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Interfaces électrochimiques appliquées à l'étude de composés d'intérêt biologique : application à l'étude de l'interaction entre cytochrome c et cardiolipide / Electrochemical interface for studying compounds of biological interest : application to the interaction between cytochrome c and cardiolipinPerhirin, Antoine 20 December 2012 (has links)
L’objectif de cette thèse était de mettre au point une interface électrochimique afin de caractériser les interactions entre le cytochrome c (cyt c), une protéine mitochondriale, et le cardiolipide (CL), un phospholipide présent dans les membranes des mitochondries. Le cyt c, dont la fonction est le transport d'électrons dans la chaîne respiratoire, est connu pour interagir avec le CL. Précédemment, un mécanisme d'accroche du cyt c sur une membrane contenant du CL a été mis en évidence par la théorie de l’« extented lipid anchorage ». Cette théorie prévoit, outre des interactions électrostatiques entre le CL (chargé négativement) et le cyt c (chargé positivement), des interactions hydrophobes issues de l'insertion d'une chaîne grasse du CL dans le cyt c. La nature particulière de la partie hydrophobe du CL, quatre chaines grasses dont la composition est très homogène, nous a amenés à émettre des hypothèses sur la présence d'interactions spécifiques entre le cyt c et différents types de chaines du CL. Dans le cadre de mes travaux, des techniques électrochimiques ont été utilisées pour étudier ces interactions. Une électrode de carbone vitreux a été modifiée par un dépôt de phosphatidylcholine (PC) et de CL en proportion 80/20 (mol/mol). Cette électrode modifiée au CL permet l'étude de l'électrochimie du cyt c. Nous avons montré que l’électroactivité du cyt c nécessite la présence de CL sur l'électrode modifiée, le cyt c étant électroinactif sur une électrode modifiée uniquement avec de la PC. De plus, le CL permet de retenir le cyt c à la surface de l'électrode. C'est la première fois que l'effet de « lipid anchorage » a été identifié sur une électrode modifiée. Une méthode électrochimique plus adaptée à l'étude des protéines adsorbées (AC voltamétrie) a été utilisée afin de caractériser les cinétiques de transfert électronique du cyt c. Par cette méthode, deux sous-populations de cyt c adsorbés ont été caractérisées. La sous-population 1 de cyt c, qui est majoritaire, possède un potentiel redox proche du potentiel du cyt c en solution (0V vs SCE). Sa vitesse de transfert électronique est de l'ordre de 20s-1. La sous-population 2, qui compte pour environ 10% du cyt c adsorbé total, possède un potentiel décalé vers les valeurs négatives (-0.15V vs SCE) et une vitesse de transfert électronique supérieure à la sous-population 1 (environ 500s-1). Afin de mieux cerner le type d'interaction dans ces deux sous-populations, l'effet d'une solution de forte force ionique (0.5M KCI), du pH, du calcium, de la classe de phospholipide ou de l'origine du cyt c a été testé. Ces expériences ont démontré que la sous-population 1 comporte des interactions de type électrostatiques et nécessite la présence d'un phospholipide ayant un motif glycérol terminal (comme le CL ou la PG), La nature de l'interaction protéine-lipide pour la sous-population 2 est plus complexe. Elle est sensible aux cations divalents ou au pH mais insensible aux fortes forces ioniques, laissant supposer la présence d'interactions de type hydrophobe.Les essais réalisés avec du cyt c de levure laissent entrevoir qu'il existe des spécificités entre cette protéine et les phospholipides d’un même organisme. La purification de cyt c de bivalve permettrait d'avancer pour valider cette hypothèse. / The main goal of this thesis was to set up an electrochemical interface in order to characterize interactions between cytochrome c (cyt c), a mitochondrial protein, and cardiolipin (CL), a phospholipid localized to the mitochondrial membrane.The cyt c, whereas the main function is to carrying electrons along the respiratory chain, is known to interact with CL.Previously, a mechanism of cyt c retention onto a CL containing membrane was highlighted by the “extended lipid anchorage” theory. This theory imply, with electrostatic interactions between CL (negatively charged) and cyt c (positively charged), the presence of hydrophobic interaction likely emanating from the insertion of an acyl chain of CL into the cyt c interior. The specificity of the hydrophobic moiety of CL, constituted of four similar chains lead us to make hypothesis about specific interactions between cyt c and acyl chains of CL. Attention have been made to the bivalves CL acyl chains carrying unique composition of 8O% DHA chains.Electrochemicals techniques have been used to study these interactions. A glassy carbon has been modified with a deposit by spin-coating of phosphatidylcholine (PC) and CL in 80/20 ratio (mol/mol). This CL modified electrode allows the study of the cyt c electrochemistry. Firstly, we showed that electroactivity of cyt c require the presence of CL onto the modified electrode meaning cyt c isn't electroactive on a modified electrode with PC only. ln add, CL allows retaining cyt c onto the electrode surface. lt is the first time that this lipid anchorage has been identified on a modified electrode.Electrochemical methods