L'asthme est une maladie respiratoire chronique à trait complexe, c'est-à-dire possédant une composante génétique et une composante environnementale. Plusieurs gènes ont démontré leur implication dans la physiopathologie, mais une part de l'héritabilité de la maladie est toujours manquante. L’épigénétique pourrait contribuer à documenter une fraction de cette héritabilité. Parmi les gènes associés à l’asthme, la majorité exerce des fonctions connues qui sont reliées à l’activité de certaines cellules impliquées dans la physiopathologie du trait notamment la cellule épithéliale bronchique qui forme la première barrière contre les allergènes et les pathogènes de l'environnement. Ce type cellulaire est aussi reconnu pour sa composante immunologique puisqu'il peut sécréter des médiateurs de l'inflammation dont l'interleukine (IL) 33, l’un des gènes les plus rapportés comme étant associés à l’asthme. L’objectif du présent projet était d’évaluer l’impact de la méthylation de l’IL33 et de deux autres gènes de sa voie biologique (interleukin-1 receptor like 1 (IL1RL1) et éotaxine-3 (CCL26)) dans des cellules épithéliales bronchiques isolées de biopsies bronchiques d’individus asthmatiques. Ainsi, la méthylation de l'ADN a été mesurée chez 10 individus asthmatiques et 10 individus sains. Les promoteurs des gènes IL33 et CCL26 ont démontré un niveau de méthylation plus faible chez les personnes asthmatiques (Δβ=15%, p=0,005; Δβ=5%, p=0,009). Il a aussi été possible d'observer une expression génique plus élevée de CCL26 chez les individus asthmatiques (augmentation de 1,5 fois; p=0,04) et une tendance semblable pour les deux autres gènes malgré une absence de significativité (IL33 : augmentation de 4,3 fois; p=0,09; IL1RL1: augmentation de 1,5 fois; p=0,06), ce qui est en accord avec les résultats de méthylation. Finalement, le séquençage d'IL33 et de CCL26 a permis d'identifier 12 polymorphismes (SNP) dont trois d'entre eux étaient associés à une différence de méthylation pour le gène IL33 (Δβ=14%, p=0,05). Les résultats obtenus démontrent l'importance d'étudier le patron de méthylation des gènes associés au trait et de faire le lien de celui-ci avec la structure génétique des gènes ciblés afin de contribuer à documenter une partie de l’héritabilité inexpliquée de l’asthme.

Les traitements par immunothérapie adoptive actuels sont compromis par une faible infiltration et expansion des LT CD8 injectés. Les travaux antérieurs de l'équipe ont montré une synergie entre les signaux du TCR et du récepteur à l'IL-2 pour la différenciation en Lymphocytes T (LT) effecteurs compétents, un effet qui peut être mimé par une forme constitutivement active du facteur de transcription STAT5 (STAT5CA). Mon projet de thèse à viser à exprimer ce STAT5 actif dans des LT CD8 anti-tumoraux dans le but d'augmenter leur réactivité. Nous démontrons que STAT5CA soutient l'expression de gènes contrôlant la migration, la survie, la composition des granules cytolytiques, la sécrétion de cytokines de type Tc1 (IFNy/TNFα) et leur potentiel de réponse secondaire. Les LT modifiés par STAT5CA sur-expriment les facteurs de transcription T-bet et Eomes qui sont associés respectivement à la différenciation en LT effecteur mémoire et central mémoire. Le potentiel cytolytique et migratoire des LT modifiés par STAT5CA rend ces cellules plus efficaces que des LT contrôlent pour induire une régression tumorale dans des modèles de mélanome transplanté ou induit (modèle TiRP). Ces résultats suggèrent une résistance accrue aux mécanismes d'immunosuppression intra-tumoraux. Contrairement aux LT contrôles, les LT modifiés par STAT5CA