Made available in DSpace on 2016-03-22T17:27:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AUDA.pdf: 3211252 bytes, checksum: 0ed314c1ec48a2480d869adc9b55b962 (MD5) Previous issue date: 2006-08-29 / Este estudio tuvo como objetivo general investigar el papel de la lengua materna en el proceso de aprendizaje, cuanto a los aspectos gramaticales, del español como lengua extranjera por lusohablantes. El estudio buscó verificar también la categoría gramatical en la que los alumnos cometieron más errores y qué errores fueron los más significativos en cada una de las categorías investigadas. Para lograr el objetivo, se tuvo como base el método Análisis de Errores (Corder, 1967). Se analisó los errores gramaticales cometidos en textos escritos en español un resumen y un texto disertativo - por un grupo de aprendices brasileños. Los informantes, alumnos del curso de Filología hispánica, se clasificaron en dos niveles de aprendizaje inicial y intermediario a partir de resultados obtenidos en un examen independiente de proficiencia. Los datos señalaron que el montante de errores fue alto y la interferencia de la lengua materna como causa de los errores también, aunque algunas otras estrategias, además de la lengua materna, hayan sido usadas por los informantes en su producción escrita en la lengua meta. Además de eso, se verificó que los errores gramaticales suplantaron los errores que causan problemas de comprensión del mensaje, destacándose el verbo como la categoría que registró el mayor número de errores gramaticales, seguida de las categorías preposiciones y pronombres personales . Los errores más significativos en cada categoría, es decir, los errores cometidos con más frecuencia por un mayor número de alumnos, señalaron las mayores dificultades del grupo / Este estudo teve como objetivo geral investigar o papel da língua materna no processo de aprendizagem de aspectos gramaticais do espanhol como língua estrangeira por falantes nativos de português brasileiro. O estudo também procurou verificar qual a categoria gramatical em que os alunos mais cometeram erros e quais os erros mais significativos em cada uma das categorias investigadas. Para isso, tendo como base o método Análise de Erros (Corder, 1967), foram analisados os erros gramaticais cometidos em textos escritos em espanhol um resumo e um texto dissertativo por um grupo de aprendizes brasileiros. Os informantes, alunos do curso de Letras, foram classificados em dois níveis de proficiência inicial e intermediário a partir dos resultados obtidos em um teste independente de proficiência. Os dados revelaram que o montante de erros foi alto e a interferência da língua materna como causa dos erros também, embora algumas outras estratégias, além do emprego de sua língua materna, também tenham sido usadas pelos informantes em sua produção escrita na língua alvo. Igualmente se verificou que os erros gramaticais suplantaram os erros que causam problemas de compreensão da mensagem, sendo a categoria verbo a que registrou o maior número de erros gramaticais, seguida das categorias preposição e pronome pessoal . Os erros mais significativos em cada categoria, ou seja, cometidos com mais freqüência por maior número de alunos, indicaram as maiores dificuldades do grupo

O uso de ensaios se faz necessário ao se entrar em regiões pouco exploradas pela teoria como uma importante ferramenta para sua validação. Ensaios aeroelásticos em túnel de vento, utilizando modelos em escala, podem ser realizados com o objetivo de se verificar os métodos analíticos, necessitando de um modelo que represente qualitativamente o problema ou, em um caso mais complexo, verificar o comportamento de uma aeronave real, sendo necessário um modelo representativo dessa, que necessariamente deverá receber ensaios que demonstrem, estática e dinamicamente, sua fidelidade à estrutura real. Neste trabalho, de posse de dados experimentais referentes a ensaios em túnel de vento previamente realizados, foi elaborada uma rotina de identificação modal, com a qual foi realizada a análise dos dados de ensaio supracitados. Utilizando-se modelos teóricos de uma aeronave em escala, foi também realizada uma comparação teórico-experimental, no intuito de se verificar a qualidade dos resultados teóricos obtidos. Foi também realizado um estudo de leis de similaridade aeroelásticas, com o qual se pode fazer a correlação entre o comportamento aeroelástico entre o modelos aeroelásticos em escala reduzida e uma aeronave real.

