A dinâmica da leishmaniose visceral humana na Amazônia brasileira é pouco conhecida e nos últimos anos tem aumentado a incidência da doença principalmente no Estado do Pará. Os objetivos do estudo foram: I) identificar indivíduos com infecção sintomática e/ou assintomática por Leishmania (L.) infantum chagasi, II) estudar os dois tipos de infecção, tanto clínica quanto imunologicamente, e III) estudar a taxa de prevalência da infecção. O estudo foi de corte transversal com 946 indivíduos de ambos os sexos, com idade a partir de 1 ano, vivendo em área endêmica de leishmaniose visceral americana (LVA), município de Barcarena, Pará, Brasil. Para o diagnóstico da infecção, foram usadas a reação dérmica de hipersensibilidade retardada (Reação Intradérmica de Montenegro) - RIM e a Reação de Imunofluorêscencia Indireta (RIFI). Foram diagnosticados 120 casos de infecção com taxa de prevalência de 12.6%; 8 casos mostraram alta soro-reatividade (1.280 a 120.240) IgG utilizando-se o teste da RIFI e nenhuma reação na RIM; 4 casos foram típicos de LVA e outros 4 casos de infecção subclínica oligossintomática. Os dois métodos imunológicos usados simultaneamente com o exame clínico permitiram a identificação de 5 perfis clínico-imunológicos: Infecção Assintomática (IA) 73,4%; Infecção Subclínica Resistente(ISR) 15%; Infecção Subclínica Oligossintomática (ISO) 3%; Infecção Sintomática (IS=LVA) 3% e, Infecção Inicial Indeterminada (III) 5% / The dynamic of the human visceral leishmaniasis in the Amazon region is not well known and the incidence of the diseases in the last years have increase mainly in the Para state. The objectives the study were I) to identify individuals with symptomatic and/or asymptomatic infection due to Leishmania (L.) i. chagasi, II) to study the two types of infection, both clinically and immunologically, and III) to study the prevalence rate of infection. This was a cross-sectional study with a cohort of 946 individuals, of both sexes, with age from one year old onward, living in an endemic area of American Visceral Leishmaniasis (AVL), municipality of Barcarena, Pará State, Brazil. For the diagnosis of infection, the delayed hypersensitivity skin reaction (LST) and the indirect fluorescent antibody test (IFAT) were used. One hundred twenty cases of infection were diagnosed, with a prevalence rate of 12.6%; 8 cases showed high seroreactivity (1.280 to 10.240, IgG) in IFAT and no reaction in the LST; 4 cases being of typical AVL and other 4 cases of subclinical oligosymptomatic infection. The two immunological methods used simultaneously, with the clinical examination enabled to identify 5 clinical-immunological profiles: Asymptomatic Infection (AI) 73.4%; Subclinical Resistant Infection (SRI) 15%; Subclinical Oligosymptomatic Infection (SOI) 3%; Symptomatic Infection (SI=AVL) 3% and, Indeterminate Initial Infection (III) 5%

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-03-22T19:38:42Z No. of bitstreams: 1 FranciscoCanindeDeSousaJunior_TESE.pdf: 1665223 bytes, checksum: a3c9c1fa573d5e42243d0808e537d798 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-03-28T19:44:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 FranciscoCanindeDeSousaJunior_TESE.pdf: 1665223 bytes, checksum: a3c9c1fa573d5e42243d0808e537d798 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-28T19:44:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FranciscoCanindeDeSousaJunior_TESE.pdf: 1665223 bytes, checksum: a3c9c1fa573d5e42243d0808e537d798 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / O crescente interesse e aplica??es dos produtos biotecnol?gicos v?m aumentando o desenvolvimento de novos processos de recupera??o e purifica??o de prote?nas. A adsor??o em leito expandido (ALE) tem se destacado como uma t?cnica promissora para essa finalidade, pois combina em uma ?nica opera??o as etapas de clarifica??o, concentra??o e purifica??o da prote?na alvo, reduzindo assim tempo e custos de opera??o. Neste contexto, o objetivo desta tese foi avaliar a recupera??o e purifica??o do ant?geno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli M15 e a remo??o de endotoxina por ALE. Na primeira etapa do trabalho foram realizados ensaios em taques agitados sob a forma de dois planejamentos experimentais, para definir as condi??es ?timas de adsor??o e elui??o do ant?geno na resina Streamline chelating. Nos ensaios de adsor??o usando o leito na forma expandida empregou-se uma coluna de 2,6 cm de