sous-expriment l'IL-6Rα et le TGFβRII et ont une moindre sensibilité à l'action immunosuppressive des cytokines IL-6 et TGFβ1. / Adoptive therapies are compromised by poor infiltration and expansion of injected CD8 T cells. Previous work in our team has demonstrated that signals from TCR and IL-2 receptor are acting in synergy to promote the differentiation of CD8 T cells. Moreover, this IL-2 effect can be mimicked by a constitutive active form of STAT5 (STAT5CA). During my PhD, I expressed this active STAT5 in anti-tumor CD8 T cells in order to enhance their activity. We demonstrated that STAT5CA sustains gene expression involved in migration, survival, cytolytic granules composition, Tc1 cytokine secretion (IFNy/TNFα) and secondary response potential. T cells transduced with STAT5CA up-regulate expression of the transcription factors T-bet and Eomes which are involved respectively in effector or central memory T cell differentiation. Cytolytic and migratory properties of STAT5CA T cells contribute to their capacities to induce regression of both transplanted and induced (TiRP model) melanomas, while control T cells were inefficient. Those results suggest that STAT5CA T cells are less sensitive to tumor-derived immunosuppression. Compared to control T cells, STAT5CA T cells show a down-regulation of IL-6Rα and TGFβRII which correlate with their decreased sensitivity to IL-6 and TGF1 derived immunosuppression. Moreover, STAT5CA T cells infiltrate lung, liver and pancreas which open possible treatments for highly frequent tumors that are not efficiently cured.

Pour ses activités immuno-activatrices, l’Interleukine-15 (IL-15) est actuellement considérée comme un candidat de choix pour le traitement des tumeurs solides, en particulier le carcinome rénal, une tumeur très agressive et résistante aux chimio- et immunothérapies. Bien qu’actuellement testée en essai clinique, les fonctions de la cytokine sur la composante rénale restent peu étudiées. Dans ces travaux, nous avons évalué le rôle de l’IL-15 sur les cellules épithéliales rénales normales et tumorales ainsi que sur une sous-population de cellules souches du cancer (CSC) très résistante aux thérapies conventionnelles. Nos résultats montrent que l’IL-15 induit la différenciation des CSC rénales en cellules épithéliales non tumorigéniques et plus sensibles aux agents cytotoxiques, confortant ainsi l’utilisation de la cytokine dans des stratégies anti-tumorales. Nos travaux révèlent cependant que l’IL-15 favorise la transition épithélio-mésenchymateuse des cellules du carcinome rénal, une action pro-tumorale à considérer dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques. / The ability of Interleukin-15 (IL-15) to activate many immune antitumor mechanisms makes it a good candidate for application in solid tumors therapy, particularly renal cell carcinoma which is a highly aggressive and resistant cancer. Although IL-15 is being currently used in clinical trials, the function of the cytokine on the kidney’s components is poorly described. In this work, we evaluated the role of IL-15 on renal normal and tumor epithelial cells as well as a subpopulation of cancer stem cells (CSC) highly resistant to conventional therapies. Our results show that IL-15 induces the differentiation of renal CSC in non-tumorigenic epithelial cells more sensitive to cytotoxic agents, supporting the use of the cytokine in antitumor strategies. Our experiments show, however, that IL-15 promotes epithelial-mesenchymal transition of renal cell carcinoma cells, a pro-tumor action to be highly considered in the development of new therapeutic approaches.

