Les hélicases à ARN de la famille DEAH/RHA sont impliquées dans la plupart des processus essentiels à la vie tels que l'épissage, la biogenèse des ribosomes, la réplication, la transcription ou encore la détection d’ARN viraux. Ces enzymes sont capables de catalyser la dissociation de duplexes d'ARN, la réorganisation de structures secondaires ou de remodeler des complexes ARN-protéines. L'hélicase DEAH/RHA Prp43 présente la particularité d'être bifonctionnelle. Prp43 est impliquée dans l'épissage des Pré-ARNm, où elle assure le recyclage du spliceosome et du lasso, mais aussi dans la biogenèse des ribosomes où elle est impliquée dans la maturation des deux sous-unités. Prp43 est activée et régulée par cinq partenaires protéiques : Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 et GPATCH2. Ces partenaires protéiques présentent tous un domaine G-patch et sont capables de stimuler les activités hélicase et ATPase de Prp43. La structure cristallographique de Prp43 en complexe avec l'ADP a été résolue au laboratoire. Cette structure a mis en évidence un mode de fixation du nucléotide inédit chez les autres hélicases, notamment au niveau de la base qui s'empile entre la phénylalanine 357 (F357) du domaine RecA2 et l'arginine 159 (R159) du domaine RecA1. Les déterminants de l'activation de Prp43 par les protéines à domaine G-patch demeurent méconnus. Dans ce travail, nous avons cherché à déterminer quel était le rôle de l’empilement de la base dans l’activation de Prp43. Nous présentons ici plusieurs structures cristallographiques de Prp43 en complexe avec tous les nucléotides diphosphates(NDP) et les désoxynucléotides triphosphates (dNDP). Ces structures ont permis de conclure qu'il y avait des différences dans l’empilement de la base selon le (d)NDP considéré. Des dosages d'activité NTPase de Prp43 avec et sans son partenaire protéique Pfa1 montrent que lorsque la base ne s'empile pas avec la F357 et la R159, l'activité de l'enzyme n'est pas correctement régulée par son partenaire protéique. Les dosages d’activité enzymatique sur les mutants ponctuels F357A et R159A révèlent que le résidu F357 permet de moduler l’activité de Prp43. Tous ces résultats nous ont permis de mettre en évidence un modèle de la régulation de Prp43 par les protéines à domaines G-patch et d'expliquer l'importance du mode de fixation de la base à l'enzyme dans cette régulation. / RNA helicases from the DEAH/RHA family are involved in most of essential processes of life such as pre-mRNA splicing, ribosome biogenesis, replication, transcription or viral RNA sensing. These enzymes are able to catalyze RNA unwinding, secondary structures reorganization or RNA-protein complexes remodeling. The DEAH/RHA helicase Prp43 is remarkable because it is bifunctional, as it is involved both in pre-mRNA splicing, where it is responsible of spliceosome and lariat recycling and in the biogenesis of the two ribosomal subunits. Prp43 is activated by five protein partners: Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 and GPATCH2. These protein partners all possess a G-patch domain and are able to stimulate helicase and ATPase activity of Prp43. The structure of Prp43 in complex with ADP has been solved by X-ray crystallography. The structure reveals that the nucleotide is bound to the enzyme in a novel mode that has never been observed in other known helicase structures. The specific feature of this binding mode is the base, stacked between phenylalanine (F357) from RecA2 domain and an arginine (R159) from RecA1 domain. Features of the activation of Prp43 by G-patch proteins are unclear. In this work, we investigated the role of base stacking in the activation of Prp43. We present several structures of Prp43 bound to all the nucleotide diphosphates (NDP) and deoxynucleotide diphosphates (dNTP). These results indicate that there are differences in stacking according to the (d)NDP bound to the enzyme. NTPase activity assays revealed that when stacking is weakened, Prp43 activity cannot be properly regulated by its protein partner Pfa1. Moreover, point mutations F357A and R159A show that stacking of F357 permits to modulate Prp43 activity. All these results allow us to propose a model of NTPase activity activation of Prp43 by G-patch proteins and to highlight the importance of base stacking in this regulation.

