Klebsiella pneumoniae carbapenemase producing Klebsiella pneumoniae (KPC-Kp) is an emerging pathogen with acquired resistance to several antimicrobial classes and produces infections associated with considerable mortality. This study aims to identify risk factors for acquisition of hospital infections caused by KPC-Kp and to identify the clinical outcomes of these patients. This is a case-control study performed at a tertiary teaching hospital with 365 beds. The cases with hospital infection caused by KPC-Kp were compared with controls admitted to the same hospital paired by gender, age group and admission entry in a proportion of 2:1. During the period from February 2013 to August 2014, 22 patients were included in the study as cases and 44 as controls. The following independent risk factors for acquisition of hospital infections caused by KPC-Kp were identified: presence of a central venous catheter (OR 21.89; 95% CI 3.7 129.0); admission in an intensive care unit (OR 8.05; 95% CI 1.5 43.2); use of beta-lactams associated with or without beta-lactamase inhibitors (OR 6.02; 95% CI 1.1 32.6); use of carbapenems (OR 11.01; 95% CI 2.1 58.0) and the use of polymyxin B (OR 15.74; 95% CI 1.3 194.2). The crude case mortality rate was 36.8% (P=0.004). Infections caused by KPC-Kp are severe with an elevated mortality. To avoid unnecessary usage of antimicrobials, mainly beta-lactams, carbapenems and polymyxin B appear to be an essential way to control these infections. / Klebsiella pneumoniae produtora de klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC-Kp) é um patógeno emergente, com resistência a várias classes de antibióticos, sendo que suas infecções são associadas a considerável mortalidade. Este estudo tem como objetivo identificar fatores de risco para aquisição de infecções hospitalares causadas por KPC-Kp e identificar o desfecho clínico dos pacientes que adquirem essas infecções. Este é um estudo de caso-controle realizado em um hospital-escola terciário de 365 leitos. Os casos com infecção hospitalar por KPC-Kp foram comparados com controles internados no mesmo hospital, pareados por sexo, faixa etária e data de internação, na proporção de 2:1. Durante o período de fevereiro de 2013 a agosto de 2014, 22 pacientes foram incluídos no estudo como casos e 44 como controles. Foram identificados, como fatores de risco independentes para infecções hospitalares causadas por KPC-Kp, o uso de cateter venoso central (OR 21.89; 95% CI 3.7 129.0); a internação em unidade de tratamento intensivo (OR 8.05; 95% CI 1.5 43.2); o uso de b-lactâmicos associados ou não a inibidores de b-lactamase (OR 6.02; 95% CI 1.1 32.6); o uso de carbapenêmicos (OR 11.01; 95% CI 2.1 58.0); e o uso de polimixina B (OR 15.74; 95% CI 1.3 194.2). A mortalidade por qualquer causa nos casos considerados foi de 36,8% (p=0,004). Infecções por KPC-Kp são infecções graves com elevada mortalidade. Evitar o uso desnecessário de antibióticos, principalmente de b-lactâmicos, carbapenêmicos e polimixina B, parece ser caminho essencial para que se atinja o controle dessas infecções.

As enterobactérias são importantes pátogenos comunitários e hospitalares e o aparecimento cada vez mais frequente de cepas multirresistentes tem sido motivo de preocupação em hospitais e instituições de saúde por todo o mundo, devido às opções terapêuticas restritas. Nas últimas décadas, o aumento global de cepas produtoras de β-lactamases plasmidiais induzíveis e β-lactamases de espectro estendido (ESBL), fizeram com que os carbapenêmicos fossem considerados a primeira opção para o tratamento de infecções graves. No entanto, a resistência aos carbapenêmicos já é considerada um problema de saúde pública em diversos países e a produção da enzima Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) tem sido descrita como o principal mecanismo de resistência a esta classe de antibióticos na família Enterobacteriaceae. Considerando que apenas relatos esporádicos de cepas produtoras de KPC têm sido reportados no Rio Grande do Sul (RS), em contraste à situação de muitos estados brasileiros, este estudo teve por objetivo estabelecer a prevalência de KPC entre isolados com reduzida sensibilidade aos carbapenêmicos provenientes de 11 hospitais do RS, promover a caracterização molecular destes isolados, bem como avaliar as principais metodologias fenotípicas utilizadas na sua detecção. Diferenças significativas foram observadas entre os perfis de sensibilidade a imipenem (IPM) e meropenem (MEM), quando comparados ao de ertapenem (ERT), sendo que para este último menos de 10% dos isolados foram considerados sensíveis em comparação a mais de 73% para os dois primeiros. Nossos resultados também demonstraram que a redução de sensibilidade aos carbapenêmicos esteve associada à produção de β-lactamases do tipo AmpC e ESBL, em detrimento de carbapenemases. Dentre as principais carbapenemases encontradas em enterobactérias, apenas cepas produtoras de KPC foram detectadas entre os isolados estudados, cuja prevalência foi de 4%. Entre os produtores de KPC, foram identificadas espécies de E. cloacae, K. pneumoniae, S. marcescens e K. georgiana, provenientes de quatro hospitais distintos. A análise por sequenciamento revelou que todos