Nos travaux décrivent l’identification et la caractérisation d’une cellule immunitaire : l’IKDC pour Interferon Producing killer dendritic cell. Cette population cellulaire, découverte à la faveur de la combinaison Imatinib mesilate et Interleukine 2 dans le traitement des métastases pulmonaires de mélanome B16F10 chez la souris, combine des caractéristiques de cellule dendritique (présentation antigénique) et de cellule natural killer (lyse sans apprentissage). Le phénotype des IKDC est le suivant :CD3-, CD19-, CD11c+,B220+, NK1.1+. Nous avons établi une stratégie de culture des IKDC ex vivo grâce à la trans-présentation de l’IL-15 et montré que ces cellules sont capables de présenter des antigènes aux lymphocytes T et de vacciner une souris contre une tumeur. Ce projet se poursuit par la mise en place d’un essai clinique de phase I utilisant Imatinib mesilate et l’Interleukine 2. / In this manuscript, we describe the isolation and the characterisation of a novel immune cell: the IKDC for Interferon Producing killer dendritic cell. This cell population, discovered thanks to the combination Imatinib mesilate and Interleukine 2 for the treatment of lung metastases of B16F10 murine melanoma, shares dendritic cell (antigen presentation) and natural killer cell (non specific lysis) properties. IKDC phenotype is the following: CD3-, CD19-, CD11c+, B220+, NK1.1+. We established a culture strategy for the IKDC ex vivo thanks to the trans-presentation of IL-15 and demonstrated that these cells once cultivated are able to prime lymphocytes and to protect mice from tumor development. This project has led to a phase I clinical trial testing the antitumor effect of the combination Imatinib mesilate and Interleukin 2.

Cette thèse s’inscrit dans le cadre de la thématique du laboratoire de Pharmacognosie de l’UFR Santé, au sein de l’Université de Bourgogne. Elle vise essentiellement la recherche de molécules d’origine végétale issue de la biodiversité tropicale dotées d’une activité antitumorale et immuno-modulatoire dont principalement les saponines. Ce sont des glycosides triterpéniques ou stéroïdiques connus pour leurs nombreuses propriétés pharmacologiques. L’étude de 4 espèces végétales appartenant à 3 familles à savoir Dracaena marginata L., Dracaena fragrans Ker Gawl (Asparagaceae), Allium flavum L. (Amaryllidaceae) et Weigela stelzneri (Caprifoliaceae),a conduit à l’isolement et à la caractérisation de 26 glycosides naturels. Il s’agit de 22 saponines stéroïdiques parmi lesquelles 6 sont de structure nouvelle ainsi que 4 saponines triterpéniques dont 3 nouvelles. Les structures ont été élucidées principalement par l’utilisation de la RMN 2D ainsi que la spectrométrie de masse. 10 des 26 molécules isolées ont été testées en vue d’évaluer leurs activités cytotoxiques sur deux lignées cellulaires cancéreuses (SW480 et EMT-6), et 3 pour l’étude de la modulation de la production d’une cytokine pro-inflammatoire, l’interleukine IL-1β sur cellules PBMC stimulées par le LPS. Nos résultats montrent que 6 d’entre elles possèdent une activité cytotoxique modérée sur les deux lignées cancéreuses. En revanche, deux saponines triterpéniques de type oléanane exercent les plus fortes cytotoxicités sur les deux lignées cancéreuses comparées à celles des références internes (Etoposide et Methotrexate). De plus elles révèlent un important effet de modulation de la production de l’interleukine IL-1β sur cellules PBMC et de ce fait, un fort potentiel anti-inflammatoire. Des relations structure/activité ont été ainsi proposées. / This thesis was carried out in the Laboratory of Pharmacognosy, in health department of the University of Burgundy. The principal theme of this Laboratory is the research of natural compounds from tropical biodiversity, mainly saponins with antitumoral and immunomodulatory activities. These molecules are triterpenic or steroidic glycosides, well known for their various pharmacological activities. The study of 4 species belonging to 3 different families: Dracaena marginata L., Dracaena fragrans Ker Gawl (Asparagaceae), Allium flavum L. (Amaryllidaceae) et Weigela stelzneri (Caprifoliaceae), led to the isolation and characterization of 26 natural glycosides. Among them, 22 were steroidic saponins with 6 new structures and 4 were triterpenic saponins with 3 new structures. The spectral analysis was achieved using mainly 2D NMR and mass spectrometry. The cytotoxic activities of 10 isolated compounds were evaluated on 2 strains cancer cells (SW480 and EMT-6), and 3 compounds for studying the modulatory effect of the production of pro-inflammatory cytokine, interleukin IL-1β on PBMCs stimulated with LPS. Our results show that six of them have moderate cytotoxic activity on both cancer cell lines. However, two oleanane-type triterpene saponins exert the strongest cytotoxicity on both cancer cell lines compared to internal references (Etoposide and Methotrexate). Moreover they show a significant effect of modulating the production of interleukin IL-1β on PBMCs and thereby a strong anti-inflammatory potential. Structure / activity relationships have been proposed.

