Le développement de molécules ciblant les surfaces d'interaction protéine-protéine constitue l'un des enjeux majeurs de la recherche scientifique académique et des industries pharmaceutiques de cette dernière décennie. A ces fins, nos travaux ont été consacrés à la conception, à la synthèse et à la caractérisation de nouveaux mimes de surfaces sur châssis. Le squelette de ce dernier est un cyclodécapeptide RAFT, pouvant présenter deux surfaces d'adressage indépendantes. La fonction de ciblage est assurée par la présentation de quatre peptides greffés par voie d'assemblage combinatoire sur la face supérieure du RAFT. De cette manière, il sera possible d'obtenir toutes les combinaisons de surfaces à partir des éléments constitutifs permettant un ciblage efficace des surfaces protéiques. L'architecture à présentation multiple a été synthétisée de manière convergente par formation hautement chimiosélective de liens éthers d'oximes, stables in vitro et in vivo. Nous avons synthétisé des substrats linéaires présentant certains motifs identiques ainsi que des substrats cycliques, contraints par la présence d'une liaison dissulfure, de séquences globalement identiques mis à part en deux positions où l'incorporation de résidus (Lys, Asp, Phe, Ser) leur confère des propriétés diverses (charges, natures...). L'utilisation de ces éléments s'inscrit dans deux approches de ciblage distinctes à savoir la réalisation de mimes de la surface de reconnaissance de l'hormone GnRH et la réalisation de surfaces pour un ciblage plus général de surfaces protéiques. L'utilisation des méthodes CLHP et LC-MS pour l'analyse des banques de produits obtenues a permis leur totale caractérisation. Enfin, la réalisation des premières évaluations biologiques sur ces mélanges vis-à-vis de plusieurs cibles (hormone GnRH, avidine, interface SHC-Grb2) a donné des résultats encourageants.

La cellule est un milieu très concentré où les interactions entre macromolécules, même faibles, jouent un grand rôle dans leur solubilité et dans l'assemblage des complexes labiles assurant les fonctions biologiques. Les interactions faibles entre protéines déterminant la non-idéalité de leurs solutions vont aussi gouverner leur cristallisation.<br />Dans quelle mesure les interactions protéine – solvant influencent-elles les interactions protéine – protéine ? Nous avons mis en relation ces deux types d'interactions pour la malate déshydrogénase (Hm MalDH) de Haloarcula marismortui, protéine halophile très acide qui a des solvatations variées et très riches en eau et en sel.<br />Nous avons développé une nouvelle méthode de détermination du second coefficient du viriel A2 par la modélisation des profils de vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique, qui permet l'étude de solvants complexes.<br />Les interactions protéine – protéine de la Hm MalDH en divers sels ont été caractérisées par diffusion de neutrons ou de rayons X aux petits angles. Les A2 et les facteurs de structure en solution ont été modélisés par des potentiels d'interaction de type DLVO. Les interactions répulsives sont principalement dues au terme de volume exclu et dans une moindre mesure au terme électrostatique. Les interactions attractives sont qualitativement corrélées à des valeurs positives ou négatives des paramètres d'interaction préférentielle avec le sel. Ces résultats permettent d'expliquer l'adaptation moléculaire des protéines halophiles qui doivent ainsi avoir une solvatation riche en sel pour rester soluble à haut sel.<br />La cristallisation par dilution de la Hm MalDH dans des mélanges sel – MPD (méthyl-2-pentanediol-2,4) résulte d'une lente évolution des interactions protéine – protéine, de répulsives à modérément attractives. Le MPD modifie les interactions protéine – protéine en divers sels en ajoutant une attraction qui est liée à la répulsion du MPD par les charges de la protéine.

L'excitation nerveuse d'une cellule musculaire produit une libération massive dans le cytoplasme du Ca2+ stocké dans le réticulum sarcoplasmique (RS). L'augmentation de la concentration cytoplasmique de Ca2+ déclenche la contraction. Ce processus, appelé couplage excitation contraction (CEC), requiert des interactions physiques entre deux canaux calciques : (1) le récepteur des dihydropyridines (DHPR), un canal calcique activé par le voltage ; le DHPR est composé de plusieurs sous-unités, dont la sous-unité α1S, qui forme le canal et le détecteur de potentiel, et la sous-unité β1a, entièrement cytoplasmique; (2) le récepteur à la ryanodine (RyR1) responsable de la libération de Ca2+ hors du RS. La sous unité β1a interagit avec la sous-unité α1S et RyR1. Au cours de ma thèse, j'ai identifié de nouveaux déterminants moléculaires et structuraux de l'interaction DHPR/RyR1. J'ai ainsi démontré l'existence d'interactions intramoléculaires entre les différentes boucles cytoplasmiques de la sous-unité α1S du DHPR, centrées autour d'un domaine appelé domaine A. J'ai également localisé le site d'interaction de la cavéoline-3 sur une boucle cytoplasmique de la sous-unité α1S. L'étude de l'interaction de la sous-unité β1a avec RyR1 a montré (1) que la région C-terminale de β1a contrôle cette interaction, (2) que l'affinité apparente de β1a pour RyR1 est fortement augmentée par l'interaction de β1a avec α1S et (3) que l'interaction β1a/RyR1 régule la fermeture du RyR. L'utilisation d'une toxine, la maurocalcine (MCa) qui se comporte comme un analogue du domaine A m'a permis d'identifier un domaine minimal de RyR1 responsable de la fixation de la MCa et du domaine A. Une étude structurale par RMN de ce site a été réalisée. Enfin, j'ai étudié l'effet de la MCa sur des myotubes n'exprimant pas la sous-unité α1S. J'ai montré que la MCa est capable de restaurer, en absence de DHPR, une augmentation de la concentration de Ca2+ cytoplasmique induite par la dépolarisation de la membrane plasmique.

Les protéines impliquées dans les voies de signalisation sont souvent activées et inactivées par des interactions de faible affinité. En particulier, les domaines protéiques liant spécifiquement de courts fragments protéiques permettent une régulation intra- et inter-moléculaire efficace des domaines catalytiques auxquels ils sont associés. Citons par exemple les domaines FHA ou des tandems BRCT fréquemment impliqués dans les réponses aux dommages de l'ADN. Etant donnée leur importance dans les réseaux d'interactions et dans la signalisation cellulaire, la prédiction par bioinformatique des propriétés de liaison de ces petits domaines constitue un enjeu majeur. Toutefois, les stratégies bioinformatiques sont jusqu'à présent limitées par des difficultés méthodologiques associées aux caractéristiques intrinsèques de ces domaines. Leurs séquences sont souvent très divergentes et les affinités pour leurs cibles physiologiques sont généralement faibles malgré une excellente spécificité. Le travail présenté dans cette thèse a donc pour objectif de dépasser les limites actuelles des outils de prédictions pour développer de nouvelles méthodologies bioinformatiques performantes. Trois points ont été plus particulièrement abordés : (i) la prédiction de la structure tridimensionnelle de ces domaines ; (ii) la prédiction des sites reconnus par ces domaines lorsque les partenaires sont connus ; (iii) la prédiction des motifs spécifiquement reconnus par ces domaines sur la base de leur structure tridimensionnelle.

Les œstrogènes (E2), via le récepteur aux œstrogènes (ER), contrôlent l'expression de nombreux gènes impliqués dans la croissance, la différenciation cellulaire et les fonctions reproductrices. La régulation de ces gènes résulte de la fixation du ER sur une séquence d'ADN : Elément de Réponse aux Œstrogènes (ERE). ER joue un rôle majeur dans le cancer du sein, il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires qui modulent in vivo son activité. Nous observons que, comparé à l'EREconsensus, les ER présentent une affinité vis-à-vis d'un EREimparfait (rtvtgERE), une activité cellulaire et une sensibilité à E2 plus faible. Une étude in vitro du comportement conformationnel, thermodynamique et dynamique des ER a démontré un rôle du réseau électrostatique au sein des ER dans leurs différences de fonctionnalité. Nous avons recherché et comparé l'impact de la liaison au ligand sur l'activité cellulaire de deux ER : hERalpha et rtERS. La reconstitution de leur mécanisme d'action chez la levure a montré que hERalpha est un facteur d'activation de la transcription plus puissant que rtERS et qu'il est plus sensible à E2. Nous observons aussi que la présence de ligand induit une relocalisation des ER au sein de foci. Une étude cinétique de l'activation transcriptionnelle et de la relocalisation subcellulaire des ER en présence de ligand nous pousse à distinguer ces deux aspects. Nous suggérons qu'un fort niveau de phosphorylation de ER par les kinases activées en présence de ligand, augmente son caractère anionique conduisant à empêcher sa fixation à l'ADN ou à l'en dissocier. Ainsi, ER pourrait être recruté par des complexes dans le noyau ou dans le cytoplasme et formé ces foci.

