their function. Absence of structure for a subset of proteins is also recognized to be as crucial. Amyloid proteins is a striking example : they fold into an ensemble of various structures hardly observable experimentally that are associated with neurodegenerative diseases. This thesis, firstly, is on the study of the structural ensemble of the amyloid proteins amyloid-beta (Alzheimer) and huntingtin (Huntington) during their folding and aggregation. Our results describe in details, with an atomic resolution, the characteristic interactions present in the structural ensemble of these two proteins. Concerning the amyloid-beta protein (AB), our results show the structural differences between three of its physiological forms during its first aggregation steps in an aqueous environment. We have then compared these results with those obtained during the past few years by several other research groups using various experimental and simulation protocols. Clear trends come out of this comparison regarding the influence of AB physiological form on its structural ensemble during its first aggregation steps. Their distinct aggregation pathways are rationalized by the identified differences. For their part, the identified similarities offer targets for therapeutical compounds disrupting the aggregation of the neurotoxic oligomers. Concerning the huntingtin protein, we identify the structural ensemble of its functional region at its N-terminal in an aqueous environment and in a phospholipid membrane. In agreement with the available experimental results on the global structure of this region in aqueous solution, our results reveal the dominant interactions, at an atomic precision, in its structural ensemble as well as the influence of its neighboring regions. We have also characterized the stability and the growth of nanotube-like structures that could occur during the aggregation of the amyloid region of huntingtin. Moreover, we have developed, in collaboration with a group of experimentalists, a precise model describing the main membrane interactions of huntingtin N-terminal, which serves as a membrane anchor that controls the localization of huntingtin in the cell. Secondly, this thesis is on the refinement of a coarse-grained model (sOPEP) and on the development of a new all-atom model (aaOPEP) that are both based on the coarse-grained OPEP force field, commonly used to study protein folding and amyloid protein aggregation. The goal behind the optimization of these models is to improve the de novo structure prediction of the PEP-FOLD method. These three models -- OPEP, sOPEP and aaOPEP -- are now also implemented in a new molecular dynamics software that we have developed specifically to greatly ease their future developments.

L'interaction non-covalente entre un ligand et un récepteur selon un modèle clé-serrure constitue une des bases essentielles de tout système biologique. La présence de multiples clés et serrures sur les biomolécules conduit à des interactions multivalentes. Les lectines sont très fréquemment structurées en homo-multimères et sont donc des cibles de choix pour l'étude des interactions avec des structures multivalentes glycosylées. Ligands et récepteurs multivalents peuvent obéir à plusieurs mécanismes d'association conduisant à des profils thermodynamiques et cinétiques permettant de rationnaliser les améliorations spectaculaires d'affinité souvent observées. L'utilisation de ligands de faible valence et de petite taille permet une présentation contrôlée des sucres au travers d'une structure unique bien définie. Ces glycoclusters sont des plateformes adaptées à l'étude de l'influence de la topologie de la présentation des sucres sur l'interaction. La synthèse de glycoclusters a été optimisée selon une voie convergente de glycosylation puis de couplage par CuAAC permettant la synthèse de structures multi-glycosylées telles que des calix[4]arènes de différentes conformations, des peptoïdes linéaires et cycliques ou encore des porphyrines. Ces ligands ont été évalués par quatre techniques d'analyse des interactions (HIA, ELLA, SPR, ITC) principalement en présence de la lectine PA-IL de Pseudomonas aeruginosa mais également avec la Galectine-1 humaine et la lectine d'Erythrina cristagalli (légumineuse). Des glycoclusters de seconde génération ont été ensuite été préparés avec l'objectif d'optimiser les composantes enthalpiques et entropiques de l'interaction. Les résultats indiquent que de légères modifications de la présentation des sucres peuvent induire des mécanismes d'association différents. La conception de structures rigidifiées a révélé des profils thermodynamiques contre-intuitifs qui ont pu être modélisés. Par cette étude, plusieurs ligands ont montré des affinités sans précédent pour la lectine PA-IL. Le meilleur ligand multivalent de première génération a confirmé un potentiel thérapeutique prometteur in vivo. / Following Fischer's “lock-key“ concept, non-covalent interactions between a ligand and its receptor is one of the most fundamental process of any biological system. The presence of multiple keys and locks at the surface of many biomolecules leads to multivalent interactions. Lectins are appropriate partners for the study of multivalent interactions with multivalent glycoconjugates since lectins are generally organized as