foram produtores da enzima KPC-2. Quanto ao perfil de sensibilidade, a maioria foi altamente resistente aos β-lactâmicos e às quinolonas, enquanto que, amicacina e polimixima foram os antibióticos mais efetivos contra os isolados in vitro. Dois grupos clonais foram evidenciados entre os isolados de E. cloacae e S. marcescens e quatro entre os isolados de K. pneumoniae, na análise por PFGE. Com relação ao contexto genético que envolve o blaKPC-2, apenas uma caracterização parcial foi possível, evidenciando uma plataforma alterada em relação ao ambiente genético clássico (Tn4401). A análise plasmidial dos produtores de KPC resultou em plasmídeos de tamanhos variáveis, evidenciando a maior prevalência de plasmídeos de ~20Kb no carreamento do gene. A análise também revelou que todos foram não- tipáveis pela técnica de PBRT. Com relação às metodologias fenotípicas utilizadas na detecção de KPC, o IPM apresentou melhor desempenho que o MEM na realização do teste de discos combinados com ácido borônico (AB), resultando em 100% de sensibilidade (SN) e 96.1% de especificidade (SP). A quantificação do Teste Modificado de Hodge (MHT), proposta neste trabalho, eliminou a subjetividade na sua interpretação e evidenciou um aumento considerável na SP do teste em relação à metodologia convencional. Em conclusão, nossos resultados confirmaramm a elevada plasticidade genética e os diversos fenótipos observados na família Enterobacteriaceae; contribuíram para o conhecimento da epidemiologia local de resistência aos carbapenêmicos e dos isolados produtores de KPC; bem como reforçaram o valor das metodologias fenotípicas como ferramenta capaz de discriminar os mecanismos envolvidos na resistência aos carbapenêmicos. / The Enterobacteriaceae family includes important community and nosocomial pathogens frequently associated to multirresistance. Multidrug-resistant strains represent an important concern among hospitals and healthcare institutions around the world, due to the limited therapeutic options. In recent decades, the overall increase of strains producing inducible β-lactamases and extended spectrum β-lactamases (ESBL) has lead to the use of carbapenems as the first option for the treatment of serious infections. However, the carbapenem resistance has been considered a public health problem in many countries and the production of the enzyme Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) has been described as the major resistance mechanism to carbapenems in this family. Whereas only sporadic reports of KPC-producing strains have been reported in Rio Grande do Sul (RS), in contrast to the situation in many Brazilian states, this study aimed to establish the prevalence of KPC among isolates with reduced susceptibility to carbapenems from 11 disctinct hospitals of RS, promote the molecular characterization of these isolates, as well as evaluate the main phenotypic methods used for KPC detection. Significant differences were observed among the susceptibility profiles of imipenem (IPM) and meropenem (MEM), when compared to ertapenem (ERT): less than 10% of the isolates were classified as susceptible to ERT compared to over 73% to IPM and MEM. Our results demonstrated that the reduced susceptibility to carbapenems, was mainly due to the production of AmpC β-lactamases and ESBL, instead of true carbapenemases. Regarding the major carbapenemases found in Enterobacteriaceae, only KPC was detected among the isolates studied, at a prevalence of 4%. KPC producers included the species E. cloacae, K. pneumoniae, S. marcescens and K. georgiana, from four different hospitals. The sequencing analysis demonstrated that all of them were KPC-2 producers. According to the susceptibility profile, most were highly resistant to β-lactams and quinolones, whereas polymyxin and amikacin were the most effective drugs in vitro. Two clonal groups were detected among isolates of E. cloacae and S. marcescens and four among isolates of K. pneumoniae, by PFGE analysis. Only a partial characterization of the genetic context that involves the blaKPC-2 gene was possible for these isolates, indicating an altered platform compared to the classic genetic environment (Tn4401). The plasmid analysis indicated plasmids of variable sizes, with a higher prevalence of those of ~ 20Kb involved with the blaKPC-2 gene. The analysis also showed that all of them were non-typable by PBRT technique. With respect to the phenotypic methods used for KPC detection, IPM proved to present a better performance than MEM in the combined-disc test with boronic acid (AB), resulting in 100% of sensitivity (SN) and 96.1% of specificity (SP). The quantification of Modified Hodge Test (MHT), proposed in this study, eliminated the subjectivity of this test leading to a considerable increase in the SP of the test compared to the conventional methodology. In conclusion, our results confirmed the high genetic plasticity and the distinct phenotypes observed in the Enterobacteriaceae family; contributed to the knowledge of the local epidemiology of carbapenem resistance and for KPC-producing isolates; as well as reinforced the use of phenotypic methods as an useful tool able to discriminate the mechanisms involved in carbapenem resistance.