Les travaux réalisés portent sur la conception de ligands protéiques capables de cibler le site catalytique des métalloprotéases matricielles (MMPs) grâce à une méthode d'ingénierie développée au laboratoire qui repose sur le greffage de motifs fonctionnels. Le motif fonctionnel choisi correspond aux 4 résidus N-terminaux du TIMP-2, un inhibiteur naturel des MMPs. Des plates-formes protéiques possédant des motifs d'acides aminés dans une topologie similaire à celle du motif de référence dans le complexe TIMP-2/MMP-14 ont été identifiées par criblage systématique de la PDB à l'aide du logiciel STAMPS (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Dix candidats ligands satisfaisant les contraintes topologiques, stériques et de similarité électrostatique avec le ligand naturel TIMP-2 ont été sélectionnés. Ces ligands ont été produits par synthèse chimique ou par voie recombinante puis leur capacité à inhiber une série de 6 MMPs a été évaluée. Les résultats indiquent que tous les ligands protéiques conçus in silico sont capables de lier les sites catalytiques des MMPs avec des constantes d'association allant de 450 nM à 590 mM, sans optimisation supplémentaire. La caractérisation structurale par diffraction X de 2 variants d'un de ces ligands protéiques a permis de montrer que les interactions établies par le motif 1-4 dans ces ligands étaient similaires à celles observées dans le complexe TIMP-2/MMP-14, avec cependant des différences dans la géométrie de certaines d'entre elles. Des études de simulation par dynamique moléculaire ont également permis de mettre en évidence de possibles différences dans la géométrie et la stabilité de certaines des interactions reproduites dans les 10 plates-formes, pouvant contribuer aux affinités modestes observées pour ces ligands. Cependant, les résultats obtenus montrent que la méthode de conception in silico utilisée est capable de fournir une série de ligands protéiques de 1ère génération ciblant de manière spécifique un site catalytique d'intérêt avec un bon rendement. Cette méthode pourrait constituer la 1ère étape d'une approche hybride de conception in silico de ligands combinée à des techniques de sélection expérimentales.

Longtemps considéré comme un composé toxique, le sélénium est maintenant<br />largement reconnu comme oligo-élément essentiel. Des carences alimentaires ont été<br />associées à de nombreuses pathologies.<br />La sélénocystéine est la forme biologique principale du sélénium. Cet acide aminé particulier<br />est spécifiquement incorporé dans les sélénoprotéines grâce à une machinerie traductionnelle<br />dédiée en réponse à un codon UGA, traditionnellement reconnu comme un codon stop.<br />A ce jour, la fonction moléculaire de la plupart des sélénoprotéines demeure inconnue. Parmi<br />celles-ci figure la sélénoprotéine N (SePN), une nouvelle protéine à sélénium identifiée en<br />1999 dans notre laboratoire par une approche bioinformatique.<br />En 2001, il a été démontré que des mutations dans le gène SEPN1 codant pour SePN étaient<br />responsables de différentes pathologies musculaires regroupées dorénavant sous le terme de<br />myopathies apparentées à la sélénoprotéine N.<br />Au début de ma thèse, peu de choses étaient connues sur la fonction de SePN. Pour<br />comprendre son rôle, nous avons entrepris son étude selon différentes approches.<br />Dans un premier temps, j'ai contribué à montrer que SePN est une glycoprotéine de 65kDa,<br />associée aux membranes du réticulum endoplasmique. Ensuite, des approches biochimiques<br />successives ont permis de mettre en évidence son interaction avec différentes protéines de la<br />membrane, et dont l'identification est en cours.<br />Dans un deuxième temps, nous avons mis au point deux modèles animaux des pathologies<br />musculaires associées à un dysfonctionnement de SePN. Par une approche antisens, il a été<br />observé que l'inhibition de l'expression de SePN au cours du développement embryonnaire<br />chez le poisson zèbre entraînait une altération de l'organisation du tissu musculaire.<br />Parallèlement, tirant avantage du système Cre-Lox, nous avons obtenu des souris invalidées<br />pour SEPN1 dans tout l'organisme ou de façon tissu spécifique dans le muscle. De façon<br />surprenante, les animaux ainsi obtenus ne présentent pas de phénotype apparent, même si les<br />analyses histologiques préliminaires permettent d'observer un profil dystrophique classique<br />des fibres musculaires. En outre, les animaux semblent présenter une sensibilité accrue au<br />stress oxydatif induit. L'exploration fonctionnelle de ce modèle est poursuivie au laboratoire<br />et fait l'objet de plusieurs collaborations.<br />Enfin, une autre étude entreprise au cours de ma thèse concerne une mutation pathologique du<br />gène SEPN1 conduisant à l'apparition de myopathies chez l'homme. Par une approche<br />originale déduite du mécanisme atypique de traduction des sélénoprotéines, une stratégie qui<br />pourrait aboutir à terme à une thérapie génique pour certains patients a été mise au point.<br />L'ensemble de ces travaux va permettre d'augmenter nos connaissances sur le rôle de<br />la sélénoprotéine N dans le muscle ainsi que sur la fonction biologique de l'oligo-élément<br />sélénium dans ce tissu. Le but ultime de l'ensemble de ces travaux est de développer des<br />outils de diagnostic ainsi que des approches thérapeutiques ciblées.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