homomultimers. Association of ligands and receptors can occur through several mechanisms leading to distinct thermodynamic and kinetic patterns. Thermodynamic and kinetic parameters often rationalize the impressive affinity improvement observed in the context of multivalent interactions. Small and low valency multivalent ligands provide a neat organization of carbohydrates through a single well-defined structure. These glycoclusters are appropriate probes for studying the influence of the overall topology on the interaction. Glycocluster synthesis was optimized according to a convergent strategy consisting of a glycosidation reaction followed by multiple CuAAC couplings. This strategy yielded a library of glycoclusters based on conformers of calix[4]arenes, linear and cyclic peptoids and porphyrins scaffolds. Glycoclusters were evaluated thanks to a combination of four biochemical techniques (HIA, ELLA, SPR, ITC) mainly versus PA-IL, a tetrameric lectin from Pseudomonas aeruginosa. Further investigations of these ligands were performed with a plant lectin from Erythrina cristagalli and with human galectin-1. Second generation glycoclusters were prepared in order to optimize enthalpic and entropic contributions to the interaction. Results indicate that a slight modification of the glycocluster topology could induce different mechanisms. The design of glycoclusters with stiffened linkers highlights unexpected entropic patterns. Molecular modeling of these linkers provided rationalization of these entropic patterns on the basis of Boltzmann distribution. This work present glycoclusters with an unprecedented affinity for PA-IL. The best first generation glycocluster confirmed promising therapeutic potentialities in vivo.

L’étude des transitions structurales dans les protéines est d’un intérêt crucial car ces transformations sont impliquées dans de nombreux processus biologiques essentiels. De tels phénomènes structuraux peuvent être à l’origine de propriétés remarquables dans les protéines flexibles ou désordonnées, propriétés difficilement accessibles par les techniques structurales usuelles. Le marquage de spin couplé à la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) est une technique bien adaptée pour l’étude de ces transitions structurales. L’insertion d’un radical nitroxyde sur une cystéine, naturelle ou introduite par mutagenèse dirigée, située à un endroit clé de la protéine permet d’obtenir des informations locales sur les changements structuraux éventuels provoqués par l’ajout d’un partenaire.Cette technique a été appliquée à deux systèmes biologiques comportant un degré de flexibilité différent. La flexibilité de la protéine chaperon NarJ, intervenant dans la biogenèse du complexe Nitrate Réductase de la bactérie Escherichia coli, a été étudiée en présence de son peptide partenaire. Ces études ont permis d’une part de déterminer le site d’interaction et d’autre part, de montrer que l’association des deux partenaires entraîne un verrouillage dans une conformation préférentielle de NarJ. Le deuxième sujet d’étude est la protéine CP12 de Chlamydomonas reinhardtii, intervenant dans la régulation d’un complexe supramoléculaire du cycle de Calvin. La CP12 s’apparente à une protéine intrinsèquement désordonnée, ayant la particularité de posséder des cystéines naturelles et fonctionnelles. Le marquage classique a permis de mettre en évidence un nouveau rôle de son partenaire et de montrer que la CP12 garde un caractère désordonné dans le complexe. Par ailleurs, cette protéine a servi de système d’étude pour développer une nouvelle stratégie de marquage sur Tyrosine et démontrer sa faisabilité. / The study of structural transitions in proteins is of crucial interest because these transformations are involved in many biological processes. Such structural phenomena can be the source of remarkable properties in flexible or disordered proteins, properties hardly accessible by conventional structural techniques. Site-directed spin labeling combined with electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) is a technique well suited for the study of these structural transitions. The insertion of a nitroxide reagent on a cysteine, natural or introduced by site-directed mutagenesis, located in a key position of a protein provides local information on possible structural changes induced by the addition of a partner. This technique was applied on two biological systems with a different degree of flexibility. The flexibility of NarJ, a chaperon protein involved in the biogenesis of the complex nitrate reductase of Escherichia coli was studied in the presence of its peptide partner. These studies enabled us to determine the interaction site and to show that the association of the two partners induced a locked conformation of NarJ. The second system is the CP12 protein of Chlamydomonas reinhardtii, involved in the regulation of a supramolecular complex of the Calvin cycle. CP12 shares some similarities with the intrinsically disordered protein but having natural and functional cysteines. The conventional labeling allowed us to highlight a new role of its partner and to demonstrate that CP12 remains disordered in the complex. Moreover, this protein was used as a model system to develop a new labeling strategy on tyrosine and to demonstrate its feasibility.