Ma thèse a porté sur l’étude des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la coiffe de deux virus à ARN: le virus du Nil Occidental (WNV) et le métapneumovirus humain (hMPV). Ces virus codent pour des enzymes assurant l’ajout de la coiffe de type-1 (m7GpppN2’Om) à l’extrémité 5’ de leur ARNm.Le domaine N-terminal de la protéine NS5 (NS5MTase) du WNV porte les activités N7- et 2’O-méthyltransférases (N7- et 2’O-MTases) et il a été proposé que NS5MTase puisse également porter l’activité guanylyltransférase (GTase). J’ai identifié in vitro des résidus clés impliqués dans l’interaction entre NS5MTase et des ARN substrats de chaque activité MTase. Nos résultats démontrent que le site de fixation de la coiffe est nécessaire lors de la 2’O-méthylation et ne l’est pas pour la N7-méthylation. En parallèle, j’ai recherché des résidus catalytiques de la GTase par la méthode de génétique inverse. Des résultats préliminaires indiquent que la mutation K29A induit un défaut de réplication. Ce résidu pourrait donc être impliqué dans l’activité GTase de NS5MTase.Concernant hMPV, j’ai effectué une analyse fonctionnelle du domaine CR-VI+ de la protéine L. J’ai démontré que CR-VI+ possède les activités N7- et 2’O-MTases et j’ai identifié les résidus impliqués dans le recrutement de l’ARNm. L’ordre de méthylation est non canonique avec la 2’O-méthylation qui précède la N7-méthylation. Enfin, j’ai également démontré que CR-VI+ possède une activité d’hydrolyse du GTP.Ce travail démontre que ces MTases possèdent 2 voire 3 des activités enzymatiques nécessaires à la formation de la coiffe, et représentent donc une cible de choix pour le développement d’inhibiteurs. / My PhD project is focus on the study of the enzymatic activities involved in the RNA capping pathway of two RNA viruses: the West Nile Virus (WNV) and the human metapneumovirus (hMPV). These viruses encode for enzymes allowing the addition of a cap-1 structure (m7GpppN2’Om) to their mRNA 5’ ends. The NS5 N-terminal domain (NS5MTase) of WNV harbours the N7- and 2’O-methyltransferase activities (N7- and 2’O-MTase); and it has been proposed that NS5MTase also bears a guanylyltransferase activity (GTase). I have identified residues involved in the NS5MTase interaction sites with their RNAs substrate. My assays demonstrate the importance of the cap-binding site for the 2’O-methylation but not for the N7-methylation. In parallel, I have tried to identify putative catalytic residues of the GTase activity by reverse genetics. Preliminary results suggest that NS5MTase K29 could be a catalytic residue.Concerning hMPV, I performed a functional analysis of CR-VI+ domain of the protein L. I demonstrated that the CR-VI+ domain harbours the N7- and 2’O-MTase activities and identified the residues involved in the mRNA recruitment. I showed that the methylation order is not canonical with the 2’O-methylation preceding the N7-methylation. Finally, I showed that the domain harbours an additional GTP hydrolysis activity, representing the first step of RNA cap formation for Mononegavirales.This work demonstrates that this MTase domains harbour 2 or 3 of the enzymatic activities required for viral RNA cap synthesis and represent attractive targets for the development of antivirals.

Spiroplasma citri est un mollicute phytopathogène transmis de plante à plante par des cicadelles du genre Circulifer selon un mode persistant circulant-multipliant. Les franchissements de l’épithélium intestinal et des glandes salivaires sont basés sur un mécanisme d’endocytose/exocytose. Ce processus d’invasion met en jeu, au sein de complexes protéiques, des protéines bactériennes spécifiques qui reconnaissent des motifs déterminés présents à la surface des cellules eucaryotes. La recherche de protéines de l’insecte vecteur interagissant avec S. citri a notamment conduit à l’identification de l’actine. Cette interaction a pu être confirmée à la fois in vitro et in vivo. L’interaction de l’actine avec son partenaire chez S. citri, qui s’est avéré être la phosphoglycérate kinase (PGK), est impliquée dans l’internalisation du spiroplasme dans les cellules de l’insecte. La région minimale de liaison à l’actine de la PGK a également été déterminée.La réalisation d’un mutant de S. citri dépourvu de PGK a été entreprise avec le plasmide navette pGOT mais n’a pas permis la sélection de spiroplasmes mutés dans ce gène essentiel. Néanmoins, la recherche de l’évènement de recombinaison chez les clones obtenus a permis de mettre en évidence la mutation de deux gènes chez ces derniers.L'ensemble des protéines impliquées dans la transmission du spiroplasme, identifiées au préalable chez ce