Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-13Bitstream added on 2014-06-13T20:56:18Z : No. of bitstreams: 1 tolentino_fm_me_sjrp.pdf: 712675 bytes, checksum: a173e0a0b0b13ecd5a1bb07001fdec0b (MD5) / A produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) por bactérias gram-negativas causadoras de infecções hospitalares é a maior causa de falha terapêutica com cefalosporinas. Klebsiella pneumoniae, um importante causador de infecções hospitalares em todo o mundo apresenta a maior diversidade de fenótipos de resistência associados à produção de ESBL, e são os organismos onde estas enzimas são mais comumente encontradas. As ESBL dos tipos TEM, SHV e CTX-M são as mais prevalentes em K. pneumoniae, e nos últimos anos, CTX-M emergiu como o principal mecanismo de resistência a cefalosporinas de amplo espectro. Surtos de infecção hospitalar causados por esta bactéria estão associados à disseminação de clones resistentes, e a disseminação de genes de resistência entre cepas ecologicamente relacionadas é comum. O Brasil apresenta uma das mais altas frequências de K. pneumoniae produtoras de ESBL do mundo, mas estudos para a caracterização genética das ESBL no país são raros. Este estudo teve como objetivos detectar e identificar os principais genes responsáveis pela produção de ESBL por cepas de K. pneumoniae isoladas de pacientes internados no Hospital de Base de São José do Rio Preto (HB), no período entre dezembro de 2005 e outubro de 2007, e realizar a tipagem molecular destes isolados buscando identificar seu perfil de ocorrência e disseminação dentro do HB. Noventa e quatro isolados clínicos de K. pneumoniae foram estudados. A detecção e identificação de blaCTX-M, blaSHV e blaTEM foi realizada por PCR e sequenciamento. A tipagem molecular dos isolados foi realizada por PFGE e ERIC-PCR. Os genes responsáveis pela produção de ESBL encontrados foram blaSHV-2, blaSHV-2a, blaSHV-5, blaSHV-12, blaSHV-31 blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 e blaCTX-M-15. Além destes, foram identificados blaSHV-1, blaSHV-11, blaSHV-38, blaSHV-62, blaSHV-25,... / Antibiotic resistance due to the production of extended-spectrum beta-lactamases (ESBL) is a worldwide increasing problem, leading to therapeutic failure with third-generation cephalosporins. K. pneumoniae, an important nosocomial pathogen, presents the higher diversity of ESBL and resistance phenotypes, and is the organism where ESBL are most frequently identified. The TEM, SHV and CTX-M ESBL types are the most prevalent in K. pneumoniae, and in recent years, CTX-M has emerged as the main mechanism of resistance to third generation cephalosporins. Hospital infections caused by K. pneumoniae are associated to the dissemination of resistant clones, and also to dissemination of resistance genes among ecologically related strains. In Brazil, ESBL producing K. pneumoniae are detected with the highest frequencies of the world, but studies for the genetic characterization of this resistance mechanism in our country are rare. This study aimed to detect and identify the main ESBL genes harbored by K. pneumoniae isolated from patients admitted to the Hospital de Base de São José do Rio Preto (HB), within the period of December/2005 and October/2007. The pattern of dissemination of the ESBL producing isolates inside the institution was also investigated. Ninety four clinical isolates of K. pneumoniae were studied. The detection and identification of blaCTX-M, blaSHV and blaTEM was performed by PCR and sequencing. The molecular typing was performed by PFGE and ERIC-PCR. The ESBL genes detected were blaSHV-2, blaSHV-2a, blaSHV-5, blaSHV-12, blaSHV-31 blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 and blaCTX-M-15. Also, other beta-lactamase genes as blaSHV-1, blaSHV-11, blaSHV-38, blaSHV-62, blaSHV-25, blaSHV-108 and blaTEM-1 were identified. The presence of blaCTX-M in 58, 5% of the studied isolates indicate that this is probably the main genetic mechanism of ESBL production... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Banca: Hélio Langoni / Banca: Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães / Resumo: O presente trabalho objetivou o isolamento de Klebsiella pneumoniae do ambiente de sala de ordenha e do ambiente dos animais, incluindo a sala de pré-ordenha, piquetes e, em algumas propriedades os galpões de "free stall", do reto e membros posteriores dos animais, do leite do tanque de refrigeração e do leite dos tetos positivos ao teste do Califórnia Mastitis Test (CMT), pesquisar cepas produtoras de β-lactamases de espectro ampliado (ESβL) e, a partir da identificação clonal, verificar a semelhança entre as cepas. Em 28 (2,14%) amostras de leite coletadas dos animais foi detectada a presença de Klebsiella pneumoniae como patógeno responsável pela infecção intramamária (IMI). A partir de swabs ambientais, da pele dos animais e do leite oriundo do tanque de expansão das dez propriedades, foram isoladas 79 cepas de K. pneumoniae. Os resultados da prova de detecção fenotípica da produção de enzimas do tipo ESβL foram positivos em oito (7,47%) das cepas bacterianas isoladas. No Brasil ainda não há relatos de coliformes produtores destas enzimas oriundos de animais de produção, e no presente estudo uma das cepas foi isolada do tanque de expansão, representando um potencial perigo à saúde pública. Pelo resultado da PFGE, observou-se grande diversidade genética da bactéria dentro da propriedade e entre as propriedades. Demonstrou-se que patógenos ambientais multirresistentes estão presentes em rebanhos bovinos leiteiros, não apenas isolados de quadros de infecção intramamária como também de galpões de free stall, membros posteriores dos animais, sala de ordenha e tanque de expansão. Confirmou-se também, a alta variabilidade genética da K. pneumoniae em rebanhos bovinos leiteiros mesmo dentro de um mesmo rebanho, e a importância da PFGE como recurso na epidemiologia molecular / Abstract: The present study aimed the isolation of Klebsiella pneumoniae from the milk parlor and the animal's environment, including the pre milking room, paddocks and, in some properties the free stall, animal's rectum and hind limbs, bulk tank milk and from all teats positive to the California Mastitis Test (CMT), search for strains producers of extended spectrum β-lactamases (ESβL) and, by the clonal identification, verify if similarities between the strains ocurred. In 2.14% (28) of the milk samples collected from the animals it was detected the presence of Klebsiella pneumoniae as the pathogen responsible for the intramammary infection (IMI). From environmental swabs and bulk milk tank of the ten properties, it was isolated 79 strains of K. pneumoniae. The results of phenotypic detection of the ESβL enzymes production were positive in eight (7.47%) bacterial strains isolated. It is important to know that, in Brazil there are no reports of coliforms producers of these enzymes isolated from livestock animals, and in the present study one of the strains was isolated from the bulk tank milk, representing a potential hazard to public health. The results of PFGE showed high genetic diversity of the bacteria within and between the dairy farms. It was demonstrated that environmental multidrug resistant pathogens are present in dairy herds, isolated from intramammary infections cases, free stall parlors, animal's hindlimbs, milking parlor and bulk tank milk. This study also confirmed the high genetic diversity of K. pneumoniae in dairy herds within the same herd, and the importance of PFGE as a molecular epidemiology tool. Keywords: environment, extended-spectrum β-lactamases (ESβL), Klebsiella pneumoniae, mastitis, milk, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) / Mestre

A resistência antimicrobiana e fatores de virulência são importantes mecanismos de sobrevivência das bactérias, através deles elas se tornaram capazes de escapar da ação das adversidades do ambiente. O presente trabalho teve como objetivo principal analisar os fatores de virulência e genes de resistência de isolados de Klebsiella sp. e sua participação na manutenção de populações bacterianas resistentes em pontos na Laguna de Tramandaí. As amostragens foram realizadas em agosto de 2014 e janeiro de 2015 em quatro pontos distintos com diferentes graus de impacto ambiental. Foram analisados 272 isolados bacterianos das amostras de água da laguna de Tramandaí. Estes isolados foram submetidos a testes bioquímicos e microbiológicos para identificação e foram encontrados 37 isolados de Klebsiella sp. Estes isolados foram submetidos a testes de susceptibilidade antimicrobiana por disco-difusão, análise fenotípica de fatores de virulência e genes de resistência e pesquisa de genes de resistência (blaCTX-M, blaSHV, blaTEM) através de PCR e similaridade através do ERIC-PCR. Através da análise por MALDI-TOF, os 37 isolados foram identificados como quatro K. oxytoca, seis K. pneumoniae e 27 K. variicola. Todos os isolados foram