Nos travaux de recherche menés dans l'ischémie cérébrale néonatale ont évalué l'effet de la Ciclosporine A sur la réduction du volume lésionnel, mais aussi sur le fonctionnement du métabolisme mitochondrial. Nous avons également étudié l'effet du postconditionnement ischémique et les conséquences hémodynamiques de la reperfusion. Le pore de perméabilité membranaire mPTP s'ouvre au cours de l'ischémie néonatale. La CsA, inhibiteur de la Cyclophiline D freine l'ouverture du pore mPTP, améliore la capacité de recapture du calcium par la mitochondrie, la respiration mitochondriale, et limite les effets inflammatoires de l'ischémie. Néanmoins, la CsA ne réduit pas le volume des lésions cérébrales. Nous avons pu montrer que la Cyclophiline D et le pore mPTP étaient bien deux acteurs majeurs dans la constitution des lésions induites par la reperfusion dans l'ischémie cérébrale focale néonatale. Le postconditionnement ischémique ne permet pas de réduire les volumes des lésions. Nous avons montré que la reperfusion chez le jeune était progressive et lente, sans hyperhémie comme chez l'adulte. Cette cinétique de reperfusion est identique dans les deux hémisphères, tant pour la perfusion tissulaire corticale que pour la perfusion des régions cérébrales profondes. La vasoconstriction cérébrale chez le jeune traduit le recrutement précoce de la circulation collatérale mais aussi les dysfonctionnements de la microcirculation cérébrale. Au final, ces résultats ouvrent la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques au profil particulier de la reperfusion dans le cerveau immature

Ce travail s'intéresse à l'étude préclinique de l'ischémie cérébrale focale transitoire à travers la caractérisation de la microvascularisation cérébrale grâce à différents outils d'investigation. Il décrit le développement d'un modèle d'ischémie cérébrale réversible par occlusion intraluminale de l'artère cérébrale moyenne chez le rat. Une ouverture précoce de la barrière hémato-encéphalique après reperfusion a été mise en évidence par l'extravasation d'agents de contraste en imagrie par résonance magnétique nucléaire. L'influence de différents anesthésiques sur l'évolution de la pathologie ischémique a été évaluée par la mesure du débit sanguin cérébral en autoradiographie et l'évaluation histologique des lésions induites. Enfin, une technique d'imagerie par spectroscopie proche-infrarouge permettant la localisation spatiale en temps réel d'un foyer ischémique est présentée.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la première cause de handicap de l'adulte. Favoriser la plasticité cérébrale post-lésionnelle représente un objectif thérapeutique majeur. Dans ce contexte, la thérapie cellulaire a récemment émergé. Son action, fondée sur la " réparation " du tissu cérébral, a montré un bénéfice sur la récupération fonctionnelle dans des modèles d'ischémie cérébrale. La transposition de ce traitement à l'homme reste à ce jour limitée à des études pilotes. Dans nos travaux précliniques, nous avons montré, après un infarctus cérébral chez le rat, une bonne tolérance et un bénéfice fonctionnel de l'administration intracérébrale (à la phase aiguë) et intraveineuse (à la phase subaiguë) de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) de grade clinique. La survie des CSMh greffées (possible durant plusieurs semaines) et leur différenciation en cellules d'intérêt (neurones, astrocytes) sont très faibles et ne peuvent expliquer à elles seules le bénéfice observé. Parmi les mécanismes d'action possibles des CSM (effet neurotrophique, pro-angiogénique, immunomodulation...), nous avons mis en évidence par IRM un effet microvasculaire précoce. Nous avons également montré l'innocuité du marquage des CSMh par microparticules ferriques pour l'IRM cellulaire et la microscopie. Ce marquage cellulaire est utile pour détecter et suivre par IRM des cellules greffées au sein du cerveau (durant au moins 15 jours), mais nous a paru insuffisant dans le cadre d'une injection IV. Pour évaluer la biodistribution des CSMh injectées par voie IV à la phase subaiguë, nous avons effectué une étude par imagerie nucléaire qui a permis d'identifier l'attraction rapide de CSMh vers l'infarctus cérébral. En parallèle, la mise en place d'un essai clinique de phase 2 a été effectuée. Le délai, la voie optimale d'administration ainsi que la source cellulaire à utiliser restent encore controversés. L'optimisation de la thérapie cellulaire nécessite encore le développement de projets de recherche translationnelle associant les études expérimentales et les essais cliniques. C'est dans ces conditions que la thérapie cellulaire pourrait devenir un traitement efficace après un AVC.