adapted to the study of adsorbed protein (AC voltametry) have been used in order to characterize the electrode transfer kinetics of cyt c. With these methods, two sub-populations of adsorbed cyt c have been characterized. The major part of cyt c, called sub-population 1, has a redox potential close to the formal potential of the native protein (around 0Vvs SCE). Electron transfer rate is in the range of 20s-1. The subpopulation 2, counting for ~10% of the total adsorbed cyt c, hold a negative shifted potential around -0.15V vs SCE and a faster electron transfer rate (~500s-1).To understand the nature of the interaction for the two subpopulations, the effect of an high ionic strength solution (0.5M KCI), pH, calcium, phospholipids classes or cyt c sources have been assayed. These tests shows that subpopulation t have electrostatics interactions and require the presence of a phospholipid holding a terminal glycerol pattern like PG or CL.The nature of the protein-lipid interaction in the case of the subpopulation 2 is more complex. lt is more sensitive to the presence of divalent cation or pH but high ionic strength solution doesn't affect it. This could be explained by hydrophobic interactions between lipid and the cyt c.The assays realized with cyt c from yeast let foresee specificity between these protein and the phospholipids carried by the same organism. The purification of bivalve cyt c could be a progress in order to validate this hypothesis.
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Etude structurale et fonctionnelle de la régulation de la compétence et du processus de transformation chez Streptococcus pneumoniae / Structural and fonctionnal study of the competence regulation and the transformation process on Streptococcus pneumoniaeSanchez, Dyana 09 October 2015 (has links)
La transformation génétique naturelle contribue au maintien et à l'évolution des génomes bactériens, elle constitue pour les bactéries un mécanisme clé pour s'adapter à l'environnement. Elle permet l'intégration d'ADN exogène au sein du chromosome bactérien par recombinaison homologue lors d'un état physiologique particulier de la bactérie appelé compétence. Mon travail de thèse a porté sur la régulation de la compétence chez S. pneumoniae (ComD, ComE) et sur les interactions entre les protéines impliquées dans la prise en charge, le traitement et la recombinaison de l'ADN transformant (DprA, RecA). Chez cette bactérie, l'entrée en compétence est sous le contrôle du système à deux composantes ComD-ComE qui induit la transcription des gènes cibles. DprA est l'une des protéines surexprimée lors de la compétence, elle est très conservée dans le monde bactérien, et participe à la fermeture de la compétence via une interaction directe avec ComE. DprA est également une protéine centrale de la transformation impliquée dans la protection de l'ADN entrant contre les nucléases, et dans le recrutement de la recombinase RecA. L'analyse par SAXS du complexe ComD-ComE, la résolution de la structure cristallographique des domaines REC de ComE, et l'étude des interaction entre ComE et ses régions promotrices ont permis de mieux comprendre la chorégraphie de l'entrée en compétence de S. pneumoniae. En parallèle, nous avons étudié les interactions de SpDprA avec l'ADN et avec RecA. Ces données nous ont permis de proposer un modèle d'interaction entre DprA et RecA chez S. pneumoniae et de proposer un mécanisme de chargement de RecA sur l'ADNsb par DprA. Je me suis également intéressée à DprA de H. pylori en participant à la résolution de la structure 3D de son domaine C-terminal par RMN et en étudiant son interaction avec l'ADNdb. / The natural genetic transformation contributes to the maintenance and the evolution of the genomes in bacteria; it is a key mechanism to adapt to their environment. It allows the integration of exogenous DNA into the bacterial chromosome by homologous recombination during a particular state called competence.My thesis focused on the regulation of the competence state in S. pneumoniae (ComD, ComE), and on the interactions between the proteins involved in the uptake, the processing and recombination of exogenous DNA (DprA, RecA). In this bacterium, the opening of the competence is under the control of the two-component system ComD-ComE, who induces the transcription of target genes. DprA is one of the protein induced during the competence state, it is very conserved into the bacterial kingdom, and is involved in the closure of competence via direct interaction with ComE. DprA is also a key transformation protein involved in processing the incoming DNA, protection against nucleases, and recruitment of the RecA recombinase. SAXS analysis of the ComD-ComE, resolution of the crystallographic structure of ComE REC domain study of the interactions between ComE and its promoter regions allowed us to understand the choreography of competence opening in S. pneumoniae. Meanwhile, we studied spDprA interactions with DNA and with RecA. These data allowed us to propose an interaction model between DprA and RecA in S. pneumoniae and to propose a mechanism for RecA's loading on the ssDNA by DprA. I focused too on H. pylori DprA participating on the resolution of the 3D structure of the C-terminal domain by NMR and studying its interaction with the dsDNA.