A investigação dos mecanismos de perdas ópticas no componente multi-camada, responsável pela geração primária de energia nos geradores solares de satélites artificiais, o Solar Cell Assembly - SCA, proporcionou a identificação de uma perda óptica adicional, causada por um tipo de defeito de fabricação até então ignorado, e o desenvolvimento de duas metodologias voltadas para a otimização do projeto e da fabricação de SCA's. A primeira delas possibilita analisar o desempenho de um SCA vizando minimizar as perdas óptica. A segunda, baseada na aplicação da técnica fototérmica da fotorefletância induzida por laser, está voltada para a detecção de defeitos em SCA's e para a análise das variações de parâmetros de interesse para a fabricação. A aplicação da primeira metodologia, ao SCA utilizado no Satélite Sino-Brasileiro de Recursos Terrestres - CBERS, demonstrou a existência de perdas ópticas elevadas neste SCA e apontou soluções que poderiam levar a um aumento significativo da potência gerada em órbita. A aplicação da segunda metodologia, ao mesmo SCA, identificou a existência de perdas por interferência óptica destrutiva causada por defeito de fabricação. A segunda metodologia permite, também, a quantificação das perdas por interferência óptica e a caracterização do defeito de fabricação que provoca essas perdas. As metodologias desenvolvidas possuem um potencial de aplicação para investigação de outros tipos de defeitos e em outro tipos de sistema multi-camada, não considerados neste trabalho de tese, sendo o horizonte de aplicações de natureza acadêmica muito mais amplo que o explorado no exemplo de aplicação prática utilizado neste trabalho. Essa é a primeira vez que se detecta e se quantificam perdas por interferência óptica em SCA e se disponibiliza uma metodologia para inspeção dessas perdas.

Face ao crescente uso de dispositivos eletrônicos portáteis, a Comissão Radio Técnica para Aeronáutica (RTCA) formulou um documento (DO-307) com orientações para o design e certificação de aeronaves para tolerância a dispositivos portáteis. Dentre os tipos possíveis de interferência desses dispositivos, são as emissões espúrias de radiofrequência que apresentam risco para o correto funcionamento da aeronave. A DO-307 estabelece um procedimento de teste e níveis de atenuação de sinal para cada faixa de frequência de operação de dispositivos críticos da aeronave. O presente trabalho aborda esse procedimento, e propõe pequenas alterações, e discute os resultados de um ensaio piloto realizado pela EMBRAER.

Muitas espécies de Leishmania são responsáveis por sérias doenças cutâneas e viscerais, que exibem alta incidência em regiões tropicais e subtropicais. Os medicamentos disponíveis são potencialmente carcinogênicos, requerem múltiplas administrações e a hospitalização do paciente. Um programa efetivo de desenvolvimento de novos fármacos requer a validação genética e bioquímica dos alvos. Neste contexto, uma das diferenças metabólicas mais marcantes entre os protozoários parasitas e o hospedeiro mamífero encontra-se na cadeia de síntese de purino-nucleotídeos. A enzima adenilosuccinato liase (ADSL), no hospedeiro mamífero, atua em duas etapas no metabolismo de purino-nucleotídeos: uma na via de síntese de novo e outra na via de recuperação. Esta característica particular da ADSL nos motivou a investigar como esta enzima poderia nos fornecer evidências sobre a evolução desta via metabólica em Kinetoplastida. Assim, os objetivos do presente trabalho foram validar a ADSL como potencial alvo terapêutico, através da técnica de RNA de interferência (RNAi), usando Trypanosoma brucei como modelo, bem como, caracterizar molecularmente o gene adsl-Lm e caracterizar bioquímica e estruturalmente a enzima recombinante de Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). Os resultados de RNAi demonstraram que a ADSL pode ser considerada um potencial alvo, uma vez