L’IL-17 est une cytokine essentielle dans la défense de l’organisme contre de nombreuses bactéries pathogènes extracellulaires, comme Siaphylococcus aureus qui est un agent majeur des mammites des ruminants, en agissant en particulier sur les cellules épithéliales. L’objectif du travail était de tester l’hypothèse d’un rôle de i’IL-17 dans la protection de la mamelle en caractérisant la réponse des cellules épithéliales mammaires bovines (CEMb) à l’IL-17A et à l’IL-17F. Ces cytokines bovines ont été utilisées seules ou en combinaison avec des agonistes du système immunitaire inné produits par S. aureus, le muramyl dipeptide (MDP) et l’acide lipotéichoïque (LTA). Une première étude a montré que le LTA et le MDP exercent un effet synergique dans la mamelle et sur les CEMb en culture. Le tissu mammaire et les CEMb expriment le récepteur pour l’IL-l7A et F, et les CEMb ont répondu à i’lL-l7A et l’IL-l7F, bien que de façon modérée. Les réponses ont été sensiblement augmentées par la combinaison de l’IL-17 avec le LTA ou le MDP. Les réponses se caractérisent par une production de chimiokines capables d’attirer les polynucléaires neutrophiles et les leucocytes mononucléés, ainsi que par une surexpression de gènes à activités antibactériennes. Par contre, les CEMb ne produisent pas de cytokines inflammatoires. Ces résultats indiquent que i’IL-l7 est adaptée à un fonctionnement en milieu septique et ales capacités pour jouer un rôle dans la protection de la mamelle contre les infections staphylococciques. / Through its activity on epithelial cells, interleukin-17 is a pivotai cytokine for the host defense against several extracellular pathogens, such as Siaphylococcus aureus that is a major agent of mastitis of ruminants. The investigation aimed at evaluating the role of IL-17 in udder protection by characterizing the response of bovine mammary epithelial cells (bMEC) to IL-17A and IL-17F. These bovine cytokines were used either alone or in combination with one of two innate immune system agonists associated with S. aureus, muramyldipeptide (MDP) or lipoteichoic acid (LTA). The first study showed that LTA synergized with MDP to recruit neutrophils in the mammary gland and to stimulate bMEC. A second study established that mammary tissue and bMEC in culture express the IL-17 receptor, and that bMEC respond to IL-17A and IL-17F, although with a moderate intensity. The response was noticeably augmented by the combination of IL-17 with LTA or MDP. The response was characterized by the production of chemokines able to attract neutrophils but also mononuclear leukocytes, as well as by an overexpression of genes endowed with antibacterial activity. Remarkably, bMEC did not release pro inflammatory cytokines. These results indicate that IL-17A and IL-17F are well suited for operating in a septic environment and have the potential to play a role in udder protection against staphylococcal infections.