As enterobactérias são importantes pátogenos comunitários e hospitalares e o aparecimento cada vez mais frequente de cepas multirresistentes tem sido motivo de preocupação em hospitais e instituições de saúde por todo o mundo, devido às opções terapêuticas restritas. Nas últimas décadas, o aumento global de cepas produtoras de β-lactamases plasmidiais induzíveis e β-lactamases de espectro estendido (ESBL), fizeram com que os carbapenêmicos fossem considerados a primeira opção para o tratamento de infecções graves. No entanto, a resistência aos carbapenêmicos já é considerada um problema de saúde pública em diversos países e a produção da enzima Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) tem sido descrita como o principal mecanismo de resistência a esta classe de antibióticos na família Enterobacteriaceae. Considerando que apenas relatos esporádicos de cepas produtoras de KPC têm sido reportados no Rio Grande do Sul (RS), em contraste à situação de muitos estados brasileiros, este estudo teve por objetivo estabelecer a prevalência de KPC entre isolados com reduzida sensibilidade aos carbapenêmicos provenientes de 11 hospitais do RS, promover a caracterização molecular destes isolados, bem como avaliar as principais metodologias fenotípicas utilizadas na sua detecção. Diferenças significativas foram observadas entre os perfis de sensibilidade a imipenem (IPM) e meropenem (MEM), quando comparados ao de ertapenem (ERT), sendo que para este último menos de 10% dos isolados foram considerados sensíveis em comparação a mais de 73% para os dois primeiros. Nossos resultados também demonstraram que a redução de sensibilidade aos carbapenêmicos esteve associada à produção de β-lactamases do tipo AmpC e ESBL, em detrimento de carbapenemases. Dentre as principais carbapenemases encontradas em enterobactérias, apenas cepas produtoras de KPC foram detectadas entre os isolados estudados, cuja prevalência foi de 4%. Entre os produtores de KPC, foram identificadas espécies de E. cloacae, K. pneumoniae, S. marcescens e K. georgiana, provenientes de quatro hospitais distintos. A análise por sequenciamento revelou que todos foram produtores da enzima KPC-2. Quanto ao perfil de sensibilidade, a maioria foi altamente resistente aos β-lactâmicos e às quinolonas, enquanto que, amicacina e polimixima foram os antibióticos mais efetivos contra os isolados in vitro. Dois grupos clonais foram evidenciados entre os isolados de E. cloacae e S. marcescens e quatro entre os isolados de K. pneumoniae, na análise por PFGE. Com relação ao contexto genético que envolve o blaKPC-2, apenas uma caracterização parcial foi possível, evidenciando uma plataforma alterada em relação ao ambiente genético clássico (Tn4401). A análise plasmidial dos produtores de KPC resultou em plasmídeos de tamanhos variáveis, evidenciando a maior prevalência de plasmídeos de ~20Kb no carreamento do gene. A análise também revelou que todos foram não- tipáveis pela técnica de PBRT. Com relação às metodologias fenotípicas utilizadas na detecção de KPC, o IPM apresentou melhor desempenho que o MEM na realização do teste de discos combinados com ácido borônico (AB), resultando em 100% de sensibilidade (SN) e 96.1% de especificidade (SP). A quantificação do Teste Modificado de Hodge (MHT), proposta neste trabalho, eliminou a subjetividade na sua interpretação e evidenciou um aumento considerável na SP do teste em relação à metodologia convencional. Em conclusão, nossos resultados confirmaramm a elevada plasticidade genética e os diversos fenótipos observados na família Enterobacteriaceae; contribuíram para o conhecimento da epidemiologia local de resistência aos carbapenêmicos e dos isolados produtores de KPC; bem como reforçaram o valor das metodologias fenotípicas como ferramenta capaz de discriminar os mecanismos envolvidos na resistência aos carbapenêmicos. / The Enterobacteriaceae family includes important community and nosocomial pathogens frequently associated to multirresistance. Multidrug-resistant strains represent an important concern among hospitals and healthcare institutions around the world, due to the limited therapeutic options. In recent decades, the overall increase of strains producing inducible β-lactamases and extended spectrum β-lactamases (ESBL) has lead to the use of carbapenems as the first option for the treatment of serious infections. However, the carbapenem resistance has been considered a public health problem in many countries and the production of the enzyme Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) has been described as the major resistance mechanism to carbapenems in this family. Whereas only sporadic reports of KPC-producing strains have been reported in Rio Grande do Sul (RS), in contrast to the situation in many Brazilian states, this study aimed to establish the prevalence of KPC among isolates with reduced susceptibility to carbapenems from 11 disctinct hospitals of RS, promote the molecular characterization of these isolates, as well as evaluate the main phenotypic methods used for KPC detection. Significant differences were observed among the susceptibility profiles of imipenem (IPM) and meropenem (MEM), when compared to ertapenem (ERT): less than 10% of the isolates were classified as susceptible to ERT compared to over 73% to IPM and MEM. Our results demonstrated that the reduced susceptibility to carbapenems, was mainly due to the production of AmpC β-lactamases and ESBL, instead of true carbapenemases. Regarding the major carbapenemases found in Enterobacteriaceae, only KPC was detected among the isolates studied, at a prevalence of 4%. KPC producers included the species E. cloacae, K. pneumoniae, S. marcescens and K. georgiana, from four different hospitals. The sequencing analysis demonstrated that all of them were KPC-2 producers. According to the susceptibility profile, most were highly resistant to β-lactams and quinolones, whereas polymyxin and amikacin were the most effective drugs in vitro. Two clonal groups were detected among isolates of E. cloacae and S. marcescens and four among isolates of K. pneumoniae, by PFGE analysis. Only a partial characterization of the genetic context that involves the blaKPC-2 gene was possible for these isolates, indicating an altered platform compared to the classic genetic environment (Tn4401). The plasmid analysis indicated plasmids of variable sizes, with a higher prevalence of those of ~ 20Kb involved with the blaKPC-2 gene. The analysis also showed that all of them were non-typable by PBRT technique. With respect to the phenotypic methods used for KPC detection, IPM proved to present a better performance than MEM in the combined-disc test with boronic acid (AB), resulting in 100% of sensitivity (SN) and 96.1% of specificity (SP). The quantification of Modified Hodge Test (MHT), proposed in this study, eliminated the subjectivity of this test leading to a considerable increase in the SP of the test compared to the conventional methodology. In conclusion, our results confirmed the high genetic plasticity and the distinct phenotypes observed in the Enterobacteriaceae family; contributed to the knowledge of the local epidemiology of carbapenem resistance and for KPC-producing isolates; as well as reinforced the use of phenotypic methods as an useful tool able to discriminate the mechanisms involved in carbapenem resistance.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Flavio Marques Lopes.pdf: 1637206 bytes, checksum: 95899c1fbc6b76141c229cf07f0d9d1b (MD5) Previous issue date: 2008-10-23 / In this research, open ground samples (Brazilian Savannah Cerrado) proceeding from treated cultures of soy with Opera® (epoxiconazol and piraclostrobin) had been used as source of resistant microorganisms to fungicide. The sample were collected in July 2006, in three points of planted area and two depths, 0 to 20 cm, and from 80 cm to 1m, next to the state highway GO-139, in the towns of São Miguel do Passa Quatro, in a producing farm model of soy seeds, where Opera® was used since its launching in 2002. The collection point was characterized as a risk place for ecological accidents, presenting area with extensive agriculture activity, intense use of pest management, soil with good level of infiltration and storage of water, and areas of declivity. The microorganism s selection was carried through using selective solid J.E. supplemented with 0.1% of Opera® with microorganisms collected in depth of 80cm. In a previous selection, 9 microorganisms were isolated, and from these, the one that showed a better growth within the selective J.E. liquid supplemented with 0.03% of Opera® (1805) was chosen for the development of this research. The analysis for coloration of Gram-negative showed that the isolated microorganism is one bacillococcus Gram-negative with poliphormic characteristics, being sensible to all the tested antibiotics. Biochemical identification made through the method of Bactray®, presented a correlaction of 99% with the genus Klebsiella. Through molecular identification by the gene 16S rDNA, it was possible to find a correlaction of 99% of similarity with the species K.pneumoniae and K. oxytoca. The proteins released by the Klebsiella in a supplemented environment with 0.03% of Opera had been precipitated with acetone, obtaining two proteinic fractions, a soluble (FS) and the other insoluble (FI) in a 0,1 mol L-1 phosphate buffer, pH 6.0. In the soluble solution (FS), it was found an oxirredutase from the peroxidases family, which uses hydrogen peroxide as an agent and several substrates as reducing agents, presenting greater activity for pyrogallol, TMB, o-dianisidine and catechol. In a chromatogram obtained through separation by molecular exclusion in Sephadex G- 100, two peaks with peroxidasic activities had been observed. Peak 1 presented two bands in SDS-PAGE, one with39.3 kDa and another one with 24.6 kDa. In the FI, it was possible to determine the presence of one hydrolysis with capacity to break the bonds between the ester molecule, from the family of carboxylesterases esterase B. The esterase B presented activity against casein substrates (9.3 UE), BApNA (1.31 UE), pNPP (0.01), presenting 5,4% activity of inhibition after incubation with E64, 6.5% activity of inhibition after incubation with protease inhibitors cocktail containing AEBSF and 7.5% of inhibition after incubation with TLCK. The electrophoreses of FI presented two protein bands with molecular mass of approximately 61.7 kDa for superior band and 60.7 kDa for the inferior band. The enzymatic characterization using pNPP showed high activity in pH 5.0 and pH 7.0. Esterase B kept 100% of activity after 120 minutes of incubation at 60oC. The presence of ZnCl2, EDTA, MgSO4 and CuSO4 had presented an inhibition effect of 16%, 16%, 23.2% and 40.8% respectively, within the enzyme activity. Esterase B slightly presented higher activity in the presence of DMSO and acetone, and a reduction of up to 87% comparing to isopropyl alcohol (lower polarity). The vale of Km using pNPP as substratum was of 3.4 mmol L-1, with a Vmax of 0.019 UE. When the selective J.E. supplemented with 0.03% Opera was treated with Klebsiella for 120 h, it had a reduction of 43.7% in the absorbance of the compounds with a peak of 200 nm, 55.7% - 220 nm and 28.7% - 260 nm. Using released enzymes by Klebsiella for treatment of the epoxiconazol standards in the reduction of the absorbance 200, 220 and 260 nm the observed results were 99.7%, 95.7% and 99.5% respectively. Whereas for the pyraclostrobin, the observed reduction were 95.5% and 80.2% for the wave lengths 200 and 260 nm respectively / Neste trabalho amostras de solo de cerrado provenientes de culturas de soja tratadas com Opera® (epoxiconazol e piraclostrobin) foram utilizadas como fonte de microrganismos resistentes ao fungicida. A coleta foi realizada no mês de julho de 2006, em três pontos de área plantada e em duas profundidades, 0 a 20 cm e de 80 cm a 1 m, próximo à rodovia estadual GO-139, no município de São Miguel do Passa Quatro, em uma fazenda modelo produtora de sementes, em que o Opera® foi utilizado desde o seu lançamento em 2002. O ponto de coleta foi caracterizado como um local de risco a acidentes ecológicos, apresentando área com atividade agrícola extensiva, uso intenso de defensivos agrícolas, solos com boa taxa de infiltração e armazenamento de água e áreas de declividade. A seleção dos microrganismos foi feita com meio seletivo J. E. sólido - suplementado com 0,1% de Opera®, com microrganismos coletados na profundidade de 80 cm. Na primeira etapa 9 microrganismos foram isolados e, destes, o