dernier, n’étant pas essentielle au cours de ce processus, une étude préliminaire des complexes multi-protéiques contenant plusieurs de ces protéines a été réalisée. L’identification de complexes impliquant à la fois la PGK, la P32 et les ScARPs pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes régissant la vection de S. citri par son insecte. / Spiroplasma citri is a phytopathogenic mollicute transmitted from plant to plant by leafhoppers of the genus Circulifer in a persistent and propagative manner on condition to cross the intestinal and salivary glands barriers of the insect. These crossings are based on a endocytosis/exocytosis mechanism which involves bacterial protein complexes in order to recognize specific patterns on the surface of eukaryotic cells.Specific molecular interactions between S. citri proteins and those of C. haematoceps were investigated using far Western technology and had notably led to the identification of actin. This interaction has been confirmed both in vitro and in vivo. The interaction of actin with his partner in S. citri, which has been identified as the phosphoglycerate kinase (PGK), is involved in the internalization of spiroplasma into the insect cells. The minimal actin-binding region of PGK was also determined.The realization of a S. citri PGK mutant was carried out using the shuttle plasmid pGOT but the selection of spiroplasmas mutated in this essential gene failed. Nevertheless, findings in the localization of recombination events in S. citri chromosome, allowed us to identify mutations in two genes that could be tested in our experimental transmission system.The set of proteins involved in the spiroplasmal transmission, previously identified as non essential proteins in the invasion process, prompted us to study the role of multi-protein complexes containing several of these proteins. Identification of complexes involving both the PGK, the P32 and ScARPs should enable us to better understand mechanisms governing the transmission of S. citri by its insect.

Les récepteurs nucléaires sont membres d'une famille de protéines activées par des ligands et qui régulent la transcription de nombreux gènes. Le récepteur nucléaire RevErbα est constitutivement inhibiteur de la transcription de gènes cibles via le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor et Histone DeAcetylase 3). Ce complexe joue un rôle important dans le contrôle de l'horloge circadienne et de la glucogenèse via la régulation de la transcription des gènes codant pour les enzymes G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) et PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase). Ces deux enzymes sont impliquées dans la glucogénèse qui est dérégulée en cas de diabète de type 2. Ce travail est basé sur l'investigation de l'interaction du récepteur nucléaire RevErbα avec deux corépresseurs: son partenaire établit NCor et SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Malgré ce qui est rapporté dans la littérature, c'est à dire que SMRT et RevErbα n'interagissent pas fonctionnellement in vivo, nous avons choisis d'étudier cette interaction à cause de la similarité de séquence entre les deux corépresseurs, mais également parce que les peptides des deux corépresseurs ont été rapportés comme interagissant avec d'autre récepteurs nucléaire. Afin d'étudier ces interactions, nous avons utilisé deux techniques complémentaires basées sur l'émission de fluorescence: Une technique in vitro qui est l'anisotropie de fluorescence et une technique de microscopie de fluorescence in cellulo appelée Number & Brightness. En plus de cette étude de l'interaction entre le récepteur nucléaire et les corépresseurs, nous nous sommes intéressé à déterminer l'effet de plusieurs ligands sur cette interaction. Trois ligands ont été testés: l'hème qui est rapporté comme étant le ligand naturel de RevErbα et deux ligands synthétiques et non naturels de RevErbα (SGN et SD7). Grâce à l'anisotropie de fluorescence (in vitro), nous avons confirmé et quantifié l'interaction entre le domaine de liaison au ligand (LBD) de RevErbα et un peptide NCor contenant le domaine d'interaction majeur (ID1 pour RevErbα et nous avons déterminé l'effet des trois ligands sur cette interaction. Nous avons également quantifié l'interaction entre RevErbα et d'autres peptides provenant de NCor et correspondant aux autres domaines d'interaction (ID2 et ID3) pour sa liaison à RevErbα. Nous avons déterminé que l'hème et le SD7 ont un effet déstabilisateur de la liaison de RevErbα à NCor in vitro, alors que le ligand SGN améliore la stabilité de complexe. Nous avons également confirmé une interaction entre RevErbα