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Approches bio-informatiques protéome-centrées pour l’étude des phénotypes complexesBesse, Savandara Ladyson 12 1900 (has links)
Parmi les différents acteurs impliqués dans le dogme de la biologie moléculaire, les protéines sont des unités biologiques fonctionnelles contribuant à de nombreux processus biologiques. Dans la compréhension de la relation génotype-phénotype, il est important d’étudier l'influence de gènes, ou de variants génétiques, sur des mécanismes moléculaires spécifiques, permettant d’expliquer la variance phénotypique de traits dits complexes. Dans cette thèse nous allons démontrer l’intérêt de proposer différentes stratégies bio-informatiques protéome-centrées pour l’étude de phénotypes complexes. Dans une première étude, nous mettons en avant comment l'utilisation de la génomique comparative, couplée à l'analyse de la propension d'agrégation des protéines, permet d'identifier certains groupes de protéines avec des différences significatives entre espèces dans leurs propriétés intrinsèques contribuant à la protéostase cellulaire. Ce mécanisme est proposé dans cette thèse comme hypothèse de travail pour étudier les différences d'espérance de vie chez les rongeurs: ce travail est réalisée sur deux espèces phylogénétiquement proches, le rat taupe-nu et la souris, mais possédant des différences phénotypiques dans le contexte du vieillissement. Dans une seconde étude, nous proposons une nouvelle méthodologie s'appuyant sur l'étude quantitative des réseaux d'interaction protéine-protéine afin d'identifier les déterminants génétiques qui seraient responsables de la variation de ces interactions, suite à une stimulation médicamenteuse dans une population de levures génétiquement diversifiées. Ces travaux de recherche étudient le protéome et ses interactions et permettent de proposer une abstraction originale des phénotypes complexes. / Among the different actors involved in the dogma of molecular biology, proteins are functional biological units contributing to many biological processes. In the understanding of the genotype-phenotype relationship, it is important to study the influence of genes, or genetic variants, on specific molecular mechanisms, allowing to explain the phenotypic variance of so-called complex traits. In this thesis we will demonstrate the interest of proposing different proteome-centric bioinformatics strategies for the study of complex phenotypes. In a first study, we highlight how the use of comparative genomics, coupled with the analysis of the aggregation propensity of proteins, allows to identify some groups of proteins with significant differences between species in their intrinsic properties contributing to cellular proteostasis. This mechanism is proposed in this thesis as a working hypothesis to study differences in life expectancy in rodents: this work is performed on two phylogenetically related species, the mole rat and the mouse, but with phenotypic differences in the context of aging. In a second study, we propose a new methodology based on the quantitative study of protein-protein interaction networks in order to identify the genetic determinants that would be responsible for the variation of these interactions, following a drug stimulation in a genetically diversified yeast population. This research studies the proteome and its interactions and proposes an original abstraction of complex phenotypes.
