Os nervos periféricos são extensões do sistema nervoso central e responsável pela interação das atividades entre as extremidades, em suas funções sensitivas e motoras. São vulneráveis aos mesmos tipos de traumas que afetam outros tecidos: contusão, compressão, esmagamento, estiramento, avulsão e laceração. As lesões de nervos periféricos situam-se entre as mais incapacitantes que acometem indivíduos em idade produtiva, em face dos múltiplos aspectos concernentes às sequelas deste tipo de afecção. Desta forma, a interrupção de continuidade da estrutura do nervo, como no caso da neurotmese, por algum tipo de trauma, resulta na interrupção de transmissão dos impulsos nervosos e na desorganização de suas atividades funcionais. Por meio da utilização da microcirurgia foi possível desenvolver técnicas reparadoras que vão desde simples neurorrafia término-terminal até sofisticados procedimentos cirúrgicos com a utilização de enxertos de nervos, veias e artérias invertidas, tubos sintéticos de materiais variados, tais como silicone e polietileno. Outro aspecto que intriga pesquisadores de todo mundo é a utilização de fatores neurogênicos capazes de acelerar ou melhorar a regeneração de nervos periféricos. A gordura autóloga tem sido continuamente referenciada pela sua abundante oferta, no próprio sitio cirúrgico, apresentando resultados promissores, visto que a adventícia dos vasos é constituída por tecido conjuntivo frouxo, rico em adipócitos. Assim, em um trauma, os neuritos oriundos do coto proximal do nervo lesado, ficam diretamente em contato com esses adipócitos. Seguindo este raciocínio, e com base em trabalhos anteriores onde foi usada veia preenchida com músculo esquelético a fresco como enxerto, decidiu-se testar a possibilidade de crescimento axonal por meio de enxerto com tubo de polietileno preenchido por tecido adiposo autólogo associado a protocolo de imersão em câmara hiperbárica, por meio de um estudo Randomizado Controlado. Para tanto utilizou-se um tubo com 12 mm de comprimento por 0,25 mm de diâmetro, com poros de 80 μm de diâmetro, preenchido com tecido adiposo in natura retirado das adjacências do referido nervo, na tentativa de se recuperar o nervo isquiático. Os resultados morfométricos demonstraram que, os grupos experimentais com e sem preenchimento de gordura tiveram resultados, do ponto de vista morfométrico e funcional sem diferenças estatisticamente significantes, contudo, quando estes foram confrontados ao grupo controle final, apresentaram diferenças estatisticamente significantes. Já relevando a avaliação funcional, por meio do Catwalk, constatou-se que não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos experimentais, mas teve diferença ao comparar com o grupo controle final, Diante das evidências encontradas e apoiados na literatura pode-se concluir que a câmara hiperbárica trouxe resultados positivos verificados pela aproximação dos resultados dos grupos experimentais tanto morfométrica como funcionalmente. / The peripheral nerves are extensions of the central nervous system and are responsible for the sensory and motor functions of the limbs. These nerves are vulnerable to the same types of traumas that affect other tissues: contusion, compression, crushing, stretching, avulsion, and laceration. Amongst the most disabling kinds of injuries that affect working-age individuals are those of the peripheral nerves; due to the multifaceted characteristics of the aftereffects of the injury. The break in continuity of the nerve structure due to trauma, as in the case of neurotmesis, results in the disruption of the transmission of nerve impulses and the disorganization of their functions. Through the use of microsurgery, it was possible to develop reconstructive techniques that range from a simple end-to-end neurorrhaphy to sophisticated surgical procedures that utilize nerve grafts, inverted veins and arteries, and synthetic rods of varied materials such as silicone or porous polyethylene. Another aspect that intrigues researchers around the world is the utilization of neurogenic factors capable of accelerating or improving the regeneration of peripheral nerves. Autologous fat has been a constant reference in this field of surgery due to its abundant supply at the surgical site itself. The results are promising, as the adventitia of vessels consists of loose connective tissue rich in adipocytes. Thus in a trauma, the neurites derived from the proximal stump of the damaged nerve are in direct contact with these adipocytes. Following this reasoning, and based on previous studies where veins grafted with fresh skeletal muscle were used, we decided to conduct a randomized controlled study to test the possibility of axonal growth by means of grating with a polyethylene rod filled with autologous adipocytes associated with immersion in a hyperbaric chamber. In an attempt to recover the sciatic nerve, a rod 12 mm in length, with a diameter of 0.25 mm, and with pores of 80 μm in diameter, filled with adipose tissue in natura removed from the surroundings of said nerve, was used. The morphometric results showed that the experimental groups with and without fat fillings had results that, from the morphometric and functional point of view, were of no statistically significant difference. However, when these results were compared with the final control group, statistically significant differences were noted. Highlighting the functional evaluation through the use of Catwalk, it was found that there were no statistically significant differences between the experimental groups, but there was indeed a difference in comparison to the final control group. In light of the evidence found and supported by literature, one can conclude that the use of the hyperbaric chamber brought positive results verified by the proximity of both the morphometric and functional results of the experimental groups.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-11-24Bitstream added on 2014-06-13T18:19:53Z : No. of bitstreams: 1 pereira_rn_me_jabo.pdf: 471924 bytes, checksum: 4ffda866a6bffc48af4632f12c8dd08f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Lesões no Sistema Nervoso Periférico (SNP) são relativamente freqüentes. Apesar do SNP apresentar capacidade regenerativa em muitas situações não ocorre regeneração nervosa adequada levando a perdas funcionais. A Catuama é a associação de quatro extratos hidroalcoólicos obtidos de plantas brasileiras (Paullinia cupana, Trichilia catigua, Ptychopetalum olacoides e Zingiber officinale) com conhecida ação neuroprotetora, antiinflamatória, anti-oxidante e antidepressiva. O bilobalide é um componente extraído das folhas de Ginkgo biloba que tem demonstrada ação neuroprotetora nos sistemas nervosos central e periférico. O presente estudo avaliou a ação da Catuama e do bilobalide na regeneração nervosa periférica de ratos submetidos à secção do nervo isquiático e reparação com implante de tubo de silicone preenchido por colágeno deixando um intervalo entre os segmentos nervosos de 10mm. A Catuama foi administrada por via oral nos primeiros 28 dias de pós-operatório, nas doses de 100, 200 e 400mg/kg e comparada ao bilobalide na dose de 200μM adicionado ao colágeno líquido do implante e ao grupo controle. Os animais foram avaliados na primeira, quinta e décima semana de pós-operatório pelo teste de marcha e na décima semana pela avaliação eletrofiosiológica e pelas análises quantitativa e qualitativa dos cortes histológicos de amostras do nervo isquiático e do músculo gastrocnêmio. Em todas as análises utilizadas não foi encontrada diferença (P>0,05) entre os grupos experimentais o que indica que a Catuama e o bilobalide não interferiram na regeneração nervosa periférica nas condições experimentais. / Peripheral nerve lesions are common. Functional recovery after peripheral nerve injuries is frequently poor, despite the capacity for axonal regeneration, resulting in most cases in a functional loss of the nerve. The Catuama is composed of four brasilian plants extracts (Paullinia cupana, Trichilia catigua, Ptychopetalum olacoides e Zingiber officinale). The Catuama is known as having neuroprotector, antinflamatory, antioxidant and antidepressive effects. Bilobalide, extraction of the leaves of Ginkgo biloba, is known by it´s neuroprotector effect in the central and peripheral nervous system. The present study evaluates the effect of Catuama and bilobalide on peripheral nerve regeneration in rats following a sciatic nerve section. Sciatic nerve of adult rats was transected with a 10-mm gap and the proximal and distal nerve stumps were fixed in a silicone tube filled with collagen. The Catuama was oral administered along 28 days after the surgery. Three different treatment groups using doses of 100, 200 and 400mg/kg of Catuama were compared with one group using 200μM bilobalide associated with the liquid collagen in the silicone tube and the control group. Animals evaluations were done by a walk test on the first, fifth and tenth week after the surgery. Eletrophysiologic stimulation and quantitative and qualitative hystologic analysis of the sciatic nerve and gastrocnemius muscle were also realized on the tenth week after the surgery. No statistical difference was found in these variables between the five groups (P >0.05). These results suggest that there was no effect of Catuama or bilobalide on peripheral nerve regeneration regeneration.