microrganismo 1805 foi o que apresentou melhor crescimento em meio seletivo J. E. líquido - suplementado com 0,03% de Opera® sendo escolhido para o desenvolvimento deste trabalho. A análise por coloração de Gram mostrou que o microrganismo isolado é um bacilococco Gram-negativo com características polimórficas, sendo sensível a todos os antibióticos testados. A identificação bioquímica pelo método de Bactray® apresentou correlação a nível de 99% com o gênero Klebsiella. Através de identificação molecular pelo gene 16S rDNA foi possível encontrar uma correlação de 99% de similaridade com as espécies K. pneumoniae e K. oxytoca. As proteínas secretadas pela Klebsiella em meio suplementado com 0,03% de Opera® foram precipitadas com acetona, obtendo duas frações protéicas, uma solúvel (FS) e outra insolúvel (FI) em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 6,0. Na FS foi encontrada uma oxirredutase da família das peroxidases, que utiliza o peróxido de hidrogênio como agente oxidante e vários substratos como agentes redutores, apresentando maior atividade para pirogalol, TMB, o- ianizidina e catecol. No cromatograma obtido na separação por exclusão molecular em Sephadex G-100 foram observados dois picos com atividade peroxidásica. O pico 1 apresentou duas bandas em SDS-PAGE, uma mais forte com 39,3 kDa e outra com 24,6 kDa. Na FI foi possível determinar a presença de uma hidrolase, com capacidade de degradação de ligações éster, da família das carboxilesterases esterase B. A esterase B apresentou atividade contra os substratos caseína (9,3 UE), BApNA (1,31 UE), pNPP (0,01 UE), apresentando 5,4% de inibição com E64, 6,5% de inibição após incubação com coquetel de inibidores contendo AEBSF e 7,5% de inibição após incubação com TLCK. A eletroforese da FI apresentou duas bandas de proteínas com massa molecular de aproximadamente 61,7 kDa para a banda superior e 60,7 kDa para a banda inferior. A caracterização enzimática utilizando pNPP mostrou atividade alta em pH 5,0 e em pH 7,0. A esterase B manteve 100% de atividade após 120 minutos de incubação a 60 ºC. A presença de ZnCl2 aumentou a atividade em 14,2%, FeCl3 e MnSO4 não tiveram efeito significativo sobre a atividade e os demais sais, CaCl2, EDTA, MgSO4 e CuSO4 apresentaram um efeito inibitório de 16%, 16%, 23,2% e 40,8% respectivamente, na atividade da enzima. A esterase B apresentou atividade ligeiramente mais alta na presença de DMSO e acetona, e uma redução de até 87% frente ao isopropanol (solvente com menor polaridade). O valor de Km encontrado utilizando pNPP como substrato foi de 3,4 mmol L-1, com uma Vmáx de 0,019 UE. Quando o meio seletivo J. E. suplementado com 0,03% de Opera foi tratado com a Klebsiella por 120 h, houve uma diminuição 43,7% na absorvância dos compostos com pico a 200 nm, 55,7% a 220 nm e 28,7% a 260 nm. Usando as enzimas secretadas pela Klebsiella para tratamento do padrão epoxiconazol a redução da absorvância observada em 200, 220 e 260 nm foi de 99,7%, 95,7% e 99,5% respectivamente. Para o piraclostrobin a redução observada foi de 95,5 e 80,2% nos comprimentos de onda 200 e 260 nm respectivamente

Realizamos um estudo de corte transversal para investigar os fatores de risco para colonização de recém-nascidos por Klebsiella pneumoniae produtora de betalactamase de espectro estendido durante surto em unidade neonatal de risco intermediário. O surto se deveu à colonização crônica de profissional de saúde portadora de onicomicose. Cento e vinte recém-nascidos internados na unidade neonatal durante um período de três meses foram rastreados para colonização por Klebsiella pneumoniae produtora de ESBL através de cultura de swab retal, sendo detectados 27 colonizados. A análise multivariada mostrou que a colonização se associou de forma independente ao uso prévio de antimicrobianos e à ausência de aleitamento materno. Os antimicrobianos mais utilizados foram penicilina e amicacina. Uso prévio de antimicrobianos apresentou odds ratio (OR) igual a 12,3 [intervalo de 95% de confiança (IC): 3,66-41,2, P<0,001]. Aleitamento materno foi associado à redução do risco de colonização (OR: 0,22; IC95%: 0,05-0,99; P=0,049). Nove isolados recuperados no primeiro estágio do surto e 27 isolados de culturas de rastreamento foram posteriormente tipadas por eletroforese em gel de campo pulsado, revelando seis apresentações distintas (A a F). No primeiro estágio do surto ocorreram os clones A, C e E, enquanto entre os 27 isolados das culturas de rastreamento os seis clones foram identificados. O clone A também foi identificado nas mãos de técnica de enfermagem portadora de onicomicose. Pudemos concluir que uso prévio de antimicrobianos predispôs à colonização. O possível efeito do aleitamento materno como fator protetor deve ser mais bem investigado. A detecção de diferentes genótipos de K. pneumoniae sugere que a disseminação de elementos móveis portando o gene ESBL tenha se superposto à simples disseminação de um clone durante o surto / We describe a cross-sectional survey to identify risk factors for colonisation of neonates by extended-spectrum beta-lactamase producing Klebsiella pneumoniae. This occurred following exposure to a colonised healthcare worker during an outbreak in an intermediate-risk neonatal unit. In total, 120 neonates admitted consecutively during a three-month period were screened for ESBL-producing K. pneumoniae by rectal swabbing and 27 were identified as colonised. Multivariate analysis showed colonisation to be independently associated with use of antibiotics and absence of breastfeeding. Previous use of antibiotics presented an odds ratio (OR) of 12,3 [95% confidence interval (CI): 3,66-41,2, P<0,001]. The most commonly used antibiotics were penicillin and amikacin. Breastfeeding was associated with reduced risk for colonisation (OR: 0,22; 95% CI: 0,05-0,99; P=0,049). Nine isolates recovered during the first stage of the outbreak and 27 isolates from surveillance cultures were typed thereafter by pulsed-field gel electrophoresis, revealing six different profiles (A - F). Clones A, C, and E were implicated in the first stage of the outbreak, whereas among the 27 strains recovered from surveillance cultures, all six clones were identified. Clone A was also found on the hand of a nursing auxiliary with onychomycosis. We concluded that prior antimicrobial use predisposed to colonisation. The possible role of breastfeeding as a protective factor needs to be further elucidated. Detection of different genotypes of ESBL-producing K. pneumoniae suggests that dissemination of mobile genetic elements bearing the ESBL gene may have been superimposed on the simple dissemination of a clone during the outbreak

