Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) résultent d’une insuffisance d’apport sanguin au cerveau et constituent la troisième cause de décès mondial. Expérimentalement et cliniquement, un AVC est suivi de réactions inflammatoires aiguës et prolongées et environ un tiers des survivants souffrent de démence post-AVC. Bien que plusieurs mécanismes aient été expliqués comme étant impliqués dans la pathologie de l’AVC, une thérapie efficace visant à minimiser les conséquences post-AVC n’a toujours pas été établie. Dans cette thèse, nous avons exploré la pathologie de la protéine TDP-43 et l’association de la neuroinflammation dans le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne dans le vieillissement (chapitre 2), un modèle d’hypoperfusion cérébrale chronique (HCC): modèle pour la démence vasculaires et les effets thérapeutiques d’IMS-088 dans le modèle d’hypoperfusion cérébrale chronique (chapitre 3). Dans le premier chapitre, nous observons qu’une accumulation cytoplasmique de TDP-43 ubiquitinée dépendante de l’âge peut moduler les réponses inflammatoires post-ischémiques comme l’activation microgliale et de grands infarctus chez les souris âgées post-accidentvasculaire cérébral (AVC). Nous avons également observé qu’une augmentation/surexpression de TDP-43 potentialise les réponses NF-κB et les lésions ischémiques post-AVC. Finalement, nous observons la présence dans le cytoplasme de structures immunoréactives de TDP-43 dans des tissus humains post-mortem-AVC. Dans le chapitre 2, nous montrons que HCC induit une accumulation cytoplasmique en plus de la formation d’agrégats insolubles de phospho-TDP-43 dans les neurones corticaux. La présence de TDP-43 cytoplasmique a également été détectée dans les maladies humaines (démencevasculaire). La dérégulation de TDP-43 a été associée avec une activation microgliale et de la voie NF-κB en plus du développement de déficits moteurs et cognitifs après 2 mois de HCC. Finalement, dans le chapitre 3, nous avons étudié l’efficacité du nouveau médicament IMS-088 (analogue semi-synthétique de withaferin A) qui vise à moduler l’inflammation post-ischémique en ciblant la voie NF-κB chez les souris HCC. Après 2 mois de traitement oral de IMS-088, les souris HCC ont montré une amélioration importante des résultats cognitifs et moteurs en plus d’une restauration de la balance nucléaire et cytoplasmique de TDP-43 ainsi qu’une diminution de l’activation microgliale, de la mort cellulaire et une amélioration de l’autophagie. Selon ces résultats, IMS-088 devrait être considéré comme un candidat potentiel pour des interventions thérapeutiques futures pour HCC et pour d’autres protéinopathies avec TDP-43. / Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) résultent d’une insuffisance d’apport sanguin au cerveau et constituent la troisième cause de décès mondial. Expérimentalement et cliniquement, un AVC est suivi de réactions inflammatoires aiguës et prolongées et environ un tiers des survivants souffrent de démence post-AVC. Bien que plusieurs mécanismes aient été expliqués comme étant impliqués dans la pathologie de l’AVC, une thérapie efficace visant à minimiser les conséquences post-AVC n’a toujours pas été établie. Dans cette thèse, nous avons exploré la pathologie de la protéine TDP-43 et l’association de la neuroinflammation dans le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne dans le vieillissement (chapitre 2), un modèle d’hypoperfusion cérébrale chronique (HCC): modèle pour la démence vasculaires et les effets thérapeutiques d’IMS-088 dans le modèle d’hypoperfusion cérébrale chronique (chapitre 3). Dans le premier chapitre, nous observons qu’une accumulation cytoplasmique de TDP-43 ubiquitinée dépendante de l’âge peut moduler les réponses inflammatoires post-ischémiques comme l’activation microgliale et de grands infarctus chez les souris âgées post-accidentvasculaire cérébral (AVC). Nous avons également observé qu’une augmentation/surexpression de TDP-43 potentialise les réponses NF-κB et les lésions ischémiques post-AVC. Finalement, nous observons la présence dans le cytoplasme de structures immunoréactives de TDP-43 dans des tissus humains post-mortem-AVC. Dans le chapitre 2, nous montrons que HCC induit une accumulation cytoplasmique en plus de la formation d’agrégats insolubles de phospho-TDP-43 dans les neurones corticaux. La présence de TDP-43 cytoplasmique a également été détectée dans les maladies humaines (démencevasculaire). La dérégulation de TDP-43 a été associée avec une activation microgliale et de la voie NF-κB en plus du développement de déficits moteurs et cognitifs après 2 mois de HCC. Finalement, dans le chapitre 3, nous avons étudié l’efficacité du nouveau médicament IMS-088 (analogue semi-synthétique de withaferin A) qui vise à moduler l’inflammation post-ischémique en ciblant la voie NF-κB chez les souris HCC. Après 2 mois de traitement oral de IMS-088, les souris HCC ont