Os nervos periféricos são extensões do sistema nervoso central e responsável pela interação das atividades entre as extremidades, em suas funções sensitivas e motoras. São vulneráveis aos mesmos tipos de traumas que afetam outros tecidos: contusão, compressão, esmagamento, estiramento, avulsão e laceração. As lesões de nervos periféricos situam-se entre as mais incapacitantes que acometem indivíduos em idade produtiva, em face dos múltiplos aspectos concernentes às sequelas deste tipo de afecção. Desta forma, a interrupção de continuidade da estrutura do nervo, como no caso da neurotmese, por algum tipo de trauma, resulta na interrupção de transmissão dos impulsos nervosos e na desorganização de suas atividades funcionais. Por meio da utilização da microcirurgia foi possível desenvolver técnicas reparadoras que vão desde simples neurorrafia término-terminal até sofisticados procedimentos cirúrgicos com a utilização de enxertos de nervos, veias e artérias invertidas, tubos sintéticos de materiais variados, tais como silicone e polietileno. Outro aspecto que intriga pesquisadores de todo mundo é a utilização de fatores neurogênicos capazes de acelerar ou melhorar a regeneração de nervos periféricos. A gordura autóloga tem sido continuamente referenciada pela sua abundante oferta, no próprio sitio cirúrgico, apresentando resultados promissores, visto que a adventícia dos vasos é constituída por tecido conjuntivo frouxo, rico em adipócitos. Assim, em um trauma, os neuritos oriundos do coto proximal do nervo lesado, ficam diretamente em contato com esses adipócitos. Seguindo este raciocínio, e com base em trabalhos anteriores onde foi usada veia preenchida com músculo esquelético a fresco como enxerto, decidiu-se testar a possibilidade de crescimento axonal por meio de enxerto com tubo de polietileno preenchido por tecido adiposo autólogo associado a protocolo de imersão em câmara hiperbárica, por meio de um estudo Randomizado Controlado. Para tanto utilizou-se um tubo com 12 mm de comprimento por 0,25 mm de diâmetro, com poros de 80 μm de diâmetro, preenchido com tecido adiposo in natura retirado das adjacências do referido nervo, na tentativa de se recuperar o nervo isquiático. Os resultados morfométricos demonstraram que, os grupos experimentais com e sem preenchimento de gordura tiveram resultados, do ponto de vista morfométrico e funcional sem diferenças estatisticamente significantes, contudo, quando estes foram confrontados ao grupo controle final, apresentaram diferenças estatisticamente significantes. Já relevando a avaliação funcional, por meio do Catwalk, constatou-se que não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos experimentais, mas teve diferença ao comparar com o grupo controle final, Diante das evidências encontradas e apoiados na literatura pode-se concluir que a câmara hiperbárica trouxe resultados positivos verificados pela aproximação dos resultados dos grupos experimentais tanto morfométrica como funcionalmente. / The peripheral nerves are extensions of the central nervous system and are responsible for the sensory and motor functions of the limbs. These nerves are vulnerable to the same types of traumas that affect other tissues: contusion, compression, crushing, stretching, avulsion, and laceration. Amongst the most disabling kinds of injuries that affect working-age individuals are those of the peripheral nerves; due to the multifaceted characteristics of the aftereffects of the injury. The break in continuity of the nerve structure due to trauma, as in the case of neurotmesis, results in the disruption of the transmission of nerve impulses and the disorganization of their functions. Through the use of microsurgery, it was possible to develop reconstructive techniques that range from a simple end-to-end neurorrhaphy to sophisticated surgical procedures that utilize nerve grafts, inverted veins and arteries, and synthetic rods of varied materials such as silicone or porous polyethylene. Another aspect that intrigues researchers around the world is the utilization of neurogenic factors capable of accelerating or improving the regeneration of peripheral nerves. Autologous fat has been a constant reference in this field of surgery due to its abundant supply at the surgical site itself. The results are promising, as the adventitia of vessels consists of loose connective tissue rich in adipocytes. Thus in a trauma, the neurites derived from the proximal stump of the damaged nerve are in direct contact with these adipocytes. Following this reasoning, and based on previous studies where veins grafted with fresh skeletal muscle were used, we decided to conduct a randomized controlled study to test the possibility of axonal growth by means of grating with a polyethylene rod filled with autologous adipocytes associated with immersion in a hyperbaric chamber. In an attempt to recover the sciatic nerve, a rod 12 mm in length, with a diameter of 0.25 mm, and with pores of 80 μm in diameter, filled with adipose tissue in natura removed from the surroundings of said nerve, was used. The morphometric results showed that the experimental groups with and without fat fillings had results that, from the morphometric and functional point of view, were of no statistically significant difference. However, when these results were compared with the final control group, statistically significant differences were noted. Highlighting the functional evaluation through the use of Catwalk, it was found that there were no statistically significant differences between the experimental groups, but there was indeed a difference in comparison to the final control group. In light of the evidence found and supported by literature, one can conclude that the use of the hyperbaric chamber brought positive results verified by the proximity of both the morphometric and functional results of the experimental groups.

INTRODUÇÃO: O tratamento padrão para lesões de nervo periférico que não podem ser suturados primariamente é a enxertia de nervo autólogo. Esse método, porém, carece de resultados satisfatórios e impõe algumas limitações técnicas e complicações. Várias opções já foram estudadas como alternativas ao enxerto de nervo, porém ainda não há conduto biológico ou sintético disponível para uso clínico que tenha a mesma capacidade regenerativa do enxerto de nervo autólogo. Os avanços em cultura celular e o maior entendimento dos mecanismos moleculares e celulares da regeneração nervosa levaram ao uso de células promotoras de regeneração associado aos condutos na tentativa de melhorar os resultados da reconstrução nervosa. Vários estudos demonstraram que o uso de célulastronco derivadas de tecido adiposo (ADSC) em condutos aloplásticos potencializa a regeneração neural. No entanto, nenhum estudo até hoje comparou a adição de ADSC indiferenciadas em conduto aloplástico ao tratamento padrão com autoenxerto. Esse estudo tem como objetivo avaliar a influência da adição de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo em conduto de fibrina na regeneração de nervo periférico e comparar com enxertia de nervo autógeno em modelo experimental de ratos. MÉTODO: Em um modelo de lesão de nervo ciático (defeito de 10 mm) foram avaliados 30 ratos Wistar divididos em 3 grupos. O defeito de nervo foi reconstruído usando conduto de fibrina (Grupo Conduto, n=10), conduto de fibrina acrescido de ADSC (Grupo ADSC, n=10) e autoenxerto do nervo (Grupo Autoenxerto, n=10). A avaliação funcional dos ratos foi realizada com o teste de marcha (walking track analysis) com 4, 8 e 12 semanas e o índice de função ciática (IFC) foi determinado. Após 12 semanas, o peso do músculo tríceps sural foi avaliado. Segmentos dos nervos regenerados também foram coletados para análises histológicas como densidade axonal e diâmetro médio das fibras. RESULTADOS: O grupo Conduto mostrou recuperação funcional no teste da marcha após a reconstrução do nervo, porém com resultados inferiores aos outros dois grupos. O grupo ADSC mostrou recuperação intermediária e o grupo Autoenxerto obteve os melhores resultados (IFC com 12 semanas de -53,3±.3 vs -44,7±3 vs - 35,6±2, respectivamente, p < 0,001). A relação de peso do músculo tríceps sural no grupo Conduto foi de 41,1±3%, no grupo ADSC de 53,3±4% e no grupo Autoenxerto de 71,0 ± 4% (p < 0,001). Na avaliação histológica, o grupo Conduto mostrou densidade axonal de 39,8±3 axônios/10.995?m2 e diâmetro médio das fibras de 3,9 ± 0?m2, o grupo ADSC densidade axonal de 58,8 ± 3 axônios/10.995um2 e diâmetro médio das fibras de 4,9 ± 1um2 e o grupo Autoenxerto densidade axonal de 67,1±2 axônios/10.995?m2 e diâmetro médio das fibras de 8,9±1um2 (p < 0,001). CONCLUSÃO: A adição de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (ADSC) em conduto de fibrina na regeneração de nervo periférico, em modelo experimental de ratos, mostrou recuperação funcional e regeneração histológica estatisticamente mais significativa comparada à reconstrução