Orientador: Valéria Marçal Félix de Lima / Resumo: A leishmaniose visceral canina (LV) no Brasil representa um grave problema de saúde pública. Na LV a supressão imune celular é determinante da progressão da doença. Estudos mostraram que a regulação da resposta imune depende de miRNAs. O objetivo deste estudo foi a caracterização dos miRNAs em leucócitos esplênicos (LE) de cães naturalmente infectados por L. infantum. Este estudo foi realizado em Araçatuba, região endêmica para LV canina (LVC). Um grupo de 4 cães saudáveis e 8 cães com LVC foi estudado. O RNA foi extraído do LE usando o Kit Mirvana (Invitrogen™) de acordo com as recomendações do fabricante. O RNA foi quantificado usando um fluorômetro (Qubit 3.0, Invitrogen™) o grau de pureza realizado por eletroforese capilar (Bioanalyser, Agilent ™), as amostras foram então armazenadas a -80°C. O miRNA foi preparado para o microarranjo usando o FlashTag Biotina HSR RNA Labeling Kit (Affymetrix ™). O microarranjo foi realizado usando o Affymetrix ™ miRNA 4.1 Strip de acordo com as recomendações do fabricante. A produção de cDNA foi realizada usando o kit miScript RT II (Qiagen™). Os miRNAs diferencialmente expressos foram validados por qPCR utilizando iniciadores para miRNAs de cães inventariados (Qiagen™) de acordo com recomendação do fabricante. Os miRNAs validados foram analisados no programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Qiagen™). Após a análise das vias, os LE de cães infectados foram transfectados com miR21 usando miScript miRNA Mimics e Inhibitor (Qiagen™) de acord... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Canine visceral leishmaniasis (VL) in Brazil represents a serious public health problem. In VL cellular immune suppression is determinant of disease progression. Studies have shown that the regulation of the immune response depends on miRNAs. The objective of this study was the characterization of the miRNAs in spleen leukocytes (SL) from dogs naturally infected by L. infantum. This study was carried out in Araçatuba, an endemic region for canine LV (LVC). A group of 4 healthy dogs and 8 dogs with VL was studied. Total RNA was extracted from SL using Mirvana Kit (Invitrogen®) according to manufacturer’s recommendations Total RNA was quantified using a fluorometer (Qubit 3.0, Invitrogen®) the degree of purity performed by capillary electrophoresis (Bioanalyser, Agilent®), the samples were then stored at -80°C. Total RNA was prepared for the microarray using the FlashTag Biotin HSR RNA Labeling Kit (Affymetrix®). The microarray was performed using the Affymetrix ™ miRNA 4.1 Strip according to manufacturer’s recommendations. cDNA production was performed using the miScript RTII kit (Qiagen®). Differentially expressed miRNAs were validated by qPCR was performed using the inventoried dog miRNAs (Qiagen®) and SYBR Green (kit miScript SYBR Green PCR, Qiagen®), according to the manufacturer's recommendation. The validated miRNAs were analyzed in the program Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen®). After analysis of the pathways, then the LS from infected dogs were transfected with miR21... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A leishmaniose visceral causada por Leishmania infantum chagasi à caracterizada pela perda da habilidade do hospedeiro gerar uma resposta imunolÃgica eficaz. Neste estudo, foi investigado o papel da quimiocina CXCL10 no controle da infecÃÃo por L. infantum chagasi in vivo. Grupos de camundongos BALB/c foram tratados ou nÃo com CXCL10 (5 μg/kg) com 1, 3 e 7 dias de infecÃÃo e apÃs 1, 7 e 23 dias do tratamento, alguns parÃmetros foram avaliados: a carga parasitÃria, os nÃveis de IFN-, IL-4, TGF-β e IL-10, e as alteraÃÃes histopatolÃgicas no fÃgado. ApÃs 23 dias de tratamento, CXCL10 induziu, no baÃo, uma reduÃÃo expressiva no nÃmero de parasitos, quando comparado ao grupo controle. No fÃgado, a carga parasitÃria mostrou uma queda no grupo tratado, entre o 7 e 23 dia apÃs o tratamento. Entretanto, o efeito leishmanicida de CXCL10, neste trabalho, nÃo parece ser mediado por NO, uma vez que nÃo houve diferenÃa na produÃÃo de NO entre os grupos. IFN-γ foi induzida de maneira mais significativa no grupo tratado do que nos controles, e atingiu sua produÃÃo mÃxima (100 pg/mL) no 23 dia apÃs o tratamento, correlacionando-se com a queda da carga parasitÃria nos ÃrgÃos-alvo. IL-4 foi produzida em baixas concentraÃÃes, em ambos os grupos, embora os animais tratados com CXCL10 tenham mostrado nÃveis mais elevados do que os controles. Em relaÃÃo Ãs citocinas antiinflamatÃrias, apÃs 23 dias do tratamento, os nÃveis de IL-10 nos animais tratados foram menores do que os do controle. A produÃÃo de TGF-β apÃs 7 dias do tratamento foi 2 vezes menor no grupo tratado quando comparado ao controle, e apÃs 23 dias do tratamento, essa citocina continuou com nÃveis mais baixos do que aqueles observados no controle. Na anÃlise histopatolÃgica do fÃgado apÃs o 1 dia do tratamento, foram encontrados, em ambos os grupos, mais granulomas imaturos (GI), do que infiltrados nÃo granulomatosos (NG) e alguns poucos granulomas maduros (GM) apenas no grupo tratado. ApÃs 7 dias do tratamento, a quantidade de infiltrados NG estava menor e os GI ainda foram os mais encontrados, em ambos os grupos, alÃm disso, foi observado um pequeno aumento de GM no grupo tratado. Em resumo, diante dos resultados encontrados, à possÃvel sugerir um importante papel leishmanicida de CXCL10 em camundongos BALB/c infectados por L. infantum chagasi, que parece ser mediado por uma expressiva produÃÃo de IFN-g e supressÃo das citocinas imunorreguladoras, IL-10 e TGF-β, abrindo a hipÃtese se isto nÃo estaria associado a uma diminuiÃÃo na frequÃncia de cÃlulas T regulatÃrias, induzida por CXCL10, nesses animais. / Visceral leishmaniasis caused by Leishmania infantum chagasi is characterized by the loss of the ability of host to generate an effective immune response. In this study it was investigated the role of CXCL10 chemokine in controlling L. infantum chagasi infection in vivo. Groups of BALB/c mice were treated or not with recombinant CXCL10 chemokine (5 μg/kg) with 1, 3 and 7 days of infection and after 1, 7 and 23 days of treatment, some parameters were evaluated: parasite load, levels of IFN-g, IL-4, TGF-β and IL-10, and the histopathological alterations in the liver. After 23 days of treatment, CXCL10 induced in the spleen a significant reduction on the number of parasites as compared to control group. In the liver, parasite load decreased in treated group between the 7th and 23th day post treatment. However, the antileishmanial effect of CXCL10, in this work, does not seem to be mediated by NO, since there was no difference in the NO production among the groups. IFN-γ was induced most significantly in treated group than in controls, and reached its maximum production (100 pg/mL) on day 23 after treatment, correlating with the reduction in parasite burden in target organs. IL-4 was produced in low doses, in both groups, although treated animals had shown higher levels than control group. Regarding to anti-inflammatory cytokines, after the 23th day of treatment, IL-10 levels in treated animals were smaller than in control group. Production of TGF-β after 7 days of treatment was 2 times lower in treated group when compared to control, and after the 23th day of treatment, this cytokine remained with lower levels than those observed in control. In the histopathological analysis of the liver after the 1st day of treatment, were found in both groups more immature granulomas (GI) than non-granulomatous infiltrate (NG), and some few mature granulomas (GM) were only observed in treated group. After 7 days of treatment, the amount of NG infiltrates was lower, and GI were still the most frequent in both groups, besides a slight increase of GM was observed in treated group. In summary, at the light of the found results, it is possible to suggest an important leishmanicidal role to CXCL10 in BALB/c mice infected by L. infantum chagasi, which seems to be mediated by a significant IFN-g production, and suppression of immunoregulatory cytokines, IL-10 and TGF-β, opening the hypothesis that this would be associated to a decrease in the frequency of regulatory T cells induced by CXCL10 in these animals.