montré une amélioration importante des résultats cognitifs et moteurs en plus d’une restauration de la balance nucléaire et cytoplasmique de TDP-43 ainsi qu’une diminution de l’activation microgliale, de la mort cellulaire et une amélioration de l’autophagie. Selon ces résultats, IMS-088 devrait être considéré comme un candidat potentiel pour des interventions thérapeutiques futures pour HCC et pour d’autres protéinopathies avec TDP-43. / Stroke results from insufficient blood supply to the brain and is the third leading cause of death in the world. Experimentally and clinically, stroke is followed by acute and prolonged inflammatory responses, and about a third of stroke survivors suffer from post-stroke dementia. Although numerous mechanisms have been explained to be involved in stroke pathology, an effective therapy to minimize post stroke consequences is still to be established. In this thesis, we have explored TDP-43 protein pathology and associated neuroinflammation in middle cerebral artery occlusion model (MCAO) in aging (chapter 2) and in chronic cerebral hypo-perfusion model(CCH): model for vascular dementia and therapeutic effects of IMS-088 in the chronic cerebral hypo-perfusion (CCH) model (chapter 3). In the chapter 2, we observed age-dependant cytoplasmic accumulation of ubiquitinated TDP-43 can modulate the post-ischemic inflammatory responses like microglial activation and large infarctionsafter acute stroke. We also observedthat an increase / over expression of TDP-43, potentiates NF-κB response and ischemic injury after stroke. Finally, we observed the presence of cytoplasmic TDP-43 immunoreactive structures in post-mortem-stroke human brain tissues.In the chapter 3, we reported that CCH induces cytoplasmic accumulation and formation of insoluble phospho-TDP-43 aggregates in cortical neurons. Presence of cytoplasmic TDP-43 was also detected in human disease (vasculardementia). Further, mislocalizationof TDP-43 was associated with microglial and NF-κB activation as well as development of cognitive and motor impairments after 2 months of CCH. Finally, in chapter 3 we studied the efficacy of a novel drug IMS-088 (semi-synthetic analog of withaferin A) which is aimed to modulate post ischemic inflammation by targeting NF-κB pathway in the CCH mice. After 2 months of oral IMS-088 treatment, CCH mice showed marked improvement in cognitive and motor outcome along with restoration of nuclear vs cytoplasmic TDP-43 balance and decreased microglial activation, cell death and improved autophagy. Basing on these evidences, IMS-088 should be considered as potential candidate for therapeutic interventions in CCH and other TDP-43 proteinopathies. / Stroke results from insufficient blood supply to the brain and is the third leading cause of death in the world. Experimentally and clinically, stroke is followed by acute and prolonged inflammatory responses, and about a third of stroke survivors suffer from post-stroke dementia. Although numerous mechanisms have been explained to be involved in stroke pathology, an effective therapy to minimize post stroke consequences is still to be established. In this thesis, we have explored TDP-43 protein pathology and associated neuroinflammation in middle cerebral artery occlusion model (MCAO) in aging (chapter 2) and in chronic cerebral hypo-perfusion model(CCH): model for vascular dementia and therapeutic effects of IMS-088 in the chronic cerebral hypo-perfusion (CCH) model (chapter 3). In the chapter 2, we observed age-dependant cytoplasmic accumulation of ubiquitinated TDP-43 can modulate the post-ischemic inflammatory responses like microglial activation and large infarctionsafter acute stroke. We also observedthat an increase / over expression of TDP-43, potentiates NF-κB response and ischemic injury after stroke. Finally, we observed the presence of cytoplasmic TDP-43 immunoreactive structures in post-mortem-stroke human brain tissues.In the chapter 3, we reported that CCH induces cytoplasmic accumulation and formation of insoluble phospho-TDP-43 aggregates in cortical neurons. Presence of cytoplasmic TDP-43 was also detected in human disease (vasculardementia). Further, mislocalizationof TDP-43 was associated with microglial and NF-κB activation as well as development of cognitive and motor impairments after 2 months of CCH. Finally, in chapter 3 we studied the efficacy of a novel drug IMS-088 (semi-synthetic analog of withaferin A) which is aimed to modulate post ischemic inflammation by targeting NF-κB pathway in the CCH mice. After 2 months of oral IMS-088 treatment, CCH mice showed marked improvement in cognitive and motor outcome along with restoration of nuclear vs cytoplasmic TDP-43 balance and decreased microglial activation, cell death and improved autophagy. Basing on these evidences, IMS-088 should be considered as potential candidate for therapeutic interventions in CCH and other TDP-43 proteinopathies.