suscetíveis a imipenem, ertapenem, piperacilina/tazobactam e polimixina B Ampicilina e amoxacilina foram os antimicrobianos com maior índice de resistência, o gene blashv foi o mais encontrado dentre os genes pesquisados. Todos os isolados apresentaram cápsula polissacarídica, 56,7% dos isolados apresentaram fímbrias do tipo 1, 56,7% demonstraram serem capazes de produzir biofilmes, 78,4% foram capazes de inativar os fatores bactericidas do soro e 81,1% sintetizaram sideróforos. A análise por ERIC-PCR e MALDI-TOF geraram dendrogramas de alta heterogeneidade e baixos índices de similaridade, indicando que diferentes populações de Klebsiella estão se mantendo naquele ambiente. Ficou evidenciado neste estudo, através dos isolados encontrados e suas características genéticas e fenotípicas de resistência bacteriana, que eles podem estar contribuindo para a manutenção e disseminação da resistência aos antimicrobianos no ambiente. / Antimicrobial resistance and virulence factors are important mechanisms for the survival of bacteria, through which they have become capable of escaping from the adversities of the environment. The present work had as main objective to analyze the virulence factors and resistance genes of Klebsiella sp. And its participation in the maintenance of resistant bacterial populations in points in Tramandaí Lagoon. Samplings were carried out in August 2014 and January 2015 at four different points with different degrees of environmental impact. A total of 272 bacterial isolates from the Tramandaí lagoon water samples were analyzed. These isolates were submitted to biochemical and microbiological tests for identification and 37 isolates of Klebsiella sp. These isolates were submitted to antimicrobial susceptibility tests by disc-diffusion, phenotypic analysis of virulence factors and and resistance gene (blaCTX-M, blaSHV, blaTEM) search by PCR and similarity through ERIC-PCR. Through the use of MALDI-TOF, the 37 isolates were identified as four of K. oxytoca, six of K. pneumoniae and 27 of K. variicola. All the isolates were suscetible to imipenem, ertapenem, piperacilin/tazobactam e polimixin B Ampicillin and amoxicillin were the most resistant antimicrobials, the blaSHV gene was the most found among the genes studied. All isolates presented a polysaccharide capsule, 56.7% of the isolates had type 1 fimbriae, 56.7% were able to produce biofilms, 78.4% were able to inactivate serum bactericidal factors and 81.1% synthesized siderophores. Analysis by ERIC-PCR and MALDI-TOF generated dendrograms with high diversity and low similarity indexes, indicating that different populations of Klebsiella are remaining in that environment. It was evidenced in this study, through the isolates found and their genetic and phenotypic characteristics of bacterial resistance that they may be contributing to the maintenance and dissemination of antimicrobial resistance.

Entre membros da Família Enterobacteriaceae a produção de β-lactamases de espectro estendido (ESBL – Extended-Spectrum β-lactamase) se constitui em um importante mecanismo de resistência a antibióticos β-lactâmicos. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência de ESBL em diferentes gêneros da Família Enterobacteriaceae em um hospital universitário no sul do Brasil. Além disso, avaliou-se o teste de triagem proposto pelo CLSI, o teste que utiliza discos combinados e técnica de PCR para detecção de ESBL na Família Enterobacteriaceae. De forma complementar, foi feita pesquisa de KPC em amostras com resistência (plena ou intermediária) ao ertapenem. Foram analisados 731 isolados da Família Enterobacteriaceae, obtidos a partir de amostras clínicas de pacientes hospitalizados. A prevalência de isolados produtores de ESBL na Família Enterobacteriaceae foi de 26,8% (196/731). Destacam-se Providencia spp. com uma prevalência de 91,7% (11/12), seguida de Klebsiella pneumoniae com 56,7% (59/104) e Enterobacter spp. com 40,7% (48/118). Entre os antibióticos utilizados no Teste Confirmatório Fenotípico, a cefepima foi o substrato que detectou o maior percentual dos isolados (90,6% - 183/202) como produtores de ESBL. Utilizando a técnica de PCR foi possível detectar blaTEM em 89,6% (208/232), blaSHV em 59% (137/232) e blaCTX-M em 37,9% (88/232) dos isolados. Comparando o perfil de suscetibilidade global das amostras ESBL com as demais amostras consideradas como não produtoras de ESBL, notou-se um grande decréscimo na sensibilidade de todos antimicrobianos testados (p < 0,05) nas ESBL positivas. Apenas os carbapenêmicos (Imipenem e Meropenem) apresentaram total eficácia in vitro. Outros antibióticos com maior percentual de sensibilidade para isolados produtores de ESBL foram Amicacina, Doxaciclina e Piperacilina/Tazobactam com 35,1%, 29,9% e 28,0% de sensibilidade, respectivamente. Entre os microrganismos com teste de triagem para ESBL positivo, 39 apresentaram resistência (plena ou intermediária) ao ertapenem, mas em nenhuma destas amostras foi detectado o gene blaKPC por técnica de PCR.