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) représentent la première cause de handicap acquis de l'adulte. En dehors de la prise en charge dans une structure de soins spécialisée, l'Unité Neuro-Vasculaire (UNV), le seul traitement efficace est la thrombolyse qui doit être administrée dans les premières heures suivant un AVC ischémique (ou infarctus cérébral). Favoriser la plasticité post-lésionnelle du cerveau représente une alternative thérapeutique majeure. C'est dans ce contexte que la thérapie cellulaire basée sur l'administration de cellules souches a émergé. Son action, fondée sur la " réparation " du tissu cérébral lésé, a montré un bénéfice sur la récupération dans des modèles d'ischémie cérébrale expérimentale. Cependant, de nombreuses questions restent en suspens concernant les mécanismes d'action de ce type de traitement. Par ailleurs, la transposition à l'homme reste à ce jour limitée à des études pilotes encourageantes mais avec de faibles effectifs. L'objectif de nos travaux au Grenoble Institut des Neurosciences (GIN U 836) a été d'évaluer les effets fonctionnels de l'administration de cellules souches mésenchymateuses (CSM) après ischémie cérébrale chez le rat, de préciser les modes d'action possibles. En parallèle de ces travaux expérimentaux, un essai clinique pilote de tolérance chez l'homme (ISIS - HERMES) a été mis en place.

Les mécanismes impliqués dans les troubles cognitifs induits à la suite d’une ischémie cérébrale (IC) demeurent mal compris. En plus du cœur ischémique nécrosé et de la zone de pénombre entourant cette lésion, certaines régions éloignées de la zone ischémique peuvent être fonctionnellement affectées, un phénomène connu sous le nom de «diaschisis». Sachant qu’il existe de fortes interactions fonctionnelles entre l’hippocampe (HPC) et le cortex lors des processus mnésiques, nous avons émis la possibilité que les troubles mnésiques survenant après une IC focale qui préserve l’intégrité de l’HPC, auraient pour origine une perturbation de la connectivité cortico-hippocampique conduisant à un hypofonctionnement hippocampique induit par le phénomène de diaschisis. Afin d’éprouver cette hypothèse, nous avons utilisé le modèle d’occlusion permanente de l'artère cérébrale moyenne chez le rat (OPACM) qui reproduit l’ischémie cérébrale focale humaine. Dans ce modèle, le cortex somato-sensoriel (SS) est endommagé unilatéralement alors que l’intégrité de l’HPC est préservé. Les rats OPACM ont montré une diminution de l’expression du gène c-fos dans l’HPC lors de l'exploration d'un nouvel environnement, indiquant une hypoactivation neuronale. Les rats OPACM ont également présenté une perturbation des mémoires olfactive associative et spatiale lors des tests de transmission sociale de préférence alimentaire (TSPA) et du Barnes maze, respectivement. Afin de confirmer que l’hypofonctionnement hippocampique induit par l’IC résultait d’une réduction des afférences corticales («déactivation») provenant du cortex endommagé, nous avons réalisé des inactivations pharmacologiques spécifiques du cortex SS et ou de l’HPC par injection de lidocaïne ou de CNQX. Ces injections ont induit une hypoactivation hippocampique (réduction du nombre de noyaux Fos-positifs) associée à une perturbation mnésique dans le test de TSPA. L'activité hippocampique chez des rats anesthésiés pendant l’IC ou deux semaines après, ainsi que lors de l’inactivation pharmacologique du cortex SS, a également été examinée par une approche électrophysiologique. Les résultats ont montré une altération de la fréquence d’apparition des «sharp-wave ripples» hippocampiques et révélé une instabilité de la fréquence thêta hippocampique lors de la reperfusion ou deux semaines après IC, ainsi que lors de l’inactivation corticale, suggérant une altération de la dynamique d’interaction entre