somente com conduto de fibrina, porém ainda aquém dos resultados obtidos com enxertia de nervo autógeno / Introduction: The standard treatment for peripheral nerve injuries that cannot be primarily sutured is nerve autograft. But this method lacks satisfactory results and imposes some technical limitations and complications. Several options have been studied as alternatives to nerve autografting, but there is no biological or synthetic conduit available for clinical use that provides the same regenerative capacity of nerve autograft. Advances in cell culture and understanding of nerve regeneration mechanisms led to the use of regeneration-inducing cells in association with conduits, in an attempt to improve the reconstruction results. Several studies have shown that the use of adipose derived stem cells (ADSC) into conduits enhances neural regeneration. However, there is no study that compared the addition of undifferentiated ADSC in alloplastic conduit to standard treatment with autograft. This study evaluated the influence of the addition of adipose derived stem cell in fibrin conduit for peripheral nerve regeneration in comparison to the nerve autograft, in a rat model. Method: A sciatic nerve injury model (10-mm defect) was performed in 30 Wistar rats, which were divided into 3 groups. Nerve defect was reconstructed using fibrin conduit (Conduit group, n=10), fibrin conduit filled with ADSC (ADSC group, n = 10) and nerve autograft, (Autograft group, n=10). The walking behavior was measured by footprint analysis at 4, 8, and 12 weeks and sciatic function index (SFI) was determined. After 12 weeks, the triceps surae muscle weight was evaluated and histological analysis was performed to evaluate the regenerated nerve and measured axonal density and fibers diameter average. Results: The Conduit group showed less improvement in walking behavior compared to ADSC group and Autograft group (SFI at 12 weeks, - 53.3 ± .3 vs -44.7 ± 3 vs -35.6 ± 2 respectively, p< 0.001). The triceps surae muscle weight ratio of the fibrin conduit group was 41.1± 3%, ADSC group was 53.3 ± 4%, and Autograft group 71.0 ± 4% (p < 0.001). In histological evaluation, the Conduit group showed axonal density of 39.8±3 axons/10995um2 and fiber diameter average of 3.9±0 ?m2, the ADSC group had axonal density of 58.8 ± 3 axons/10995 um2 and fiber diameter average of 4.9±1?m2 and axon density of Autograft group was 67.1±2 axons/10995 um2 and fiber diameter average was 8.9±1?m2 (p < 0.001). Conclusion: The addition of adipose derived stem cells (ADSC) into fibrin conduit used for nerve reconstruction following peripheral nerve injury in the rat model, showed better functional recovery and better histological regeneration compared to reconstruction with fibrin conduit without ADSC. However, the functional recovery in the ADSC group was worse than that in nerve Autograft group and the nerve repair with the ADSC-fibrin conduit has less myelinated fibers when compared to the repair with nerve autograf

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Kleber Fernando Pereira.pdf: 1118848 bytes, checksum: 4671bfd9ffd403997392e07dda224e2d (MD5) Previous issue date: 2012-03-02 / The raccoon (Procyon cancrivorus) is a wild carnivore, reaching one meter in length including the tail, and weigh up to 10 kg. Known as raccoon or mouse naked hand washer has the peculiarity to dive in the water everything she eats. It has nocturnal and crepuscular, terrestrial and arboreal climber, a resident of shrub areas, preferably near water courses, is a good swimmer with great ability to dig, climb and is living alone. This thesis has generated the production of two articles. In the first article, entitled "Origin and anatomical distribution of the ischiatic nerve of raccoon", it was proposed to study the anatomy of the ischiatic nerve of raccoon in order to build morphological basis of this nerve with the aim of comparative neurology, and thus provide necessary support especially for the practices used in clinical medicine and surgery. The ischiatic nerve of the raccoon comes from the ventral ramus of the sixth and seventh nerves lumbar and first sacral nerve, resembling the origin of the guinea pig. Leaves the pelvic cavity through the greater ischiatic foramen, presenting themselves surrounded by the superficial gluteal muscles, biceps femoris and caudal crural abductor, this path similar to the dog and is distributed to the gluteus biceps, gluteus medius, gluteus deep, as well as observed in goats Saanen, and quadratus femoris muscles twin, resembling in dog, cat and pig, biceps femoris, semitendinosus, semimembranosus, observed in all specimens analyzed and adductor magnus, only observed raccoon. In all specimens are compared, the ischiatic nerve ends by bifurcating into the tibial and common peroneal nerve. In the second article, entitled "Morphological Aspects of the salivary glands of crab-eating raccoon (Procyon cancrivorus)" were described morphological aspects of salivary glands and their ducts located in Procyon cancrivorus and compare with literature data on the morphology of domestic and wild animals such as dogs, cats, skunks and raccoons. The salivary glands of the raccoon are formed by the parotid, mandibular, sublingual and zygomatic. The parotid gland shows irregular triangular shape and mandibular rounded contour is observed surrounded by a fibrous capsule. The sublingual is divided into two parts: a caudal part which lies in the region occiptomandibular the digastric muscle and the rostral part lies between the mucous membrane of the mouth and mylohyoid muscle with its respective duct. The zygomatic gland is small and rounded, situated in the rostral part of the pterygopalatine fossa. The anatomical knowledge of the origin and distribution of the ischiatic nerve and the morphology of the salivary glands when compared with bare hand domestic and wild animals, provides contributions to medicine and surgery in wild animals and for future studies on the general biology of the species. / O mão-pelada (Procyon cancrivorus) é um carnívoro silvestre, podendo chegar a 1 metro de comprimento incluindo a cauda, e pesar até 10 kg. Conhecido como guaxinim, mão-pelada ou rato lavador têm a peculiaridade de mergulhar na água tudo o que come. Possui hábito noturno e crepuscular, escalador arborícola e terrícola, habitante de áreas arbustivas, preferencialmente próximas a cursos de água, é um bom nadador com ótimas habilidades para cavar, escalar e tem vida solitária. A presente tese gerou a produção de dois artigos. No primeiro artigo, Origem e distribuição anatômica do nervo isquiático de mão-pelada , propôs-se estudar a anatomia do nervo isquiático de mão-pelada, a fim de assentar bases morfológicas deste nervo visando à neurologia comparativa, e assim fornecer subsídios necessários especialmente para as práticas utilizadas nas clínicas médica e cirúrgica. O nervo isquiático do mão-pelada origina-se do ramo ventral do sexto e sétimo nervos lombares e primeiro nervo sacral, assemelhando-se com a origem em preá. Deixa a cavidade pélvica através do forame isquiático maior, apresentando-se envolvido pelos músculos glúteo superficial, bíceps femoral e abdutor caudal crural, trajeto este semelhante com o cão e distribui-se para os músculos glúteo bíceps, glúteo médio, glúteo profundo, assim como observado em caprinos da raça Saanen, músculos quadrado femoral e gêmeo, assemelhando-se em cão, gato e suíno, músculos bíceps femoral, semitendíneo, semimembranáceo, observado em todos os espécimes analisadas e adutor magno, verificado apenas em mão-pelada. Em todos os espécimes comparados, o nervo isquiático termina bifurcando-se em nervo tibial e fibular comum. No segundo artigo, Morphological aspects of the salivary glands of crab-eating racoon (Procyon cancrivorus) foram descritos os aspectos morfológicos das glândulas salivares e a localização dos seus ductos em Procyon cancrivorus, e comparar com dados literários sobre a morfologia de animais domésticos e silvestres, como cão, gato, gambás e quatis. As glândulas salivares do mão-pelada são formadas pelas glândulas parótida, mandibular, sublingual e zigomática. A glândula parótida apresenta formato irregularmente triangular e a mandibular observa-se contorno arredondado circundada por uma cápsula fibrosa. A sublingual se divide em duas partes: uma parte caudal que se situa na região occiptomandibular do músculo digástrico e a parte rostral situa-se entre a túnica mucosa da boca e o músculo milo-hióideo com seu respectivo ducto. A glândula zigomática é pequena e arredondada, situada na parte rostral da fossa pterigopalatina. O conhecimento anatômico da origem e distribuição do nervo isquiático e da morfologia das glândulas salivares do mão-pelada, quando comparado com animais domésticos e silvestres, oferece contribuições para a clínica médica e cirúrgica em animais silvestres e para futuros estudos sobre a biologia geral da espécie.