La communauté Rurale de Mont-Rolland (région de Thiès, Sénégal) est un foyer endémique de leishmaniose canine décrit depuis 1970. Des études épidémiologiques récentes ont montré que l'agent étiologique est Leishmania (Leishmania) infantum et que le cycle de transmission est bien établi sur l'ensemble de la commune, avec plus de 30% des chiens et plus de 20% des hommes séropositifs. Néanmoins, malgré les différentes études épidémiologiques, le vecteur reste toujours inconnu. Jusqu'à présent, aucune espèce de Phlebotomus, connue pour être vecteur de L. infantum (sous genre Larroussius et secondairement Adlerius), n'a été identifiée au Sénégal. Dans ce contexte, l'objectif principal de cette thèse était d'identifier les vecteurs potentiels de la maladie et de caractériser le cycle de transmission de la leishmaniose canine par des études écologiques, parasitologiques et moléculaires des populations de phlébotomes. Ainsi, 7442 spécimens de phlébotomes ont été récoltés par piégeage adhésif, piégeage lumineux et par pulvérisations intradomiciliaires d'insecticides pyréthrinoïdes. Neuf espèces de phlébotomes ont été identifiées : deux appartiennent au genre Phlebotomus, P. duboscqi (vecteur de la leishmaniose cutanée au Sénégal) et P. rodhaini, les autres espèces appartiennent au genre Sergentomyia, S. adleri, S. clydei, S. antennata, S. buxtoni, S. dubia, S. schwetzi, et S. magna. La distribution spatiale des phlébotomes est hétérogène selon le village, selon l'écosystème et l'environnement de capture. Les études parasitologiques et les études moléculaires (PCR diagnostique de Leishmania) ont révélé trois espèces de Sergentomyia infectées par L. infantum, S. dubia (dissection et PCR), S. schwetzi (dissection et PCR) et S. magna (PCR). Il faut noter que plus de 2% des individus femelles à jeun testées étaient PCR positives, soulignant la survie des parasites chez ces espèces après la digestion. Toutes les autres espèces étaient négatives aussi bien en dissection qu'en PCR. Les analyses statistiques ont montré : que la distribution de S. dubia est significativement associée à la séroprévalence chez les chiens, que les individus de S. schwetzi positifs en PCR sont significativement associés à la séroprévalence chez le chien, qu'il y a un effet significatif du nombre de phlébotomes positifs en PCR (les 3 espèces confondues) sur la séroprévalence chez l'homme. Toutes ces données démontrent pour la première fois que 3 espèces du genre Sergentomyia, S. dubia, S. schwetzi et probablement S. magna, sont les vecteurs de la leishmaniose canine dans le foyer de Mont-Rolland. Ces résultats remettent en question le dogme qui stipule que seul le genre Phlebotomus serait capable de transmettre le parasite Leishmania dans l'Ancien-Monde. L'étude du comportement et de la distribution de ces trois espèces et de leurs spécimens infectés nous ont permis de proposer un modèle de transmission dans ce foyer. / AbstractThe rural community of Mont-Rolland (Thiès, Sénégal) is an endemic focus of canine leishmaniasis described since 1970. Recent epidemiological studies showed that the causative agent is Leishmania infantum with well established transmission cycle throughout the area. However, despite the several epidemiological studies, the vector species is still unknown. So far, no species of Phlebotomus belongs to Larroussius and Adlerius subgenera, known as vector of L. infantum, was identified in Senegal. In this context, the main objective of this thesis was to identify potential vectors of the disease and to characterize the cycle of canine leishmaniasis transmission by ecological, parasitological and molecular studies on sandfly populations. Thus, 7442 specimens were collected by sticky traps, light traps and indoor spraying with pyrethroid insecticide from different environments (intradomiciliary, peridomiciliary, culture area, isolated area) and different villages and ecosystems (sandy soils, lateritic gravel soils and sandy clay soils). Nine species of sand flies were identified; two belong to the Phlebotomus genus, P. duboscqi (vector of cutaneous leishmaniasis in Senegal) and P. rodhaini, the other species belong to the Sergentomyia genus, S. adleri, S. clydei, S. antennata, S. buxtoni, S. dubia, S. schwetzi, and S. magna. Two species of the Phlebotomus genus were significantly underrepresented (292 specimens) compared to species of the Sergentomyia genus (7150 specimens). The spatial distribution of sand flies is heterogeneous depending on the village, the ecosystem and environment, suggesting that several species are capable of transmitting the parasite. Parasitological and molecular studies (diagnostic PCR of Leishmania) revealed that three species of Sergentomyia were infected with L. infantum, S. dubia (dissection and PCR), S. schwetzi (dissection and PCR) and S. magna (PCR). It is worth noting that more than 2% of un-fed females of these species were PCR-positive, emphasizing the survival of parasites after digestion. All other species were found to be negative in both PCR and dissection. In addition, statistical analysis showed that 1) the distribution of S. dubia is significantly associated with seroprevalence in dogs, 2) PCR-positive individuals of S. schwetzi are significantly associated with seroprevalence in dogs, 3) there is a significant effect of PCR-positive sand flies (all species considered) on seroprevalence in humans. All these data demonstrated for the first time that three species of Sergentomyia, S. dubia, S. schwetzi and probably S. magna, are the vectors of the canine leishmaniasis in the Mont-Rolland commune. The results presented in this study challenge the dogma which states that only the Phlebotomus genus would be capable of transmitting Leishmania parasites in the Old World. The behaviour and distribution of these three species and their infected specimens allowed us to propose a model of transmission in the focus.