Certains marqueurs inflammatoires augmentent en concentration chez les sujets avec maladie coronarienne athérosclérotique. Le système inflammatoire pourrait également être modifié par un effort exhaustif prolongé (marathon) ou l'activité physique régulière. L'impact d'un exercice court et intense sur l'activation du système inflammatoire, chez les sujets sains d'âge mûr, sans évidence d'ischémie myocardique, n'est pas bien défini, tout comme l'évaluation de leur condition vasculaire. Chez ces sujets, une épreuve d'effort maximale sur tapis roulant a causé l'augmentation de ces marqueurs et médiateurs inflammatoires : protéine C-réactive (CRP), interleukine-6 (IL-6), interleukine-18 (IL-18) et myeloperoxydase (MPO). Pour la première fois, il est démontré que l'exercice bref et intense activerait significativement le système inflammatoire, chez des sujets matures asymptomatiques sans évidence d'ischémie à l'exercice. Immédiate et transitoire, cette réaction suggère une réponse physiologique de l'organisme. Dans un deuxième temps, des mesures échographiques vasculaires estimant la fonction endothéliale et l'épaisseur de l'intima-média carotidienne ont été prises, lesquelles contribueront aux connaissances portant sur la condition vasculaire et viennent compléter notre investigation sur le portrait inflammatoire du sujet sain d'âge mûr.

Les progresseurs lents du VIH-1 sont de rares sujets asymptomatiques pendant plusieurs années sans thérapie antirétrovirale. Parmi ces sujets à progression lente vers le SIDA, il est possible qu’un sous-groupe perde le contrôle de leur infection après plusieurs années de contrôle. Notre laboratoire a analysé l’expression différentielle de différentes protéines et voies moléculaires associées à la perte de contrôle de l’infection: l’interleukine-32 (IL-32) est une cytokine pro-inflammatoire dont le niveau des isoformes alpha et delta a significativement diminué chez les progresseurs lents lors de la perte de contrôle. Par ailleurs, des études antérieures ont attribué, de façon intrigante, à l’IL-32 aussi bien des propriétés anti-VIH-1 que des propriétés immunosuppressives induisant un environnement propice à la réplication du VIH-1. Ce projet de maitrise s’est penché sur l’implication de l’IL-32 dans la progression de l’infection à VIH-1 avec un accent particulier sur les progresseurs lents. Nous avons principalement mesuré les niveaux d’IL-32 des sujets séropositifs comparativement aux sujets VIH négatif et estimé les fonctions de cette cytokine à travers des études longitudinales et de corrélation. Nous avons observé que l’IL-32 total demeure plus élevé chez les séropositifs comparativement aux sujets VIH négatif. Également, l’infection par le VIH-1 entraine une augmentation du niveau d’IL-32 total. De plus, après une année de thérapie antirétrovirale, les taux plasmatiques d’IL-32 total demeurent significativement plus élevés que ceux des sujets VIH négatif. Comme attendu, le taux d’IL-32 total augmente lors de la perte de contrôle de l’infection chez les progresseurs lents. Une forte concentration plasmatique d’IL-32 total coïncide avec: 1) une augmentation du taux plasmatique de sCD14 et de la cytokine pro-inflammatoire IL-6, 2) une baisse du compte cellulaire CD4 et une augmentation de la charge virale. Un taux plasmatique élevé de CCL5 pourrait prédire une faible concentration d’IL-32 total. L’isoforme alpha de l’IL-32 est plus élevée dans le plasma des sujets VIH négatif tandis que l’IL-32 gamma semble induire un environnement pro-inflammatoire et immunosuppressif. Il ressort à l’issue de ces observations que l’augmentation de l’IL-32 total est associée à la progression de l’infection à VIH-1 et pourrait constituer un biomarqueur permettant d’apprécier le pronostic de cette infection. / HIV-1 slow progressors constitute a rare population of subjects who remain asymptomatic for many years without antiretroviral therapy. Among this population, some individuals will lose control of their infection after several years of immunological control. Our laboratory has analyzed the differential expression profile of various proteins and molecular pathways associated with the loss of control of HIV infection. The pro-inflammatory cytokine interleukin-32 alpha and delta