Orientador: Marcus Alexandre Finzi Corat / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:01:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nicolielo_RenatoLuizCursino_D.pdf: 3694566 bytes, checksum: 9d48540bdf4e330a06198c2b7816ad32 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As lesões traumáticas de nervos periféricos têm sido objeto de numerosos estudos que tentam compreender os processos de reparação pós-lesão. Apesar dos avanços nas técnicas cirúrgicas, os resultados funcionais têm sido bastante decepcionantes, ao que se refere ao intervalo de tempo entre lesão e tratamento. Para tratamento rápido e eficaz de lesões nervosas, a terapia celular torna-se uma possibilidade no aumento do sucesso de reparo do nervo. Propõe-se então avaliar a eficácia da terapia celular, sobre os níveis de melhora funcional dos camundongos com o nervo isquiático lesionado e tratado com células progenitoras GFP da medula óssea em comparação com seus controles. No presente trabalho utilizou-se camundongos C57BL/6-HETGFP/J/Unib geneticamente modificados como doadores de células progenitoras GFP ("green fluoresent protein") da medula óssea que foram usadas no tratamento via sistêmica em camundongos C57BL/6/J/Unib não marcados com GFP submetidos a esmagamento do nervo isquiático. Estes animais foram analisados quanto sua performance funcional, migração celular, imunohistoquímica de proteínas p75NTR e neurofilamento e contagem axonal em imagens de microscopia eletrônica. Através dos resultados obtidos verificou-se que houve uma significativa melhora funcional do grupo tratado de 224,9% quando comparado com o grupo controle, principalmente no início do processo de recuperação. Estes valores de melhora funcional coincidiram com a grande quantidade de células GFP, maior quantidade de axônios mielinizados e menor quantidade de axônios degeneradas encontradas no sitio da lesão, além do aumento de imunorreatividade da proteína p75NTR, envolvida no processo de regeneração nervosa. Tudo isto vem a demonstrar a eficiência da terapia celular utilizada com células progenitoras da medula óssea, com uma purificação não especifica, tornando-a viável para uma terapia celular sistêmica rápida, simples e eficaz sendo assim uma possibilidade terapêutica para lesões de nervo / Abstract: Traumatic injuries of peripheral nerves have been the subject of numerous studies that attempt to understand the processes of repair after injury. Despite advances in surgical techniques, the functional results have been very disappointing to depend on the time interval between injury and treatment. For fast and effective treatment of nerve lesions, cell therapy becomes a possibility in increasing the success of nerve repair. So it is proposed to evaluate the efficacy of cell therapy on levels of functional improvement of mice with injured ischiatic nerve and treated with GFP progenitor cells of bone marrow as compared with their controls. In this study we used mices C57BL/6-HETGFP/J/Unib genetically modified as donors of stem cells GFP ("green fluoresent protein") of bone marrow that were used in the treatment via systemic of mice C57BL/6/J/Unib not marked with GFP underwent sciatic nerve crush. These animals were analyzed for their functional performance, cell migration, immunohistochemistry of p75NTR protein and neurofilament and axonal counts in electron microscope images. From the results obtained it was verified that there was a significant functional improvement in the treated group 224.9% when compared with the control group, mainly at the start of the recovery process. These values of functional improvement have coincided with the large amount of GFP cells, largest amount of myelinated axons and smallest amount of degenerate axons found at the site of injury axons, in addition to the increase of immunoreactivity of the protein of p75NTR involved in nerve regeneration process. All this is to demonstrate the efficiency of cell therapy used in bone marrow progenitor cells with a non-specific purification, making it feasible for a quick, simple and effective systemic cell therapy becoming this way a therapeutic possibility for nerve injured / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

As rãs são utilizadas como modelos experimentais em diferentes situações experimentais. Uma delas é o estudo dos efeitos da seção do nervo isquiático (SNI) sobre o tecido nervoso. Essa ampla utilização desses animais como modelos experimentais justifica a realização de estudos que visam o conhecimento morfofuncional de seus tecidos. Inúmeros estudos mostram que, assim como nos mamíferos, o principal substrato energético no tecido nervoso de rãs é a glicose. Porém, é desconhecida a distribuição dos transportadores de glicose no tecido nervoso de rãs, bem como se a SNI altera esse transporte. Outra questão em aberto é se o lactato, cuja concentração está aumentada no plasma de rãs durante períodos de hibernação e após atividades motoras, é usado como substrato energético pelo tecido nervoso, o que está demonstrado em outras espécies de vertebrados. É desconhecida ainda no gânglio da raiz dorsal (GRD) de rãs a distribuição e os efeitos da SNT sobre a reação à nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato diaforase (NADPH-diaforase), enzima considerada equivalente a óxido nítrico sintase, responsável pela síntese de óxido nítrico, e a reação ao ácido periódico-reativo de Schiff (PAS), que indica a presença de mucopolissarídeos, incluindo o glicogênio, uma importante reserva energética no tecido nervoso de rãs. Desconhece-se também a distribuição e os efeitos da SNT sobre a imunorreatividade à serotonina, importante molécula com função neurotransmissora e/ou moduladora no sistema nervoso, tirosina hidroxilase, enzima limitante na síntese de catecolaminas, moléculas com diversos papéis fisiológicos, incluindo ação neurotransmissora e/ou neuromoduladora no tecido nervoso, e c-Fos, proteína considerada marcadora de ativação neural por estimulação nociva. Outras questões ainda em aberto são os efeitos da SNT sobre: a captação do análogo da glicose 1-14C 2-deoxi-D-glicose (14C-2-DG) e concentração plasmática de glicose e lactato; se os tipos II e III de células gliais satélites (CGSs), recentemente descritas no GRD de coelho, estão presentes nesse gânglio de rãs; e os efeitos da SNT sobre a ultraestrutura de CGSs e neurônios do GRD. Assim, o objetivo dessa tese foi determinar: 1) a ultraestrutura de neurônios e CGSs; 2) a distribuição das reações à NADPH-diaforase e PAS, e a imunoistoquímica à serotonina, tirosina hidroxilase, c-Fos e transportadores de glicose tipo 1 e 3; e 3) a captação de 14C-2-DG, na presença e ausência de lactato, em GRD de rãs Lithobates catesbianus com e sem SNI. A escolha pelos transportadores de glicose tipos 1 e 3 foi pelo fato de ocorrerem na membrana de endotélio, células gliais e de neurônios. Para a realização do estudo inicialmente 12 rãs Lithobates catesbianus, adultas, machos, com peso de 100-200g, que não sofreram qualquer manipulação cirúrgica foram mortas por decapitação e os gânglios das raízes dorsais (GRDs) do nervo isquiático retirados e preparados para análises ultraestrutural, histoquímica à NADPH-diaforase e PAS, e imunoistoquímica à serotonina, tirosina hidroxilase e transportadores de glicose dos tipos 1 e 3. Feito isso, 18 outras rãs, nas mesmas condições físicas, foram divididas em três grupos experimentais (n=6/grupo): controle (rãs que não sofreram qualquer manipulação cirúrgica), sham (rãs onde foram efetuados apenas os procedimentos para isolamento do nervo isquiático) e SNI (rãs que tiveram o nervo isquiático direito totalmente seccionado em seu tronco comum). Esses animais foram mortos três dias após a intervenção cirúrgica e seus GRDs do nervo isquiático usados para demonstrar os efeitos da secção nervosa sobre a ultraestrutura, a reação à NADPH-diaforase, e a imunoistoquímica à serotonina, tirosina hidroxilase, c-Fos e transportadores de glicose dos tipos 1 e 3 no GRD. Outros 20 animais, divididos nos mesmos grupos experimentais, foram usados para demonstrar os efeitos da SNI sobre a captação de 14C-2-DG, na presença ou ausência de lactato, e a taxa de produção de 14CO2 a partir de 14C-L-lactato e de 14C-glicose no