O presente projeto de pesquisa teve por objetivo a descoberta de metabólitos secundários potencialmente bioativos contra atividade parasitária e como agentes anti-virais e antibióticos, usando desreplicação como metodologia essencial na seleção e priorização de extratos brutos oriundos de invertebrados, para a descoberta de produtos naturais estruturalmente inéditos.<br /><br />Foram preparados diversos extratos de invertebrados marinhos a partir de um fracionamento inicial. O desenvolvimento e a aplicação de uma metodologia de desreplicação permitiu a seleção de três organismos de estudo, Iotrochota birotulata, Amathia verticillata, e Tedania brasiliensis. Os extratos destes organismos foram submetidos a diferentes metodologias de fracionamento, isolamento e purificação de substâncias, dependendo dos resultados de desreplicação para cada organismo.<br /><br />Como resultado do isolamento e identificação de substancias destes organismos, obteve-se dois compostos já conhecidos na literatura e dezesseis compostos inéditos, dos quais dois são derivados sintéticos. De todos os compostos isolados, a pseudoceratidina, as desbromopseudoceratidinas e as tedamidas A e B apresentaram um índice de seletividade de 243.1, 217.1 e 89.3 respectivamente para Leishmania (L.) infantum, e o composto N12-acetilpseudoceratidina de 23.2 para Trypanosoma cruzi, sendo estes resultados muito promissores para a utilização das estruturas destas moléculas como potenciais modelos para o desenvolvimento de fármacos. / This research project aimed at the discovery of potentially bioactive secondary metabolites against parasitic activity and as antiviral agents and antibiotics, using dereplication as an essential methodology in the selection and prioritization of crude extracts derived from invertebrates, to the discovery of natural products structurally unpublished.<br /><br />Various extracts of marine invertebrates from an initial fractionation were prepared. The development and application of a dereplication methodology allowed the selection of three study organisms, Iotrochota birotulata, Amathia verticillata, and Tedania brasiliensis. The extracts of these organisms were subjected to different methods of fractionation, isolation and purification of substances, depending on the results of dereplication for each organism.<br /><br /> As a result of the isolation and identification of substances of these organisms, it obtained two compounds already known in the literature and unpublished sixteen compounds, two of which are synthetic derivatives. In all isolated compounds, pseudoceratidina, the desbromopseudoceratidinas and tedamidas A and B showed an index of selectivity 243.1, 217.1 and 89.3 respectively for Leishmania (L.) infantum, and the compound N12-acetilpseudoceratidina 23.2 for Trypanosoma cruzi, which are very promising results for the use of these molecules as structures potential models for drug development.

O presente projeto de pesquisa teve por objetivo a descoberta de metabólitos secundários potencialmente bioativos contra atividade parasitária e como agentes anti-virais e antibióticos, usando desreplicação como metodologia essencial na seleção e priorização de extratos brutos oriundos de invertebrados, para a descoberta de produtos naturais estruturalmente inéditos.<br /><br />Foram preparados diversos extratos de invertebrados marinhos a partir de um fracionamento inicial. O desenvolvimento e a aplicação de uma metodologia de desreplicação permitiu a seleção de três organismos de estudo, Iotrochota birotulata, Amathia verticillata, e Tedania brasiliensis. Os extratos destes organismos foram submetidos a diferentes metodologias de fracionamento, isolamento e purificação de substâncias, dependendo dos resultados de desreplicação para cada organismo.<br /><br />Como resultado do isolamento e identificação de substancias destes organismos, obteve-se dois compostos já conhecidos na literatura e dezesseis compostos inéditos, dos quais dois são derivados sintéticos. De todos os compostos isolados, a pseudoceratidina, as desbromopseudoceratidinas e as tedamidas A e B apresentaram um índice de seletividade de 243.1, 217.1 e 89.3 respectivamente para Leishmania (L.) infantum, e o composto N12-acetilpseudoceratidina de 23.2 para Trypanosoma cruzi, sendo estes resultados muito promissores para a utilização das estruturas destas moléculas como potenciais modelos para o desenvolvimento de fármacos. / This research project aimed at the discovery of potentially bioactive secondary metabolites against parasitic activity and as antiviral agents and antibiotics, using dereplication as an essential methodology in the selection and prioritization of crude extracts derived from invertebrates, to the discovery of natural products structurally unpublished.<br /><br />Various extracts of marine invertebrates from an initial fractionation were prepared. The development and application of a dereplication methodology allowed the selection of three study organisms, Iotrochota birotulata, Amathia verticillata, and Tedania brasiliensis. The extracts of these organisms were subjected to different methods of fractionation, isolation and purification of substances, depending on the results of dereplication for each organism.<br /><br /> As a result of the isolation and identification of substances of these organisms, it obtained two compounds already known in the literature and unpublished sixteen compounds, two of which are synthetic derivatives. In all isolated compounds, pseudoceratidina, the desbromopseudoceratidinas and tedamidas A and B showed an index of selectivity 243.1, 217.1 and 89.3 respectively for Leishmania (L.) infantum, and the compound N12-acetilpseudoceratidina 23.2 for Trypanosoma cruzi, which are very promising results for the use of these molecules as structures potential models for drug development.

