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L’utilisation de chromophores absorbant à deux photons (ADP) pour des applications en photothérapie dynamique (PDT) et en imagerie de fluorescence présente de nombreux avantages. Les propriétés non-linéaires de ces chromophores permettent notamment d’améliorer la longueur de pénétration dans les organismes vivants ainsi que la résolution. Pour des applications in-vivo la biocompatibilité de ces chromophores lipophiles doit aussi se poser. Une étude d’ingénierie pour le développement de chromophores pour la PDT-ADP en utilisant des atomes de brome comme groupe générateur d’oxygène singulet est décrite. Différents paramètres dont le nombre et la position des atomes de brome sur la chaîne carbonée, la longueur de conjugaison, la géométrie des chromophores ont été étudiés. Cette étude permet de mettre en évidence l’importance de la position des substituants bromes et de la symétrie sur le rendement de croisement inter-système.Les observations spectroscopiques faites lors de l’étude d’ingénierie ont permis de développer des chromophores pour la microscopie de fluorescence à deux photons. La biocompatibilité est apportée grâce à un polymère d’(hydroxyethyl)acrylate. Ce polymère permet de créer une coquille hydrosolubilisante covalente. Ces chromophores ont été utilisés pour faire de l’imagerie de vascularisation cérébrale de haute résolution. Une observation particulière sur un chromophore, marquage des cellules endothéliales des parois des vaisseaux sanguins intravitaux ainsi que les applications en résultant sont présentées. Des stratégies visant l’amélioration de la sélectivité des systèmes polymères/chromophores pour des applications intravitales, comme le traitement des tumeurs cancéreuses sont décrites. Une stratégie de modification des fonctions hydroxy des chaînes polymères par des groupements imidazoliums est présentée. L’étude de complexation des polymères avec l’ADN et les études spectroscopiques in-cellulo ont été réalisées. / The use of two-photon absorbing (TPA) chromophore for applications in photodynamic therapy (PDT) and fluorescence imaging provides many advantages. The non-linear properties make it possible to increase both observation depth in animals and 3D resolution. Nevertheless, for in-vivo applications, improving bio-compatibility of these inherently lipophilic chromophore is a challenge. The development of new chromophores for PDT-TPA using a molecular engineering approach using bromide substituents as singlet oxygen generators is described. Parameters like position and number of bromide, the conjugated length and chromophore symmetry are studied. The study shows the importance of bromide atom position and of the symmetry on the inter system crossing efficiency. During the engineering study, spectroscopic observation and rationalization permit to envision the design of new chromophores for two photon laser scanning fluorescent microscopy. Bio-compatibility of these chromophores is provided by (hydroxyethyl)acrylate polymer, which provides a covalent water-soluble shell. These chromophores are used to make high resolution image of cerebral vascularization. One of these chromophores shows intravital specific interaction with endothelial cells in blood vessels. Some applications of the chromophore are described. Strategies to increase the intravital selectivity of polymer/chromophores units towards cancer cells and tumor are presented. A modification of hydroxyl function by imidazolium group is described. This new chromophore is evaluated towards its complexation properties with DNA and in cellulo spectroscopic studies.

Intravital microscopy (IVM) is a well-established imaging technique for real-time monitoring of microscale lung tissue dynamics. Although accepted as a gold standard in respiratory research, its characteristic image features are scarcely understood, especially when trying to determine the actual position of alveolar walls. To allow correct interpretation of these images with respect to the true geometry of the lung parenchyma, we analyzed IVM data of alveoli in a mouse model in comparison with simultaneously acquired optical coherence tomography images. Several IVM characteristics, such as double ring structures or disappearing alveoli in regions of liquid filling, could be identified and related to the position of alveoli relative to each other. Utilizing a ray tracing approach based on an idealized geometry of the mouse lung parenchyma, two major reflection processes could be attributed to the IVM image formation: partial reflection and total internal reflection between adjacent alveoli. Considering the origin of the reflexes, a model was developed to determine the true position of alveolar walls within IVM images. These results allow thorough understanding of IVM data and may serve as a basis for the correction of alveolar sizes for more accurate quantitative analysis within future studies of lung tissue dynamics.