di?metro por 30,0 cm de altura, acoplada a uma bomba perist?ltica. Na segunda etapa do trabalho, avaliou-se a remo??o de endotoxina durante o processo de recupera??o do ant?geno, empregando o tensoativo n?oi?nico triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Na terceira etapa, buscou-se elaborar um modelo matem?tico capaz de prever as curvas de ruptura do ant?geno 503 em coluna na forma expandida. Os resultados do planejamento experimental para adsor??o do ant?geno 503 mostraram o pH 8,0 e a concentra??o de NaCl de 2,4 M como melhores condi??es de adsor??o. No segundo planejamento, o ?nico fator significativo para elui??o foi a concentra??o de imidazol, definida em 600 mM. A isoterma de adsor??o do ant?geno 503 mostrou bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores de qmax (capacidade m?xima de adsor??o) e Kd (constante de equil?brio) estimados foram de 1,95 mg/g e 0,34 mg/mL, respectivamente. Atrav?s dos testes de purifica??o diretamente do homogeneizado n?o clarificado obteve-se uma recupera??o de 59,2% da prote?na de interesse e um fator de purifica??o de 6,0. A adi??o do tensoativo n?o-i?nico Triton X-114 ? etapa de lavagem da ALE proporcionou altos valores (>99%) de remo??o do LPS inicialmente presente nas amostras para todas as condi??es estudadas. O modelo matem?tico obtido para descrever a curva de ruptura do ant?geno 503 na resina Streamline Chelanting em leito expandido apresentou bom ajuste aos dados experimentais, tanto para etapa de estimativa de par?metros quanto para de valida??o. O modelo validado foi utilizado na otimiza??o das efici?ncias, obtendo-se os valores m?ximos de efici?ncia do processo e efici?ncia da coluna de 89,2% e 75,9%, respectivamente. Portanto, ALE mostrou ser uma alternativa eficiente na recupera??o da prote?na-alvo e remo??o de endotoxina a partir de um extrato de E. coli n?o clarificado em apenas uma etapa. / The growing interest and applications of biotechnology products have increased the development of new processes for recovery and purification of proteins. The expanded bed adsorption (EBA) has emerged as a promising technique for this purpose. It combines into one operation the steps of clarification, concentration and purification of the target molecule. Hence, the method reduces the time and the cost of operation. In this context, this thesis aim was to evaluate the recovery and purification of 503 antigen of Leishmania i. chagasi expressed in E. coli M15 and endotoxin removal by EBA. In the first step of this study, batch experiments were carried out using two experimental designs to define the optimal adsorption and elution conditions of 503 antigen onto Streamline chelating resin. For adsorption assays, using expanded bed, it was used a column of 2.6 cm in diameter by 30.0 cm in height coupled to a peristaltic pump. In the second step of study, the removal of endotoxin during antigen recovery process was evaluated employing the non-ionic surfactant Triton X-114 in the washing step ALE. In the third step, we sought developing a mathematical model able to predict the 503 antigen breakthrough curves in expanded mode. The experimental design results to adsorption showed the pH 8.0 and the NaCl concentration of 2.4 M as the optimum adsorption condition. In the second design, the only significant factor for elution was the concentration of imidazole, which was taken at 600 mM. The adsorption isotherm of the 503 antigen showed a good fit to the Langmuir model (R = 0.98) and values for qmax (maximum adsorption capacity) and Kd (equilibrium constant) estimated were 1.95 mg/g and 0.34 mg/mL, respectively. Purification tests directly from unclarified feedstock showed a recovery of 59.2% of the target protein and a purification factor of 6.0. The addition of the non-ionic surfactant Triton X-114 to the washing step of EBA led to high levels (> 99%) of LPS removal initially present in the samples for all conditions tested. The mathematical model obtained to describe the 503 antigen breakthrough curves in Streamline Chelanting resin in expanded mode showed a good fit for both parameter estimation and validation steps. The validated model was used to optimize the efficiencies, achieving maximum values of the process and of the column efficiencies of 89.2% and 75.9%, respectively. Therefore, EBA is an efficient alternative for the recovery of the target protein and removal of endotoxin from an E. coli unclarified feedstock in just one step.