A dinâmica da leishmaniose visceral humana na Amazônia brasileira é pouco conhecida e nos últimos anos tem aumentado a incidência da doença principalmente no Estado do Pará. Os objetivos do estudo foram: I) identificar indivíduos com infecção sintomática e/ou assintomática por Leishmania (L.) infantum chagasi, II) estudar os dois tipos de infecção, tanto clínica quanto imunologicamente, e III) estudar a taxa de prevalência da infecção. O estudo foi de corte transversal com 946 indivíduos de ambos os sexos, com idade a partir de 1 ano, vivendo em área endêmica de leishmaniose visceral americana (LVA), município de Barcarena, Pará, Brasil. Para o diagnóstico da infecção, foram usadas a reação dérmica de hipersensibilidade retardada (Reação Intradérmica de Montenegro) - RIM e a Reação de Imunofluorêscencia Indireta (RIFI). Foram diagnosticados 120 casos de infecção com taxa de prevalência de 12.6%; 8 casos mostraram alta soro-reatividade (1.280 a 120.240) IgG utilizando-se o teste da RIFI e nenhuma reação na RIM; 4 casos foram típicos de LVA e outros 4 casos de infecção subclínica oligossintomática. Os dois métodos imunológicos usados simultaneamente com o exame clínico permitiram a identificação de 5 perfis clínico-imunológicos: Infecção Assintomática (IA) 73,4%; Infecção Subclínica Resistente(ISR) 15%; Infecção Subclínica Oligossintomática (ISO) 3%; Infecção Sintomática (IS=LVA) 3% e, Infecção Inicial Indeterminada (III) 5% / The dynamic of the human visceral leishmaniasis in the Amazon region is not well known and the incidence of the diseases in the last years have increase mainly in the Para state. The objectives the study were I) to identify individuals with symptomatic and/or asymptomatic infection due to Leishmania (L.) i. chagasi, II) to study the two types of infection, both clinically and immunologically, and III) to study the prevalence rate of infection. This was a cross-sectional study with a cohort of 946 individuals, of both sexes, with age from one year old onward, living in an endemic area of American Visceral Leishmaniasis (AVL), municipality of Barcarena, Pará State, Brazil. For the diagnosis of infection, the delayed hypersensitivity skin reaction (LST) and the indirect fluorescent antibody test (IFAT) were used. One hundred twenty cases of infection were diagnosed, with a prevalence rate of 12.6%; 8 cases showed high seroreactivity (1.280 to 10.240, IgG) in IFAT and no reaction in the LST; 4 cases being of typical AVL and other 4 cases of subclinical oligosymptomatic infection. The two immunological methods used simultaneously, with the clinical examination enabled to identify 5 clinical-immunological profiles: Asymptomatic Infection (AI) 73.4%; Subclinical Resistant Infection (SRI) 15%; Subclinical Oligosymptomatic Infection (SOI) 3%; Symptomatic Infection (SI=AVL) 3% and, Indeterminate Initial Infection (III) 5%

A dinâmica da leishmaniose visceral humana na Amazônia brasileira é pouco conhecida e nos últimos anos tem aumentado a incidência da doença principalmente no Estado do Pará. Os objetivos do estudo foram: I) identificar indivíduos com infecção sintomática e/ou assintomática por Leishmania (L.) infantum chagasi, II) estudar os dois tipos de infecção, tanto clínica quanto imunologicamente, e III) estudar a taxa de prevalência da infecção. O estudo foi de corte transversal com 946 indivíduos de ambos os sexos, com idade a partir de 1 ano, vivendo em área endêmica de leishmaniose visceral americana (LVA), município de Barcarena, Pará, Brasil. Para o diagnóstico da infecção, foram usadas a reação dérmica de hipersensibilidade retardada (Reação Intradérmica de Montenegro) - RIM e a Reação de Imunofluorêscencia Indireta (RIFI). Foram diagnosticados 120 casos de infecção com taxa de prevalência de 12.6%; 8 casos mostraram alta soro-reatividade (1.280 a 120.240) IgG utilizando-se o teste da RIFI e nenhuma reação na RIM; 4 casos foram típicos de LVA e outros 4 casos de infecção subclínica oligossintomática. Os dois métodos imunológicos usados simultaneamente com o exame clínico permitiram a identificação de 5 perfis clínico-imunológicos: Infecção Assintomática (IA) 73,4%; Infecção Subclínica Resistente(ISR) 15%; Infecção Subclínica Oligossintomática (ISO) 3%; Infecção Sintomática (IS=LVA) 3% e, Infecção Inicial Indeterminada (III) 5% / The dynamic of the human visceral leishmaniasis in the Amazon region is not well known and the incidence of the diseases in the last years have increase mainly in the Para state. The objectives the study were I) to identify individuals with symptomatic and/or asymptomatic infection due to Leishmania (L.) i. chagasi, II) to study the two types of infection, both clinically and immunologically, and III) to study the prevalence rate of infection. This was a cross-sectional