isoforms significantly decreased in slow progressors as they were losing control of their infection. Furthermore, previous studies have attributed to IL-32 both antiviral property against HIV-1 and immunosuppressive properties that can induce an environment conducive to HIV-1 replication. This project addresses the role of IL-32 in HIV-1 disease progression with a particular emphasis on slow progressors. We compared the levels of IL-32 in HIV-1 positive versus HIV-1 negative subjects and evaluated the role of this cytokine using longitudinal studies. We observed that levels of IL-32 remains higher in HIV-positive compared to HIV-negative subjects. Also, HIV-1 infection leads to increased level of IL-32. In addition, after one year of antiretroviral therapy, IL-32 plasma levels remain significantly higher than those of HIV-negative subjects. As expected, the levels of IL-32 increased as slow progressors lost control of their infection. A high plasma concentration of IL-32 predicts: 1) an increase in plasma levels of sCD14 as well as pro-inflammatory cytokine IL-6, 2) a decrease in CD4 cell count and an increase in viral load. High plasma CCL5 predicted a low concentration of IL-32. The alpha isoform of IL-32 is elevated in the plasma of HIV negative subjects while IL-32 gamma appears to induce a pro-inflammatory and immunosuppressive environment. We conclude that increased IL-32 levels are associated with progression of HIV-1 disease and could be used as a biomarker for assessing HIV-1 prognosis.

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La nature du lien qui unit les deux aspects du système immunitaire, que sont la défense de l’hôte contre les agressions extérieures et la genèse des maladies auto- immunes, n’a pas été élucidée. L’axe IL-23/Th17 joue un rôle dans les deux versants, ce qui le place en bonne position pour être un potentiel chaînon manquant. Objectif : connaître l’implication de cet axe dans un modèle infectieux, Mycoplasma hominis, et un modèle de maladie auto-immune, la sclérodermie systémique (ScS), dans lesquels il n’a pas encore été étudié. Les lipoprotéines membranaires de M. hominis sont capables d’induire une maturation des cellules dendritiques humaines. Elle s’accompagne d’une sécrétion d’IL-23 variable selon l’origine clinique des isolats, via TLR2, et d’une polarisation vers la voie Th17. Nous avons observé une augmentation de la fréquence des cellules Th17 et Th22 dans le sang périphérique des patients ScS, potentialisée par l’iloprost, via entre autres la production monocytaire d’IL-23. Dans la peau des patients ScS, il existe une augmentation des cellules produisant l’IL-17 inversement corrélé au score de fibrose cutanée. In vitro, l’IL-17 est capable d’inhiber partiellement l’expression d’α-SMA induite par le TGF-ß et d’induire la sécrétion de MMP1 par des fibroblastes dermiques humains. L’axe IL-23/IL-17 et les cellules Th17 jouent un rôle dans la défense contre M. hominis et dans la physiopathologie de la ScS. / Relationship between both aspects of the immune system, ie host defense against external aggression and genesis of autoimmune diseases, has not been elucidated. IL-23/Th17 axis plays a role in both sides, which puts him in a good position to be a potential missing link. Objective: To understand the implication of this axis in a model of infection, Mycoplasma hominis, and a model of autoimmune disease, systemic sclerosis (SSc), in which it has not yet been studied.
The membrane lipoproteins of M. hominis are capable of inducing human dendritic cell maturation. It occurs along with an IL-23 secretion changing with the clinical origin of isolates, via TLR2, and a T cell polarization towards Th17. Then we observed an increase in the Th17 and Th22 cell frequency in peripheral blood of SSc patients, further enhanced by iloprost via monocyte production of IL-23 among others. In the skin of SSc patients, we showed an increase in IL-17-producing cells with an inverse correlation to the skin fibrosis score. In vitro, IL-17 is able to partially inhibit the expression of α-SMA induced by TGF-ß and to induce the secretion of MMP1 in human dermal fibroblasts. The IL-23/IL-17 axis and Th17 cells play a role in defense against M. hominis and in the pathogenesis of SSc.