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Synthèse et évaluation pharmacologique de nouveaux peptides biomimétiques et de benzothiadiazines / Synthesis and pharmacological evaluation of new biomimetic peptides and benzothiadiazinsKihal, Nadjib 29 January 2013 (has links)
Les canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP) jouent un rôle primordial dans plusieurs processus cellulaires. La modulation de ces canaux par des molécules activatrices constituerait des applications pharmacologiques et médicinales très intéressantes. À cet effet nous avons conçu et synthétisé de nouvelles molécules hybrides cromakalim-diazoxide et diazoxide-amine/aminoacide. Nous avons également, évalué l’activité myorelaxante de ces composés sur l’aorte de rates. Les résultats obtenus ne montrent pas un effet myorelaxant significatif. Des études sur d’autres tissus, notamment les cellules β pancréatiques et le muscle utérin, sont envisagées afin d’explorer une éventuelle sélectivité tissulaire. Par ailleurs, les interactions protéine-protéine jouent un rôle fondamental dans presque tous les processus cellulaires. Elles sont fortement impliquées dans la formation de la structure dimérique de la protéase du VIH-1 et l’agrégation du peptide β amyloïde impliquée dans la maladie d’Alzheimer. L’inhibition de ces interactions serait donc d’un avantage thérapeutique pour le traitement du SIDA et de la maladie d’Alzheimer. Nous avons conçu et synthétisé d’une part, des pinces moléculaires à base de motifs carbonylhydrazides et oligohydrazides (Azatide), et d’autre part, des molécules pentapeptidiques avec un peudoaminoacide central alcoolfluoré. Enfin, nous avons testé la capacité des pinces moléculaires à perturber le feuillet β terminal de la PR du VIH-1 afin d'inhiber sa dimérisation et donc son activité. Nous avons réalisé de même une étude de relation structure-activité et d’après l’ensemble des résultats obtenus, il semblerait que la flexibilité est délétère pour l’activité inhibitrice. Nous avons également évalué la capacité des nouvelles molécules peptidomimétiques alcool fluorées à accélérer ou inhiber l’agrégation du peptide Aβ1-42 dans le but de diminuer la présence de petits oligomères neurotoxiques. Les résultats obtenus sont très prometteurs, nous avons réussi à développer d’une part un pentapeptide capable d’inhiber totalement l’agrégation de Aβ1-42, et d’autre part des pseudopentapeptides capables d’accélérer son agrégation. Nous avons aussi démontré l’influence de l’atome de fluor sur la structuration d’un pentapeptide. Des études par RMN et DC sont en cours. / ATP-sensitive potassium channels (KATP) play an important role in many cellular processes. The modulation of these channels by activating molecules may constitute very interesting pharmacological and medicinal applications. For this purpose, we have designed and synthesized new hybrid molecules cromakalim-diazoxide and diazoxide-amine/aminoacid. We also evaluated the relaxant activity of these compounds on aorta of rats. The obtained results do not show a significant relaxant effect. Studies on other tissues, including pancreatic cells and uterine muscle, are envisaged to explore the potency of these compounds and their possible tissue selectivity.Otherwise, Protein-protein interactions play a fundamental role in almost all cellular processes. They are strongly involved in the formation of the dimeric structure of HIV-1 protease and β amyloid peptide aggregation involved in Alzheimer's disease. Inhibition of these interactions would be a therapeutic advantage for the treatment of AIDS and Alzheimer's disease. We designed and synthesized on one hand, molecular tongs based on carbonylhydrazide oligohydrazid (Azatide) fragments and in the other hand, pentapeptide molecules with a central fluorinated and hydroxylated aminoacid. Finally, we tested the ability of molecular tongs to disrupt the terminal β sheet of the HIV-1 PR to inhibit its dimerization and thus its activity. We have also conducted a structure-activity relationship study and According to the results it seems that flexibility is detrimental to the inhibitory activity. We evaluated as well the ability of new fluorinated and hydroxylated peptidomimetics to accelerate or inhibit the aggregation of Aβ1-42 peptide in order to reduce the presence of small toxic oligomers. The results are very promising that we succeeded in developing a pentapeptide able to completely inhibit the aggregation of Aβ1-42, and in the other hand pseudopentapeptides able to accelerate its aggregation. We also demonstrated the influence of fluorine on the structure of a pentapeptides. Studies by NMR and DC are in progress.