GRD. Essas rãs foram usadas ainda para demonstrar os efeitos da denervação periférica sobre a concentração plasmática de glicose e lactato. Nossos resultados mostraram que os neurônios sensoriais do GRD de rã Lithobates catesbianus tiveram distribuição, diâmetro e morfologia que foi similar àquela descrita para essas células em gânglio de mamíferos. As CGSs apresentaram morfologia similar àquela descrita para essas células em gânglios de outras espécies de vertebrados. As células dos tipos II e III, observadas no GRD de coelho, não ocorreram no GRD de Lithobates catesbianus. O padrão de atividade à NADPH-diaforase e a distribuição da imunorreatividade à serotonina, tirosina hidroxilase e Glut 1 e 3 foram também similares ao descrito em mamíferos. Pela primeira vez foi demonstrada, em anfíbios, a presença de reação à NADPH-diaforase em CGCs do GRD. A captação de 14C-2-DG foi reduzida quando o lactato foi acrescentado ao meio de incubação. As alterações induzidas pela SNI foram também similares àquelas descritas nos mamíferos. Houve acréscimo no número de mitocôndrias, retículo endoplasmático, ribossomas e filamentos no citoplasma das CGSs, mais neurônios e CGCs com reação positiva à NADPH-diaforase, um maior número de prolongamentos imunorreativos à tirosina hidroxilase em torno de somas de neurônios sensoriais, e mais núcleos neuronais imunorreativos a c-Fos. Nenhuma alteração ocorreu na imunorreatividade a serotonina e transportadores de glicose. Houve aumento na captação de 14C-2-DG, que foi reduzido quando o lactato foi acrescentado ao meio de incubação. Porém, a formação de 14CO2 a partir de 14C-L-lactato e de 14C-glicose não alterou nessas condições. Todavia, diferentemente dos mamíferos, a SNI não provocou mudança no número de CGCs no GRD, mostrando uma peculiaridade na resposta das rãs à SNI. Assim, nosso estudo reforça o uso de rãs como modelo experimental para estudo dos efeitos da SNI, um modelo de dor fantasma, sobre o tecido nervoso. Porém, dada a diferença peculiar ocorrida no GRD de rãs com SNI, é evidente a necessidade de mais conhecimento dos efeitos dessa situação experimental nesses animais. / Frogs have been used as experimental models in different experimental situations. One of these is the study of the effects of the sciatic nerve transection (SNT) on the nerve tissue. The wide use of these animals as experimental models justifies the studies aimed at morphofunctionally understanding of their tissues. Numerous studies have shown that glucose is the main energy substrate in the nerve tissue of frogs as well as in mammals. However, the distribution of glucose transporters in the nerve tissue of frogs is unknown as well as whether SNT alters such transportation. Another unanswered question is whether the lactate, whose concentration is increased in the frog plasma during hibernation periods and after motor activities, is used as an energy substrate by the nerve tissue, which has been demonstrated in other vertebrate species. In the dorsal root ganglion (DRG) cells of frogs are still unknown the distribution and effects of SNT on the reaction of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase (NADPH-diaphorase), an enzyme that is considered equivalent to nitric oxide synthase, responsible for the synthesis of nitric oxide, and on the reaction of periodic acid-Schiff (PAS), which indicates the presence of mucopolysaccharides, including glycogen, an important energy reserve in frog nerve tissue. Moreover, the distribution and effects of SNT on immunoreactivity to serotonin, an important molecule that functions as a neurotransmitter and / or neuromodulator in the nervous system, tyrosine hydroxylase, the rate-limiting enzyme in catecholamine biosynthesis, molecules with various physiological roles, including neurotransmitter and / or neuromodulator action in the nerve tissue, and c-Fos, a protein that is regarded as a marker of neuronal activation by noxious stimulation are also unknown. Other questions regarding is the effect of SNT on the uptake of glucose analogue 2-Deoxy-D-glucose-1-14C (14C-2-DG) and glucose and lactate concentration plasma; whether the types II and III of satellite glial cells (SGCs), recently described in rabbit DRG, are present in this ganglion of frogs; and the effects of SNT on the ultrastructure of SGCs and DRG neurons remain unanswered as well. Thus, this thesis aimed to determine: 1) the ultrastructure of neurons and SGCs; 2) the distribution of NADPH-diaphorase and PAS reaction, and immunohistochemistry for serotonin, tyrosine hydroxylase, c-Fos and glucose transporters types 1 and 3; and 3) the uptake of 2-DG-14C, in the presence and absence of lactate, in DRG of frogs, Lithobates catesbianus, with and without SNT. Glucose transporters types 1 and 3 were chosen because they occur in the membrane of endothelial cells, glial cells and neurons. Initially, 12 adult male frogs, Lithobates catesbianus, weighing 100-200g, not having undergone any previous surgical manipulation, were killed by decapitation. The DRGs of the sciatic nerve were removed and prepared for ultrastructural analysis, histochemistry of NADPH-diaphorase and PAS, and immunohistochemistry for serotonin, tyrosine hydroxylase and glucose transporters types 1 and 3. After that, 18 other frogs in the same physical conditions were divided into three experimental groups (n = 6/group): control group (frogs not subjected to any surgical manipulation), sham (frogs in which only surgical procedures for isolating the sciatic nerve were performed), and SNT (frogs in which the right sciatic nerve was completely transected). These animals were killed three days after the procedure, and their sciatic nerve DRGs used to demonstrate the effects of nerve transection on the ultrastructure, NADPH-diaphorase reaction, and immunohistochemical serotonin, tyrosine hydroxylase, c-Fos and glucose transporters types 1 and 3 in the DRG. Other 20 animals, divided into the same experimental groups, were used to demonstrate the effects of SNI on the uptake of 14C-2-DG in the presence or absence of lactate, the production rate of 14CO2 from 14C-L-lactate and 14C-glucose in the DRG. These frogs were used to further demonstrate the effects of peripheral denervation on plasma glucose and lactate levels. Our results have demonstrated that sensory neurons of bullfrog, Lithobates catesbianus, DRG showed distribution, diameter and morphology similar to those described for these ganglion cells in mammals. The CGSs showed morphology similar to that described for these cells in the lymph nodes of other vertebrate species. Cells types II and III, observed in rabbit DRG did not occur in the Lithobates catesbianus DRG. The pattern of NADPH-diaphorase activity and distribution of immunoreactivity of serotonin, tyrosine hydroxylase and Glut 1 and 3 were also similar to those described in mammals. For the first time, it has been demonstrated the presence of NADPH-diaphorase reaction on SGCs of DRG in amphibians. The uptake of 14C-2-DG was reduced when lactate was added to the incubation medium. SNT-induced changes were also similar to those ones described in mammals. There was an increase in the number of mitochondria, endoplasmic reticulum, ribosomes and filaments in the SGCs cytoplasm; more neurons and SGCs with positive reaction to NADPH-diaphorase; a greater number of tyrosine hydroxylase immunoreactive extensions around body sensory neurons; and more c-Fos immunoreactivity in neuronal nuclei. No changes occurred in serotonin immunoreactivity and glucose transporters. There was an increase in the uptake of 14C-2-DG, which was reduced when lactate was added to the incubation medium. However, the formation of 14C-2-DG from 14C-L-lactato and glucose did not change under these conditions. Unlike mammals, SNT caused no change in the number of SGCs in DRG, showing a peculiarity in the response of frogs to SNT. Therefore, our study supports the use of frogs as an experimental model to study the effects of SNT, a model of phantom pain on the nerve tissue. However, given the peculiar differences occurred in the DRG of frogs with SNT, it is clearly necessary to carry out further studies to better understand the effects of an experimental situation like this in such animals.