l’HPC et le cortex. Pris dans leur ensemble, ces résultats identifient le phénomène de diaschisis hippocampique comme un mécanisme crucial impliqué dans l’hypofonctionnement hippocampique et les déficits mnésiques observés après une IC. / The cognitive consequences and the underlying mechanisms leading to cognitive impairments after cerebrovascular occlusive diseases are still unclear. In addition to the infarct zone that suffer the deadly consequence of ischemic stroke, the penumbra surrounding the lesion site and some brain regions more remote to the ischemic areas can be functionally affected by the insult. This phenomenon is referred to as diaschisis. In light of the importance of interactions between hippocampus and cortex during memory processing, we hypothesized that the cognitive impairments observed following focal ischemia could occur in the absence of direct hippocampal insult, possibly via impaired connectivity within cortico-hippocampal networks leading to diaschisis-induced hypofunctioning in specific hippocampal subregions. To examine this possibility, we used the distal middle cerebral artery occlusion (dMCAO) ischemic model in rats which induces restricted cortical infarct in the somatosensory (SS) cortex in the absence of direct hippocampal injury. dMCAO rats exhibited reduced expression of the activity-dependent gene c-fos in the hippocampus when exploring a novel environment, indicating neuronal hypoactivation. Ischemic rats also showed impaired associative olfactory and spatial memory when tested in the social transmission of food preference (STFP) task and the Barnes maze test, respectively. To confirm that the ischemic-induced hippocampal hypofunctioning resulted from reduced afferent inputs (i.e. deactivation) originating in the damaged cortex, we performed region-specific pharmacological inactivation of SS and/or HPC using lidocaine or CNQX. Fos imaging revealed that these treatments induced hippocampal hypoactivation and impaired memory performance as measured in the STFP task. We additionally performed electrophysiological recordings of hippocampal activity in anesthetized rats during acute stroke and two weeks later or after SS cortex inactivation. We found an alteration in the occurrence of sharp-wave ripples associated with instability of theta frequency during reperfusion after stroke and SS cortex inactivation, suggesting an alteration in the dynamics of hippocampal-cortical interactions. Taken collectively, these findings identify hippocampal diaschisis as a crucial mechanism for mediating stroke-induced hippocampal hypofunction and associated memory deficits.

Accidents Vasculaire Cérébraux (parfois appelés AVC ou attaques cérébrales) sont les 3èmes causes principales de mortalité et les causes de handicap dans les pays industrialisés. Ils représentent un problème de santé publique en raison de leurs fréquences, de leurs mortalités et des handicaps physiques et cognitifs qu'ils entraînent. Malgré d’importants progrès réalisés dans le domaine de la physiopathogénie de l’ischémie cérébrale, on ne dispose pas encore, aujourd’hui, de thérapeutiques efficaces pour traiter un accident vasculaire cérébral lors de sa phase aiguë. Les gangliosides GM1 sont des composants majeurs du feuillet externe de la membrane cellulaire au niveau du système nerveux central. Ces gangliosides ont des effets antineurotoxiques, neuroprotecteurs et les propriétés neurorestoratrices sur les divers neurotransmetteurs du SNC mais pour le moment ils n’ont pas des valeurs thérapeutiques en raison de leurs manques de biodisponibilités et de leurs manques de perméabilité de la barrière hématoencéphalique (BHE). Nous avons synthétisé les structures simplifiées de ces gangliosides GM1, L’idée qui a prévalu pour la conception, des nouvelles structures a été : d’introduire des chaînes grasses saturées ou insaturées sur un motif sérine, tyrosine ou cystéine, de remplacer la fonction carboxylique par des groupements reconnus comme bioisostères classiques ou non classiques de cette fonction ; comme par exemple les fonctions phosphonique, tétrazolique, 2,4-oxadiazolidine-3,5-dione. Nous avons élaboré un nouveau modèle de composé neuroprotecteur dans lequel une chaîne grasse est couplée à une entité acide ascorbique