que ela se apresentou essencial a viabilidade do parasita. Em relação à caracterização molecular do gene adsl-Lm suas regiões não traduzidas 5\'UTR e 3\'UTR foram definidas por RT-PCR, indicando que o RNA mensageiro maduro possui 2060 nucleotídeos. Análises com enzimas de restrição e eletroforese em campo pulsado (PFGE), seguidas de \"Southern blot\" revelaram que adsl-Lm trata-se de um gene de cópia simples e está localizado no cromossomo 4 deste parasita. O gene adsl-Lm foi clonado em um vetor de expressão e um protocolo de purificação da enzima recombinante foi estabelecido. A forma tetramérica da ADSL-Lm foi confirmada por eletroforese em gel nativo e por espalhamento dinâmico de luz (DLS). ADSL-Lm apresentou um pI experimental de 6,07 e exibiu atividade máxima no pH 8,5. Os parâmetros cinéticos de Km, Vmax , Kcat e eficiência catalítica (Kcat/Vm) foram determinados para o substrato adenilosuccinato. Experimentos de complementação funcional evidenciaram que ADSL-Lm foi capaz de complementar de maneira eficiente o genoma deficiente em ADSL da linhagem de E. coli JK268 (mutação purB58). Entretanto, esta complementação deve ocorrer na via de recuperação, uma vez que ensaios enzimáticos com o SAICAR (substrato da via de novo) mostraram que a enzima não retém atividade sobre este composto. Estes resultados indicam que provavelmente os tripanosomatídeos não representam um caso de perda da via de síntese de novo. Adicionalmente, ADSL-Lm foi cristalizada no grupo espacial tetragonal I4122, com parâmetros de cela unitária a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90°. A estrutura cristalográfica da ADSL-Lm foi resolvida por SIRAS (substituição isomórfica simples com dispersão anômala) usando um cristal nativo (2.2 \'angstron\') e um derivado de Gadolínio. O monômero é composto por três domínios em um enovelamento típico das enzimas da superfamília de -eliminação e é constituído quase exclusivamente por hélices- . Para o sitio ativo, três subunidades são requeridas e os resíduos envolvidos são His 153 (ácido geral), His 231 (base geral), Gln 308, Asn 364 and Glu 369. Entretanto, sem um ligante (substrato ou inibidor) no sítio ativo torna-se difícil estudar detalhadamente as interações entre a enzima e seus dois substratos. Desta forma, experimentos de co-cristalização e modelagem molecular podem auxiliar nesta questão. / Many species of Leishmania are responsible for serious visceral or skin diseases that exhibit high incidence in tropical and subtropical regions. The drugs currently employed in the treatment of parasitic diseases are potentially carcinogenic, often require prolonged treatment and patient hospitalization. An effective program of drug design requires the validation of the potential target. In this context, one of the most striking metabolic discrepancies between Trypanosomatidae and their human hosts is the purine nucleotide biosynthesis pathway. Adenylosuccinate lyase (ADSL) is a bifunctional enzyme that catalyses two non-sequential steps in this cycle (one in the de novo purine pathway and another in the salvage pathway). This particular ADSL feature motivated us to investigate if ADSL could give us information about purine biosynthesis evolution in Kinetoplastida. Hence, the present work is aimed to validate ADSL as a potential target using the RNAi (RNAi) technique, as well as to characterize the adsl gene and the recombinant enzyme from Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). The RNAi results proved that ADSL can be considered a potential target, because it is shown to be essential for parasite viability. Regarding the molecular characterization of the adsl-Lm gene, the mature mRNA transcript containing 2060 nucleotides was defined by 5\' and 3\'RT-PCR. Restriction analysis and Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) followed by Southern Blot hybridizations showed that adsl-Lm is a single copy