The juxtaglomerular niche occupied by renin cells (RCN) plays an important role in glomerular repair but the precise temporal and spatial interrelations remain unclear. This study proposes the hypothesis of a local intra-extraglomerular regenerative feedback system and establishes a new quantifiable system for RCN responses in individual glomeruli in vivo. A strictly intraglomerular twophoton laser-induced injury model was established. Labeled renin cells (RC) in transgenic renin reporter mice were fate-traced in healthy and injured glomeruli over several days by intravital microscopy and quantified via new three-dimensional image processing algorithms based on ray tracing. RC in healthy glomeruli demonstrated dynamic extraglomerular protrusions. Upon intraglomerular injury the corresponding RCN first increased in volume and then increased in area of dynamic migration up to threefold compared to their RCN. RC started migration reaching the site of injury within 3 hours and acquired a mesangial cell phenotype without losing physical RCN-contact. During intraglomerular repair only the corresponding RCN responded via stimulated neogenesis, a process of de novo differentiation of RC to replenish the RCN. Repeated continuous intravital microscopy provides a state-of-the-art tool to prove and further study the local intraglomerular RCN repair feedback system in individual glomeruli in vivo in a quantifiable manner.

Experimentelle Melanin-induzierte Uveitis (EMIU): Modulation der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion durch Makrophagendepletion - intravitalmikroskopische Analysen. Einleitung: Die Experimentelle Melanininduzierte Uveitis (EMIU) dient als Modell für eine autoimmune Iridozyklitis und Choroiditis. Die frühe Entzündungsreaktion ist durch eine gesteigerte Leukozyten-Endothel-Interaktion gekennzeichnet. Um die Rolle von Makrophagen bei der Induktion der EMIU zu untersuchen, analysierten wir Veränderungen der Leukozyten-Endothel-Interaktionen in Irisvenolen anästhesierter Ratten nach Makrophagendepletion mit liposomalem Clodronat. Methoden: Die EMIU wurde durch intraperitoneale Injektion einer Emulsion aus 250 µg bovinen Melanosomen in komplettem Freund Adjuvant und Pertussistoxin bei Lewis Ratten induziert. Die Tiere wurden mit 2 ml Clodronat-Liposomen (Clodronat-lip) an den Tagen 2; 1; 4; 6 beziehungsweise 8 nach Immunisierung behandelt. Kontrolltiere erhielten anstelle von Clodronat-lip Leerliposomen (Kontrolle). Für die Intravitalfluoreszenzmikroskopie wurden Leukozyten intravasal mit Rhodamin 6G gefärbt. Anschließend wurden die postkapillären Irisvenolen am 4.; 6.; 8. und 10. Tag untersucht, um die Zahl der rollenden und fest am Endothel adhärenten Leukozyten zu quantifizieren. Weitere Parameter wie Zellzahl und Proteingehalt des Kammerwassers, TNF-alpha und IFN-gamma im Plasma und das Differentialblutbild wurden zur Charakterisierung der Entzündungsreaktion herangezogen. Ergebnisse: Bei makrophagendepletierten Tieren konnten spaltlampenmikroskopisch keine entzündlichen Veränderungen des Vorderabschnittes beobachtet werden. Der prozentuale Anteil rollender Leukozyten war am 8. Tag mit 2 +/- 1.1 vs. 15.2 +/- 1.6; 5.2 +/- 0.5% (Clodronat-lip vs. EMIU; Kontrolle, Mittelwert +/- MSF, ANOVA, p