La méthode de conception de médicaments à partir de molécules « fragments » (connue sous le nom de « Fragment-Based Drug Design ») a été proposée au milieu des années 90, et a depuis été reconnue comme une alternative tangible aux techniques plus classiques de recherche de médicaments telles que le criblage à haut débit par exemple. La méthode des fragments consiste à cribler un petit nombre (< 10000) de composés organiques de faible poids moléculaire (< 300 Da) afin de détecter ceux qui se lient à la cible (protéine ou acides nucléiques). Du fait de leur faible complexité, les fragments présentent une affinité faible pour la cible, et la détection s'effectue généralement grâce à une technique biophysique (en particulier, résonance magnétique nucléaire (RMN), cristallographie aux rayons X, résonance plasmonique de surface). Les fragments « hits » sont ensuite modifiés par addition de nouvelles fonctions chimiques, ou par liaison de deux fragments, afin d'élaborer, étape par étape, une molécule capable d'établir des interactions plus nombreuses avec la cible, et d'améliorer ainsi l'affinité. Comparée aux méthodes classiques de criblage haut débit, la méthode des fragments offre divers avantages, notamment une meilleure exploration de l'espace chimique, une meilleure efficacité de liaison des molécules « hits », et une plus grande facilité d'optimisation des hits en molécules plus affines. Dans le cadre de ce projet de thèse, plusieurs aspects de la méthode des fragments ont été abordés : dans une première partie, nous étudions un cas concret d'application de la méthode des fragments à la recherche d'un inhibiteur de la peroxiredoxine 5 humaine, en utilisant la RMN comme outil de criblage des fragments ainsi que comme outil d'étude des interactions protéine-fragment. La découverte d'un inhibiteur de cette enzyme représente une avancée importante, qui devrait permettre de mieux comprendre son fonctionnement. Les autres parties de ce projet de thèse abordent des aspects plus méthodologiques de la méthode des fragments : les fragments conservent-ils leur site de liaison, leur efficacité de liaison et leur mode d'interaction au cours de leur élaboration en inhibiteur ? Les fragments peuvent-ils être spécifiques d'une protéine ? D'un site de liaison particulier ? Ces questions, rarement traitées, sont pourtant essentielles à la compréhension du comportement des molécules fragments, et sont abordées d'une part en défragmentant plusieurs inhibiteurs de la protéine Bcl-xL et en étudiant par RMN le comportement de ces fragments vis-à-vis de la protéine en termes d'affinité et de site de liaison, d'autre part en réalisant le criblage par RMN d'une série de fragments sur cinq protéines différentes (peroxiredoxine 5 humaine, sérum albumine humaine et trois protéines homologues de la famille Bcl-2). De manière générale, ce projet de thèse vise à étudier des aspects peu abordés de la méthode des fragments et à proposer des pistes permettant de mieux comprendre le comportement des fragments vis-à-vis de leur cible, au cours du criblage initial comme lors de leur optimisation / Fragment-Based Drug Design (FBDD) has been proposed in 1996 and has since been recognized as a tangible alternative to the more classical drug discovery methods such as High-Throuput Screening. FBDD consists of screening a small number (< 10 000) of low-molecular weight (< 300 Da) compounds and detect those that bind to the target (protein or nucleic acids). Because of their low complexity, fragment molecules usually display low affinities for their target, hence detecting fragment-protein interactions is mostly achieved using a biophysical technique (mostly Nuclear Magnetic Resonance (NMR), X-ray crystallography or Surface Plasmon Resonance). “Hit” fragments are then modified by addition of chemical substituents, or linked together, so as to elaborate a more complex molecule, forming more interactions with the target and hence displaying an improved affinity. As compared to the more classical High Throughput Screening method, fragment screening provides several advantages, including a better exploration of chemical space, highly ligand-efficient hits and easier optimization of the hits into more affine molecules. In this PhD project, several aspects of FDBB have been addressed : first, FBDD approaches were applied to the research of an inhibitor of the human peroxiredoxin 5 protein, using NMR not only as a screening method but also for the