O objetivo desta Tese foi analisar os efeitos do treinamento de equilíbrio e coordenação e do treinamento aeróbico sobre variáveis funcionais, morfológicas do nervo isquiático e do músculo sóleo, bem como a imunorreatividade para sinaptofisina e da neurotrofina-3 na medula espinal após uma lesão por esmagamento do nervo isquiático. Para isso, ratos Wistar adultos foram divididos de maneira aleatória em 4 grupos experimentais: Sham-operado (SH), Não-treinados (NT), Treinamento Aeróbico (Endurance Training – ET) e Treinamento de Equilíbrio e Coordenação (Balance and Coordination Training – BCT), sendo que os três últimos grupos experimentais foram submetidos à lesão por esmagamento do nervo isquiático, que teve como consequência uma axonotmese. Os protocolos de treinamento tiveram início na fase aguda, 48 horas após o procedimento cirúrgico para o esmagamento do nervo e tiveram a duração de 4 semanas. Nossos resultados demonstraram que na análise funcional sensoriomotora (Teste da Escada Horizontal e Teste da Barra Estreita) os animais do grupo BCT apresentaram um melhor desempenho que os animais dos outros grupos. Entretanto, na análise funcional locomotora (Índice de Funcionalidade do Nervo Isquiático e Comprimento da Passada do Membro Lesionado), os resultados do Índice de Funcionalidade do Nervo Isquiático foram similares entre os grupos lesionados (NT, ET e BCT) enquanto no Comprimento da Passada do Membro Lesionado, os animais do ET apresentaram resultados mais satisfatórios que os demais grupos. No estudo morfológico quantitativo do músculo sóleo, a análise morfométrica muscular demonstrou que os grupos ET e BCT apresentaram resultados semelhantes entre si e melhores que o grupo NT nos parâmetros de área de tecido muscular, de tecido conjuntivo, de vasos sanguíneos, de densidade de fibras musculares e da área de secção transversal das fibras musculares. Na análise morfométrica da porção distal do nervo lesionado os resultados dos dois grupos treinados foram similares entre si em todos os parâmetros analisados. Esses animais treinados apresentaram melhores resultados quando comparado ao grupo NT para a variável diâmetro médio das fibras nervosas, enquanto o grupo ET na área total dos vasos sanguíneos e na densidade das fibras mielínicas. A análise qualitativa, tanto do músculo sóleo como do nervo isquiático, mostrou que os grupos lesionados apresentaram características de nervo e de músculo em regeneração, não sendo possível verificar diferenças entre os grupos treinados e o grupo não treinado. A imunorreação para sinaptofisina na medula espinal, por meio da análise da densitometria óptica no corno dorsal dos níveis L4-L6 da medula espinal revelou-se significativamente maior no grupo BCT quando comparado ao grupo NT. Na análise da neurotrofina-3 na mesma região da medula espinal, o grupo BCT apresentou resultados significativamente superiores aos demais grupos. Hipotetizamos que essa imunorreação específica do grupo BCT está diretamente relacionada com os melhores resultados deste grupo nos testes sensoriomotores, uma vez que nas análises morfológicas quantitativas e qualitativas os grupos ET e BCT apresentaram resultados similares. / The aim of this thesis is to analyze the effects of balance and coordination training, and aerobic training on functional variables, morphological variables of the sciatic nerve and soleus muscle, as well as synaptophysin and neurotrophin-3 immureactivity in the spinal cord after a crush injury of the sciatic nerve. Therefore, adult Wistar rats were randomly divided into 4 groups: Sham-operated (SH); Non-trained (NT); Endurance Training (ET), and Balance and Coordination Training (BCT). The last three experimental groups were submitted to sciatic nerve crush injury, which resulted in an axonotmesis. The training protocols, which lasted for four weeks, were initiated early during the acute phase - 48 hours after the surgical procedures. Our results showed that for the sensorimotor functional analysis (Horizontal Ladder Rung Walking Test and Narrow Bar Test) the BCT group animals presented better performance than the other group’s animals. However, for the locomotor functional analysis (Sciatic Functional Index and Right Hindlimb Paw Stride Length), the Sciatic Functional Index presented similar results between the injured groups (NT, ET, and BCT) while the Right Hindlimb Paw Stride Length, the animals from the ET group showed better results than those from the other groups. In the quantitative morphological study of the soleus muscle, the muscular morphometric analysis showed that ET and BCT groups presented similar results in comparison to each other, and better results than NT group regarding the parameters of muscle tissue areas, connective tissue, blood vessels, muscle fiber density, and the muscle fibers cross-sectional area. In the morphometric analysis of the distal portion of the damaged nerve, the results from both trained groups were similar in comparison to each other in all analyzed parameters as well. This trained animals presented better results when compared to the NT group to the nerve fiber diameter, while the ET group presented better results regarding the blood vessel total area and the myelinated fiber density. The qualitative analysis - both of the soleus muscle and the sciatic nerve - showed that the injured groups had characteristics of nerve and muscle regeneration, not being possible to verify differences between the trained and untrained groups. The spinal cord synaptophysin immureactivity, through optical densitometry at spinal cord L4-L6 levels of the dorsal horn revealed to be significantly in the BCT in comparison to the NT group. In the same region of the spinal cord neurotrophin-3 analysis, the BCT group showed significantly better results than the other groups. We hypothesized that this specific immureactivity in group BCT is directly related to the best results from this group in the sensorimotor tests, once the quantitative and qualitative morphological analyzes of the ET and BCT groups showed similar results.