pour améliorer le passage de la BHE. Pour étudier l’activité neuroprotectrice des composés synthétisés nous avons utilisé deux modèles biologiques in vitro : un modèle cellulaire (cellules HT22) et un modèle tissulaire (tranches de cerveaux). / Stroke is the third leading cause of mortality and the primary cause of disability in adults. Therefore, it is critical to identify new, efficacious pharmacological treatments. One pharmacological approach for treatment of stroke is called neuroprotective therapy. It has been reported that the amphiphilic, monosialotetrahexosylganglioside (GM1) (II3 NeuAc-GgOsc4Cer) has antineurotoxic, neuroprotective, and neurorestorative effects on various central neurotransmitter systems. Since GM1 is not of therapeutic value because of its lack of bioavailability and its low blood-brain barrier (BBB) permeation. Thus, molecules that mimic GM1 represent a novel approach to neuroprotection. We have synthesized the smalls GM1-like analogues whose simplified structure includes various lipophilic saturated, unsaturated, or cyclic polyunsaturated moieties have been introduced, while in the second series, thecarboxylic acid function was replaced by different hydrophilic groups including bioisosters of the carboxylate, such as a phosphonic acid, a tetrazole, the 1,2,4-oxadiazolidine-3,5-dione or an ascorbic acid moiety. Introduction of ascorbic acid was supported by several reports that showed that ascorbic acid conjugates can improve BBB permeation properties. We report their neuroprotective effects in two distinct models of nerve cell death using hippocampus-derived HT22 cells and an additional neuroprotective assays using cortical slices injured by glutamate confirmed these results.

Il est reconnu que les survivants d’accident vasculaire cérébral (AVC) présentent un important déconditionnement physique ainsi qu’une grande prévalence de comorbidités cardiovasculaires qui augmente considérablement le risque de subir un autre événement cardiovasculaire. En prévention secondaire, mis à part le traitement pharmacologique, il existe actuellement très peu de prise en charge de ces facteurs de risque lors de la phase de retour en communauté des patients. Pourtant, les lignes directrices recommandent l’activité physique de type aérobie comme moyen efficace de prévention cardiovasculaire. Par ailleurs, il existe de plus en plus de données probantes suggérant que l’entraînement par intervalles à haute intensité (HIIT) représenterait une forme d’exercice efficace pour améliorer la capacité cardiorespiratoire et le profil de santé chez différentes populations symptomatiques. La littérature demeure, toutefois, limitée quant à l’utilisation de cette méthode post-AVC. L’objectif général de cette thèse était de développer et d’évaluer un programme d’exercice incluant le HIIT en combinaison avec l’entraînement continu à intensité moyenne (MICT) pour les personnes ayant vécu un AVC ischémique ou une ischémie cérébrale transitoire (ICT) en prévention secondaire dans la phase chronique de la maladie. Les différentes étapes de cette recherche ont permis la rédaction de quatre articles scientifiques. Premièrement, la faisabilité et l’acceptabilité du protocole d’exercice élaboré incluant le HIIT ont été évaluées de façon favorable à la suite d’une intervention de trois mois. Cette première étude aura permis d’optimiser notre protocole pour développer les étapes subséquentes. En second lieu, l’efficacité du protocole lors d’une intervention de six mois a été évaluée dans une étude contrôlée randomisée en démontrant notamment une amélioration de la capacité cardiorespiratoire ainsi que des marqueurs d’anxiété et de dépression qui persistaient six mois après l’arrêt du programme supervisé comparativement à un groupe contrôle. Cette deuxième étude a également permis de comparer notre programme combiné contenant du HIIT à un programme d’activité physique standard comprenant seulement du MICT, sans toutefois démontrer aucune supériorité du protocole expérimental sur les variables cliniques mesurées. En troisième lieu, les réponses aiguës de la mesure ambulatoire de la pression artérielle à la suite d’un entraînement HIIT et à un iv entraînement MICT ont démontré un effet hypotenseur perdurant jusqu’à