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-26T17:18:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese doutorado Alexsandra Scavuzzi.pdf: 8878953 bytes, checksum: 50dba197129c93a6d62fed598bc1f2d1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-26T17:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese doutorado Alexsandra Scavuzzi.pdf: 8878953 bytes, checksum: 50dba197129c93a6d62fed598bc1f2d1 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Foi investigada a ocorrência de genes de resistência a quinolonas (qnrA, qnrB e qnrS), a presença de mutações em gyrA, gyrB e parC, a expressão de bombas de efluxo (acrB e acrF) e mutações no gene ramR, como também foi avaliado alterações ultraestruturais provocadas pela polimixina B, meropenem e pela associação entre polimixina B e meropenem em isolados de Klebsiella pneumoniae portadores de blaKPC-2 provenientes de infecção e colonização, em pacientes de hospitais de Recife-PE, Brasil. Trinta isolados de K. pneumoniae foram selecionados para este estudo, destes, seis isolados foram selecionados para seqüenciamento de DNA e dois foram selecionados para detecção de alterações ultraestruturais. A detecção dos genes qnr, acrB e acrF foram realizadas por PCR seguidas por sequenciamento de DNA. As mutações em ramR e nas QRDRs de gyrA, gyrB e parC foram detectadas por sequenciamento, a expressão das bombas de efluxo foi determinada por RT-PCR e as alterações ultraestruturais foram detectadas por microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Dos isolados analisados, 73,3% (n=22) apresentaram o gene qnrB, sendo detectadas por seqüenciamento as variantes qnrB1 e qnrB12. Esse é o primeiro relato publicado da presença de genes qnrB1 e qnrB12 com blaKPC-2 em K. pneumoniae, como também o primeiro relato mundial da presença do gene qnrB12 em K. pneumoniae. Foram observadas mutações em gyrA S83 em dois isolados e mutação em ramR em um isolado. Todos os isolados apresentaram genes para as bombas de efluxo acrB e acrF. A RT-PCR realizada mostrou que as bombas estavam sendo expressas. Quando submetidos à concentração clinicamente relevante para meropenem, a análsie de microscopia eletrônica mostrou que os isolados apresentaram alterações morfológicas, retração do material citoplasmático, incapacidade de divisão celular, rompimento da parede celular e extravasamento do conteúdo citoplasmático. Quando submetidos à concentração clinicamente relevante de polimixina B os isolados apresentaram perda de membrana celular, retração do material citoplasmático, extravasamento do conteúdo citoplasmático e presença de compartimento membranares. Quando submetidos à concentração clinicamente relevante de meropenem associado com polimixina B, os isolados apresentaram uma maior intensidade das alterações ultraestruturais visualizadas. Portanto, foi observada uma maior alteração celular quando os isolados eram submetidos à associação de meropenem e polimixina. Os resultados obtidos são preocupantes porque foram detectados isolados de K. pneumoniae portadores do gene blaKPC-2, qnrB, mutação em gyrA, expressão de bombas de efluxo acrB e acrF e mutação em ramR, infectando e colonizando pacientes, podendo ser importantes reservatórios para disseminação de diversos mecanismos de resistência no ambiente hospitalar.