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L’HPr, une protéine clé dans l’établissement de la virulence chez Neisseria meningitidis / The HPr, a key protein in Neisseria meningitidis virulenceNait Abdallah, Jamila 12 October 2011 (has links)
Neisseria meningitidis (Nm) est un germe commensal du rhinopharynx ayant pour seul hôte l’homme. Malgré un portage asymptomatique largement répandu, et pour des raisons encore inconnues, elle peut échapper au système immunitaire de l’hôte et devenir pathogène provoquant ainsi méningite et septicémie pouvant être mortelles principalement chez les enfants. Au cours du processus infectieux, Nm alterne entre des phases de colonisation et de dissémination, et se retrouve alors confrontée à différents environnements. L’adaptation rapide à ces variations, par modulation de l’expression des gènes de virulence, représente un facteur important dans sa pathogénie. Les facteurs qui contribuent à la virulence de Nm sont essentiellement des structures présentes à la surface de la bactérie parmi lesquelles les pili et la capsule. Les gènes codant ces facteurs sont sous le contrôle de la protéine CrgA, régulateur transcriptionnel de la famille LysR qui intervient lors de l’adhésion de Nm aux cellules humaines. La protéine CrgA régule négativement sa propre expression ainsi de celle des gènes impliqués dans la synthèse de la capsule (sia) et des pili (pilE et pilC1). Par ailleurs, le PTS est un système de transduction du signal qui intervient, par phosphorylation ou via des interactions protéine/protéine, dans le transport des sucres et dans la régulation du métabolisme du carbone. Chez Nm, ce système est incomplet (constitué des protéines EI, HPr, et deux EIIA), il n’est donc pas fonctionnel pour le transport des sucres mais aurait pu conserver ses fonctions régulatrices. Nous avons montré que les protéines du PTS de Nm étaient actives in vitro et in vivo et que la cascade de phosphorylation du PTS était fonctionnelle. Nous avons également montré que l’inactivation du gène ptsH, codant la protéine HPr, entrainait une diminution significative de la synthèse de la capsule, une augmentation de l’adhésion du mutant aux cellules épithéliales humaines et une augmentation de l’expression de crgA. De ce fait, l’absence de l’HPr semble empêcher la répression de crgA et par conséquent celle des gènes sia. Par ailleurs, des expériences de co-immunoprécipitation, nous ont permis de mettre en évidence que l’HPr interagissait directement avec la protéine CrgA in vitro et in vivo. Ces résultats suggèrent que la protéine HPr interviendrait dans la régulation de l’expression des gènes de virulence de Nm via la régulation de l’expression de crgA. Ainsi, un lien entre métabolisme du carbone et virulence a été mis en évidence chez Nm. / Neisseria meningitidis (Nm) is a commensal bacterium of the nasopharynx, which only colonizes humans. Despite a large number of asymptomatic carriers, and for reasons so far unknown, Nm occasionally becomes virulent, escaping the host’s immune system and causing septicaemia and meningitis, the latter being potentially lethal, mostly in children.During the infectious process, Nm alternates between phases of colonization and dissemination, each time facing different environments. This rapid adaptation to the changing environment occurs via the modulation of the expression of virulence genes and represents an important factor of pathogenicity. The structures involved in virulence in Nm are mainly present at the surface of the bacterium, including the pili and the capsule. The genes coding for these structures are controlled by the CrgA protein, a transcriptional regulator of the LysR family, which is induced during the adhesion of Nm to human cells. CrgA negatively regulates its own expression as well as the expression of those genes implicated in the synthesis of the capsule (sia) and pili (pilE and pilC1).Moreover, the PTS is a signal transduction system, which is involved, via phosphorylation or protein/protein interactions, in the transport of sugars and the regulation of the carbon metabolism. In Nm, the PTS is incomplete (only composed of the proteins EI, HPr and two EIIA), thus not functioning in the transport of sugars but it may have conserved regulatory functions.In this work, we demonstrate that the PTS proteins in Nm are active in vitro and in vivo and that the phosphorylation cascade of the PTS is functional. We further show that the inactivation of the ptsH gene, coding for the HPr protein, significantly reduces the synthesis of the capsule, enhances the adhesion of the mutants to human epithelial cells and increases the expression of crgA. Thus, the absence of HPr seems to inhibit the repression of crgA and as a consequence also the repression of the sia genes. Furthermore, from co-immunoprecipitation experiments we provide evidence that HPr directly interacts with the CrgA protein in vitro and in vivo. These results suggest that the HPr protein in Nm regulates the expression of the virulence genes via the regulation of crgA expression. Thus, we provide evidence of a link between carbon metabolism and virulence in Nm.
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Etude structurale des protéines et des acides nucléiques par RMN. Etude de la répression du gène de la beta-lactamase chez B. licheniformis 749/I. Augmentation de la résolution des spectres RMN multidimensionnels par filtrage Hadamard.Van Melckebeke, Hélène 29 September 2005 (has links) (PDF)
La RMN est une méthode de choix pour la détermination de la structure tridimensionnelle des protéines et des acides nucléiques en solution. Cependant, la taille des systèmes que l'on peut étudier actuellement par RMN est limitée. Dans la première partie de ce travail, la structure du répresseur BlaI de la beta-lactamase de B. licheniformis 749/I et son interaction avec l'ADN ont été étudiées par RMN avec des méthodes classiques. Ces résultats ont permis de mieux caractériser la répression des gènes de plusieurs mécanismes de résistance aux antibiotiques, incluant la résistance à la méthicilline de la souche pathogène S. aureus. Le deuxième volet de ce travail concerne l'implémentation de filtres Hadamard qui augmentent la résolution des spectres dans certaines expériences de RMN multidimensionnelle. Ces filtres permettent de séparer les pics de corrélation des protéines et des acides nucléiques selon le type d'acide aminé et le type de base, respectivement. Ces développements ouvrent de nouveaux horizons vers l'étude de macromolécules biologiques de plus grosse taille par RMN.