huit heures post-exercice, lequel était comparable pour les deux types d’entraînement. Finalement, une quatrième étude qualitative a permis de mettre en lumière une acceptabilité favorable des participants au programme comprenant du HIIT en plus de permettre de comprendre leur expérience afin de bonifier et d’optimiser des recherches futures. Cette thèse a contribué à l’avancement des connaissances en lien avec l’utilisation de la méthode HIIT chez les victimes d’AVC ischémique ou d’ICT dans la phase de réintégration et de maintien en communauté du continuum de soins post-AVC. Cette recherche a démontré un effet favorable sur des variables cliniques en plus d’avoir mis de l’avant l’acceptabilité positive du projet par les participants. Toutefois, les résultats ne supportent pas de supériorité d’inclure la méthode HIIT par rapport à l’utilisation du MICT seulement. Cette thèse soutient donc que l’ajout du HIIT pourrait être une alternative efficace dans un objectif de prévention secondaire en phase chronique de l’AVC ischémique et de l’ICT. Ce qui importe réellement est de rendre l’activité physique aérobie accessible, faisable et acceptable pour améliorer la santé et la qualité de vie des survivants d’AVC. / Stroke survivors have significant physical deconditioning and a high prevalence of cardiovascular comorbidities that significantly increase the risk of another cardiovascular event. In secondary prevention, apart from pharmacological treatment, there is currently little management of these risk factors during the phase of community reintegration. However, guidelines recommend aerobic exercise as an effective method of cardiovascular protection. In addition, there is growing evidence to suggest that high-intensity interval training (HIIT) is an effective form of exercise for improving cardiorespiratory fitness and health profile in different symptomatic populations. However, the literature remains limited on the use of this method post-stroke. The overall objective of this thesis was to develop et evaluate a realistic physical activity program including a combination of HIIT and moderate intensity continuous training (MICT) for people with ischemic stroke or transient ischemic attack (TIA) for secondary prevention in the chronic phase of the disease, thus addressing a clinical need. The different steps of this research led to the writing of four scientific articles. First, the feasibility and acceptability of the protocol developed were favorably evaluated following a three-month intervention. This first study allowed us to optimize our protocol to develop the subsequent steps. Secondly, the effectiveness of our protocol during a sixmonth intervention was evaluated in a randomized controlled study by demonstrating an improvement in cardiorespiratory capacity as well as markers of anxiety and depression that persisted six months after the program supervision was stopped compared to a control group. This second study also compared our program containing HIIT to a standard physical activity program with MICT without, however, showing any superiority of our combinated protocol on our variables. Third, the acute responses of ambulatory blood pressure measurement following HIIT training and MICT training demonstrated a hypotensive effect lasting up to eight hours post-exercise that was comparable for both types of intervention. Finally, a fourth qualitative study revealed a favorable acceptability of the participants to the combined program including HIIT and allowed us to understand their experience in order to improve and optimize future research. This thesis has contributed to the advancement of knowledge related to the use of HIIT post-stroke or TIA. Our research has demonstrated a positive effect on clinical variables and has highlighted the positive acceptability of the project by the participants. However, our results do not support a superiority of including the HIIT method over the use of MICT alone. This thesis therefore argues that the addition of HIIT could be an effective alternative in a secondary prevention goal in the chronic phase of ischemic stroke and TIA, but what really matters is making aerobic physical activity accessible to improve the health and quality of life of stroke survivors.