La réaction inflammatoire post-ischémique est dominée par les cellules mononuclées phagocytaires : la microglie, cellules immunocompétentes du parenchyme cérébral, et les macrophages dérivant du sang et infiltrant le tissu cérébral lésé. L’imagerie cellulaire par IRM avec injection de nanoparticules superparamagnétiques d’oxydes de fer (USPIO) a contribué à la description dynamique de cette infiltration macrophagique tardive. Cependant, la séquence spatio-temporelle de l’activation microgliale et du recrutement macrophagique, intriqués avec des altérations de la barrière hématoencéphalique au cours des premières heures post-ischémie, reste mal élucidée. Nous avons tenté de mieux comprendre la relation entre les signaux IRM après injection d’USPIO et la réaction phagocytaire aux temps précoces post-ischémie dans un modèle d’accident vasculaire cérébral chez la souris. Nos résultats suggèrent que les modifications précoces de signal après injection d’USPIO reflètent principalement des mécanismes non spécifiques d’entrée des particules dans le tissu lésé. Pour étudier les interactions entre les cellules neurales et les macrophages périphériques au cours de la réaction inflammatoire post-ischémique précoce, nous avons développé un modèle in vivo d’ischémie globale chez la souris et un modèle in vitro d’hypoxie sur cultures organotypiques d’hippocampe. Ce dernier modèle nous a permis d’analyser les effets de co-cultures macrophagiques sur la survie des cellules neurales au sein du parenchyme cérébral ischémié et d’analyser les profils d’expressions cytokiniques impliqués dans ces interactions à médiation humorale. Nous avons observé un effet neuroprotecteur sur la perte neurale post-hypoxique des co-cultures macrophagiques. Cet effet à médiation humorale est associé à un profil d’activation macrophagique de type alternatif (M2). / Clinical outcome in cerebral ischemia may be influenced by innate immune cells of myeloid lineage : central nervous system (CNS)-infiltrating peripheral macrophages and CNS-resident microglia. Noninvasive monitoring of these cells may improve the understanding of postischemic inflammation. Accumulation of Ultrasmall Superparamagnetic Particles of Iron Oxide (USPIO) has been observed in infarcted areas at the subacute stage of experimental stroke. However, the exact route of USPIO uptake and early brain distribution remain elusive, hampering the interpretation of USPIO-relatedsignals. Therefore, we compared MRI signal changes after intravenous USPIO injection with the histological distribution of iron particles and macrophagic cells 6 to 24 hours after permanent middle cerebral artery occlusion in mice. Our results suggest that in this model, early USPIO-related MR signal changes are mainly related to passive diffusion of free USPIO through a damaged blood-brain barrier and to intravascular trapping rather than peripheral phagocyte infiltration. To understand the complex interactions between microglia, hypoxic neurons and CNS-infiltrating macrophages, we setup an in vitro model where primary macrophages were co-cultured with hippocampal slices submitted to hypoxia and glucose deprivation (OGD). Our results indicate that under these experimental conditions, cultured macrophages engage in a M2 activation pattern and afford partial protection from OGD-induced neuronal loss through paracrine mechanisms. We also conclude that microglia is susceptible to hypoxia-induced cell death in vitro and in vivo

La neuroradiologie Interventionnelle est devenue une spécialité médicale à part entière en évolution permanente avec l'amélioration des technologies radiologiques et endovasculaires. Néanmoins, de trop nombreuses complications liées à la technique elle-même sont encore rapportées. Basés sur notre expérience clinico-radiologique, nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux complications thromboemboliques grâce à de nouvelles technologies biologiques permettant d'envisager une analyse des lésions vasculaires à l'échelle cellulaire (Cellsearch®). Ainsi au cours de différents examens diagnostiques et thérapeutiques nous avons analysé les taux artériels et veineux de cellules endothéliales circulantes à différents temps de la procédure. Nous avons démontré l'agression du matériel endovasculaire sur les parois artérielles induisant un relargage immédiat de CECs unitaires et en amas de taille variable, parfois géants (300 µm). Les amas présentant une taille supérieure aux diamètres des microcapillaires ne peuvent pas migrer dans le compartiment veineux et sont donc potentiellement à l'origine d'une occlusion artérielle très distale responsable de lésions microischémiques qualifiées de silencieuses car asymptomatique dans l'ensemble des cas observés. Les lésions pariétales artérielles induites sont ensuite probablement réparées par un mécanisme dynamique mettant en jeu une augmentation lente et progressive des CEPs jusqu'à l'obtention d'une réparation de l'endothélium. Au delà des facteurs mécaniques endovasculaires, l'analyse cellulaire de cette cinétique destruction-régénération des parois artérielles pourrait s'avérer intéressante dans l'évaluation de l'endothélialisation des endoprothèses intracrâniennes. / Permanents Improvements in radiological and endovascular devices made the Interventional Neuroradiology considered as a complete medical specialty. However, too many procedural complications due to the devices remain observed in all reported series. On the basis of our clinical center experience we decided to analyze thromboembolic complications by using new biological tests allowing to the detection of circulating endothelial cells. During cerebral diagnostic or therapeutic angiography, arterial and venous CECs rates were analyzed before, during, and after endovascular procedures. Thus, we demonstrated the potential arterial wall injury following catheterization that induced unit and cluster of CECs, some of them were giants (300 µm). Clusters presenting with a size up than those described from microcapillary lumen cannot go through venous compartment, and potentially block into a distal artery inducing microischemic stroke (silent embolism) as observed in this work. In addition, the induced arterial wall injury is probably regenerated by a dynamic mechanism involving a delayed increase of CEPs rates, until the new endothelialization. Over endovascular mechanism factor analysis, the CECs-CEPs investigations could be an interesting strategy in the monitoring of intracranial endoprothesis endothelialization.