As rãs são utilizadas como modelos experimentais em diferentes situações experimentais. Uma delas é o estudo dos efeitos da seção do nervo isquiático (SNI) sobre o tecido nervoso. Essa ampla utilização desses animais como modelos experimentais justifica a realização de estudos que visam o conhecimento morfofuncional de seus tecidos. Inúmeros estudos mostram que, assim como nos mamíferos, o principal substrato energético no tecido nervoso de rãs é a glicose. Porém, é desconhecida a distribuição dos transportadores de glicose no tecido nervoso de rãs, bem como se a SNI altera esse transporte. Outra questão em aberto é se o lactato, cuja concentração está aumentada no plasma de rãs durante períodos de hibernação e após atividades motoras, é usado como substrato energético pelo tecido nervoso, o que está demonstrado em outras espécies de vertebrados. É desconhecida ainda no gânglio da raiz dorsal (GRD) de rãs a distribuição e os efeitos da SNT sobre a reação à nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato diaforase (NADPH-diaforase), enzima considerada equivalente a óxido nítrico sintase, responsável pela síntese de óxido nítrico, e a reação ao ácido periódico-reativo de Schiff (PAS), que indica a presença de mucopolissarídeos, incluindo o glicogênio, uma importante reserva energética no tecido nervoso de rãs. Desconhece-se também a distribuição e os efeitos da SNT sobre a imunorreatividade à serotonina, importante molécula com função neurotransmissora e/ou moduladora no sistema nervoso, tirosina hidroxilase, enzima limitante na síntese de catecolaminas, moléculas com diversos papéis fisiológicos, incluindo ação neurotransmissora e/ou neuromoduladora no tecido nervoso, e c-Fos, proteína considerada marcadora de ativação neural por estimulação nociva. Outras questões ainda em aberto são os efeitos da SNT sobre: a captação do análogo da glicose 1-14C 2-deoxi-D-glicose (14C-2-DG) e concentração plasmática de glicose e lactato; se os tipos II e III de células gliais satélites (CGSs), recentemente descritas no GRD de coelho, estão presentes nesse gânglio de rãs; e os efeitos da SNT sobre a ultraestrutura de CGSs e neurônios do GRD. Assim, o objetivo dessa tese foi determinar: 1) a ultraestrutura de neurônios e CGSs; 2) a distribuição das reações à NADPH-diaforase e PAS, e a imunoistoquímica à serotonina, tirosina hidroxilase, c-Fos e transportadores de glicose tipo 1 e 3; e 3) a captação de 14C-2-DG, na presença e ausência de lactato, em GRD de rãs Lithobates catesbianus com e sem SNI. A escolha pelos transportadores de glicose tipos 1 e 3 foi pelo fato de ocorrerem na membrana de endotélio, células gliais e de neurônios. Para a realização do estudo inicialmente 12 rãs Lithobates catesbianus, adultas, machos, com peso de 100-200g, que não sofreram qualquer manipulação cirúrgica foram mortas por decapitação e os gânglios das raízes dorsais (GRDs) do nervo isquiático retirados e preparados para análises ultraestrutural, histoquímica à NADPH-diaforase e PAS, e imunoistoquímica à serotonina, tirosina hidroxilase e transportadores de glicose dos tipos 1 e 3. Feito isso, 18 outras rãs, nas mesmas condições físicas, foram divididas em três grupos experimentais (n=6/grupo): controle (rãs que não sofreram qualquer manipulação cirúrgica), sham (rãs onde foram efetuados apenas os procedimentos para isolamento do nervo isquiático) e SNI (rãs que tiveram o nervo isquiático direito totalmente seccionado em seu tronco comum). Esses animais foram mortos três dias após a intervenção cirúrgica e seus GRDs do nervo isquiático usados para demonstrar os efeitos da secção nervosa sobre a ultraestrutura, a reação à NADPH-diaforase, e a imunoistoquímica à serotonina, tirosina hidroxilase, c-Fos e transportadores de glicose dos tipos 1 e 3 no GRD. Outros 20 animais, divididos nos mesmos grupos experimentais, foram usados para demonstrar os efeitos da SNI sobre a captação de 14C-2-DG, na presença ou ausência de lactato, e a taxa de produção de 14CO2 a partir de 14C-L-lactato e de 14C-glicose no GRD. Essas rãs foram usadas ainda para demonstrar os efeitos da denervação periférica sobre a concentração plasmática de glicose e lactato. Nossos resultados mostraram que os neurônios sensoriais do GRD de rã Lithobates catesbianus tiveram distribuição, diâmetro e morfologia que foi similar àquela descrita para essas células em gânglio de mamíferos. As CGSs apresentaram morfologia similar àquela descrita para essas células em gânglios de outras espécies de vertebrados. As células dos tipos II e III, observadas no GRD de coelho, não ocorreram no GRD de Lithobates catesbianus. O padrão de atividade à NADPH-diaforase e a distribuição da imunorreatividade à serotonina, tirosina hidroxilase e Glut 1 e 3 foram também similares ao descrito em mamíferos. Pela primeira vez foi demonstrada, em anfíbios, a presença de reação à NADPH-diaforase em CGCs do GRD. A captação de 14C-2-DG foi reduzida quando o lactato foi acrescentado ao meio de incubação. As alterações induzidas pela SNI foram também similares àquelas descritas nos mamíferos. Houve acréscimo no número de mitocôndrias, retículo endoplasmático, ribossomas e filamentos no citoplasma das CGSs, mais neurônios e CGCs com reação positiva à NADPH-diaforase, um maior número de prolongamentos imunorreativos à tirosina hidroxilase em torno de somas de neurônios sensoriais, e mais núcleos neuronais imunorreativos a c-Fos. Nenhuma alteração ocorreu na imunorreatividade a serotonina e transportadores de glicose. Houve aumento na captação de 14C-2-DG, que foi reduzido quando o lactato foi acrescentado ao meio de incubação. Porém, a formação de 14CO2 a partir de 14C-L-lactato e de 14C-glicose não alterou nessas condições. Todavia, diferentemente dos mamíferos, a SNI não provocou mudança no número de CGCs no GRD, mostrando uma peculiaridade na resposta das rãs à SNI. Assim, nosso estudo reforça o uso de rãs como modelo experimental para estudo dos efeitos da SNI, um modelo de dor fantasma, sobre o tecido nervoso. Porém, dada a diferença peculiar ocorrida no GRD de rãs com SNI, é evidente a necessidade de mais conhecimento dos efeitos dessa situação experimental nesses animais. / Frogs have been used as experimental models in different experimental situations. One of these is the study of the effects of the sciatic nerve transection (SNT) on the nerve tissue. The wide use of these animals as experimental models justifies the studies aimed at morphofunctionally understanding of their tissues. Numerous studies have shown that glucose is the main energy substrate in the nerve tissue of frogs as well as in mammals. However, the distribution of glucose transporters in the nerve tissue of frogs is unknown as well as whether SNT alters such transportation. Another unanswered question is whether the lactate, whose concentration is increased in the frog plasma during hibernation periods and after motor activities, is used as an energy substrate by the nerve tissue, which has been demonstrated in other vertebrate species. In the dorsal root ganglion (DRG) cells of frogs are still unknown the distribution and effects of SNT on the reaction of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase (NADPH-diaphorase), an enzyme that is considered equivalent to nitric oxide synthase, responsible for the synthesis of nitric oxide, and on the reaction of periodic acid-Schiff (PAS), which indicates the presence of mucopolysaccharides, including glycogen, an important energy reserve in frog nerve tissue. Moreover, the distribution and effects of SNT on immunoreactivity to serotonin, an important molecule that functions as a neurotransmitter and / or neuromodulator in the nervous system, tyrosine hydroxylase, the rate-limiting enzyme in catecholamine biosynthesis, molecules with various physiological roles, including neurotransmitter and / or neuromodulator action in the nerve tissue, and c-Fos, a protein that is regarded as a marker of neuronal activation by noxious stimulation are also unknown. Other questions regarding is the effect of SNT on the uptake of glucose analogue 2-Deoxy-D-glucose-1-14C (14C-2-DG) and glucose and lactate concentration plasma; whether the types II and III of satellite glial cells (SGCs), recently described in rabbit DRG, are present in this ganglion of frogs; and the effects of SNT on the ultrastructure of SGCs and DRG neurons remain unanswered as well. Thus, this thesis aimed to determine: 1) the ultrastructure of neurons and SGCs; 2) the distribution of NADPH-diaphorase and PAS reaction, and immunohistochemistry for serotonin, tyrosine hydroxylase, c-Fos and glucose transporters types 1 and 3; and 3) the uptake of 2-DG-14C, in the presence and absence of lactate, in DRG of frogs, Lithobates catesbianus, with and without SNT. Glucose transporters types 1 and 3 were chosen because they occur in the membrane of endothelial cells, glial cells and neurons. Initially, 12 adult male frogs, Lithobates catesbianus, weighing 100-200g, not having undergone any previous surgical manipulation, were killed by decapitation. The DRGs of the sciatic nerve were removed and prepared for ultrastructural analysis, histochemistry of NADPH-diaphorase