Plusieurs études menées chez le petit animal ont montré que l'IRM réhaussé avec les nanoparticules d'oxyde de fer (USPIO) permettait de détecter la neuroinflammation. Cependant, à notre connaissance, aucune équipe n'avait à ce jour étudié le potentiel de cette approche pour le suivi d'un traitement anti-inflammatoire. Dans ce contexte, nous avons démontré la faisabilité de cette approche pour monitorer les effets de la minocycline suite à une ischémie cérébrale chez la souris. L'IRM est une technique très sensible pour la détection du fer, mais la localisation précise des USPIO tout comme leur quantification est difficile. Nous avons donc proposé de compléter l'approche IRM par une technique inédite à notre connaissance dans le domaine de l'imagerie cérébrale des USPIO : la tomographie par rayonnement Synchrotron. Nous présentons ici les tous premiers résultats montrant la faisabilité de l'approche, ainsi qu'une étude comparée de la sensibilité, des deux techniques pour la détection des USPIO dans le cerveau. Dans la première partioe de notre travail , nous apportons nos résultats concernant la biotransformation des USPIOs dans la rate de la souris dans les 40 premiers jours suivant leur injection intraveineuse obtenus en microscopie électronique par transmission (MET). / Several studies on small animals have shown that MRI enhanced with nanoparticles of iron oxide (USPIO) is able to detect the neuroinflammation. However, to our knowledge, no team had yet investigated the potential of this approach for monitoring an anti-inflammatory treatment. In this context, we have demonstrated the feasibility of this approach to monitor the effects of minocycline after cerebral ischemia in mice. MRI is a very sensitive technique for the detection of iron, but the precise location of USPIO as well as their quantification is difficult. We therefore propsed to complete the MRI approach by a new technique to our knowledge in the field of USPIO imaging in the brain : Synchrotron radiation tomography. We here present the first results showing the feasibility of this approach and a comparative study of the sensitivity of two techniques used for the detection of USPIO in the brain. In the last part of our work, we report our results on the biotransformation of USPIOs in the spleen of the mouse during the first 40 days after intravenous injection obtained by transmission electron microscopy (TEM).

Le seul traitement actuellement disponible pour les accidents vasculaires cérébraux d’origine ischémique est la thrombolyse par l’activateur tissulaire du plasminogène recombinant (rt-PA). Cependant, l’efficacité du rt-PA est souvent partielle ou absente, et des phénomènes de réocclusion du vaisseau peuvent être observés. Par ailleurs, l’administration de rt-PA est associée à un risque hémorragique. Il apparaît donc indispensable de rechercher les mécanismes à l’origine de la toxicité vasculaire du rt-PA, afin de pouvoir développer des stratégies capables de protéger le lit vasculaire. Parmi ces stratégies, notre équipe a montré dans des modèles expérimentaux que l’inhibition d’une enzyme nucléaire, la poly(ADP-ribose) polymérase ou PARP, permet de protéger la barrière hémato-encéphalique, de réduire les hémorragies et d’améliorer la reperfusion cérébrale suite à l’administration post-ischémique de rt-PA. Dans ce contexte, mon travail a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans les altérations vasculaires associées à l’administration de rt-PA à la suite de l’ischémie. Mes travaux de recherche ont comporté un volet in vivo et un volet in vitro. Les études réalisées in vivo ont été menées dans un modèle murin d’ischémie cérébrale thrombo-embolique. Nos résultats indiquent que ni l’ischémie, ni le rt-PA, ni l’association au rt-PA d’un puissant inhibiteur de PARP, le PJ34, ne modifient à 24 heures la présence de dépôts de fibrine, marqueur d’hypoperfusion et de réocclusion. Nous nous sommes ensuite intéressés à deux marqueurs endothéliaux d’inflammation : VCAM-1 et ICAM-1, et avons montré que leur expression, qui augmente 24 heures après l’ischémie, n’est pas modifiée par le rt-PA. Enfin, l’association du PJ34 au rt-PA réduit significativement l’expression post-ischémique