study with a cohort of 946 individuals, of both sexes, with age from one year old onward, living in an endemic area of American Visceral Leishmaniasis (AVL), municipality of Barcarena, Pará State, Brazil. For the diagnosis of infection, the delayed hypersensitivity skin reaction (LST) and the indirect fluorescent antibody test (IFAT) were used. One hundred twenty cases of infection were diagnosed, with a prevalence rate of 12.6%; 8 cases showed high seroreactivity (1.280 to 10.240, IgG) in IFAT and no reaction in the LST; 4 cases being of typical AVL and other 4 cases of subclinical oligosymptomatic infection. The two immunological methods used simultaneously, with the clinical examination enabled to identify 5 clinical-immunological profiles: Asymptomatic Infection (AI) 73.4%; Subclinical Resistant Infection (SRI) 15%; Subclinical Oligosymptomatic Infection (SOI) 3%; Symptomatic Infection (SI=AVL) 3% and, Indeterminate Initial Infection (III) 5%

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O princ?pio de transdu??o foi a Resson?ncia de Pl?smons de Superf?cie (SPR) e o sensor foi produzido atrav?s da imobiliza??o covalente de ant?genos sol?veis de Leishmania infantum sobre Monocamada Auto-Organizada (SAM) do ?cido 11-Mercaptoundecan?ico (11-MUA) ativado pela mistura contendo 100,0 mmol.L-1 de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e 150 mmol.L-1 de N-hidroxisuccinimida (NHS). Atrav?s das t?cnicas de Voltametria C?clica e Redu??o Dessortiva por Voltametria de Pulso Diferencial o processo de forma??o da SAM foi otimizado. Sob condi??es otimizadas, 1,0 mmol.L-1 da solu??o etan?lica de 11-MUA e 24 horas foram suficientes para a forma??o de uma SAM est?vel sobre a superf?cie de ouro. Para obten??o de informa??es complementares da SAM, foram realizados c?lculos da Cobertura de Superf?cie, Constante Diel?trica e Espessura do tiol adsorvido no substrato de ouro. Ap?s esta etapa, a adi??o de ant?genos sol?veis de L. infantum sobre a SAM foi acompanhada por SPR. As t?cnicas de Voltametria C?clica e Espectroscopia de Imped?ncia Eletroqu?mica foram usadas para caracterizar a imobiliza??o do ant?geno. Ap?s constru??o do imunosensor, foram adicionados em sua superf?cie soros caninos positivos para Leishmaniose Visceral, evidenciando varia??o significativa no ?ngulo de SPR, mostrando excelente sensibilidade da t?cnica para detec??o da intera??o ant?geno-anticorpo. Por outro lado, a adi??o dos soros negativos n?o foi acompanhada com resposta significativa, concluindo-se tamb?m que o imunosensor apresentou boa especificidade contra anticorpos anti-L. infatum. Portanto, neste trabalho foi desenvolvido com sucesso um sensor empregando SPR para detec??o em tempo real de anticorpos anti-L. infatum, apresentando grande perspectiva como sistema de sensoriamento da Leishmaniose Visceral em ?reas end?micas. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2012. / ABSTRACT In this work, the development of an immunosensor for detection of anti-Leishmania infantum antibodies was performed. The principle of transduction used was the Surface Plasmon Resonance (SPR) and the sensor was constructed by covalent immobilization of soluble antigens of Leishmania infantum on self-assembled monolayers (SAMs) of 11-mercaptoundecanoic acid (11-MUA) which was activated by the mixture 100.0 mmol.L-1 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 150 mmol.L-1 N-hidroxisuccinimide (NHS). Cyclic Voltammetry and Dessortive Reduction by Differential Pulse Voltammetry techniques were employed in monitoring of SAM formation. Under optimized conditions, 1.0 mmol.L-1 of the 11-MUA in ethanolic solution and 24 hours were sufficient for the formation of a stable SAM on the gold surface. To obtain further information about the SAM, the Surface Coverage, Dielectric Constant and Thickness of the thiol film adsorbed on gold substrate were performed. After this step, the addition of soluble antigens?of L.?infantum?on the?SAM?was monitored?by SPR. Cyclic Voltammetry and Electrochemical Impedance Spectroscopy techniques were employed in characterization of antigen immobilization. After construction of immunosensor, positive canine serum for Visceral Leishmaniasis were added on its surface showing significant variation in the SPR angle, indicating excellent sensitivity of the technique for?antigen-antibody interaction detection. On the other hand, the addition of negative serum was not accompanied with a significant response, demonstrating that the immunosensor shows excellent specificity against anti-L infantum antibodies. Therefore, this work shows a successfully development of a SPR sensor for anti-L. infatum antibodies detection in real time, showing a great perspective as a sensing system of Visceral Leishmaniasis in endemic regions.