Les progéniteurs endothéliaux semblent offrir de nouvelles perspectives dans le traitement des pathologies ischémiques. Nos travaux portent sur l'étude des effets d'une transplantation d'une sous population homogène de progéniteurs endothéliaux dits tardifs, les ECFCs, sur un modèle d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) transitoire chez le rat. 4x106 ECFCs cultivés à partir du sang de cordon humain ou 1ml de PBS ont été injectés en intraveineuse (IV) 24h après une MCAO d'une durée d'une heure chez les rats appartenant respectivement au groupe greffé et au groupe contrôle. On a pu mettre en évidence le passage des cellules greffées dans l'hémisphère cérébral ischémié par radiomarquage à l'oxinate d'indium 111 (111In) et marquage fluorescent au CM-Dil des ECFCs avant transplantation. Ceci a été confirmé par la visualisation d'ECFCs d'origine humaine en périphérie de la zone infarcie par marquages immunohistochimiques au MAB1281 et CD31. La transplantation d'ECFCs a augmenté significativement le taux de survie et a amélioré la récupération fonctionnelle des animaux. L'effet bénéfique observé est associé à une réduction du nombre de cellules apoptotiques ainsi qu'une augmentation de la densité capillaire et de la neurogenèse en périphérie de la zone lésée. Ces effets semblent corrélés à une surexpression en zone de pénombre de VEGF et IGF1 aux propriétés pro-angiogéniques et neurotrophiques, et à une diminution de l'expression d'un facteur pro-apoptotique proBDNF. De plus, nous avons montré que les ECFCs sont capables de sécréter des cytokines pro-angiogéniques. / Endothelial progenitor cells (EPCs) seem to be a promising option to treat patients with ischemic diseases. Here, we investigated the effects of late EPCs or Endothelial Colony-Forming Cells (ECFCs), a recently defined homogeneous subtype of EPCs, in a rat model of transient middle cerebral artery occlusion (MCAO). Either vehicle or 4.106 ECFCs, isolated from human cord blood, were intravenously injected 24h after 1 hour of MCAO in rats assigned to control and transplanted groups respectively. 111In-oxine-labeled ECFCs specifically homed to ischemic hemisphere and CM-Dil prelabeled ECFCs preferentially settled in the inner boundary of the core area of transplanted animals. The presence of human cells in rat brain sections was detected by immunohistochemical staining (MAB1281, CD31). We demonstrated that ECFCs injected 24h after MCAO improved functional recovery and survival rate. Beneficial effect was associated with an increase in growth factors expression in homogenates from ischemic area (VEGF, IGF-1, proBDNF) and may be related to the secretion by ECFCs of soluble factors that could affect apoptosis, vascular growth and neurogenesis. These findings raise perspectives for the use of ECFCs as a well-characterized cell therapy product for optimal therapeutic outcome after stroke.