et un peptide corépresseur issu de SMRT. Afin d'étudier l'interactions des protéines pleine taille dans un contexte plus fonctionnel, nous avons utilisé le 2 photons-2 couleurs Number & Brightness. C'est une technique de microscopie à fluorescence basée sur la fluctuation de l'intensité de fluorescence pour étudier les interactions spécifiques de RevErbα avec NCor et SMRT pleine taille in cellulo ainsi que l'effet des ligands, précédemment mentionné, sur ces interactions. Dans les conditions choisies pour notre étude, nous avons déterminé que RevErbα interagit fortement avec NCor in cellulo et que cette interaction est améliorée par le ligand SGN. En revanche, l'hème et le SD7 n'ont pas d'effet observable sur ce complexe. Nous avons également montré pour la première fois que RevErbα forme des complexes avec le corépresseur SMRT pleine taille in cellulo. La continuité de ce travail pourrait être ciblée sur l'identification de ligands qui augmenterait le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 sur RevErbα, menant ainsi à la diminution de l'expression des gènes cibles. En définitive, un ligand tel que celui-ci pourrait être d'un grand intérêt dans la recherche de la diminution de glucose dans le sang dans les cas de diabètes de type 2. / Nuclear receptors are members of ligand-inducible factors that regulate the transcription of many genes. Nuclear receptor RevErbα constitutively inhibits the transcription of target genes via the recruitment of the corepressor complex NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor and Histone DeAcetylase 3). This complex plays an important role in controlling the circadian clock and glucogenesis via regulation of the transcription of the G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) and PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase) genes, both coding for proteins involved in glucogenesis, which is central to type 2 diabetes. Here we have investigated the interaction of the nuclear receptor RevErbα with two corepressors: its establish partner, NCor and SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Despite literature reports that SMRT and RevErbα do not interact functionally in vivo, we choose to study this interaction because of sequence similarity between the two corepressors, because peptides of both corepressors were reported to interact with other nuclear receptors. To investigate these interactions, we used two complementary fluorescence techniques: In vitro assays based on fluorescence anisotropy and an in cellulo fluorescence microscopy technique called Number & Brightness. In addition to the interactions between the CoRs and the RN, we were interested in determining the effects of several ligands on these interaction. Three ligands were tested: heme, which is reported to be the natural ligand of RevErbα and two synthetic and non-naturals ligands of RevErbα (SGN and SD7). By fluorescence anisotropy (in vitro) we confirmed and quantitated the interaction between purified RevErbα Ligand Binding Domain (LBD) and an NCoR peptide containing the major interaction domains (ID1) for RevErbα and revealed the effect of the three ligands on this interaction. We quantitated as well, the interaction between RevErbα and other peptides from NCor corresponding to the other interaction domains (ID2 and ID3) for it binding to RevErbα. We found a destabilizing effect of heme and SD7 binding to RevErbα on it interaction with NCor in vitro, whereas the ligand SGN enhanced the complex stability. We also confirmed an interaction between RevErbα and a SMRT peptide corepressor in vitro. In order to examine these interactions in a more functionally relevant context using full length proteins, we used 2 photon 2 colors Cross Number and Brightness (N&B), an fluorescence microscopy technique based on fluorescence intensity fluctuations to study specific interactions of full length RevErbα with NCor and SMRT in cellulo as well as the effect of several ligands above mentioned. Under the conditions of our studies, we find that RevErbα and NCor interact strongly in cellulo, and we observed a slight enhancement of this interaction by the SGN ligand. No effect of heme or SD7 was observed on the complex. We show as well for the first time that RevErbα forms complexes with the full length SMRT corepressor in cellulo. Future extensions of these studies could be aimed at identifying ligands that enhance the recruitment of the corepressor complex NCor/HDAC3 by RevErbα, thus leading to a decrease expression of the target genes. Ultimately such a ligand could be of interest in the quest to decrease blood glucose levels in type 2 diabetes.