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Étude des interactions protéiques impliquant NPM-MLF1 dans la leucémie myéloïde aiguë.Jacinthe, Patricia 12 1900 (has links)
Différentes translocations génomiques sont fréquemment associées à l'apparition de leucémies myéloïdes aiguës (LMA). Ces translocations génomiques résultent de l’assemblage de deux gènes conduisant à la production d'une protéine de fusion. C'est le cas de la translocation t (3; 5) (q25.1; q34) impliquant le suppresseur tumoral NPM et l'oncogène MLF1 donnant naissance à la protéine de fusion NPM-MLF1. Généralement, les gènes impliqués dans ces translocations contrôlent la croissance cellulaire, la différenciation ou la survie cellulaire. Cependant, pour NPM-MLF1 les causes du gain ou de la perte de fonction associée à la translocation demeurent inconnues car nous ne savons pas comment cette translocation peut favoriser ou participer à l'avènement de la LMA. Le but de ce travail est d’analyser le rôle de NPM-MLF1 dans le cancer et d’examiner comment son activité contribue à la leucémie en faisant des études d’interactions protéine/protéine. En effet, l’étude de la fonction d’une protéine implique souvent de connaître ses partenaires d’interactions. Pour ce faire, la technique de double hybride dans la souche de levure AH109 a été utilisée. Tout d’abord, les ADN complémentaires (ADNc) de MLF1, NPM1 et de NPM-MLF1, MLF1-Like (une partie de MLF1 de l’acide aminé 94 à 157) normaux et mutés du domaine MTG8-Like constitué des acides aminés (a.a.) 151 à 164 de MLF1 (excepté NPM) ont été clonés dans un vecteur d'expression de levure pGBKT7. Les ADNc de GFI-1, mSin3A, PLZF, HDAC1 et HDAC3 ont été clonés dans le plasmide pGADT7 de façon à créer des protéines de fusion synthétiques avec le domaine de liaison à l'ADN et de trans-activation de la protéine GAL4. Le plasmide pGBKT7 possède un gène TRP1 et pGADT7 un gène LEU2 qui permettent la sélection des clones insérés dans la levure. Aussi, le pGBKT7 a un épitope c-myc et pGADT7 un épitope HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage de type Western. Après la transformation des levures les interactions protéine/protéine ont été observées en vérifiant l’expression des gènes rapporteurs HIS3, LacZ, MEL1, ADE2 de la levure en utilisant des milieux de sélection YPD/-Leu/-Trp, YPD/-Leu/-Trp/-His, YPD/-Leu/-Trp/-His/-Ade, YPD/-Leu/-Trp/+ X-Gal, YPD/-Leu/-Trp/ + X-α-Gal. Ensuite, les interactions trouvées par double-hybride ont été vérifiées dans les cellules érythroleucémiques K562 par immuno-précipitation (IP) de protéines suivies de buvardages Westerns avec les anticorps appropriés. NPM-MLF1, MLF1, MTG8, MLF1-Like surexprimés dans les cellules K562 ont été clonés dans le plasmide pOZ-FH-N. pOZ-FH-N possède un récepteur IL-2 qui permet de sélectionner les cellules qui l’expriment ainsi qu’un tag Flag-HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage-Western. Les résultats du double-hybride suggèrent une interaction faible de NPM-MLF1 avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A ainsi qu’une interaction qui semble plus évidente entre NPM-MLF1 et PLZF, GFI-1. NPM interagit avec GFI-1 et mSin3A. Aussi, MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3, GFI-1, PLZF mais pas avec mSin3A. Les IP suggèrent que NPM-MLF1 interagit avec HDAC1, HDAC3, mSin3A et PLZF. MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A. L’interaction de NPM-MLF1 avec GFI-1, MLF1 et MLF1-Like avec PLZF et GFI-1 n’a pas encore été vérifiée par IP. Ainsi, nos observations permettent de suggérer que NPM-MF1, MLF1 et NPM pourraient jouer un rôle dans la transcription et la régulation de l’expression de certains gènes importants dans l’hématopoïèse et une variété de processus cellulaires parce qu’ils interagissent avec différents corépresseurs. En déterminant les partenaires protéiques de MLF1, NPM et NPM-MLF1, leurs fonctions et comment NPM-MLF1 influence et modifie le fonctionnement cellulaire normal; il sera possible de renverser le processus de LMA favorisé par la t (3; 5) NPM-MLF1 par la technologie d’interférence à l’ARN. / Abstract