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Aparecida Sperança / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, São Bernardo do Campo, 2018. / A leishmaniose compreende um grupo de doenças zoonóticas causadas por protozoários da família Trypanosoma e do gênero Leishmania, sendo transmitida por vetores flebotomíneos. O género Leishmania compreende 30 espécies, incluindo 20 espécies capazes de causar doença em humanos, com diferentes manifestações clínicas, que vão desde lesões assintomáticas, cutânea e mucocutânea, até a forma visceral grave, que é letal se não tratada. No continente americano, a leishmaniose visceral (LV) é causada por Leishmania infantum chagasi e o Brasil concentra 90% dos casos registrados na América Latina. O diagnóstico da LV na América apresenta dificuldades devido a reações cruzadas com outras tripanossomíases endêmicas. Além disso, os sinais clínicos e as alterações hematológias da LV são encontrados em outras doenças infecciosas e em alterações malignas hematológicas. Com o intuito de buscar ferramentas e estratégias para o diagnóstico diferencial da LV, neste trabalho foram desenvolvidos métodos de isolamento e detecção molecular de L. infantum chagasi, além da busca por características demográficas específicas e avaliação do diagnóstico diferencial da LV em aspirados de medula óssea de pacientes com sintomas de doença hematológica da região de Marília-SP, no período de 2010 a 2017. O método de isolamento de L. infantum chagasi foi realizado a partir de amostras de medula óssea e sangue periférico de indivíduos sintomáticos. O diagnóstico molecular por reação em cadeia da polimerase, convencional, foi desenvolvido utilizando como alvo o gene de cópia única que codifica a enzima quitinase de L. infantum, o qual permite o diagnóstico específico e direto a partir de diferentes amostras clínicas. Os testes apresentaram elevada especificidade e mostraram sensibilidade aumentada quando comparados com métodos utilizados rotineiramente nos serviços de saúde. Os resultados da análise demográfica e do diagnóstico diferencial a partir de aspirados de medula óssea de pacientes com suspeita de doenças hematológicas indicaram que 19,4% apresentaram LV, e que a população com maior risco possui menos de 20 anos. O estudo realizado demonstra que a investigação de LV em pacientes com alterações hematológicas é fundamental não só para identificar casos de LV, mas também para tratar corretamente os casos de doenças infecciosas e hematológicas associadas. / Leishmaniasis covers a group of zoonotic diseases caused by protozoa parasites of the Trypanosoma Family and the genus Leishmania, being transmitted by phlebotomine insect vectors. The genus Leishmania comprises 30 species, including 20 species capable of causing disease in humans, with different clinical manifestations, ranging from asymptomatic, cutaneous and mucocutaneous lesions, to severe visceral form, which is lethal if untreated. In the American continent, visceral leishmaniasis (VL) is caused by Leishmania infantum chagasi and Brazil accounts for 90% of the Latin America registered cases. The diagnosis of VL in America presents difficulties due to cross-reactions with other endemic trypanosomiasis. In addition, clinical signs and VL hematological alterations are found in other infectious diseases and hematological malignancies. In order to search for tools and strategies for the differential VL diagnosis, in this work we have developed methods of isolation and molecular detection of L. infantum chagasi, as well as the search for specific demographic characteristics and evaluation of the differential diagnosis of VL in bone marrow biopsies of patients with symptoms of haematological diseases in the region of Marília-SP, from 2010 to 2017. The method of L. infantum chagasi isolation was performed from samples of bone marrow and peripheral blood of symptomatic individuals. Conventional polymerase chain reaction (PCR) was developed using the single copy gene encoding the chitinase enzyme of L. infantum, which allows specific and direct diagnosis from different clinical samples. Both diagnostic tests showed high specificity and increased sensitivity when compared with routinely used methods in health services. The results of the demographic analysis and the differential diagnosis from bone marrow biopsy of patients with supposed hematological diseases indicated that 19.4% had VL, and that the population with the highest risk is less than 20 years old. The present study demonstrates that the investigation of VL in patients with hematological alterations is fundamental not only to identify cases of VL but also to correctly treat cases of VL associated infectious and hematological diseases.