Le paludisme et le sepsis sont des maladies infectieuses très répandues causant plusieurs centaines de milliers de morts tous les ans. Elles sont toutes deux multifactorielles. Les devenirs de ces infections sont influencés par des facteurs environnementaux, par des facteurs sociaux-économiques, politiques et comportementaux mais aussi par des variables dépendant du patient comme son âge. De nombreux arguments existent en faveur d'un contrôle génétique de la résistance au paludisme et au sepsis. Ces deux maladies sont considérées comme proches par les spécialistes car leur physiopathologie est liée notamment à une inflammation systémique non contrôlée responsable des formes les plus graves. Afin d'identifier de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans la résistance à ces deux maladies, nous avons effectué des études génétiques pangénomiques dans deux populations vivant en zone endémique pour le paludisme à Plasmodium falciparum au Burkina-Faso et dans une cohorte de patients atteints de sepsis.Enfin nous avons réalisé les deux premières études d'association pangénomiques identifiant des associations significatives avec la mortalité suite à un choc septique. Nous avons obtenu 32 SNPs significativement associés à la mortalité précoce et 108 significativement associés à la mortalité tardive. Le réseau des interactions protéine-protéine impliquant les protéines codées par les gènes associés a permis d'établir une liste non exhaustive des fonctions altérées durant le choc septique, notamment liées à la réponse immune, et a révélé, malgré les différences au niveau des gènes impliqués, un mécanisme commun participant à la susceptibilité précoce et tardive au choc septique. / Malaria and sepsis are widespread infectious diseases causing hundreds of thousands deaths each year. There is a growing body of evidence for a genetic control of malaria and sepsis resistance. Both diseases are considered close because they are characterized by a systemic inflammation, some common organ dysfunctions, and disorders of coagulation. In order to identify new genes potentially involved in disease resistance, we performed genomewide genetic studies in two populations living in endemic regions for Plasmodium falciparum malaria in Burkina-Faso and in a cohort of septic shock patients. Genetic linkage studies revealed significant genetic linkages on chromosome 6p21.3 and 17p12 with, respectively, mild malaria and asymptomatic parasitaemia. We also performed the first genetic linkage studies concerning immunoglobulin G and their sub-classes against Plasmodium falciparum antigens. We detected significant linkages of IgG3 sub-class with chromosomes 8p22-p21 and 20q13 and between IgG4 sub-class and chromosome 9q34. Finally we performed the first two genomewide association studies identifying significant associations with all-causes mortality after a septic shock. We identified 32 SNPs significantly associated with early mortality and 108 SNPs significantly associated with late mortality. We identified a protein-protein network containing proteins associated with both early and late mortality. Furthermore, the network of protein-protein interactions involving proteins encoded by associated genes allowed us to establish a list of some altered functions during septic shock, most of them being related to the immune responses or the renin-angiotensin-aldosterone system.

Il existe de nombreux mécanismes impliqués dans le développement des tissus qui nécessitent que des cellules ou des groupes de cellules s’orientent et se polarisent. Les protéines de la voie de la polarité planaire (PP) s’associent pour former des complexes à la membrane et créer des asymétries proximo-distale. Vangl2 et Scrib1 ont été identifiés comme les deux premiers gènes impliqués dans la PP chez les mammifères. Lors de ma thèse, je me suis intéressé à ces deux protéines et à certains des complexes dans lesquelles elles sont impliquées. Dans un premier temps, nous avons montré l’implication directe de Scribble1 dans le trafic après endocytose des récepteurs NMDA. Scrib1 interagit avec les récepteurs NMDA grâce à ses domaines PDZ. Scribble1 peut interagir avec le complexe AP2 qui intervient dans l’endocytose des récepteurs. Cette étude a permis de définir un nouveau mécanisme dans lequel Scrib1 régule la quantité de récepteurs NMDA à la membrane et donc participe à la plasticité synaptique. Vangl2 est l’une des protéines transmembranaires les plus en amont de la voie de la PP. Nous avons identifié un nouveau partenaire nommé "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). Nous avons montré, par double hybride en levure et pull down, l’interaction de Vangl2 avec les deux isoformes de AIDA et leur colocalisation en COS7 et neurones. Ensemble, ces données présentent AIDA comme un très bon candidat pour le maintien de Vangl2 aux jonctions adhérentes et/ou pour son adressage à la membrane. Ces études nous ont permis d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliquant les protéines de la polarité planaire. / There are many mechanisms involved in the development of tissues that require cells or groups of cells orient and polarize. The proteins of the planar cell polarity (PCP) combine to form complexes with the membrane and create proximal-distal asymmetries. Vangl2 and Scrib1 have been identified as the first two genes involved in the PCP in mammals. In this study, I am interested in these two proteins and some of the complex in which they are involved. At first, using techniques of biochemistry, cell biology and biophysics, we showed the direct involvement of Scribble1 in traffic after endocytosis of NMDA receptors. Scrib1 interacts with NMDA receptors through its PDZ domains. Due to this binding motif between PDZ1 and PDZ2 of Scrib1, it can interact with the AP2 complex which is involved in receptor endocytosis. This study has identified a new mechanism in which Scrib1 regulates the amount of NMDA receptors on the membrane and is therefore involved in synaptic plasticity. Vangl2 is a transmembrane protein of the most upstream of the PCP pathway. We have identified a new partner named "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). We have shown, by yeast two-hybrid and pull down the interaction of Vangl2 with two isoforms of AIDA and collocation in COS7 and neurons. Together, these data show AIDA as a very good candidate for maintaining Vangl2 to adherens junctions and/or its membrane targeting. These studies have allowed us to improve our understanding of the mechanisms involving the planar polarity proteins.