and PAS, and immunohistochemistry for serotonin, tyrosine hydroxylase and glucose transporters types 1 and 3. After that, 18 other frogs in the same physical conditions were divided into three experimental groups (n = 6/group): control group (frogs not subjected to any surgical manipulation), sham (frogs in which only surgical procedures for isolating the sciatic nerve were performed), and SNT (frogs in which the right sciatic nerve was completely transected). These animals were killed three days after the procedure, and their sciatic nerve DRGs used to demonstrate the effects of nerve transection on the ultrastructure, NADPH-diaphorase reaction, and immunohistochemical serotonin, tyrosine hydroxylase, c-Fos and glucose transporters types 1 and 3 in the DRG. Other 20 animals, divided into the same experimental groups, were used to demonstrate the effects of SNI on the uptake of 14C-2-DG in the presence or absence of lactate, the production rate of 14CO2 from 14C-L-lactate and 14C-glucose in the DRG. These frogs were used to further demonstrate the effects of peripheral denervation on plasma glucose and lactate levels. Our results have demonstrated that sensory neurons of bullfrog, Lithobates catesbianus, DRG showed distribution, diameter and morphology similar to those described for these ganglion cells in mammals. The CGSs showed morphology similar to that described for these cells in the lymph nodes of other vertebrate species. Cells types II and III, observed in rabbit DRG did not occur in the Lithobates catesbianus DRG. The pattern of NADPH-diaphorase activity and distribution of immunoreactivity of serotonin, tyrosine hydroxylase and Glut 1 and 3 were also similar to those described in mammals. For the first time, it has been demonstrated the presence of NADPH-diaphorase reaction on SGCs of DRG in amphibians. The uptake of 14C-2-DG was reduced when lactate was added to the incubation medium. SNT-induced changes were also similar to those ones described in mammals. There was an increase in the number of mitochondria, endoplasmic reticulum, ribosomes and filaments in the SGCs cytoplasm; more neurons and SGCs with positive reaction to NADPH-diaphorase; a greater number of tyrosine hydroxylase immunoreactive extensions around body sensory neurons; and more c-Fos immunoreactivity in neuronal nuclei. No changes occurred in serotonin immunoreactivity and glucose transporters. There was an increase in the uptake of 14C-2-DG, which was reduced when lactate was added to the incubation medium. However, the formation of 14C-2-DG from 14C-L-lactato and glucose did not change under these conditions. Unlike mammals, SNT caused no change in the number of SGCs in DRG, showing a peculiarity in the response of frogs to SNT. Therefore, our study supports the use of frogs as an experimental model to study the effects of SNT, a model of phantom pain on the nerve tissue. However, given the peculiar differences occurred in the DRG of frogs with SNT, it is clearly necessary to carry out further studies to better understand the effects of an experimental situation like this in such animals.

O objetivo desta Tese foi analisar os efeitos do treinamento de equilíbrio e coordenação e do treinamento aeróbico sobre variáveis funcionais, morfológicas do nervo isquiático e do músculo sóleo, bem como a imunorreatividade para sinaptofisina e da neurotrofina-3 na medula espinal após uma lesão por esmagamento do nervo isquiático. Para isso, ratos Wistar adultos foram divididos de maneira aleatória em 4 grupos experimentais: Sham-operado (SH), Não-treinados (NT), Treinamento Aeróbico (Endurance Training – ET) e Treinamento de Equilíbrio e Coordenação (Balance and Coordination Training – BCT), sendo que os três últimos grupos experimentais foram submetidos à lesão por esmagamento do nervo isquiático, que teve como consequência uma axonotmese. Os protocolos de treinamento tiveram início na fase aguda, 48 horas após o procedimento cirúrgico para o esmagamento do nervo e tiveram a duração de 4 semanas. Nossos resultados demonstraram que na análise funcional sensoriomotora (Teste da Escada Horizontal e Teste da Barra Estreita) os animais do grupo BCT apresentaram um melhor desempenho que os animais dos outros grupos. Entretanto, na análise funcional locomotora (Índice de Funcionalidade do Nervo Isquiático e Comprimento da Passada do Membro Lesionado), os resultados do Índice de Funcionalidade do Nervo Isquiático foram similares entre os grupos lesionados (NT, ET e BCT) enquanto no Comprimento da Passada do Membro Lesionado, os animais do ET apresentaram resultados mais satisfatórios que os demais grupos. No estudo morfológico quantitativo do músculo sóleo, a análise morfométrica muscular demonstrou que os grupos ET e BCT apresentaram resultados semelhantes entre si e melhores que o grupo NT nos parâmetros de área de tecido muscular, de tecido conjuntivo, de vasos sanguíneos, de densidade de fibras musculares e da área de secção transversal das fibras musculares. Na análise morfométrica da porção distal do nervo lesionado os resultados dos dois grupos treinados foram similares entre si em todos os parâmetros analisados. Esses animais treinados apresentaram melhores resultados quando comparado ao grupo NT para a variável diâmetro médio das fibras nervosas, enquanto o grupo ET na área total dos vasos sanguíneos e na densidade das fibras mielínicas. A análise qualitativa, tanto do músculo sóleo como do nervo isquiático, mostrou que os grupos lesionados apresentaram características de nervo e de músculo em regeneração, não sendo possível verificar diferenças entre os grupos treinados e o grupo não treinado. A imunorreação para sinaptofisina na medula espinal, por meio da análise da densitometria óptica no corno dorsal dos níveis L4-L6 da medula espinal revelou-se significativamente maior no grupo BCT quando comparado ao grupo NT. Na análise da neurotrofina-3 na mesma região da medula espinal, o grupo BCT apresentou resultados significativamente superiores aos demais grupos. Hipotetizamos que essa imunorreação específica do grupo BCT está diretamente relacionada com os melhores resultados deste grupo nos testes sensoriomotores, uma vez que nas análises morfológicas quantitativas e qualitativas os grupos ET e BCT apresentaram resultados similares. / The aim of this thesis is to analyze the effects of balance and coordination training, and aerobic training on functional variables, morphological variables of the sciatic nerve and soleus muscle, as well as synaptophysin and neurotrophin-3 immureactivity in the spinal cord after a crush injury of the sciatic nerve. Therefore, adult Wistar rats were randomly divided into 4 groups: Sham-operated (SH); Non-trained (NT); Endurance Training (ET), and Balance and Coordination Training (BCT). The last three experimental groups were submitted to sciatic nerve crush injury, which resulted in an axonotmesis. The training protocols, which lasted for four weeks, were initiated early during the acute phase - 48 hours after the surgical procedures. Our results showed that for the sensorimotor functional analysis (Horizontal Ladder Rung Walking Test and Narrow Bar Test) the BCT group animals presented better performance than the other group’s animals. However, for the locomotor functional analysis (Sciatic Functional Index and Right Hindlimb Paw Stride Length), the Sciatic Functional Index presented similar results between the injured groups (NT, ET, and BCT) while the Right Hindlimb Paw Stride Length, the animals from the ET group showed better results than those from the other groups. In the quantitative morphological study of the soleus muscle, the muscular morphometric analysis showed that ET and BCT groups presented similar results in comparison to each other, and better results than NT group regarding the parameters of muscle tissue areas, connective tissue, blood vessels, muscle fiber density, and the muscle fibers cross-sectional area. In the morphometric analysis of the distal portion of the damaged nerve, the results from both trained groups were similar in comparison to each other in all analyzed parameters as well. This trained animals presented better results when compared to the NT group to the nerve fiber diameter, while the ET group presented better results regarding the blood vessel total area and the myelinated fiber density. The qualitative analysis - both of the soleus muscle and the sciatic nerve - showed that the injured groups had characteristics of nerve and muscle regeneration, not being possible to verify differences between the trained and untrained groups. The spinal cord synaptophysin immureactivity, through optical densitometry at spinal cord L4-L6 levels of the dorsal horn revealed to be significantly in the BCT in comparison to the NT group. In the same region of the spinal cord neurotrophin-3 analysis, the BCT group showed significantly better results than the other groups. We hypothesized that this specific immureactivity in group BCT is directly related to the best results from this group in the sensorimotor tests, once the quantitative and qualitative morphological analyzes of the ET and BCT groups showed similar results.