gene and is located in chromosome 4 of this parasite. The adsl-Lm gene was cloned into an expression vector and a purification protocol of the recombinant enzyme was established. The tetrameric form of the recombinant ADSL-Lm enzyme was confirmed by native gel electrophoresis and Dynamic Light Scattering. ADSL-Lm has an experimental pI of 6.07 and exhibited maximum enzymatic activity at pH 8.5. The kinetic parameters of Km, Vmax , Kcat and kinetic efficiency (Kcat/Vm) were obtained for adenylosuccinate substrate. Functional complementation experiments showed that the adsl-Lm gene can effectively complement the E. coli JK268 purB58 mutation. However, this complementation must be in the salvage pathway, because enzymatic assays were performed using SAICAR (de novo pathway substrate) and ADSL-Lm did not convert this compound into product. This result indicates that probably Trypanosomatidae is not an example of de novo purine nucleotide cycle lost. In addition, ADSL-Lm was crystallized in the tetragonal I4122 space group, with unit cell parameters a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90° and diffracted beyond 2.2\'angstron\'. ADSL-Lm crystal structure has been determined by SIRAS (Single Isomorphous Replacement with Anomalous Dispersion), using both native and Gadolinium derivative crystals. The ADSL-Lm monomer is composed of three domains arranged in the elongated manner typical of enzymes in the p-elimination superfamily, and is constituted almost exclusively by helices. Three subunits are necessary to form the active site cleft and the residues His 153, His 231 (general bases), Gln 308, Asn 364 and Glu 369 are involved. Without a bound inhibitor or substrate, the specific contacts made by the enzyme to its two substrates cannot be analyzed in detail. Hence, co-crystallization and docking can help in this question.

Submitted by Filipe dos Santos (fsantos@pucsp.br) on 2016-12-02T13:42:46Z No. of bitstreams: 1 Eliane Alves de Sousa.pdf: 1490027 bytes, checksum: a27ab166d66a997aa6c233acf3699f1b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-02T13:42:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eliane Alves de Sousa.pdf: 1490027 bytes, checksum: a27ab166d66a997aa6c233acf3699f1b (MD5) Previous issue date: 2016-10-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Linguistic studies, due to the advent of interactive digital media and the increasing use of technology in communication, currently involve texts with meanings expressed through complex, dense and multimodal ways. For example, there is, as a result, a close interrelation between some areas of knowledge, which have their own criteria to judge a piece of information as useful and effective. This fact is known as "speech interference" with different requirements coming from each domain. The objective of this doctoral dissertation is a critical examination of the interference of speech in multimodal texts, about issues about obesity, to see how different domains of knowledge - science, news media and food company - have been manifested on the subject and to examine the persuasive elements that recur in their positions. The research should answer the following questions: (a) with reference to the issue of obesity, what are the persuasive resources employed by these domains? and (b) what role does the language-image-color relationship have in this process? In accordance with many studies on multimodal studies, I also use for my analysis the sociosemiotic systemic-functional theory, known as Systemic Functional Linguistics. The theory holds the notion of Appraisal - the author's view on the message content, and on the interlocutor, and has been indicated by many researchers for critical discourse analysis. The results show the persuasion strategies present in the construction of the multimodal text, which can contribute to the development of a critical awareness concerning