L'analyse cinétique d'interactions de protéines offre une multitude d'informations sur les fonctions physiologiques de ces molécules au sein de l'activité cellulaire, et peut donc contribuer à l'amélioration des diagnostics médicaux ainsi qu'à la découverte de nouveaux traitements thérapeutiques. La résonance plasmonique de surface (SPR) est la technique de biodétection optique de référence pour les études cinétiques d'interaction de molécules biologiques. Si la SPR offre une détection en temps réel et sans marquage, elle nécessite en revanche des équipements coûteux et sophistiqués ainsi que du personnel qualifié, limitant ainsi son utilisation au sein de laboratoires de recherche académiques. Dans ces travaux de thèse, nous avons développé une plateforme de biodétection basée sur l'utilisation de nanofentes biofonctionnalisées combinées avec une détection par microscopie à fluorescence. Ce système permet l'observation en temps réel d'interactions protéines-protéines et la détermination des constantes cinétiques associées, avec des temps de réponse optimisés et une excellente efficacité de capture. La fonctionnalité du système a été démontrée par l'étude des cinétiques d'interaction de deux couples modèles de différentes affinités : le couple streptavidine/biotine et le couple IgG de souris/anti-IgG de souris. Une très bonne cohérence entre les constantes cinétiques extraites, celles obtenues par des expériences similaires réalisées en SPR et les valeurs rapportées dans la littérature montre que notre approche pourrait être facilement applicable pour l'étude cinétique d'interactions de protéines avec une sensibilité allant jusqu'au pM, sur une large gamme de constantes de dissociation. De plus, nous avons intégré un générateur de gradient de concentrations microfluidique en amont de nos nanofentes, permettant ainsi des mesures simultanées de cinétiques d'interactions à différentes concentrations d'analyte en une seule expérience. Ce système intégré offre de nombreux avantages, tels qu'une réduction de la consommation des réactifs et des temps d'analyse par rapport aux approches séquentielles classiques. Cette technologie innovante pourrait ainsi être un outil précieux non seulement pour les domaines du biomédical et de la médecine personnalisée mais aussi pour la recherche fondamentale en chimie et biologie. / Kinetic monitoring of protein-protein interactions offers fundamental insights of their cellular functions and is a vital key for the improvement of diagnostic tests as well as the discovery of novel therapeutic drugs. Surface plasmon resonance (SPR) is an established biosensor technology routinely used for kinetic studies of biomolecular interactions. While SPR offers the benefits of real-time and label-free detection, it requires expensive and sophisticated optical apparatus and highly trained personnel, thus limiting the accessibility of standard laboratories. In this PhD project, we have developed an alternative and cost-effective biosensor platform exploiting biofunctionalized nanofluidic slits, or nanoslits, combined with a bench-top fluorescence microscope. Our approach enables the visualization of protein interactions in real-time with the possibility to determine associated kinetic parameters along with optimized response times and enhanced binding efficiency. We have demonstrated the effectiveness of our devices through kinetic studies of two representative protein-receptor pairs with different binding affinities: streptavidin-biotin and mouse IgG/anti-mouse IgG interactions. Good agreement of extracted kinetic parameters between our device, SPR measurements and literature values indicated that this approach could be readily applicable to study kinetics of protein interactions with sensitivity down to 1 pM on a large scale of dissociation constants. In addition, we have incorporated a microfluidic gradient generator to our validated nanoslit device, which has allowed one-shot parallel kinetic measurements to be realized in a single-experiment. This integrated system provides advantages of diminished material consumption and analysis time over the conventional kinetic assays. We believe that this innovative technology will drive future advancements not only in the discipline of biomedical and personalized medicine, but also in basic chemical/biological research.