characterization of the protein-fragment interactions. The discovery of an inhibitor against this enzyme would allow to better understand its function. Next, methodological aspects of the FBDD method were addressed : Do fragments conserve their binding site, binding efficiency and mode of interaction upon optimization? Can the fragments display specificity towards a given target? Towards a given binding site? These issues, rarely studied, are yet essential to the understanding of the behavior of fragment molecules, and will be addressed firstly by defragmentating several Bcl-xL inhibitors into fragments and studying their behavior towards the protein in terms of a_nity and binding mode, secondly by screening a set of fragments against five different proteins (human peroxiredoxin 5, human serum albumin and three homologous proteins of the Bcl-2 family of proteins). More generally, this PhD project aims at studying less characterized aspects of the fragment methodology and proposing answers to better understand the behavior of fragment molecules towards their targets, both in the initial screening step and then during their optimization

Le nombre considérable d'interactions protéine-protéine (PPIs) existant au sein d'un organisme, ainsi que leur implication cruciale dans la vie cellulaire et dans de nombreuses pathologies, font des PPIs un immense réservoir de cibles potentielles pour la recherche de médicaments. Les PPIs sont aujourd'hui sur le devant de la scène grâce au développement de méthodologies innovantes et la validation récente de molécules chimiques modulant ces interactions dans des essais précliniques.L'étude des modulateurs d'interactions protéine-protéine (PPIM), a des implications tant dans la recherche fondamentale que thérapeutique. Les PPIMs peuvent aider à la compréhension des réseaux d'interactions. Elles permettront également de faire émerger de nouvelles familles d'agents thérapeutiques actifs dans diverses pathologies.Mon travail de thèse a principalement porté sur deux aspects de l'étude de l'inhibition des PPIs. D'une part, l'étude de l'implication des divers paramètres physicochimiques gouvernant une PPI dans sa capacité à être modulée (étude dite de la « druggabilité »), m'a amené à participer à la création d'une base de données structurale des interactions protéine-protéine : 2P2IDB (http://2p2idb.cnrs-mrs.fr/). D'autre part, j'ai contribué à l analyse de l'espace chimique des molécules présentes dans la base de données 2P2IDB. Nous avons défini la « Rule Of 4 » comme ligne de conduite pour caractériser ces molécules. Nous avons de plus utilisé le SVM afin de créer un protocole innovant (2P2IHUNTER) qui nous a permis de filtrer de grandes collections de composés afin de créer des chimiothèques dédiées aux PPIs. / The number of protein-protein interactions (PPIs) existing in an organism, and their crucial implication in cellular life and in many pathologies, demonstrates the importance of PPIs as a large reservoir of potential targets for medicinal research. Neglected for a long time by both pharmaceutical companies and academic laboratories because they were historically classified as difficult targets, PPIs are now getting into the groove due to the development of innovative methodologies and the growing number of small molecule compounds modulating these interactions.The study of PPI modulators has implications in both fundamental and therapeutics research. On the one hand, PPI modulators can be used in basic research to decipher the role of PPIs in biological networks. On the other hand, they represent a valuable source of new families of therapeutic agents in pathologic processes.In the first part of my PhD, I contributed to the development of a structural database dedicated to protein-protein interactions: 2P2IDB (http://2p2idb.cnrs-mrs.fr/). The interface descriptors of protein-protein interfaces which are typical of complexes present in 2P2IDB have been used to develop a qualitative scoring function to assess the ‘druggability' of PPI targets.In the second part of my PhD, I contributed to the analysis of the chemical space of PPI inhibitors present in the 2P2I database using chemoinformatics tools. We defined the ‘Rule-of-4' as a guideline to characterize these compounds. We have used support vector machine approaches to elaborate a protocol: 2P2IHUNTER, which allows filtering large collection of compounds to design chemical libraries dedicated to PPI targets.