Ökande antibiotikaresistens utgör en allvarlig samhällsutmaning. För resistensbestämning av bakterier används standardmetoden buljongspädning. Då bestäms minsta inhiberande koncentration (MIC) som den lägsta koncentration av antibiotika som kan förhindra tillväxt. Examensarbetets syfte var att undersöka om val av odlingsbuljong påverkar MIC-värdet för Gramnegativa bakterier. En litteraturundersökning genomfördes av studier som jämfört resistensbestämning i standardbuljong med alternativ buljong. Därutöver gjordes en experimentell jämförelse. Litteraturstudien visade att buljongens sammansättning kan ha betydelse för MIC-värdet, men resultatet varierade med både bakteriearter och typer av antibiotika. Viktigt att beakta är det begränsade materialet i studien, möjliga förklaringar till MIC-varianser är exempelvis bikarbonat och antibiotikums olika känslighet för ämnet. Den experimentella studien visade att buljongvalet inte hade någon inverkan på MIC-värdet när det undersöktes för Klebsiella pneumoniae och antibiotikan meropenem. Det kan möjligen förklaras av att effekten av meropenem inte påverkas av buljongvalet. Slutsatsen är att många faktorer påverkar MIC-värdet och att standardbuljongen är en tillgång med stor mängd historiska data som kan nyttjas för att följa resistensutvecklingen, även om alternativa buljonger i vissa fall kan vara bättre lämpade för att förutsäga behanlingsbarheten. Buljongval bör väljas med noggrannhet efter rådande omständigheter. / Increasing antibiotic resistance is a concerning societal challenge. The standard test for measuring antibiotic susceptibility of bacteria is the method of broth microdilution. This method is used to determine the minimum inbibitory concentration (MIC), defined as the lowest concentration of an antibiotic that can inhibit the growth of a specific strain of a bacterium. This study aimed to investigate whether the choice of broth affects the MIC-value for Gram-negative bacteria. A literature review was conducted to examine studies comparing standard broth against alternative broth, alongside an experimental comparison of the same. The result of the literature review indicated that the composition of the broth does have an effect. However, the effect varies depending on the bacterial species and type of the antibiotic that was analyzed. Its important to note the limited amount of data from both prior work and this study, but one possible explanation to the variance in MIC-values could be e.g., bicarbonate and the specific antibiotic´s sensitivity to this substance. The experimental part of this study concluded that the choice of broth did not affect the resulting MIC-value when the antibiotic susceptibility of Klebsiella pneumoniae to meropenem was analyzed. This could be attributed to the efficacy of meropenem being unaffected by the broths used in this study. The conclusing of this study is that multiple factors contribute to the resulting MIC-value, and that the standard broth with its large volume of historical data, is a valuable asset to use when tracking the evolution of antibiotic resistance, even though an alternative broth may be better suited to predict treatability. The choice of broth should be made with great care and be adapted to actual circumstances and conditions.

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INTRODUÇÃO: O aumento da incidência de infecções causadas por bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos limita cada vez mais as opções terapêuticas, dificultando o tratamento e aumentando os índices de morbidade e mortalidade, além dos gastos em saúde. Ao longo dos últimos cinco anos, essa limitação tem levado ao reestabelecimento do uso de antimicrobianos consideradas ultrapassados, como as polimixinas. Este grupo passou a ser utilizado com cada vez mais frequência no tratamento de infecções causadas por microrganismos gram-negativos resistentes aos carbapenêmicos. As enterobactérias, em particular a espécie Klebsiella pneumoniae, tem apresentado frequentemente esse perfil, porém, a resistência à polimixinas têm sido relatada, eliminando essa importante alternativa terapêutica. Apesar da importância do tema, são escassas as publicações sobre frequência de resistência às polimixinas em K. pneumoniae e a relação clonal entre isolados resistentes à polimixina B no Brasil. OBJETIVOS: Avaliar a relação genética, perfil de sensibilidade antimicrobiana e mecanismos de resistência às polimixinas em K. pneumoniae. MATERIAIS E MÉTODOS: A execução deste trabalho dividiu-se em duas partes principais: (i) levantamento de dados de culturas positivas para K. pneumoniae da rotina de pacientes hospitalizados em instituições atendidas pelo serviço de análises clínicas do Fleury Medicina e Saúde; (ii) confirmação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) para polimixina B, avaliação da relação clonal por eletroforese em campos pulsados (PFGE),e sequenciamento de múltiplos loci (MLST), avaliação da integridade do gene mgrB e da presença do gene mcr-1 por PCR entre isolados resistentes à polimixina B e aos carbapenêmicos (CPRKp). RESULTADOS e CONCLUSÕES: Na análise de 3.085 isolados de K. pneumoniae obtidos de pacientes internados em 11 hospitais da Grande São Paulo entre os anos de 2011 e 2015, foi evidenciado um aumento estatisticamente significativo na resistência aos carbapenêmicos de 6,8% em 2011 para 35,5% em 2015. Em 2015, KPC foi detectada em 96,2% dos isolados resistentes aos carbapenêmicos. A distribuição das concentrações inibitórias mínimas de polimixina B entre todos os isolados de K. pneumoniae evidenciou uma distribuição bimodal com a CIM de 2 mg/L como o valor de ponto de corte para a susceptibilidade à polimixina B; assim, 3,6% do número total de isolados sensíveis aos carbapenêmicos foram interpretados como resistentes enquanto essa proporção foi de 22,5% entre as resistentes aos carbapenêmicos (CRKp). Entre esses últimos isolados também houve um aumento estatisticamente