STAT5 est une protéine de la signalisation cellulaire normale, qui peut jouer un rôle important dans la transformation, la survie et à la résistance aux inhibiteurs de tyrosine kinase des cellules tumorales. Son activation constitutive par phosphorylation est liée à la présence de protéines oncogéniques comme la protéine de fusion BCR/ABL1 (leucémie myéloïde chronique) ou de formes mutées de KIT (mastocytoses), par exemple. L’inhibition pharmacologique de STAT5 constitue donc un enjeu thérapeutique majeur pour plusieurs pathologies malignes. Nous avons réalisé la première modélisation et les simulations de dynamique moléculaire des principales formes de STAT5 : la forme monomérique cytoplasmique phosphorylée ou non, et la forme dimérique phosphorylée et liée à l’ADN. Nous avons caractérisé les propriétés dynamiques et le réseau allostérique intramoléculaire des monomères de STAT5. Les résultats générés montrent des variations structurales et dynamiques liées à la différence de séquence primaire des isoformes de STAT5 et/ou à la présence du groupement phosphate. Deux poches à la surface des protéines ont également été caractérisées. Leur localisation à proximité de voies de communication allostériques suggère que ces poches pourraient constituer des sites de modulation des fonctions de STAT5. Nous avons également caractérisé les liaisons hydrogènes entre les monomères constituant les dimères de STAT5 et leur reconnaissance de l’ADN. En outre, nous avons identifié des résidus clés aux interfaces entre les entités moléculaires, nous permettant de mieux comprendre les effets de mutations de STAT5 observées en clinique dans certaines pathologies malignes. / STAT5 is a protein involved in normal cell signalling that is crucial for transformation, survival and resistance to tyrosine kinase inhibitors of tumour cells. The constitutive phosphorylation activates STAT5 and is related to oncogenic proteins like the hybrid protein BCR/ABL1 (chronic myeloid leukaemia) or mutated KIT receptor (mastocytosis). The pharmacologic inhibition of STAT5 is thus a major therapeutic concern in several malignant pathologies. We performed the first modelling and molecular dynamics simulations of the main cellular species of STAT5: the cytoplasmic phosphorylated or unphosphorylated monomer, and the phosphorylated dimer bound to DNA. We characterized the dynamical properties and the intramolecular allosteric network of the monomers. The generated results show structural and dynamic variations linked to the primary sequence changes between the two STAT5 isoforms and/or to the phosphate group. Two pockets were characterized at the surface of STAT5. Their location at close proximity of allosteric communication pathways suggests new putative inhibition sites to modulate STAT5 functions. We also described the hydrogen bonds network between the monomers of the dimeric species and the recognition of the DNA. We identified key residues at the interfaces, allowing us to better understand the effects of clinically relevant STAT5 mutations observed in malignancies.

Les interactions protéine-protéine sont souvent contrôlées par de petits domaines protéiques qui régulent les chemins de signalisation au sein des cellules eucaryotes. Les domaines PDZ sont parmi les domaines les plus répandus et les plus étudiés. Ils reconnaissent spécifiquement les 4 à 10 acides aminés C-terminaux de leurs partenaires. Tiam1 est un facteur d'échange de GTP de la protéine Rac1 qui contrôle la migration et la prolifération cellulaire et dont le domaine PDZ lie les protéines Syndecan-1 (Sdc1), Caspr4 et Neurexine. Des petits peptides ou des molécules peptidomimétiques peuvent potentiellement inhiber ou moduler son activité et être utilisés à des fins thérapeutiques. Nous avons appliqué des approches de dessin computationnel de protéine (CPD) et de calcul d'énergie libre par simulations dynamique moléculaire (DM) pour comprendre et modifier sa spécificité. Le CPD utilise un modèle structural et une fonction d'énergie pour explorer l'espace des séquences et des structures et identifier des variants protéiques ou peptidiques stables et fonctionnels. Nous avons utilisé le programme de CPD Proteus, développé au laboratoire, pour redessiner entièrement le domaine PDZ de Tiam1. Les séquences générées sont similaires à celles des domaines PDZ naturels, avec des scores de similarité et de reconnaissance de pli comparables au programme Rosetta, un outil de CPD très utilisé. Des séquences contenant environ 60 positions mutées sur 90, ont été testées par simulations de DM et des mesures biophysiques. Quatre des cinq séquences testées expérimentalement (par nos collaborateurs) montrent un dépliement réversible autour de 50°C. Proteus a également déterminer correctement la spécificité de la liaison de quelques variants protéiques et peptidiques. Pour étudier plus finement la spécificité, nous avons paramétré un modèle d'énergie libre semi-empirique de Poisson-Boltzmann ayant la forme d'une énergie linéaire d'interaction, ou PB/LIE, appliqué à des conformations issues de simulations de DM en solvant explicite de complexes PDZ:peptide. Avec trois paramètres ajustables, le