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-10-17T12:39:08Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DissertaçãoParcial (Cap.I,II,III,IV e VII) - Polyane Lima - PPGIBA.pdf: 832056 bytes, checksum: a70651fc03df55df1e12db3ec2f97adb (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-10-17T12:39:21Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DissertaçãoParcial (Cap.I,II,III,IV e VII) - Polyane Lima - PPGIBA.pdf: 832056 bytes, checksum: a70651fc03df55df1e12db3ec2f97adb (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-17T12:39:21Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DissertaçãoParcial (Cap.I,II,III,IV e VII) - Polyane Lima - PPGIBA.pdf: 832056 bytes, checksum: a70651fc03df55df1e12db3ec2f97adb (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2018-06-21 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Klebsiella pneumonia is a pathogenic and opportunistic Gram-negative bacterium, which can cause pneumonia, consequently lung injury and mortality according to the exacerbation of inflammatory response. Therefore, many efforts have been made to discovery alternative therapies to control the events involved in inflammation, increasing resolution and reducing the risk of tissue injury. Recently studies described such as potential anti-inflammatory the isomer of palmitoleic acid 16:1 n-9 in humans circulating monocytes and in macrophages derived from monocytes in humans. Thus, we investigated the immunomodulatory effect of 16:1 n-9 on experimental infection with K. pneumoniae. In this study, we performed in vitro LPS stimulation and 16:1 n-9 treatment using AMJ2-C11 lineage macrophages and bone marrow derived macrophages (BMDM). Although both macrophages presented different biology, we observed for BMDM the decrease production of inflammatory mediators such as NO, IL-6, KC, MCP-1 after the treatment with 16:1 n-9. In efferocytosis process of neutrophils infected with K. pneumoniae, the treatment with 16:1 n-9 increased phagocytosis by MDMO and IL-1β production, and decreased IL-10. In vivo experiments, mice infected with lethal dose of K. pneumoniae and treated with 16: 1 n-9 (100 μg/mL) had increased survival. The immunomodulatory effects of 16:1 n-9 during the experimental infection by K. pneumoniae were characterized for decrease in neutrophil recruitment in the acute phase of infection, and increased mononuclear cells in the chronic phase, indicating action on resolution of inflammation. The effect on the production of inflammatory, proteic and lipid mediators has also been described, and the data contribute to the resolution effect, however it is not efficient in eliminating the infectious agent. In addition, treatment with 16:1 n-9 had a great influence on the metabolism of eicosanoids. Thereby, we suggest that 16:1 n-9 treatment in pneumonia is potential in resolving an inflammatory process, without immunosuppressive effects, and can be used only as an adjuvant of other pharmacological therapies. / Klebsiella pneumoniae é uma bactéria gram-negativa, oportunistas, podendo causar pneumonia, consequentemente lesão pulmonar intensa e mortalidade correlacionadas com exacerbação da resposta inflamatória. Estudos buscam terapias alternativas para controlar os eventos envolvidos na inflamação, aumentando a resolução e reduzindo o risco de lesão tecidual. Recentemente, um isômero do Ácido palmitoleico, 16:1 n-9 foi descrito em monócitos circulantes e em macrófagos derivados de monócitos, com potencial antiinflamatório. Dessa forma, investigamos o efeito imunomodulador de 16:1 n-9 na infecção experimental por K. pneumoniae. Neste estudo, realizamos experimentos in vitro, com estímulo de LPS e tratamento com 16:1 n-9 em macrófagos de linhagem AMJ2-C11 e macrófagos derivados de medula óssea (MDMO) e observamos que apesar da biologia dos macrófagos serem diferentes, o tratamento diminui a produção de mediadores inflamatórios, como NO, IL-6, KC, MCP-1 nos MDMO. No processo de eferocitose de neutrófilos infectados com K. pneumoniae, o tratamento com 16:1 n-9, aumentou a fagocitose por MDMO e potencializou a produção de IL-1β e diminuiu IL-10. Nos nossos experimentos in vivo, camundongos infectados com dose-letal de K. pneumoniae e tratados com 16:1 n-9 (100 μg/mL) tiveram sobrevida aumentada. Quando analisamos os efeitos imunomoduladores do 16:1 n-9 durante a infecção experimental por K. pneumoniae, observamos a diminuição no recrutamento de neutrófilos na fase aguda da infecção, e aumento das células mononucleares na fase tardia da infecção, que nos indicaram ação na resolução da inflamação. O efeito na produção dos mediadores inflamatórios, proteicos e lipídicos também foram descritos, e os dados colaboram com o efeito de resolução, apesar de não ser eficiente na eliminação do agente infeccioso. Por outro lado, o tratamento com 16:1 n-9 teve grande influência no metabolismo de eicosanoides. Assim, sugerimos que o tratamento com 16:1 n- 9 na pneumonia apresenta-se com capacidade de resolução em processo inflamatório, não sendo imunossupressor, mas podendo ser utilizado apenas como um adjuvante de outras terapias farmacológicas.