de VCAM-1, ce qui suggère le rôle de la PARP dans l’expression de cette molécule d’adhésion. La seconde partie de mon travail a été réalisée in vitro sur une lignée de cellules endothéliales cérébrales murines (bEnd.3). Le rt-PA est à l’origine de changements caractéristiques au niveau de l’organisation et de la morphologie de ces cellules. Ces changements ne sont pourtant associés ni à une dégradation de l’expression des molécules de jonctions inter-endothéliales (occludine, VE-cadhérine), ni à une augmentation de l’expression des marqueurs endothéliaux pro-inflammatoires (VCAM-1, ICAM-1). Nous nous sommes également intéressés à d’autres marqueurs de dysfonction endothéliale, les microparticules endothéliales (MPE). Nos résultats montrent que le rt-PA est à l’origine d’une augmentation importante de la libération des MPE. L’utilisation d’un inhibiteur de la protéine p38, le SB203580, et d’un inhibiteur de PARP, le PJ34, permet de réduire cette augmentation, ce qui suggère que p38 et la PARP pourraient être impliquées dans la production de MPE induite par le rt-PA. En conclusion, l’ensemble de ce travail contribue à préciser les effets vasculaires du rt-PA. Parmi ces effets, la mise en évidence de la production de MPE, via la PARP, est particulièrement novatrice. / Thrombolysis with recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA) is currently the only approved pharmacological strategy for acute ischemic stroke. However, the efficacy of rt-PA is rarely complete, and arterial reocclusion can be observed. Furthermore, administration of rt-PA increases the risk of hemorrhagic transformations. Therefore, it is essential to seek mechanisms underlying the vascular toxicity of rt-PA in order to develop strategies protecting the vascular bed. Among these strategies, our laboratory has previously shown that inhibition of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), a nuclear enzyme, protects the blood-brain barrier, reduces hemorrhagic transformations and improves cerebral reperfusion following the post-ischemic administration of rt-PA. In this context, the aim of the present work was to establish the post-ischemic mechanisms of rt-PA-induced vascular alterations. The research was divided into (1) in vivo experiments and (2) in vitro studies to examine the effect of rt-PA on the endothelium. The in vivo studies were performed in a mouse model of thrombo-embolic stroke induced by thrombin injection in the middle cerebral artery. Our results showed that neither ischemia, nor rt-PA, nor the association to rt-PA of the potent inhibitor of PARP PJ34 alter cerebral fibrin deposits, a marker of hypoperfusion and reocclusion, at 24 hours after ischemia. We then evaluated the expression of two endothelial markers of inflammation : VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) and ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1). Our results showed that their expressions increase 24 hours after ischemia and are not modified by rt-PA. Finally, the association of PJ34 to rt-PA significantly reduced the post-ischemic expression of VCAM-1, suggesting a role for PARP in the expression of this adhesion molecule. The second part of my work was carried out in vitro in cultures of mouse brain-derived endothelial cells bEnd.3. In the presence of rt-PA, the organization and the morphology of the endothelial cells radically changed. However, these changes were associated neither to a degradation of endothelial junction proteins (occludin, VE-cadherin (vascular endothelial-cadherin)), nor to an increase in the expression of pro-inflammatory endothelial markers (VCAM-1, ICAM-1). We were also interested in a recently identified marker of endothelial dysfunction : endothelial microparticles (EMP). Our results showed that rt-PA induces a significant increase in the EMP released by bEnd.3 cells. The use of a p38 inhibitor, SB203580, and the PARP inhibitor, PJ34, reduced this increase, suggesting that p38 and PARP could be involved in the EMP production induced by rt-PA. In conclusion, this work helps to clarify the vascular effects of rt-PA. Among these effects, the highlight of EMP production, through PARP pathway, is particularly original.