Different genomic translocations are frequently associated with the development of acute myeloid leukemia (AML). Genomic translocations can result in the fusion of two genes leading to the formation of a fusion protein. This is the case of the T (3; 5) (q25.1; q34) translocation that implicates the tumour suppressor NPM1 and the oncogene MLF1, giving rise to the fusion protein NPM-MLF1. Generally the genes implicated in these translocations control cell growth, differentiation and survival. However, for NPM-MLF1 the reasons behind the gain or loss of function associated with the translocation are still unknown as we still ignore how this translocation can enhance or take part in the AML development. The goal of my master degree project was to analyse in part the role of NPM-MLF1 in cancer and to examine how its activity can contribute in leukemia through protein/protein interaction assays. The usual study of a protein function implicates the investigation of interacting partners. For this purpose, we used the yeast AH109 to conduct a two-hybrid screen assay. The MLF1, MLF1-Like (amino acid 94 to 157 of MLF1), NPM1 and NPM-MLF1 cDNAs, normal and mutated in the MTG8-Like domain from the amino acid (a.a.) 151 to 164 of MLF1 (with the exception of NPM1) were cloned into the yeast expression vector pGBKT7. The GFI-1, mSin3A, PLZF, HDAC1 and HDA3 cDNAs were cloned into the vector pGADT7. These clones were developed to creat synthetic fusion proteins with the DNA binding or trans-activation domain(s) of the protein Gal4. The pGBKT7 vector contains the TRP1 gene and the pGADT7 the LEU2 gene. These genes were used for the selection of the yeast clones transformed with the plasmids mentioned above. In addition, the pGBKT7 vector has c-myc-tag and the PGADT7 vector the HA-tag allowing the assessment of protein expression through Western Blot analysis. After yeast transformation, the protein/protein interaction were studied while verifying the expression of the reporter genes HIS, LacZ, MEL1, ADE while using the following selective medias YPD/-Leu/-Trp, YPD/-Leu/-Trp/-His, YPD/-Leu/-Trp/-His/-Ade, YPD/-Leu/-Trp/+ X-Gal, YPD/-Leu/-Trp/ + X-α-Gal. The interactions determined by the two-hybrid screening were verified in the erythroleukemic cells K562 using immuno-precipitation (IP) of the proteins followed by western blot using the appropriate antibodies. To achieve this, NPM-MLF1, MLF1, ETO, MLF1-Like cDNAs were cloned into the pOZ-FH-N vector that possess an IL2 receptor, which allows the selection of the positive transformed clones in the cell and a Flag-HA tag that permit the verification of protein expression through Western-blot. The two-hybrid screen results suggest that NPM-MLF1 interacts with HDAC1, HDAC3, PLZF, GFI and mSin3A. NPM interacts with GFI-1 and mSin3A. This has not been yet verified using the IP method. As in the case of MLF1, MLF1-Like interacts with HDAC1, HDAC3, GFI-1 and PLZF. However, no interaction was observed with Sin3A. The IP experiments suggest that NPM-MLF1 interacts with HDAC1, HDAC3, mSin3A and PLZF. MLF1 and MLF1-Like interact with HDAC1, HDAC3 and mSin3A. The interaction of NPM-MLF1 with GFI1 as well as MLF1 and MLF1-Like with PLZF and GFI-1 are not yet verified by IP. Therefore, our observations led to the suggestion that NPM-MLF1, MLF1 and NPM can play a role in the transcription and the regulation of the expression of certain genes that are important for hematopoiesis and a variety through the determination of the protein partners of MLF1, NPM and NPM-MLF1, their functions and how NPM-MLF1 influence/modify the normal cellular function, and by focusing on this study, it might become possible to reverse the AML process that is by the t(3;5) NPM-MLF1 while using the RNA interference technology.