Introdução: As leishmanioses são doenças que se apresentam como um sério obstáculo ao desenvolvimento socioeconômico. A leishmaniose visceral americana (LVA) tem como agente etiológico a Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, como reservatório doméstico principal o cão e os vetores são flebotomíneos (Diptera:Psychodidae). Objetivo: investigar a vulnerabilidade do município de São Paulo para a ocorrência de LVA, utilizando os parâmetros de casos humanos notificados, presença do vetor e infecção em reservatórios domésticos. Método: A área de estudo compreende a região dos distritos administrativos do Anhanguera, Jaraguá e Perus (município de São Paulo) que incluem o Parque do Anhanguera e o Parque estadual do Jaraguá. A justificativa para o estudo nessa área é o eixo viário oeste-leste de expansão da LVA no estado de São Paulo. Foram levantados notificações humanas de LVA entre os anos de 2007 a 2014, para análise espacial pelos programas SaTScan e Terra View, num total de 140 e nenhuma dessas é considerada autóctone. Realizamos levantamento entomológico nos parques Anhanguera e Jaraguá. A análise estatística foi realizada pelos cálculos da Média geométrica de Williams, pelo índice de diversidade de Shannon-Weaver (H) e a dominância pelo índice de Pielou (J) também foi calculado o índice de Abundância de espécies padronizado (IAEP). Realizamos inquérito canino amostral e obtivemos 126 amostras de sangue canino que foram submetidas aos testes EIE. Foram colhidas amostras de Swab bucal do cão sororreagente e contactantes, as quais foram analisadas por PCR (RFLP), juntamente ás amostras de coágulos sanguíneos dos cães dos parques Anhanguera e Jaraguá num total de 31 amostras. Resultado: A análise espacial mostrou Clusters nos distritos do Brás e Guaianases (p<0,05) e, a espaço temporal em Raposo Tavares e Parelheiros (p<0,05). Os distritos do Carrão, Cachoeirinha e José Bonifácio formaram clusters secundários (p>0,05). Foram capturados 3660 espécimes de flebotomíneos identificadas 16 espécies de flebotomíneos e as mais frequentes na amostra foram: Pintomyia fischeri (82,46 por cento ), Psathyromyia pascalei (5,57 por cento ), Migonemyia migonei (5.25 por cento ) e Expapillata firmatoi (3.22 por cento ). Dentre as espécies capturadas, está uma fêmea de espécie similar à Lutzomyia longipalpis. O inquérito canino sorológico apontou um sororreagente no distrito de Perus. Do total de 31 amostras analisadas por PCR, 10 foram positivas para Leishmania sp. Foi possível chegar á espécie em seis delas, três positivas para a espécie L. (V.) shawi ou L (V.) lainsoni e três para L. (L.) infantum chagasi. Conclusões: A análise espacial das notificações de LVA humana dá direcionamento para investigações de uma possível transmissão autóctone no município. Há elos epidemiológicos que sugerem que as leishmanioses tegumentar e visceral caninas se tratam de doenças emergentes no município. Possivelmente, os casos caninos encontrados na região de estudo sejam parte da disseminação do eixo oeste-leste da leishmaniose visceral no Estado de São Paulo, pelo eixo viário. Palavras-chave: Leishmaniose visceral canina; Leishmaniose tegumentar. / Introduction: The leishmaniases are diseases which are a serious obstacle to social economic development. American visceral leishmaniasis (AVL) has Leishmania (Leishmania) infantum chagasi as its etiological agent, the domestic dog is its main reservoir and sand flies (Diptera, Psychodidae) its vectors. Objective: to investigate the vulnerability of São Paulo municipality to the occurrence of AVL, using the parameters of notified human cases, the presence of the vector and infection in domestic reservoirs. Method: The study area covers the region of the distinct administrative districts of Anhanguera, Jaraguá and Perus (São Paulo municipality) which include the Parque do Anhanguera and the Parque Estadual do Jaraguá. The reason for