my high school students at the State Public System / Os estudos linguísticos, devido ao advento da mídia digital interativa e ao crescente uso da tecnologia na comunicação, envolvem atualmente textos com significados expressos por meio de formas complexas, densas e multimodais. Há, assim, por exemplo, uma interrelação estreita entre alguns domínios de conhecimento, que têm seus próprios critérios para julgar uma informação como útil e efetiva. Esse fato foi chamado de "interferência de discursos", com requisitos diferentes vindos de cada domínio. O objetivo desta tese é o exame, de cunho crítico, da interferência de discursos, em texto multimodal, nas questões que cercam a obesidade, para verificar como diferentes domínios do conhecimento – ciência, mídia jornalística e empresa de alimentos – têm-se manifestado sobre o assunto e os elementos persuasivos a que recorrem em seus posicionamentos. A pesquisa deve responder às seguintes perguntas: (a) com referência à questão da obesidade, quais são os recursos persuasivos empregados por esses domínios?; e (b) que papel tem a relação língua-imagem-cor nesse processo? Em conformidade com muitas pesquisas realizadas nos estudos multimodais, adoto também para minhas análises a teoria sistêmico-funcional da sociossemiótica, conhecida como Linguística Sistêmico-Funcional. A teoria abriga em seu bojo a noção de avaliatividade - o posicionamento do autor sobre o conteúdo da mensagem, bem como sobre o interlocutor, e tem sido indicada por vários pesquisadores para a análise do discurso crítica. Os resultados mostram as estratégias de persuasão presentes na construção do texto multimodal, que podem contribuir para o desenvolvimento da consciência crítica dos meus alunos do Ensino Médio da Rede Pública do Estado

A raiva é uma zoonose que afeta todos os mamíferos e causa cerca de 55.000 mortes humanas por ano, causada pelo vírus da raiva. O vírus da raiva pertence à Ordem Mononegavirales, Família Rhabdoviridae e o Gênero Lissavirus. Atualmente, o tratamento humano se baseia no uso do Protocolo de Milwaukee composto de indução do paciente ao coma e uso de massiva terapia antiviral. O protocolo, apesar de ter sido utilizado duas vezes com sucesso, inclusive em um caso brasileiro, ainda requer aprimoramentos. Neste sentido, a interferência por RNA (RNAi) é uma nova abordagem para terapia de doenças virais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a inibição da replicação do vírus da raiva in vitro e in vivo utilizando RNAi. Para tanto, foram utilizados três siRNAs (siRNA 124, siRNA 750, siRNA B) com a fita antisenso complementar ao mRNA da nucleoproteína (N) do vírus da raiva. Para o ensaio in vitro foram utilizadas a cepa PV do vírus da raiva e as células de BHK-21 (Baby hamster kidney). As monocamadas celulares foram infectadas com a cepa PV e depois de 2 horas de incubação transfectadas com cada um dos siRNAs em combinação com Lipofectamine 2000®. Depois de 22 horas as placas teste e controle foram submetidas à imunofluorescência direta (IFD) com conjugado globulina de coelho anti-nucleocapsídeo do vírus da raiva/isotiocianato de fluoresceína (BIO-RADTM). Os resultados revelaram títulos de 5,71logTCID50/ml, 5,56logTCID50/ml e 5,65logTCID50/ml para os siRNAs 124, B e 750, respectivamente, enquanto que, para a placa controle, o título foi 6,43logTCID50/ml. Para o ensaio in vivo, foram usados camundongos albino suíços de 21 dias com peso entre 11 e 14g, infectados com a cepa PV via intracerebral. Duas horas depois da infecção foi inoculada por via intracerebral uma solução do \"pool\" dos três siRNAs com Lipofectamine 2000® . Os animais com paralisia foram sacrificados e aqueles sobreviventes foram observados até completar 30 dias de observação quando foram, então, sacrificados. O sistema nervoso central de todos os animas foi recolhido e submetido a IFD. O título viral do grupo teste foi 7.03logLD50%/ml