Considerando o grave quadro das doenças negligenciadas, no Brasil e no mundo, e as limitações do tratamento empregado, na atualidade, torna-se urgente a pesquisa de novos fármacos, que sejam mais ativos e seguros. Para tanto, a busca de moléculas-protótipo, a partir de espécies vegetais, tem sido importante estratégia. Neste contexto, foi realizado o estudo de Annona crassiflora Mart. (Annonaceae), cujos alcalóides totais (AT) demonstraram promissora atividade antiprotozoária in vitro, em estudo anterior. Em paralelo, outras espécies de Annona mostraram atividade antimicobacteriana in vitro, igualmente, tendo motivado o presente estudo. Cinco das vinte frações alcaloídicas obtidas, por cromatografia em coluna, a partir dos AT das folhas, apresentaram atividade anti-Leishmania in vitro, tendo causado 100% de morte das formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi. Além disto, três delas foram ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis. O isolamento de dois alcalóides noraporfínicos foi realizado, por fracionamento biomonitorado em coluna cromatográfica, seguido de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa. As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas empregando-se as análises espectroscópicas de ressonância magnética nuclear, mono e bidimensionais, e por CLAE acoplada à espectrometria de massas (CLAEIES-EM2). Um dos alcalóides foi identificado pela primeira vez, nesta espécie, sendo que o outro apresentou estrutura inédita. Ambos demonstraram significativa atividade anti-Leishmania in vitro (CE50&#8804; 10 &#181; g/ mL) frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. O primeiro teve maior índice de seletividade (IS: 7,4), em relação à citotoxicidade em células do tecido conjuntivo NCTC Clone 929 de camundongos. Frente ao Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) e ao M. smegmatis (ATCC 35798), os alcalóides isolados foram inativos (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). O óleo volátil das folhas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas (CG-EM), tendo sido identificados 41 constituintes, prevalecendo os sesquiterpenos (81,7%) em relação aos monoterpenos (0,8%). Entre os compostos majoritários encontrados no óleo, citam-se os sesquiterpenos &#945;-amorfeno (43,6%), E-cariofileno (17,7%) e o germacreno (5,3%). Nos testes de atividade anti-Leishmania in vitro frente às formas promastigotas de quatro espécies do parasita, o óleo foi mais ativo em L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25,97 &#181;g/ mL). Nas formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi mostrou atividade 8,5 vezes superior àquela do fármaco-padrão benznidazol (CE50: 5,31 &#181;g/ mL). Os resultados obtidos ratificaram a importância da prospecção da flora, em particular de A. crassiflora, como fonte potencial de compostos bioativos, que venham a constituir novos fármacos, como alternativa à restrita terapêutica existente para o tratamento das doenças negligenciadas. / Neglected diseases are a serious health problem in Brazil and worldwide. The available drugs are limited in effectiveness with a high toxicity. There is an urgent need of more safe and bioactive compounds. The search of new molecules from plant species is a well known and important strategy to achieve this goal. In a previous work, Annona crassiflora Mart. (Annonaceae) showed a promising antiprotozoal activity. Beside this, other Annona species presented an interesting antimicobacterial action. In this bio-guided study, after the column fractionation of the leaves total alkaloids, in vitro tests were performed and five from twenty fractions were highly active (100% deaths) against promastigotes of Leishmania (L.) infantum chagasi, and only three were active against Mycobacterium tuberculosis. After purification of the bioactive fractions, two noraporphine alkaloids were isolated by HPLC and identified by the usual mono and bidimensional spectroscopic techniques. One of them was isolated from the first time from this species. The other one is a novel chemical entity. Both compounds presented anti- Leishmania activity (CE50 &#8804; 10 &#181;g/ mL) against L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. The first one showed a higher selectivity index (SI: 7.4) considering its mice connective tissue cells toxicity [NCTC Clone 929]. However, both were inactive against Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) and M. smegmatis (ATCC 35798) (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). In the leaves volatile oil 41 compounds were identified. The sesquiterpenes were in majority (81.7%), followed by monoterpenes (0.8%). The sesquiterpenes &#945;-amorphene (43.6%), E-caryophyllene (17.7%) and germacrene (5.3%) were the main constituents. The oil was little effective against the four tested Leishmania species and slightly more active against L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25.97 &#181;g/ mL). However, it was highly active against the trypomastigotes of Trypanosoma cruzi (CE50: 5.31 &#181;g/ mL) showing to be 8.5 times more active than benznidazol. These results stimulate a deeper investigation of those alkaloids as antiprotozoal agents, confirming the importance of the plant species metabolites as a source of new bioactive molecules and their potential as future drugs.