Störungen im Bereich der Mikrozirkulation gelten als ursächlich für die Entstehung des Multiorganversagens bei Sepsis, wobei der Darm eine zentrale Rolle einnimmt. Aktivierte Leukozyten setzen u.a. Sauerstoffradikale frei, die entscheidend zur Zerstörung der endothelialen Integrität beitragen. Die Antagonisierung schädigender Mediatoren stellt ein Prinzip der adjunktiven Sepsis-Therapie dar, wobei die antioxidativ wirkenden Substanzen N-Acetylcystein (NAC) und Tirilazad Mesylat (TM) in mehreren Studien positive Effekte gezeigt haben. In einer tierexperimentellen Untersuchung an Ratten wurde der Effekt der kombinierten Gabe von NAC und TM auf die mesenteriale Mikrozirkulation, auf die Freisetzung von TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, IL-10 und auf die Leukozytenzahl unter einer kontinuierlichen Lipopolysaccharidbelastung (LPS) von 10 mg/kg KG untersucht. Die Beurteilung der mesenterialen Mikrozirkulation erfolgte mittels Intravitalmikroskopie. Hierbei wurde das Ausmaß der Leukozytenadhärenz am Endothel der mesenterialen Venolen als Maß für die Leukozytenaktivierung und die Plasmaextravasation als Parameter für die Endotheldysfunktion bestimmt. Dabei konnte während zwei Stunden Endotoxinämie die Zunahme der Plasmaextravasation an mesenterialen Venolen durch die kombinierte Gabe von NAC und TM nicht signifikant beeinflusst werden (p>0,05). Eine tendenziell erhöhte Plasmaextravasation unterstützt die Hypothese, dass leukozytenunabhängige Mechanismen für die Plasmaextravasation existieren. Während zwei Stunden Endotoxinämie kam es zu einer signifikanten Reduktion der Anzahl der fest adhärenten Leukozyten in der NAC/TM-Gruppe im Vergleich zur LPS-Gruppe (p=0,001). Durch die kombinierte Gabe von NAC und TM konnte die endotoxininduzierte Freisetzung von TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, IL-10 und die endotoxinbedingte Leukopenie nicht signifikant beeinflusst werden. / Disturbances of the microcirculation are causal for the pathophysiology of multiorgan failure related to sepsis in which the gut plays a central part. Activated leukocytes release i.e. oxygen radicals which decisively contribute to the destruction of the endothelial integration. To antagonize the damaging mediators is a principle of the adjunctive sepsis therapy in which the antioxidant agents N-acetylcysteine (NAC) and tirilazad mesylate (TM) showed positive effects in several studies. The effect of the combined administering of NAC and TM under continuous lipopolysaccharide (LPS) exposure of 10 mg/kg BW on the mesenteric microcirculation, on the release of TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, IL-10 and on the number of leukocytes was examined in an animal study on rats. The appraisal of the microcirculation was done by intravital microscopy. The degree of leukocyte adherence on the endothelium of mesenteric venules was determined for the degree of leukocyte activation, and the plasma extravasation was the parameter for the endothelial dysfunction. The increase of plasma extravasation on mesenteric venules during 2 hours of endotoxemia could not be affected significantly by the combined administering of NAC and TM. The tendency of increased plasma extravasation supports the hypothesis of the existence of a leukocyte independent mechanism of plasma extravasation. During 2 hours of endotoxemia the NAC/TM group showed a significant decrease in the number of firmly adherent leukocytes in comparison to the LPS group. There was no significant effect on the endotoxin induced release of TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, IL-10 and the endotoxin induced leukopenia by the combined administration of NAC and TM.

Inflammatory bowel diseases, (IBD), are a group of chronic disorders of the gastro-intestinal tract, and include Crohn’s disease (CD) and Ulcerative Colitis (UC). The pathogenesis is not known, but involves at least in part a loss of tolerance towards the commensal colonic microbiota. In this thesis, we show in animal models of CD and UC that the colonic mucosal blood flow increased compared to healthy animals. This blood flow increase is due to an up regulation of endothelial nitric oxide synthase (NOS). Further, we show in the UC model that the thickness of the firmly adherent colonic mucus layer increased compared to healthy animals. This increase is due to an up regulation of inducible NOS in the epithelium. Both the blood flow and mucus thickness increase appear to be protective mechanisms.  We demonstrate that the firmly adherent colonic mucus layer acts as a partial barrier towards luminal bacteria. In the UC model, this barrier is destroyed, causing increased bacterial translocation. The adhesion molecule P-selectin was up regulated in the UC model, leading to increased interactions between leukocytes and the endothelium, but also increased interactions between platelets and the endothelium. This indicates that not only leukocytes, but also platelets are involved in colonic inflammation. The addition of the probiotic bacterial strain Lactobacillus reuteri prevented disease by normalizing P-selectin levels and endothelial interactions with leukocytes and platelets. Lactobacillus reuteri also decreased bacterial translocation over the epithelium. In summary, this thesis highlights the importance of colonic barrier functions, and investigates the role of the microbiota in experimental IBD.