e do grupo controle 7.13logLD50%/ml. O resultado do ensaio in vitro demonstra que os siRNAs utilizados são efetivos em inibir a replicação do vírus da raiva, com eficiências equivalentes. A utilização do \"pool\" dos três siRNA em camundongos resultou em 30% de animais sobreviventes frente a 100 DL50% do vírus PV, enquanto que a mesma dose levou a 100% de mortalidade nos animais não tratados. Pode-se atribuir a menor eficiência em inibir a replicação do vírus da raiva in vivo quando se compara com os resultados in vitro possivelmente às elevadas doses virais utilizadas. Estes resultados, ainda que indiquem a necessidade de mais estudos, permitem concluir que a RNAi é uma tecnologia promissora como antiviral contra a raiva. / Rabies is a zoonotic disease that affects all mammals and causes more than 55.000 human deaths every year, caused by rabies virus (RABV) a virus of the Mononegavirales order, Family Rhabdoviridae and the Lissavirus genus. After the onset of the symptoms, the illness has a fast progression and the patients feel intense physical suffering. Currently, human rabies treatment has been based on the Milwaukee Protocol which consists on the induction of coma and massive antiviral therapy. Despite this protocol has been successful in two cases, including a Brazilian case (Recife State), more studies on antiviral for human rabies treatment are required. RNA interference is a new antiviral approach, which gives hope to the possibility of rabies antiviral treatment. The aim of this study was to assess the decrease in the titer of rabies virus in vitro and in vivo using short-interfering RNAs. For this purpose, three siRNAs (siRNA 124, siRNA B, siRNA 750) were used with antisense strands complementary to rabies virus nucleoprotein (N) mRNA. Pasteur virus strain (PV) of rabies virus and BHK-21 cells were used, and the monolayers were transfected with each of tree RNAs with Lipofectamine-2000. After 22 hours, the siRNA-treated and the control plates were tested by direct fluorescent antibody test (DFAT) with anti-rabies virus nucleocapsid antibody conjugate with fluorescein isothiocianate. Virus titers were calculated by the Spearman-Karber method. The results revealed that all three siRNAs reduced the titer of PV strain and a more intense effect was obtained with siRNA B. The titer of the PV strain in the control plate was 6.43lg TCID50%/ml and 5.56lg TCID50%/ml in the plate treated with siRNA B, respectively. The similar result was obtained in plates treated with siRNAs 124 and 750. The title of PV strain of these plates was 5.71lg TCID50%/ml of siRNA 124 and 5.65lg TCID50%/ml of siRNA750, respectively. No cytopathic or cytotoxic effect was observed in the monolayers treated with Lipofectamine-2000®. Swiss albino mice with 21 days weighing between 11 and 14g infected with strain PV by the intracerebral route used in this in vivo essay. After two hours of infection, a pool solution of 3 siRNAs with lipofectamine was also inoculated by the intracerebral route. The animals with paralysis were euthanized and those which survived were observed until the 30th day when they were also euthanized. The central nervous system of all animals were collected and induced to IFD. The title viral test group was 7.03logLD50%/ml and the control group was 7.13logLD50%/ml. The in vitro test results indicate that siRNAS are effective in inhibiting the replication of rabies virus with similar efficiencies. The use of the pool of three siRNA in mice resulted in 30% of survivors for 100 LD50% of PV virus, while the same dose led to 100% mortality in untreated animals. A lower efficiency in inhibiting the replication of rabies virus in vivo when compared with results in vitro could be possibly due to the high viral doses used. These results, although indicative of the need for further studies, show that RNAi is a promising technology as antiviral against rabies.