A la phase aiguë des accidents vasculaires cérébraux, les stratégies thérapeutiques reposent sur l'utilisation d'agents fibrinolytiques dont l'utilisation est limitée par une fenêtre thérapeutique étroite en raison du risque d'hémorragies intra-cérébrales lié à des altérations vasculaires et parenchymateuses. Cette approche fibrinolytique nécessiterait d'être complétée par une double protection de la paroi vasculaire et du parenchyme cérébral. Au sein de l'unité neurovasculaire, les leucocytes, et particulièrement les polynucléaires neutrophiles, jouent un rôle important dans l'inflammation, tant vasculaire que parenchymateuse qui conduit aux lésions cérébrales.<br />Ce travail a pour objectif de déterminer si dans un modèle d'ischémie cérébrale la modulation des interactions leucocytes-endothélium pourrait représenter une cible pertinente : (i) pour diminuer les conséquences lésionnelles de l'ischémie ; (ii) limiter le risque de complications hémorragiques de la thrombolyse. Ceci s'est fait par une double approche pharmacologique : (i) une modulation directe des polynucléaires neutrophiles ; (ii) une modulation des interactions par l'activation des récepteurs nucléaires PPAR-alpha.<br />Dans un premier temps, nos résultats suggèrent une contribution importante des leucocytes dans les altérations vasculaires post-ischémiques ainsi que dans la survenue des complications hémorragiques induites par la fibrinolyse. Dans la deuxième partie de notre travail, l'activation des récepteurs nucléaires PPAR-alpha prévient les altérations endothéliales vasculaires post-ischémiques parallèlement à un effet neuroprotecteur. Ces effets étaient associés à une diminution des complications hémorragiques et du recrutement leucocytaire au sein du foyer ischémique.<br />En conclusion, la protection neurovasculaire après une ischémie cérébrale suivie ou non d'une fibrinolyse apparaît comme une cible intéressante susceptible de prévenir la maturation de l'ischémie cérébrale et les complications hémorragiques. Les récepteurs nucléaires PPAR-alpha représentent expérimentalement une stratégie thérapeutique potentielle de protection de la paroi vasculaire et du tissu cérébral en modulant les interactions leucocytes-endothélium

L’objectif de mon travail de thèse était d’évaluer si des autogreffes de cellules souches olfactives ecto-mésenchymateuses (CSO-EMs) restauraient les capacités d’apprentissage et de mémorisation dans un modèle d’amnésie chez le rat, consécutive à une ischémie cérébrale globale (ICG). Cette dernière pouvant avoir lieu suite à un arrêt cardiaque (AC) et conduire à des conséquences neurologiques délétères telles que des atteintes cognitives et/ou sensorimotrices.C’est dans ce contexte scientifique que se sont inscrits mes travaux de recherche dont le premier objectif était de valider un modèle fiable et reproductible d’amnésie chez le rat. Nous avons sélectionné un modèle d’AC induisant une ICG caractérisé par des pertes neuronales ciblées au niveau de la zone CA1 des hippocampes dorsaux associées à des déficits d’apprentissage et de mémorisation.Enfin, la dernière étape de mon projet a consisté à évaluer l'effet des autogreffes de CSO-EMs sur la restauration des fonctions cognitives chez des rats ayant subi une ICG. Tout d’abord, j’ai dû élaborer un protocole permettant le suivi du devenir des CSO-EMs à la suite d’autogreffes, sans en altérer leurs propriétés endogènes. Puis j’ai démontré que ces autogreffes de CSO-EMs GFP+ : i) restauraient les capacités d’apprentissage et de mémorisation, ii) stimulaient la neurogénèse et iii) amélioraient la PLT chez des rats ayant subis une ICG.L’ensemble des données recueillies au cours de ma thèse accordent d’avantage de crédibilité à l’utilisation des CSO-EMs dans le cadre de thérapies menées contre les atteintes du SNC. / The main goal of my thesis was to evaluate whether autografts of ecto-mesenchymal olfactory stem cell (EM-OSCs) restored learning and memory abilities in a rats model of amnesia following global cerebral ischemia (GCI). The latter can occur following cardiac arrest (CA) and lead to deleterious neurological consequences such as cognitive and / or sensorimotor injuries.Finally, the final step in my project was to evaluate the effect of EM-OSCs autografts on restoration of cognitive functions in ischemic rats. First of all, I had to develop a protocol to monitor the fate of EM-OSCs following autografts, without altering their endogenous properties. Then, I demonstrated that these GFP+ EM-OSCs autografts: i) restored learning and memory abilities, ii) stimulated neurogenesis, and iii) improved PLT in ischemic rats. All the data gathered during my thesis give credibility to the use of EM-OSCs in the framework of therapies against the CNS damages.