significativo na tendência anual de resistência à polimixina B, de 0% em 2011 para 27,1% em 2015. Estas taxas variaram de 0,7% em 2011 para 3,9% até junho de 2014 entre os sensíveis aos carbapenêmicos. Entre os antimicrobianos alternativos, a amicacina e a tigeciclina foram os compostos mais ativos. A análise por PFGE de 60 isolados de CPRKp obtidos de pacientes distintos nos anos de 2014 e 2015 evidenciou dois grandes grupos clonais: CPRKp1 e CPRKp2, os quais segundo a análise por MLST pertencem, respectivamente, aos grupos ST11 e ST437, ambos do complexo clonal 258. Foi observado o mesmo grupo ST entre isolados obtidos dentro de um mesmo hospital e também entre diferentes hospitais, públicos e privados. O mecanismo de resistência mais comum entre os isolados de CPRKp foi a presença de sequências de inserção interrompendo o gene mgrB. O gene mcr-1 não foi detectado em nenhum dos isolados. / INTRODUCTION: The increasing incidence of infections caused by bacteria resistant to multiple antimicrobials increasingly limits therapeutic options, making treatment difficult and increasing the morbidity and mortality and health spending. Over the past five years, this limitation has led to the reestablishment of the use of antimicrobials deemed outdated, such as polymyxins. This group is now used with increasing frequency to treat infections caused by carbapenem-resistant gram-negative microorganisms. Enterobacteria, especially Klebsiella pneumoniae, have often presented this profile, however, resistance to polymyxins have been also reported, eliminating this important therapeutic alternative. Despite the importance of this issue, the publications are scarce on the polymyxins resistance frequency in K. pneumoniae and clonal relationship among isolates resistant to polymyxin B in Brazil. OBJECTIVES: To evaluate the genetic relationship, antimicrobial susceptibility profile and polymyxin B resistance mechanisms in K. pneumoniae. MATERIALS AND METHODS: The execution of this work was divided into two main parts: (i) survey data on routine cultures positive for K. pneumoniae from patients hospitalized in institutions attended by the clinical analysis service of Fleury Health and Medicine; (ii) confirmation of to polymyxin B minimum inhibitory concentrations (MIC), evaluation of clonal relationship by electrophoresis pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST), evaluation of the integrity of the mgrB gene and the presence of mcr-1 gene by PCR among isolates resistant to polymyxin B and carbapenems (CPRKp). RESULTS AND CONCLUSIONS: The analysis of 3,085 K. pneumoniae isolates obtained from inpatients from 11 hospitals in the São Paulo urban area between 2011 and 2015, has shown a statistically significant increase in carbapenem resistance from 6.8% in 2011 to 35.5% in 2015. In 2015, KPC was detected in 96.2% of isolates resistant to carbapenems. The polymyxin B MIC distribution of all Klebsiella pneumoniae showed a bimodal distribution with the MIC of 2 mg/L as the cutoff value for polymyxin B susceptibility; thus, 3.6% of the total number of isolates susceptible to carbapenems were interpreted as resistant while this proportion was 22.5% among carbapenem-resistant isolates (CRKp). Among these isolates there was also a statistically significant increase in the annual trend of polymyxin B resistance, from 0% in 2011 to 27.1% in 2015. These rates ranged from 0.7% in 2011 to 3.9% by June 2014 between carbapenem-susceptible isolates. Among alternative antimicrobials, amikacin and tigecycline were the most active compounds. The analysis by PFGE of 60 CPRKp isolates obtained from different patients in the years 2014 and 2015 showed two major clonal groups: CPRKp1 and CPRKp2, which according to the analysis by MLST belong respectively to ST11 and ST437 groups, both from clonal complex 258. We observed the same ST group of isolates obtained within a hospital and between different public and private hospitals. The most common mechanism of polymyxin B resistance among CPRKp isolates was the presence of insertion sequences interrupting the mgrB gene. The mcr-1 gene was not detected in any of the isolates.

Há poucos dados na literatura sobre o transporte transplacentário de imunoglobulinas em gestações múltiplas. O objetivo deste estudo foi observar fatores que influenciam a concentração de imunoglobulina G (IgG) no cordão umbilical dos neonatos e a transferência transplacentária de IgG total e de IgG contra o Streptococcus grupo B (EGB), e lipopolissacarídeos (LPS) de Klebsiella spp. e Pseudomonas spp.. Métodos: estudo prospectivo realizado no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo no período de 2012 a 2013. Foram coletadas amostras de sangue materno e de cordão umbilical no momento do parto. Os critérios de inclusão foram gestações gemelares com ausência de sinais de infecção por HIV, citomegalovírus, Hepatites B e C, toxoplasmose e rubéola e ausência de doenças autoimunes, malformação fetal e síndromes genéticas. A análise multivariada foi realizada para avaliar a associação entre os níveis de IgG em cordão umbilical e as taxas de transferência de anticorpos com a concentração materna de IgG, a corionicidade da gestação, a presença de insuficiência placentária, a restrição de crescimento intrauterino, a idade gestacional de nascimento, o peso de nascimento, o tabagismo, a doença materna e a via de parto. Resultados: a concentração de IgG total em cordão umbilical apresentou correlação positiva com os níveis maternos séricos de IgG total e a idade gestacional do parto. Os níveis de IgG total em cordão umbilical foram significativamente menores em gestações monocoriônicas quando comparadas às dicoriônicas. A taxa de transferência de IgG total apresentou correlação positiva com a idade gestacional do parto, mas negativa com as concentrações maternas de IgG total. As concentrações de IgG contra EGB e LPS de Klebsiella spp. e Pseudomonas spp. apresentaram associação com os níveis maternos de IgG específicos contra esses antígenos e com o diabetes. Os níveis de IgG contra LPS de Klebsiella spp. também foram associados com o peso de nascimento e com hipertensão materna. As taxas de transferência de IgG contra EGB e LPS de Pseudomonas spp. apresentaram correlação com os níveis maternos de IgG específicos contra os antígenos