Ce travail de thèse s'inscrit dans le cadre d'une collaboration avec le groupe Guerbet. Il visait à caractériser la lésion qui fait suite à un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique en imagerie par résonance magnétique (IRM) grâce à des agents de contraste novateurs. Guerbet et leurs collaborateurs ont développés des USPIO ciblés (ultrasmall superparamagnetic iron oxide), particules de fer couplées à des peptides reconnaissant spécifiquement un biomarqueur. Dans un modèle d’ischémie cérébrale avec reperfusion réalisé chez la souris, nous avons recherché la capacité de ces agents à caractériser la lésion d’une part en terme de type de mort cellulaire par le ciblage de la phosphatidylsérine (PS), marqueur cellulaire externalisé au cours de l’apoptose, et d’autre part en terme de déficit vasculaire par le ciblage de VCAM-1, molécule d’adhésion impliquée dans le processus inflammatoire. En ce qui concerne l’apoptose, nous avons tout d’abord montré par immunohistochimie l’expression de caspase-3 active, marqueur apoptotique, dès 6 heures et jusqu’à 72 heures après l’ischémie. Cependant, en IRM, l’utilisation d’USPIO ciblant la PS (le P03234 et le P03675) n’a pas permis la détection du phénomène apoptotique. Actuellement d’autres agents de contraste de ce type sont en cours de développement chez Guerbet. En ce qui concerne l’inflammation vasculaire, l’étude de l’expression de VCAM-1 par immunohistochimie a montré l’apparition d’un marquage dès 6 heures après l’ischémie avec un maximum à 24 heures. L’utilisation d’un USPIO-VCAM-1 (le P03011) a permis de mettre en évidence sur les images IRM des zones d’hypointensités dans la lésion, ce qui correspond à la présence de particules de fer. L'analyse histologique de ces cerveaux a montré une colocalisation de l’USPIO avec sa cible VCAM-1, ce qui établit la preuve de concept. Ces travaux ont permis mettre en évidence la capacité d’USPIO développés par Guerbet à cibler des marqueurs biologiques, notamment VCAM-1, à la suite d’une ischémie cérébrale. Ceci suggère que ce type d’agent de contraste pourrait être un bon outil clinique pour la caractérisation de la lésion ischémique chez les patients victimes d’AVC. / This work is a collaboration with Guerbet group. It aimed to characterize the lesion that follows an ischemic stroke with magnetic resonance imaging (MRI) by innovative contrast agents. Guerbet developped targeted USPIO (ultrasmall superparamagnetic iron oxide), which are iron particles coupled to peptides which specifically bind a biomarker. In a mouse model of cerebral ischemia-reperfusion, we studied the capacity of these agents to characterize the lesion on the one hand in terms of cellular death by targeting phosphatidylserin (PS), a cellular marker externalized during apoptosis, and on the other hand in terms of vascular deficit by targeting VCAM-1, an adhesion molecule implied in the inflammatory process. Concerning apoptosis, we showed by immunohistochemistry the expression of active caspase-3, an apoptotic marker, between 6 and 72 hours after ischemia. Nevertheless on MRI, the use of USPIO targeting PS (both P03234 and P03675) did not allow us to detect the apoptotic phenomenon. Currently, other PS-targeted contrast agents are developed by Guerbet. Concerning vascular inflammation, the study of VCAM-1 by immunohistochemistry showed an up-regulated expression 6 hours after ischaemia which reached a maximum at 24 hours. VCAM-1-USPIO (P03011) induced a decrease of the MRI signal appearing as hypointense foci in the lesion, which correspond to iron particles. The histological analysis of these brains showed a colocalisation of the USPIO with its target VCAM-1, which establishes the proof of concept. This work showed the capacity of USPIO developed by Guerbet to target biological markers, particularly VCAM-1, following cerebral ischemia. This suggests that this kind of contrast agent could be a good clinical tool to characterize the ischemic lesion in patients suffering from stroke.