Les interactions protéines-carbohydrates sont à la base de nombreux processus biologiques physiologiques aussi bien que pathologiques. Ces interactions incluent la synthèse et la dégradation enzymatique des oligosaccharides, la cohésion des tissus, l'immunité, le cancer ou encore l'infection bactérienne et virale. L'inhibition de ce type d'interaction par des molécules multivalentes synthétiques telles les glycopolymères, glycodendrimères, glycoclusters, etc. fait l'objet d'études importantes depuis plusieurs décennies. L'obtention de telles molécules pourrait permettre de développer de nouvelles thérapies qui pourraient palier notamment la multi-résistance aux antibiotiques. De plus, la détection de telles interactions par des méthodes simples et faciles à mettre en oeuvre permettrait une amélioration de la compréhension de ces phénomènes, ainsi que le diagnostic rapide de la présence de microorganismes. C'est dans ce contexte, que nous avons développé une nouvelle classe de composés glycosylés multivalents à coeur triazine. Ces glycoclusters de basse valence, ont la particularité de présenter une double fonctionnalité : l'inhibition d'interactions lectine-sucre par des effets de multivalence ainsi que la détection de ces interactions. Nous présentons dans ce manuscrit, la synthèse d'une nouvelle famille de glycoclusters polysulfurés à coeur triazine portant des épitopes saccharidiques tels que D-glucose, D-galactose, D-mannose, L-fucose, ainsi que leurs évaluations biologiques réalisées sur des lectines de Pseudomonas aeuriginosa. Nous avons ainsi mis en évidence la possibilité de reconnaître et de détecter les interactions lectine-sucre dans un premier temps par association d'un cluster mixte portant un fluorophore, et de façon plus sophistiquée, grâce à un système à géométrie variable incorporant dans le scaffold même un switch photochimique variant l'arrangement des sucres dans l'espace / Protein-carbohydrate interactions mediate a wide range of biochemical processes. Amongst these is the process of bacterial infection, which often proceeds through carbohydrate-binding lectins involved in biofilm formation. Even if the individual associations result from weak interactions, the assembly of multiple carbohydrate-protein interactions, typically more than additive, confers to the system the required specificity and avidity for their biological functions. In order to study this « glycocluster effects », a number of scaffold systems presenting multivalent carbohydrate ligands have been prepared in the literature. Dendrimers, polymers, peptides, calixarenes, to name a few, have been used as core molecules for the synthesis of multivalent glycoconjugates. The purpose of this work is to design new glycoclusters which exhibit dual functionality: the inhibition of carbohydrate-protein interactions via a multivalency effect; and detection of the interactions via fluorescence spectroscopy. A first generation of polysulfurated glycoclusters, organized around a heteroaromatic core, was synthesized using click chemistry reactions, which provided a family of highly soluble and readily accessible clusters. The glycoclusters were evaluated for their ligand-lectin interactions, multivalency effects, thermodynamic parameters, and abilty to modulate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa, a major causative agent of lung infections in cystic fibrosis patients. We describe a new family of ‘switchable glycoclusters’ based on photochromic behavior. They are designed to generate a modulated fluorescence signal as well as a defined change in the three-dimensional arrangement of the sugar epitopes, and may eventually provide significantly improved probes for studying the distribution, dynamics, interactions, and activities of specific lectins

Au cours des dernières années, le développement de nouvelles thérapies contre les infections bactériennes a suscité un grand intérêt face à l’émergence des nombreuses souches résistantes aux antibiotiques. Le point de départ de cette recherche de nouveaux antibiotiques, pour lesquels les bactéries n’ont pas encore acquis de mécanismes de résistance, est l’identification de nouvelles cibles cellulaires. En 2000, des études génétiques ont identifié engA, un gène bactérien dont le produit est une GTPase, comme une cible pharmacologique pertinente: elle est essentielle à la survie cellulaire, conservée au sein des bactéries et absente chez les eucaryotes.Puisque EngA agit comme un facteur d’assemblage pour le ribosome bactérien, un de nos objectifs a été de développer un test de criblage pour identifier des inhibiteurs des interactions EngA-ribosome. Ces interactions sont modulées par des changements conformationnels d'EngA, qui sont eux-mêmes déclenchés par la fixation de différents nucléotides dans le domaine catalytique. Cependant, les liens entre ces différents changements restent encore méconnus. Nous avons utilisé une approche multi-technique pour étudier ces questions et obtenir des informations utiles pour l’optimisation de notre test de criblage.Des analyses de SAXS et protéolyse limitée ont démontré un changement conformationnel en solution après adition de nucléotides di- ou tri-phosphate. La comparaison des données avec des modèles cristallographiques d'EngA a confirmé la conformation de la protéine liée au GDP. Cependant, la conformation de la protéine liée au GTP ne correspond à aucune structure connue. Des essais d’interaction ont démontré que la fixation de différents nucléotides au niveau des domaines catalytiques régule l’interaction d'EngA avec le ribosome. En outre, les effets des nucléotides se produisent en utilisant des fortes concentrations, ce