referidos. A taxa de transferência de IgG contra EGB também esteve associada com a idade gestacional do parto, enquanto a taxa de transferência de IgG contra LPS de Pseudomonas spp. apresentou correlação com diabetes. Não houve correlação entre a taxa de transferência de IgG contra a LPS de Klebsiella spp. com nenhum fator analisado. Conclusão: em gestações gemelares, a concentração total de IgG em cordão umbilical foi influenciada pela concentração materna de IgG total, pela idade gestacional do parto e pela corionicidade placentária. As concentrações de IgG total foram significativamente menores em gestações monocoriônicas que em dicoriônicas. As concentrações séricas de IgG contra EGB e LPS de Klebsiella spp. e Pseudomonas spp. em cordão umbilical apresentaram associação com os níveis maternos de IgG específicos contra esses antígenos e com a presença de diabetes. Todos os outros parâmetros estudados apresentaram diferentes associações com as concentrações de IgG e com as taxas de transferências de IgG específicas contra cada antígeno investigado / There is a lack of data in the literature regarding the placental transport of immunoglobulins in twin pregnancies. The objective of this study was to examine factors that influence the concentration of immunoglobulin G (IgG) in cord serum and the placental transfer of total IgG and of IgGs against Klebsiella spp. LPS and Pseudomonas spp. LPS, and Group B Streptococcus (GBS). Methods: A prospective study was conducted at the Hospital das Clinicas in the São Paulo University Medical School between 2012 and 2013. Maternal and umbilical cord samples were collected at birth. The inclusion criteria were twin pregnancies with no evidence of infection with HIV, cytomegalovirus, hepatitis B or C, toxoplasmosis, or rubella. Twin pregnancies with evidence of autoimmune disease, fetal malformations or genetic syndromes were also excluded. Stepwise multivariate regression analysis was used to evaluate the association between cord serum concentrations of IgG and IgG transfer ratios as well as the associations between cord serum concentrations of IgG and maternal serum concentrations of IgG, pregnancy chorionicity, the presence of an abnormal umbilical artery pulsatility index, intrauterine growth restriction, gestational age at delivery (GAD), birth weight, placental weight, smoking during pregnancy, maternal disease, and mode of delivery. Results: Total IgG concentrations in cord sera were positively correlated with total IgG concentrations in maternal sera. Cord serum concentrations of IgG were also positively correlated with GAD. Cord serum concentrations of total IgG were significantly lower in monochorionic versus dichorionic pregnancies. The total IgG transfer ratio was positively correlated with GAD but was inversely correlated with total IgG concentration in maternal serum. Cord serum concentrations of IgGs against GBS, Klebsiella spp. LPS and Pseudomonas spp. LPS were significantly associated with maternal concentrations of specific IgGs and the presence of maternal diabetes. Cord serum concentrations of anti-Klebsiella spp. LPS IgG were also correlated with birth weight and the presence of maternal hypertension. The transfer ratios of IgGs against GBS and Pseudomonas spp. LPS were related to maternal concentrations of specific IgGs. The transfer ratios of IgGs against GBS and Pseudomonas spp. LPS were also associated with GAD and the presence of diabetes, respectively. None of the examined parameters were found to be correlated with the transfer ratio of IgG against Klebsiella spp. LPS. Conclusions: In twin pregnancies, in addition to the influences of maternal serum concentrations of total IgG and of GAD, chorionicity was also found to influence cord serum concentrations of total IgG. Compared with dichorionic twins, monochorionic twins were found to have lower concentrations of total IgG in cord sera. Umbilical cord serum concentrations of IgGs against GBS, Klebsiella spp. LPS and Pseudomonas spp. LPS were associated with maternal serum concentrations of specific IgGs and with maternal diabetes. All of the remaining parameters that were investigated had varying associations with concentrations of specific IgGs in cord serum and with placental transfer and were dependent on the antigen being studied

O 1,3-propanodiol é um composto produzido a partir da fermentação do glicerol por bactérias como a do gênero Klebsiella e que pode ser utilizado para diversas aplicações na indústria, como a produção de PTT (politrimetileno tereftalato). Esse trabalho focou na produção de 1,3-propanodiol utilizando os genes que codificam as enzimas da via retirados de uma cepa de Klebsiella previamente isolada (GLC29). Os genes foram inseridos em um plasmídeo e este em cepa hospedeira de Escherichia coli com alteração na afinidade da enzima isocitrato desidrogenase pelo seu cofator. A enzima foi modificada no genoma da bactéria e utiliza como cofator NAD em vez do NADP original. Ensaios preliminares em agitador rotativo mostraram uma melhoria de produção da cepa mutada em comparação com a Escherichia coli selvagem. Em ensaios em biorreator, variando a concentração de oxigênio dissolvido no meio, a cepa mutante apresentou uma produção 25% maior que a cepa selvagem na condição de maior produção com 5% de oxigênio dissolvido. / The 1,3-propanediol is a compound produced from glycerol fermentation by bacteria such as Klebsiella and which can be used for various applications in industry, such as the production of PTT (polytrimethylene terephthalate). This work focused on the production of 1,3-propanediol using genes encoding the enzymes of the pathway taken from a Klebsiella strain previously isolated (GLC29). The genes were inserted into a plasmid and in the host strain of Escherichia coli with changes in the affinity of the enzyme isocitrate dehydrogenase for its cofactor. The enzyme was modified in the genome of the bacteria using the cofactor NAD instead of the original NADP. Preliminary tests on shaker showed an improvement of production by the mutated strains in comparison to the wild Escherichia coli. In biorreactor cultivation, varying the concentration of dissolved oxygen in the medium, the mutant strain showed a production 25% higher than the wild type strain in the condition with 5% of dissolved oxygen.