modèle reproduit correctement les affinités expérimentales de 41 variants, avec une erreur moyenne absolue de 0,4~kcal/mol, et donne des prédictions pour 10 nouveaux variants. Le modèle PB/LIE a ensuite comparé à la méthode non-empirique de calcul d'énergie libre par simulations alchimiques, qui n'a pas de paramètre ajustable et qui prédit correctement l'affinité de 12 complexes Tiam1:peptide. Ces outils et les résultats obtenus devraient nous permettre d'identifier des peptides inhibiteurs et auront d'importantes retombées pour l'ingénierie des interactions PDZ:peptide. / Small protein domains often direct protein-protein interactions and regulate eukaryotic signalling pathways. PDZ domains are among the most widespread and best-studied. They specifically recognize the 4-10 C-terminal amino acids of target proteins. Tiam1 is a Rac GTP exchange factor that helps control cellmigration and proliferation and whose PDZ domain binds the proteins syndecan-1 (Sdc1), Caspr4, and Neurexin. Short peptides and peptidomimetics can potentially inhibit or modulate its action and act as bioreagents or therapeutics. We used computational protein design (CPD) and molecular dynamics (MD) free energy simulations to understand and engineer its peptide specificity. CPD uses a structural model and an energy function to explore the space of sequences and structures and identify stable and functional protein or peptide variants. We used our in-house Proteus CPD package to completely redesign the Tiam1 PDZ domain. The designed sequences were similar to natural PDZ domains, with similarity and fold recognition scores comarable to the widely-used Rosetta CPD package. Selected sequences, containing around 60 mutated positions out of 90, were tested by microsecond MD simulations and biophysical experiments. Four of five sequences tested experimentally (by our collaborators) displayed reversible unfolding around 50°C. Proteus also accurately scored the binding specificity of several protein and peptide variants. As a more refined model for specificity, we parameterized a semi-empirical free energy model of the Poisson-Boltzmann Linear Interaction Energy or PB/LIE form, which scores conformations extracted from explicit solvent MD simulations of PDZ:peptide complexes. With three adjustable parameters, the model accurately reproduced the experimental binding affinities of 41 variants, with a mean unsigned error of just 0.4 kcal/mol, andgave predictions for 10 new variants. The PB/LIE model was tested further by comparing to non-empirical, alchemical, MD free energy simulations, which have no adjustable parameters and were found to give chemical accuracy for 12 Tiam1:peptide complexes. The tools and insights obtained should help discover new tight binding peptides or peptidomimetics and have broad implications for engineering PDZ:peptide interactions.

Les canaux potassiques sensibles à l'ATP (KATP) jouent un rôle primordial dans plusieurs processus cellulaires. La modulation de ces canaux par des molécules activatrices constituerait des applications pharmacologiques et médicinales très intéressantes. À cet effet nous avons conçu et synthétisé de nouvelles molécules hybrides cromakalim-diazoxide et diazoxide-amine/aminoacide. Nous avons également, évalué l'activité myorelaxante de ces composés sur l'aorte de rates. Les résultats obtenus ne montrent pas un effet myorelaxant significatif. Des études sur d'autres tissus, notamment les cellules β pancréatiques et le muscle utérin, sont envisagées afin d'explorer une éventuelle sélectivité tissulaire. Par ailleurs, les interactions protéine-protéine jouent un rôle fondamental dans presque tous les processus cellulaires. Elles sont fortement impliquées dans la formation de la structure dimérique de la protéase du VIH-1 et l'agrégation du peptide β amyloïde impliquée dans la maladie d'Alzheimer. L'inhibition de ces interactions serait donc d'un avantage thérapeutique pour le traitement du SIDA et de la maladie d'Alzheimer. Nous avons conçu et synthétisé d'une part, des pinces moléculaires à base de motifs carbonylhydrazides et oligohydrazides (Azatide), et d'autre part, des molécules pentapeptidiques avec un peudoaminoacide central alcoolfluoré. Enfin, nous avons testé la capacité des pinces moléculaires à perturber le feuillet β terminal de la PR du VIH-1 afin d'inhiber sa dimérisation et donc son activité. Nous avons réalisé de même une étude de relation structure-activité et d'après l'ensemble des résultats obtenus, il semblerait que la flexibilité est délétère pour l'activité inhibitrice. Nous avons également évalué la capacité des nouvelles molécules peptidomimétiques alcool fluorées à accélérer ou inhiber l'agrégation du peptide Aβ1-42 dans le but de diminuer la présence de petits oligomères neurotoxiques. Les résultats obtenus sont très prometteurs, nous avons réussi à développer d'une part un pentapeptide capable d'inhiber totalement l'agrégation de Aβ1-42, et d'autre part des pseudopentapeptides capables d'accélérer son agrégation. Nous avons aussi démontré l'influence de l'atome de fluor sur la structuration d'un pentapeptide. Des études par RMN et DC sont en cours.