undertaking the study in this area is the existence of the roads linking the west and east of São Paulo state along which AVL has expanded eastwards. A survey was made of the 140 human cases (none of which was considered autochthonous) of AVL notified from 2007 to 2014, for the spatial analysis of the SaTScan and Terra View programs. An entomological survey was conducted in the two parks mentioned. The statistical analyses of the insects were undertaken using Williams geometrical means, Shannon-Weavers diversity index (H), Pielous evenness index (J) and the standardized species abundance index (SSAI). A canine sampling inquiry was conducted and 126 blood samples were submitted to the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) test. A total of five samples of mouth swabs of the serum positive dog and four of its contacts and also blood clot samples of a total of 26 dogs from the two parks were analyzed by PCR (RFLP). Results: The spatial analysis showed clusters in the Brás and Guaianases (p<0.05) districts and the temporal/spatial analysis in Raposo Tavares and Parelheiros (p<0.05) districts. The Carrão, Cachoeirinha and José Bonifácio districts formed secondary clusters (p>0.05). A total of 3,660 specimens of sand flies were collected, representing 16 species, Pintomyia fischeri (82.46 per cent ), Psathyromyia pascalei (5.57 per cent ), Migonemyia migonei (5.25 per cent ) and Expapillata firmatoi (3.22 per cent ) being the most frequent. One female of a species similar to Lutzomyia longipalpis was captured. The canine serological enquiry showed one reagent in the Perus district. Of the total of 31 samples analyzed by PCR, 10 were positive for Leishmania sp., among which six were identified, three as species L. (V.) shawi/L (V.) lainsoni and three as L. (L.) infantum chagasi. Conclusions: The spatial analysis of the AVL human cases notified suggests the direction to be followed for future investigation of a possible autochthonous transmission in the municipality. There are epidemiological links which suggest that the canine cutaneous and visceral leishmaniases are emergent diseases in the municipality. Possibly the canine cases of visceral leishmaniasis found in this study region are part of its dissemination along the west-east axis of the diseases expansion in the state of São Paulo along the highways.

Introdução: As leishmanioses são doenças que se apresentam como um sério obstáculo ao desenvolvimento socioeconômico. A leishmaniose visceral americana (LVA) tem como agente etiológico a Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, como reservatório doméstico principal o cão e os vetores são flebotomíneos (Diptera:Psychodidae). Objetivo: investigar a vulnerabilidade do município de São Paulo para a ocorrência de LVA, utilizando os parâmetros de casos humanos notificados, presença do vetor e infecção em reservatórios domésticos. Método: A área de estudo compreende a região dos distritos administrativos do Anhanguera, Jaraguá e Perus (município de São Paulo) que incluem o Parque do Anhanguera e o Parque estadual do Jaraguá. A justificativa para o estudo nessa área é o eixo viário oeste-leste de expansão da LVA no estado de São Paulo. Foram levantados notificações humanas de LVA entre os anos de 2007 a 2014, para análise espacial pelos programas SaTScan e Terra View, num total de 140 e nenhuma dessas é considerada autóctone. Realizamos levantamento entomológico nos parques Anhanguera e Jaraguá. A análise estatística foi realizada pelos cálculos da Média geométrica de Williams, pelo índice de diversidade de Shannon-Weaver (H) e a dominância pelo índice de Pielou (J) também foi calculado o índice de Abundância de espécies padronizado (IAEP). Realizamos inquérito canino amostral e obtivemos 126 amostras de sangue canino que foram submetidas aos testes EIE. Foram colhidas amostras de Swab bucal do cão sororreagente e contactantes, as quais foram