O Brasil é o maior produtor de laranja doce no mundo. Entretanto, a cultura enfrenta grandes problemas, devido ao ataque de pragas e doenças, o que reduz a produtividade da cultura. Entre estas doenças, destaca-se o huanglongbing (HLB), doença associada a três espécies da bactéria Candidatus Liberibacter. No Brasil, o psilídeo Diaphorina citri é o inseto transmissor do HLB. A falta de cultivares de laranja doce resistentes ao HLB torna a transformação genética de plantas uma medida em potencial para o controle desta doença. Plantas transgênicas de laranja doce expressando um RNA de dupla fita (dsRNA) de um gene essencial à sobrevivência de D. citri podem resultar no controle do inseto por meio do mecanismo de RNA de interferência. Tal mecanismo resulta na degradação do RNAm homólogo ao dsRNA. Este trabalho teve por objetivo produzir plantas transgênicas de laranja doce, expressando um fragmento do gene DcV-ATPase-A de D. citri, em uma construção gênica tipo hairpin. Dessa forma, o silenciamento gênico por RNA de interferência seria ativado no psilídeo quando este for submetido à alimentação nas plantas transgênicas. O trabalho foi iniciado com a elaboração da construção gênica contendo uma sequência repetida e invertida do gene DcV-ATPase-A de D. citri, para formação de um hairpin. Segmentos de epicótilo, provenientes de sementes germinadas in vitro das laranjas \'Hamlin\', \'Pêra\' e \'Valência\' (Citrus sinensis L. Osbeck) foram utilizados como fontes de explantes para a transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Paralelamente aos experimentos de transformação genética, insetos adultos de D. citri foram submetidos a experimentos de alimentação artificial, contendo RNA de dupla fita (dsRNA) ou pequenos RNA interferentes (siRNA) da DcV-ATPase-A. Ao final do período de alimentação, foram avaliadas o número de insetos vivos e a expressão relativa do RNAm da DcV-ATPase-A. Através de PCR e Southern blot, a transgenia foi confirmada em 26 e 39 plantas de laranja \'Hamlin\' e \'Valência\', respectivamente. A transgenia não foi confirmada nas plantas regeneradas de laranja \'Pêra\'. O número de inserções no transgene variou de 1 a 4 cópias. A produção dos siRNAs foi confirmada em 10 plantas de laranja \'Valência\', através de siRNA blot. O uso de dietas artificiais contendo dsRNA ou siRNA do gene DcV-ATPase-A não resultou em diferenças significativas no número de insetos vivos, ou no nível de expressão relativa do RNAm do gene DcV-ATPase-A em insetos adultos de D. citri. / Brazil is the largest sweet orange producer in the world. However, this crop faces major problems due to the attack of pests and diseases that reduce its productivity. Among the diseases, stands out the huanglongbing (HLB), disease associated with three different species of the Candidatus Liberibacter bacteria. In Brazil, the psyllid Diaphorina citri is the insect vector of HLB. The absence of resistant sweet orange cultivars to HLB makes the genetic transformation of plants a potential methodology to control this disease. Sweet orange transgenic plants engineered to express double strand RNA (dsRNA) of an essential gene for D. citri survival could result in insect control by RNA interference. This mechanism results in degradation of homologous RNAm to dsRNA. The aim of this work was to produce transgenic sweet orange plants expressing a fragment of D. citri DcV-ATPase-A gene, in a hairpin construction aiming gene silencing by RNA interference in D. citri, when fed on sweet orange transgenic plants. The work started developing a gene construct containing an inverted and repeated sequence of DcV-ATPase-A gene, to form a hairpin. Epicotyl segments collected from in vitro germinated seedlings of \'Hamlin\', \'Pêra\' and \'Valência\' sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) were used as explants for the genetic transformation experiments via Agrobacterium tumefaciens. At the same time, adults of D. citri underwent artificial diet experiments containing dsRNA or siRNA of DcV-ATPase-A. At the end of feeding time, the survival of insects and the relative expression of DcV-ATPase-A RNAm were evaluated. Through PCR and Southern blot analysis, 26 \'Hamlin\' and 39 \'Valência\' sweet orange transgenic lines were confirmed. None of the regenerated \'Pêra\' plants were transgenic. The transgenic plants had 1 to 4 T-DNA insertions. The siRNA products were observed in 10 \'Valência\' plants, through siRNA blot. The artificial diets containing dsRNA or siRNA of DcV-ATPase-A resulted in no differences in the number of live insects and in the relative expression of DcV-ATPase-A RNAm in adult insects.