En l’absence de structures tridimensionnelles expérimentales des cytochromes P450 CYP26A1, CYP26B1 et CYP26C1, la caractérisation de leur substrats et ligands s’est basée sur l’analyse des modèles structuraux obtenus par modélisation par homologie avec la structure expérimentale du cytochrome P450 CYP120. La justesse des modèles a été validée par l’amarrage de l’acide rétinoïque all-trans dans des configurations compatibles avec les métabolites attendus. L’amarrage d’agonistes et d’antagonistes des récepteurs nucléaires RARs prédirent l’acide tazaroténique (TA) et l’adapalène comme des substrats potentiels. Les expériences in vitro confirmèrent la métabolisation de ces 2 médicaments par les CYP26s. L’analyse de la cinétique de sulfoxidation du TA par CYP26A1 and CYP26B1 a permis d’établir le TA comme la référence contrôle de l’activité de ces enzymes. Puis, la comparaison des modèles des CYP26s avec la structure cristalline de CYP2C8 a permis d’identifier des similarités structurales de leurs inhibiteurs. Une corrélation entre l’inhibition de CYP26A1 et de CYP2C8 par des inhibiteurs connus de CYP2C8 a été démontrée après détermination de leurs IC50 pour CYP26A1 et CYP26B1 en utilisant le TA comme substrat de référence. La mesure de l’inhibition in vitro fut ensuite utilisée pour évaluer la possibilité que les CYP26s soient impliquées dans des interactions médicamenteuses observées pour certaines molécules. Cette thèse caractérise et appuie le rôle encore mal connu des CYP26s dans la métabolisation in vivo de certains xénobiotiques ainsi que l’effet potentiel de leur inhibition qui favoriserait la survenue d'effets indésirables. / Without crystal structures to study the CYP26 family of drug metabolizing enzymes, homology models were used to characterize CYP26A1, CYP26B1 and CYP26C1 and to identify substrates and inhibitors of the enzymes. Computational models of each isoform based on structural homology to CYP120 were validated by docking all-trans retinoic acid, an endogenous ligand of CYP26. Docking of retinoic acid receptor agonists and antagonists suggested that tazarotenic acid (TA) and adapalene may be metabolic substrates for CYP26, data which was confirmed using in vitro metabolite identification assays. Phenotyping experiments determined that CYP26s played a major role in the metabolism of these compounds in vitro. The kinetics of TA sulfoxidation by CYP26A1 and CYP26B1 were characterized and the compound was proposed as an in vitro probe of CYP26 activity in single enzyme expression systems. Structural characterization efforts identified similarities between the CYP26 homology models and the known crystal structure of CYP2C8, in agreement with previously published reports. Using TA as a probe, the IC50’s of known CYP2C8 inhibitors was measured against CYP26A1 and CYP26B1, with a statistically significant correlation observed between CYP26A1 and CYP2C8. Additional in vitro and computational experiments were used to characterize the inhibition mechanism for the most potent inhibitors. The observed in vitro inhibition was then used to predict the likelihood of CYP26 inhibition being involved in clinically relevant drug interactions. As a whole, the results presented support the role of the CYP26s in the metabolism of xenobiotic compounds as well as in potential in vivo drug interactions.

Comprendre les interactions réalisées entre un candidat médicament et sa protéine cible est un enjeu crucial pour orienter la recherche de nouvelles molécules. En effet, ce processus implique de nombreux paramètres qu’il est nécessaire d’analyser séparément pour mieux comprendre leurs effets.Nous proposons ici deux nouvelles approches observant les relations protéine/ligand. La première se concentre sur la comparaison de cavités formées par les sites de liaison pouvant accueillir une molécule. Cette méthode permet d’inférer la fonction d’une protéine mais surtout de prédire « l’accessibilité » d’un site de liaison pour un médicament. La seconde tactique se focalise sur la comparaison des interactions non-covalentes réalisées entre la protéine et le ligand afin d’améliorer la sélection de molécules potentiellement actives lors de criblages virtuels, et de rechercher de nouveaux fragments moléculaires, structuralement différents mais partageant le même mode d’interaction. / Understanding the interactions between a drug and its target protein is crucial in order to guide drug discovery. Indeed, this process involves many parameters that need to be analyzed separately to better understand their effects.We propose two new approaches to observe protein/ligand relationships. The first focuses on the comparison of cavities formed by binding sites that can accommodate a small molecule. This method allows to infer the function of a protein but also to predict the accessibility of a binding site for a drug. The second method focuses on the comparison of non-covalent interactions made between the protein and the ligand to improve the selection of potentially active molecules in virtual screening, and to find new molecular fragments, structurally different but sharing the same mode of interaction.