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Inférence de réseaux d'interaction protéine-protéine par apprentissage statistiqueBrouard, Céline 14 February 2013 (has links) (PDF)
L'objectif de cette thèse est de développer des outils de prédiction d'interactions entre protéines qui puissent être appliqués en particulier chez l'homme, sur les protéines qui constituent un réseau avec la protéine CFTR. Cette protéine, lorsqu'elle est défectueuse, est impliquée dans la mucoviscidose. Le développement de méthodes de prédiction in silico peut s'avérer utile pour suggérer aux biologistes de nouvelles cibles d'interaction et pour mieux expliquer les fonctions des protéines présentes dans ce réseau. Nous proposons une nouvelle méthode pour le problème de la prédiction de liens dans un réseau. Afin de bénéficier de l'information des données non étiquetées, nous nous plaçons dans le cadre de l'apprentissage semi-supervisé. Nous abordons ce problème de prédiction comme une tâche d'apprentissage d'un noyau de sortie, appelée régression à noyau de sortie. Un noyau de sortie est supposé coder les proximités existantes entre les noeuds du graphe et l'objectif est d'approcher ce noyau à partir de descriptions appropriées en entrée. L'utilisation de l'astuce du noyau dans l'ensemble de sortie permet de réduire le problème d'apprentissage à partir de paires à un problème d'apprentissage d'une fonction d'une seule variable à valeurs dans un espace de Hilbert. En choisissant les fonctions candidates pour la régression dans un espace de Hilbert à noyau reproduisant à valeur opérateur, nous développons, comme dans le cas de fonctions à valeurs scalaires, des outils de régularisation. Nous établissons en particulier des théorèmes de représentation dans le cas supervisé et dans le cas semi-supervisé, que nous utilisons ensuite pour définir de nouveaux modèles de régression pour différentes fonctions de coût, appelés IOKR-ridge et IOKR-margin. Nous avons d'abord testé l'approche développée sur des données artificielles, des problèmes test ainsi que sur un réseau d'interaction protéine-protéine chez la levure S. Cerevisiae et obtenu de très bons résultats. Puis nous l'avons appliquée à la prédiction d'interactions entre protéines dans le cas d'un réseau construit autour de la protéine CFTR.
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Étude des interactions protéiques impliquant NPM-MLF1 dans la leucémie myéloïde aiguëJacinthe, Patricia 12 1900 (has links)
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Recherche et caractérisation par dynamique moléculaire d'états intermédiaires pour la complexation entre la protéine FKBP12 et des ligands de haute affinité / Study of building intermediate states between FKBP12 and high-affinity ligands by molecular dynamics simulationsOlivieri, Lilian 04 July 2012 (has links)
FKBP12 est une protéine ubiquitaire, principalement cytosolique, qui est au carrefour de plusieurs voies signalétiques. Son abondance naturelle dans les tissus nerveux peut être reliée à son implication dans les maladies neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson ainsi que dans les neuropathies périphériques et diabétiques ou dans des blessures des cordons spinaux. De nombreuses études ont montré que des molécules exogènes (ligands) venant se fixer sur cette protéine permettent la régénération d'un grand nombre de connexions neuronales endommagées. Une difficulté provient cependant du fait que, pour un ligand donné, il n'existe aucune relation claire entre sa structure et sa capacité de liaison à FKBP12. Notre étude vise ainsi à rationaliser la relation entre la structure d'un ligand et son affinité pour cette protéine. Deux complexes modèles, formés entre FKBP12 et chacun des deux ligands 8 et 308, ont été utilisés. Ces deux ligands de haute affinité ont des structures différentes. Notre travail s'est appuyé sur des simulations de dynamique moléculaire pour caractériser l'état intermédiaire qui est formé transitoirement lors du processus de complexation entre la protéine et son ligand. Dans cet état particulier, l'identification des interactions naissantes entre les partenaires a permis (i) de comprendre l'implication des différentes parties du ligand dans le mécanisme de reconnaissance avec FKBP12 et (ii) de rationaliser les affinités de certains ligands apparentés. / FKBP12 is an ubiquitous, mostly cytosolic, protein found at the crossroads of several signaling pathways. Its natural abundance in the nervous tissues can be related to its implication in neurodegenerative diseases like Alzheimer's and Parkinson's as well as in peripheral neuropathies and diabetes or in injuries of the spinal cords. Several studies have demonstrated that exogenous molecules (ligands) that can bind to FKBP12 allow the regeneration of many damaged neuron connections. However, there is no clear relationship between the structure of a ligand and its ability to bind to FKBP12. Our study aims at rationalizing the relationship between the structure of a ligand and its affinity to FKBP12. Two model complexes, formed between FKBP12 and each of the two high-affinity ligands 8 and 308, were studied. These two ligands are structurally different. We used molecular dynamics simulations to characterize the intermediate state that is transiently formed during the binding process between the protein and its ligand. In this state, the analysis of the nascent interactions allowed (i) to unravel the role played by the various ligand moieties in the recognition process with FKBP12 and (ii) to rationalize the affinities of related ligands.
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