Considerando o grave quadro das doenças negligenciadas, no Brasil e no mundo, e as limitações do tratamento empregado, na atualidade, torna-se urgente a pesquisa de novos fármacos, que sejam mais ativos e seguros. Para tanto, a busca de moléculas-protótipo, a partir de espécies vegetais, tem sido importante estratégia. Neste contexto, foi realizado o estudo de Annona crassiflora Mart. (Annonaceae), cujos alcalóides totais (AT) demonstraram promissora atividade antiprotozoária in vitro, em estudo anterior. Em paralelo, outras espécies de Annona mostraram atividade antimicobacteriana in vitro, igualmente, tendo motivado o presente estudo. Cinco das vinte frações alcaloídicas obtidas, por cromatografia em coluna, a partir dos AT das folhas, apresentaram atividade anti-Leishmania in vitro, tendo causado 100% de morte das formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi. Além disto, três delas foram ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis. O isolamento de dois alcalóides noraporfínicos foi realizado, por fracionamento biomonitorado em coluna cromatográfica, seguido de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa. As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas empregando-se as análises espectroscópicas de ressonância magnética nuclear, mono e bidimensionais, e por CLAE acoplada à espectrometria de massas (CLAEIES-EM2). Um dos alcalóides foi identificado pela primeira vez, nesta espécie, sendo que o outro apresentou estrutura inédita. Ambos demonstraram significativa atividade anti-Leishmania in vitro (CE50&#8804; 10 &#181; g/ mL) frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. O primeiro teve maior índice de seletividade (IS: 7,4), em relação à citotoxicidade em células do tecido conjuntivo NCTC Clone 929 de camundongos. Frente ao Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) e ao M. smegmatis (ATCC 35798), os alcalóides isolados foram inativos (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). O óleo volátil das folhas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas (CG-EM), tendo sido identificados 41 constituintes, prevalecendo os sesquiterpenos (81,7%) em relação aos monoterpenos (0,8%). Entre os compostos majoritários encontrados no óleo, citam-se os sesquiterpenos &#945;-amorfeno (43,6%), E-cariofileno (17,7%) e o germacreno (5,3%). Nos testes de atividade anti-Leishmania in vitro frente às formas promastigotas de quatro espécies do parasita, o óleo foi mais ativo em L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25,97 &#181;g/ mL). Nas formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi mostrou atividade 8,5 vezes superior àquela do fármaco-padrão benznidazol (CE50: 5,31 &#181;g/ mL). Os resultados obtidos ratificaram a importância da prospecção da flora, em particular de A. crassiflora, como fonte potencial de compostos bioativos, que venham a constituir novos fármacos, como alternativa à restrita terapêutica existente para o tratamento das doenças negligenciadas. / Neglected diseases are a serious health problem in Brazil and worldwide. The available drugs are limited in effectiveness with a high toxicity. There is an urgent need of more safe and bioactive compounds. The search of new molecules from plant species is a well known and important strategy to achieve this goal. In a previous work, Annona crassiflora Mart. (Annonaceae) showed a promising antiprotozoal activity. Beside this, other Annona species presented an interesting antimicobacterial action. In this bio-guided study, after the column fractionation of the leaves total alkaloids, in vitro tests were performed and five from twenty fractions were highly active (100% deaths) against promastigotes of Leishmania (L.) infantum chagasi, and only three were active against Mycobacterium tuberculosis. After purification of the bioactive fractions, two noraporphine alkaloids were isolated by HPLC and identified by the usual mono and bidimensional spectroscopic techniques. One of them was isolated from the first time from this species. The other one is a novel chemical entity. Both compounds presented anti- Leishmania activity (CE50 &#8804; 10 &#181;g/ mL) against L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. The first one showed a higher selectivity index (SI: 7.4) considering its mice connective tissue cells toxicity [NCTC Clone 929]. However, both were inactive against Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) and M. smegmatis (ATCC 35798) (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). In the leaves volatile oil 41 compounds were identified. The sesquiterpenes were in majority (81.7%), followed by monoterpenes (0.8%). The sesquiterpenes &#945;-amorphene (43.6%), E-caryophyllene (17.7%) and germacrene (5.3%) were the main constituents. The oil was little effective against the four tested Leishmania species and slightly more active against L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25.97 &#181;g/ mL). However, it was highly active against the trypomastigotes of Trypanosoma cruzi (CE50: 5.31 &#181;g/ mL) showing to be 8.5 times more active than benznidazol. These results stimulate a deeper investigation of those alkaloids as antiprotozoal agents, confirming the importance of the plant species metabolites as a source of new bioactive molecules and their potential as future drugs.