L’ischémie cérébrale est caractérisée par une interruption totale ou partielle de l’apport sanguine au cerveau, conduisant à une privation d’oxygène et de glucose pour les cellules du cerveau. La série de processus cellulaires qui sont déclenchées par une ischémie cérébrale sont nombreux et complexes. La réduction sévère d’oxygène et de glucose la diminution de la production d’ATP et un changement drastique de la concentration de K+, du pH intracellulaire et extracellulaire et de la production de lactate. La perturbation du métabolisme énergétique au sein des tissus ischémiés conduit rapidement à la dépolarisation membranaire et au relarguage de neurotransmetteurs dans le milieu extracellulaire. Dans le cervelet, l’impact d’un stress ischémique à largement été étudié sur les cellules de Purkinje, seule voie de sortie neuronale du cortex cérébelleux. Il a été montré que le glutamate, relargué par une surexcitation des fibres glutamatergique et par l’inversion des transporteurs du glutamate, est la cause principale de la dépolarisation anoxique des cellules de Purkinje. Cependant, la compréhension de la réponse astrocytaire et l’influence des astrocytes vis-à-vis de l’ischémie ne sont pas encore connu.La cellule de Bergmann est un astrocyte radiaire qui compose un réseau couplé électriquement, formant des interactions anatomiques et fonctionnelles complexes avec les neurones du cortex cérébelleux. En utilisant un modèle in vitro d’ischémie cérébrale, la privation d’oxygène et de glucose (OGD), plusieurs caractéristiques de base de la réaction astrocytaire à l'ischémie sont analysés. Des expériences en patch clamp et d’imagerie calcique sont réalisées sur tranche de cervelet adulte révélant la réponse de la glie de Bergmann à l’OGD par une dépolarisation progressive de la membrane, avec en parallèle une augmentation de calcium cytosolique soutenue. L’enregistrement apparié entre cellule de Purkinje et cellule de Bergmann révèle des différences importantes de réponse à l’OGD entre ces deux types cellulaires. De plus, nous avons mesuré les changements de la concentration de K+ extracellulaire durant l’OGD en utilisant des microélectrodes sensibles aux ions. Nos résultats montrent une corrélation importante entre la dynamique du K+ extracellulaire et la dépolarisation membranaire de la cellule de Bergmann au cours de l’OGD. / Cerebral ischemia is characterized by partial or total interruption of the blood supply to the brain resulting in glucose and oxygen deprivation to brain cells. The series of cellular processes that are unleashed by cerebral ischemia are complex. The severe reduction in oxygen and glucose induces decreases in ATP production and dramatic changes in extracellular K concentration, pH of intracellular and extracellular space and lactate production. The disruption of energy metabolism in the ischemic tissue rapidly lead to membrane depolarisation and neurotransmitters are released into the extracellular space. In the cerebellum, the impact of an ischemic stress has been extensively studied in Purkinje cells, the only neuronal output of the cerebellar cortex. It has been shown that glutamate released from overexcited fibers and from reversal of glutamate transporters, is the principal cause of the dramatic, anoxic depolarization in Purkinje cells. However a detailed understanding of the astrocytic response to cerebellar ischemia and the potential influence of astrocyte to ischemia outcome is still lacking.Bergmann glia (BG) are radial gial cells that form networks of electrically coupled cells underling complex anatomical and functional interactions with the neurons of the cerebellar cortex. Using an in vitro model of cerebral ischemia, the oxygen and glucose deprivation (OGD), several basic features of astrocytic reaction to ischemia are analyzed. Patch clamp and calcium imaging experiments performed in cerebellar slices from adult mice revealed that BG respond to OGD with a progressive membrane depolarisation that is paralleled with a sustained cytosolic calcium increase. Double patch-clamp recordings between Purkinje neurons and BG reveal different responses to OGD in these cell types. Furthermore, we measured extracellular potassium concentration changes during OGD by using ion-sensitive microelectrodes. Our results indicate an important correlation between the BG membrane depolarisation and the extracellular K dynamics during OGD.