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura na produção de alimentos e energia. Várias espécies de insetos podem causar sérios prejuízos econômicos à cultura da cana-de-açúcar. A broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis) é a praga de maior relevância por estar amplamente distribuída nas regiões canavieiras. O silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) se tornou uma técnica amplamente estudada e utilizada nos mais diversos aspectos da biologia. Uma de suas aplicações é no controle de insetos-praga como uma alternativa de alta eficiência, especificidade e reduzido impacto ambiental. A ingestão de moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) com identidade a regiões de genes essenciais de insetos-praga pode resultar no silenciamento destes genes, levando a fenótipos deficientes. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo buscar genes alvos para o silenciamento com potencial para impedir o desenvolvimento normal da D. saccharalis e estabelecer uma forma de entrega do dsRNA eficiente para o teste de genes, visando assim validar o uso da técnica para a espécie. Por meio da clonagem de regiões de genes ortólogos já utilizados como alvo de silencimento em outras espécies de insetos (V-ATPase A, Receptor de Ecdisona e Arginina Kinase), e de genes com função específica identificadas após a caracterização do transcritoma de D. saccharalis (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland e Quitina Sintase) foram conduzidos ensaios de RNAi. Foram realizados ensaios de dose resposta para o gene V-ATPaseem lagartas neonatas, onde a concentração selecionada por causar melhor redução na expressão do gene alvo foi de 2,5 µg µL-1. Esta concentração foi então utilizada em ensaios de alimentação para os outros genes. Os genes V-ATPase A, receptor de Ecdisona, Arginina Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase e Quitina Sintase apresentaram redução significativa no número de transcritos em larvas, demonstrando a viabilidade do uso de RNAi em D. saccharalisneonatas. O gene Neverland não demonstrou redução no acúmulo de transcritos nas condições trabalhadas. O gene GFP inicialmente utilizado como controle negativo apresentou variação na expressão de genes alvo, sendo desconsiderado como bom controle para D. saccharalis. O silenciamento dos genes alvo requer quantidades elevadas de dsRNA, superiores aos obtidos por transcrição in vitro, o que limita a viabilidade de ensaios com maiores replicatas e para determinar efeitos biológico. Alternativas de produção de dsRNA devem ser avaliadas para viabilizar a seleção de genes alvo efetivos / Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop for the production of food and bioenergy. Many insect species can cause economic losses in sugarcane. The sugarcane borer (Diatraea saccharalis) is the most important sugarcane pest, because it occurs in all production regions. Gene silencing by RNA interference (RNAi) rapidly became a widely investigated approach, adopted in various aspects of biology. One of the potential applications of RNAi is agricultural pest control, as an alternative with high efficiency, specificity and reduced environmental impact. The ingestion of double-stranded RNA (dsRNA) molecules with identity to regions of essential genes of the insect-pest can result in the target gene knock-down and, consequently, to deficient phenotypes. In the present work, target genes with the potential to affect the normal development of D. saccharaliswere searched, together with an efficient dsRNA delivery approach to test the target-genes to validate the use of the RNAi in D. saccharalis. Based on degenerated primers, expressed orthologous genes previously tested in other insect species (V-ATPase A, Ecdisone Receptor, and Arginine Kinase) were cloned,whilegenes with specific function (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland, and Chitin Synthase) were identified from an in-house assembled transcriptome of D. saccharalis and cloned. A dose-response assay was conducted using the V-ATPase gene region delivered by droplets to neonate larvae, and the 2.5 µg µL-1dsRNA concentration was selected for further tests. This concentration was then used to deliver the other genes. The dsRNA version from the genes V-ATPase A, Ecdisone Receptor, Arginine Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase and Chitin Synthaseexhibited a significant reduction in the accumulation of transcripts, indicating the viability of RNAi to D. saccharalis in 1st instar larvae. The Neverland gene was not silenced by RNAi in the used conditions. The dsRNA of the Green Fluorescent Protein gene, used as negative control appeared to affectother gene targets. Target gene silencing require large amounts of dsRNA, more than what is achievable by in vitro transcription, which limits the viability to conduct large assays with more replicates and to determine biological effects. Alternatives to produce dsRNA need to be evaluated to enable the selection of effective target genes

Orientador: Gustavo Michel Mendoza La Torre / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Física, 2009.