The investigations presented in this thesis form part of a systematic international effort to establish the structures of the capsules produced by the bacterial genera, Escherichia coli and Klebsiella (family enterobacteriaceae). These bacteria are of medical interest as they are opportunistic pathogens and are frequently responsible for serious infections in animals and man. Invasive strains are invariably surrounded by a structurally complex polysaccharide capsule which contributes to the organism's ability to attenuate non-specific host defence mechanisms or, in some instances, to completely prevent an immune response. A knowledge of the chemical composition and structure of the capsule is, therefore, of great value as it provides insight into the mechanisms involved in this process. The E. coli, in particular, have generated considerable interest as their capsules are more structurally diverse and cross-reactivity with other, more pathogenic bacteria has also been demonstrated. Accordingly, the structures of three previously unstudied E. coli K-antigens viz. those produced by serotypes 020:K83:H26, 020:K84:H26, and 09:K48:H9 have been established by chemical and spectroscopic means and are presented in this thesis. In addition, a reinvestigation of the structure of the capsule produced by Klebsiella K15 using a novel enzymatic approach was also undertaken and a revised structure is proposed . The E. coli K48 polysaccharide is of special interest as it was found to contain a new diacetamido trideoxy hexose hitherto unrecorded. A synthesis for this saccharide is also presented. Finally, the application of lithium dissolved in ethylenediamine for the degradation of amino sugar-containing polysaccharides was also investigated using the capsular polysaccharides produced by E. coli serotypes K38 and K84 as model compounds.

The work presented in this thesis forms part of a continuing programme concerned with the structural determination of capsular polysaccharides of some Enterobacteriaceae. Since bacteria of this family are pathogenic to Man, work in this laboratory has focused on the structural elucidation of Klebsiella and, more recently, Escherichia coli ( E. coli) capsular polysaccharides ( K-antigens ). To date, some 74 K-antigens have been distinguished serologically within the genus E. coli and the structures of approximately 70% are known. In general, the K-antigens of the E. coli are characterized by a wide variety of constituent monosaccharides arranged in repeating units. In this thesis the structural elucidation of the capsular polysaccharides of E. coli serotypes 08: KI02: H- and 08: K47: H2 is presented. A variety of chemical techniques has been employed in the structural analysis, and are discussed. The thesis also includes extensive two-dimensional n.m.r. studies on the E. coli KI02 and K47 polysaccharides, as well as on a modified KI02 polymer produced after a lithium-ethylenediamine degradation of the native polysaccharide.

Bestrophins are a family of calcium (Ca²⁺) -activated chloride (Cl⁻) channels (CaCCs) with functional importance in eye physiology. Mutations to the VMD2 gene, which encodes the Best1 protein, cause an array of degenerative eye disorders called bestrophinopathies, which result from aberrant CaCC activity of the Best1 channel in the pigmented epithelium of the retina. While there are four bestrophin paralogs in mammals (Best1-4), the only current structures are of Best1 homologs. The structure of the prokaryotic homolog of Best1 from Klebsiella pneumonia (KpBest) was previously solved in this lab, representing the first structure of a Best1 homolog at the time. This initial study laid the foundational groundwork in the field and contributed significant knowledge to understanding the bestrophin structure-function relationship. Nevertheless, significant questions remain regarding bestrophin function, such as the molecular determinants underlying its Ca²⁺-dependent gating and anion selectivity. This dissertation uses single-particle cryogenic electron microscopy paired with electrophysiology to probe the structure-function relationship of mammalian bestrophins under different buffer conditions and reveals conformational dynamics involved in gating of wild-type channels. Key regions of the channel contributing to its function are described at the atomic level leading to development of a gating model to explain Ca²⁺-dependent activation and inactivation in mammalian bestrophins.

This master thesis deals with typing of Klebsiella pneumoniae isolates. The first part of the thesis introduces molecular typing methods. Then bacterial genomes and Klebsiella pneumoniae are characterized. Following part describes data validation, assembly of genomes and proposed algorithm for finding genes with high variability. In last part obtained results are presented and validated on other genomes of Klebsiella pneumoniae.