L’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est le seul traitement aigu de l’ischémie cérébrale autorisé chez l’Homme. Cependant, la thrombolyse présente des limites d’utilisation, comme son étroite fenêtre thérapeutique, un risque hémorragique et une efficacité de recanalisation malgré tout relativement peu élevée. De plus, la littérature suggère fortement que non seulement le tPA endogène, mais aussi exogène (capable de traverser la barrière hémato-encéphalique), a des effets pro-excitotoxiques. Nous avons proposé que cet effet résulte du clivage de la sous unité NR1 du récepteur NMDA. Malgré un effort important de la communauté scientifique pour chercher de nouveaux traitements, tous les espoirs se sont avérés être des échecs. Sur ces bases, ces travaux de thèse ont consisté à : 1) Améliorer les approches précliniques en développant un nouveau modèle d’ischémie cérébrale chez la souris et en incluant dans les études un des principaux facteur de risque des AVC, le vieillissement ; 2) Développer une stratégie d’immunothérapie visant l’interaction tPA/ récepteur NMDA. J’ai ainsi montré qu’il existe une diminution du volume de lésion ischémique corrélée à l’âge et que cette diminution de tPA est due à une diminution d’expression du facteur de transcription D-Site Albumin Binding Protein (DBP). J’ai également développé un modèle innovant d’ischémie thrombo-embolique chez la souris, dans lequel la reperfusion par le tPA est bénéfique, si tant est qu’elle soit réalisée de manière précoce. Sur ce modèle, j’ai apporté par une stratégie d’immunisation active la preuve in vivo du clivage du domaine amino-terminal de la sous-unité NR1 des récepteurs NMDA. Enfin, j’ai produit un anticorps médicament, capable d’empêcher l’interaction du tPA avec la sous-unité NR1 des récepteurs NMDA, dont une injection unique permet de réduire les lésions ischémiques, mais aussi d’augmenter la fenêtre thérapeutique de la thrombolyse, conférant alors une récupération fonctionnelle à long terme. Cette stratégie pourrait donc accroître la proportion de patients traitables après un AVC ischémique aiguë / Reperfusion with tissue plasminogen activator (tPA) is the only approved treatment for ischemic stroke. However, thrombolysis has some limitations, including a narrow therapeutic window, an elevated risk of hemorrhage transformation and a low level of effective recanalization. Moreover, there is a growing body of evidence that both endogenous and exogenous tPA (able to cross the blood-brain barrier) could mediated pro-excitotoxic effects. We have proposed that this noxious effect results from the cleavage of the NR1 subunit of the NMDA receptor. My thesis work consisted in: 1) Improving pre-clinic approaches by developing a new model of thrombo-embolic ischemia in mice and by taking into account a major risk factor for stroke, aging; 2) Developing a strategy of immunotherapy targeting the interaction between tPA and NMDA receptor. I have thus shown that ischemic lesions decrease as a function of age, due to reduced levels of tPA. Moreover, I have identified DBP (D-site albumin Binding Protein), as being the transcription factor responsible for the control of tPA levels as a function of age. I have also developed a new model of thrombo-embolic ischemia in mice, in which tPA-induced thrombolysis is beneficial, provided it is performed soon enough. In this model, I have demonstrated by using a strategy of active immunization the in vivo occurrence of the cleavage of the NMDA receptor NR1 subunit by tPA. Finally, I have produced an antibody able to prevent the interaction between tPA and the NMDA receptor subunit, of which a single injection confers long lasting brain protection and neurological recovery and can also increase the therapeutic window of thrombolysis. This strategy could thus significantly increase the proportion of treatable ischemic stroke patients

Les stéroïdes sexuels ne sont pas impliqués uniquement dans la reproduction, ils sont également actifs dans le système nerveux où ils exercent des effets neuroprotecteurs. La mitochondrie a un rôle central dans la synthèse de l’énergie cellulaire et le contrôle du stress oxydant. Ces fonctions mitochondriales seraient une cible potentielle des effets des stéroïdes sexuels dans le cerveau. Deux approches ont été développées au cours de ce travail de thèse : une approche physiologique avec l’étude de l’influence des stéroïdes endogènes sur la fonction mitochondriale cérébrale et une approche thérapeutique en utilisant le modèle expérimental de l’ischémie cérébrale et du traitement par la progestérone. Pour analyser l’influence des stéroïdes endogènes, nous avons comparé le fonctionnement de la phosphorylation oxydative (consommation d’oxygène ou « respiration » et activités enzymatiques) ; le niveau du stress oxydant (pool de glutathion mitochondrial et inactivation oxydative de l’aconitase mitochondriale) et les taux cérébraux de stéroïdes dans des groupes de souris mâles et femelles soit jeunes adultes intactes ou gonadectomisées (3 mois) ; soit âgées (20 mois). Nous avons montré que la respiration NADH-dépendante est plus importante et que le stress oxydant mitochondrial est moins important chez les femelles que chez les mâles jeunes. Cette différence n’existe plus chez les souris âgées et est abolie après ovariectomie mais pas après orchidectomie, ce qui démontre l’influence des stéroïdes ovariens. Les taux cérébraux importants de prégnènolone et de progestérone chez les souris jeunes femelles par rapport aux jeunes mâles pourraient être impliqués dans le dimorphisme sexuel observé.Les modifications de la respiration mitochondriale induites par l’ischémie cérébrale sont également différentes entre les mâles et les femelles dans notre modèle. La respiration