qui suggère que le rôle d'EngA dans la biogenèse du ribosome peut être contrôlé par la concentration intracellulaire de nucléotides. Les travaux visant la détermination de la structure d'EngA dans sa conformation liée au GTP par cristallographie nous ont permis d’obtenir la structure d’EngA dans différentes formes cristallines. Cependant, ces structures représentent la conformation liée au GDP. L’analyse de l’empilement des cristaux a montré des contacts intermoléculaires conservés qui peuvent stabiliser cette conformation pendant la nucléation. Des mutations spécifiques permettant la rupture de ces contacts peuvent éventuellement aider à promouvoir la cristallisation de conformations alternatives. Des analyses de cryo-microscopie électronique ont débuté afin d’obtenir la structure du complexe EngA:50S de chez B. subtilis. Des résultats préliminaires montrent une carte de densité électronique à 6.4 Å de résolution. L’interprétation de ces résultats est en cours. / The development of new therapeutics against bacterial infections has aroused great interest over the last years in the context of drug resistance. The starting-point in the pursuit of new antibiotics for which bacterial resistance mechanisms do not exist is the identification of novel cellular targets. Genetics studies in the early 2000s have identified engA as a conserved bacterial gene whose product is a GTPase that could represent a potential drug target: it is conserved among bacteria, essential for cell survival, and absent in humans.Since EngA acts as an assembly factor for the bacterial ribosome, one of our aims was to develop an assay to screen inhibitors of the EngA-ribosome interactions. These interactions are modulated by EngA conformational changes that are in turn triggered by the binding of different nucleotides to the catalytic G-domain. As the interplay between all these events in bacteria is still not resolved, we have used a multi-technique approach to explore these questions in order to obtain useful information for the setting up of a robust screening assay.SAXS and limited proteolysis showed a conformational change occurring in solution upon addition of either di- or tri-phosphate nucleotides. While model validation analysis confirmed the GDP-bound conformation, the GTP-bound state does not match any known EngA structure. Binding studies have revealed modulation of interactions by different nucleotide-bound states. Furthermore, response to nucleotides occurs at high concentrations, suggesting that the role of EngA in promoting ribosome assembly could be monitored by the intracellular nucleotide concentration. Efforts on identifying the GTP-bound state 3D structure by crystallography have resulted in EngA structures in different crystal forms. Although all the obtained structures represent the GDP-bound state, packing analysis has revealed conserved crystal contacts that can potentially stabilise this conformation during nucleation. Specific mutations aiming at disrupting these contacts may help to promote crystallisation of alternative conformations. Cryo-EM investigation has been initiated in order to obtain the structure of the B. subtilis EngA:50S complex. So far, an electron density map at 6.4 Å resolution has been obtained and its interpretation is underway.

UHRF1 est une protéine nucléaire responsable du maintien et de la régulation de l'épigénome des cellules. Elle favorise la prolifération cellulaire et est surexprimée dans la plupart des cancers. TIP60, l'un des partenaires le plus important d’UHRF1, est impliqué dans le remodelage de la chromatine et la régulation transcriptionnelle grâce à son activité acétyltransférase. Ensemble, les deux protéines régulent la stabilité et l'activité d'autres protéines telles que la DNMT1 et la p53. Le but de cette étude était d'explorer le mécanisme d'interaction entre UHRF1 et TIP60 en visualisant cette interaction dans les cellules. La microscopie par imagerie à temps de vie de fluorescence et d'autres techniques de biologie moléculaire ont été utilisées. Les résultats ont montré que UHRF1 interagit directement avec le domaine MYST de TIP60 et cette interaction se produit dans la phase S du cycle cellulaire. Les deux protéines ont également montré une réponse similaire aux dommages à l'ADN, ce qui prédit une cohérence dans leur fonction dans le mécanisme de réparation de l'ADN. La surexpression de TIP60 a également induit la baisse du niveau d’UHRF1 et de DNMT1 ainsi qu’une induction d'apoptose dans les cellules ce qui suggère un rôle de TIP60 dans la régulation des fonctions oncogéniques d’UHRF1. / UHRF1 is a nuclear protein maintaining and regulating the epigenome of cells. Its promotes proliferation and is found upregulated in most of cancers. TIP60 is one of the important interacting partner of UHRF1 and is involved in chromatin remodeling and transcriptional regulation through its acetyltransferase activity. Together they regulate the stability and activity of other proteins such as DNMT1 and p53. The aim of this thesis was to explore the mechanism of interaction between UHRF1 and TIP60 by visualizing this interaction in cells. Fluorescent lifetime imaging microscopy and other molecular biology techniques were employed for this purpose. Results of this study showed that UHRF1 interacts directly to the MYST domain of TIP60 and this interaction prevails in the S-phase of cell cycle. Both proteins also showed a similar response to DNA damage predicting a coherence in their function in DNA repair mechanism. Overexpression of TIP60 also downregulated UHRF1 and DNMT1 and induced apoptosis in cells suggesting a role of TIP60 in regulation of oncogenic functions of UHRF1.