NADH-dépendante est diminuée dans les deux sexes, mais la respiration FADH2-dépendante est diminuée spécifiquement chez les femelles. Le stress oxydant mitochondrial est augmenté dans les deux sexes. L’administration de progestérone permet de restaurer la respiration FADH2-dépendante chez les femelles et la respiration NADH-dépendante ainsi que le pool de glutathion mitochondrial dans les deux sexes. Ce travail a permis de mettre en évidence des différences de fonctionnement mitochondrial cérébral chez les souris mâles et femelles jeunes et d’identifier la phosphorylation oxydative et le stress oxydant mitochondrial comme cibles d’action des effets neuroprotecteurs de la progestérone lors de l’ischémie cérébrale. / Besides the reproduction control, sex steroids also act on nervous system and exert neuroprotective effects. The mitochondria are centrally involved in cellular energy synthesis and oxidative stress regulation and constitute a potential target of steroids effects on brain. The aim of our study was twofold: (1) to study the influence of endogenous steroids on brain mitochondrial function in physiological conditions ; (2) to determine the effects of progesterone on mitochondrial function when used as therapeutic agent in an experimental model of cerebral ischemia. To analyze the influence of endogenous sex steroids, the oxidative phosphorylation system (oxygen consumption or “respiration” and enzymatic activities) and mitochondrial oxidative stress (glutathione pool and mitochondrial aconitase oxidative inactivation) were analyzed in brain mitochondria of young adult male and female mice (3-month-old), intact and after gonadectomy, and of aged male and female mice (20-month-old). Our results showed that young adult females have lower oxidative stress and a higher NADH-linked respiration rate as compared to young adult males. This sex difference was suppressed by ovariectomy but not by orchidectomy and no longer existed in aged mice. Concomitant analysis of brain steroids suggest that the major male/female differences in brain pregnenolone and progesterone levels may contribute to the sex differences observed in brain mitochondrial function.We have also shown that the decrease of brain mitochondrial respiration induced by ischemia is different according to sex in our experimental model. The NADH-linked respiration decreased after ischemia in males and female but a decrease of FADH2-linked respiration only occurred in females. Ischemia induced oxidative damages in both males and females. Progesterone restored NADH-linked respiration in both sexes and FADH2-linked respiration in females. Progesterone also preserved mitochondrial glutathione pool in both sexes. Our findings point to a sex difference in brain mitochondrial function of young male and female mice and identify the oxidative phosphorylation system and the mitochondrial oxidative stress as targets of the neuroprotective effects of progesterone.

Les accidents vasculaires cérébraux constituent la troisième cause de mortalité et la première cause de handicap chez l'adulte dans les pays industrialisés. Ils induisent d'importantes altérations fonctionnelles au sein du tissu neuro-glio-vasculaire avec des conséquences dramatiques en terme de handicap cognitif et moteur affectant le quotidien des patients. L'objectif de ce travail est d'étudier les modifications des conductances potassiques vasculaires, Kir et Kv, dans un modèle d'ischémie-reperfusion focale par occlusion intraluminale de l'artère cérébrale moyenne chez le rat. Une étude de la plasticité ionique au cours de la période post-ischémique (7 jours) est réalisée par des techniques électrophysiologiques (patch-clamp) et une évaluation du déficit sensorimoteur représentatif du handicap fonctionnel observé chez des patients suite à un accident vasculaire cérébral est effectuée. Face à ces lésions, l'évaluation en phase aiguë de deux traitements pharmacologiques a été réalisée, par l'administration de la Stobadine, molécule aux propriétés antioxydantes, et de Fénofibrate, agoniste des récepteurs PPAR alpha.<br />Au niveau vasculaire, nous avons confirmé à 24 heures de reperfusion l'altération du courant Kir2.x, de la relaxation K + dépendante qui lui est associée ainsi que de la relaxation endothélium-dépendante. Il est mis en évidence pour la première fois la réduction d'une autre conductance potassique, voltage-dépendante, impliquant les canaux Kv. Au cours de la période post-ischémique étudiée jusqu'à 7 jours, une récupération totale, spontanée et progressive de la conductance Kir2.x et de la relaxation potassium-dépendante est obtenue. En revanche aucune récupération de la relaxation endothélium-dépendante n'est observée à 7 jours de reperfusion. En ce qui concerne le déficit sensorimoteur observé dès 24 heures et évalué par le test du ruban adhésif et de la traction préhensile, un retour significatif et progressif des capacités sensorimotrices se met en place mais reste partiel.<br />L'administration de Stobadine (1h et 6h après l'ischémie) permet de prévenir l'altération de la relaxation endothélium-dépendante et de la densité de courant Kir2.x dès 24h de reperfusion sans modifier la cinétique de la récupération spontanée de la relaxation potassium-dépendante. En revanche ce traitement induit une diminution significative des lésions cérébrales et une accélération de la récupération des fonctions motrices et sensorimotrices au cours des 7 premiers jours de reperfusion. De même, à 3 jours de reperfusion, une réduction significative des lésions cérébrales et une accélération de la récupération du déficit moteur sont observées suite à l'administration du Fénofibrate (traitement biquotidien sur 3 jours) en parallèle d'une récupération totale des deux mécanismes de vasorelaxation étudiés.