analisadas por PCR (RFLP), juntamente ás amostras de coágulos sanguíneos dos cães dos parques Anhanguera e Jaraguá num total de 31 amostras. Resultado: A análise espacial mostrou Clusters nos distritos do Brás e Guaianases (p<0,05) e, a espaço temporal em Raposo Tavares e Parelheiros (p<0,05). Os distritos do Carrão, Cachoeirinha e José Bonifácio formaram clusters secundários (p>0,05). Foram capturados 3660 espécimes de flebotomíneos identificadas 16 espécies de flebotomíneos e as mais frequentes na amostra foram: Pintomyia fischeri (82,46 por cento ), Psathyromyia pascalei (5,57 por cento ), Migonemyia migonei (5.25 por cento ) e Expapillata firmatoi (3.22 por cento ). Dentre as espécies capturadas, está uma fêmea de espécie similar à Lutzomyia longipalpis. O inquérito canino sorológico apontou um sororreagente no distrito de Perus. Do total de 31 amostras analisadas por PCR, 10 foram positivas para Leishmania sp. Foi possível chegar á espécie em seis delas, três positivas para a espécie L. (V.) shawi ou L (V.) lainsoni e três para L. (L.) infantum chagasi. Conclusões: A análise espacial das notificações de LVA humana dá direcionamento para investigações de uma possível transmissão autóctone no município. Há elos epidemiológicos que sugerem que as leishmanioses tegumentar e visceral caninas se tratam de doenças emergentes no município. Possivelmente, os casos caninos encontrados na região de estudo sejam parte da disseminação do eixo oeste-leste da leishmaniose visceral no Estado de São Paulo, pelo eixo viário. Palavras-chave: Leishmaniose visceral canina; Leishmaniose tegumentar. / Introduction: The leishmaniases are diseases which are a serious obstacle to social economic development. American visceral leishmaniasis (AVL) has Leishmania (Leishmania) infantum chagasi as its etiological agent, the domestic dog is its main reservoir and sand flies (Diptera, Psychodidae) its vectors. Objective: to investigate the vulnerability of São Paulo municipality to the occurrence of AVL, using the parameters of notified human cases, the presence of the vector and infection in domestic reservoirs. Method: The study area covers the region of the distinct administrative districts of Anhanguera, Jaraguá and Perus (São Paulo municipality) which include the Parque do Anhanguera and the Parque Estadual do Jaraguá. The reason for undertaking the study in this area is the existence of the roads linking the west and east of São Paulo state along which AVL has expanded eastwards. A survey was made of the 140 human cases (none of which was considered autochthonous) of AVL notified from 2007 to 2014, for the spatial analysis of the SaTScan and Terra View programs. An entomological survey was conducted in the two parks mentioned. The statistical analyses of the insects were undertaken using Williams geometrical means, Shannon-Weavers diversity index (H), Pielous evenness index (J) and the standardized species abundance index (SSAI). A canine sampling inquiry was conducted and 126 blood samples were submitted to the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) test. A total of five samples of mouth swabs of the serum positive dog and four of its contacts and also blood clot samples of a total of 26 dogs from the two parks were analyzed by PCR (RFLP). Results: The spatial analysis showed clusters in the Brás and Guaianases (p<0.05) districts and the temporal/spatial analysis in Raposo Tavares and Parelheiros (p<0.05) districts. The Carrão, Cachoeirinha and José Bonifácio districts formed secondary clusters (p>0.05). A total of 3,660 specimens of sand flies were collected, representing 16 species, Pintomyia fischeri (82.46 per cent ), Psathyromyia pascalei (5.57 per cent ), Migonemyia migonei (5.25 per cent ) and Expapillata firmatoi (3.22 per cent ) being the most frequent. One female of a species similar to Lutzomyia longipalpis was captured. The canine serological enquiry showed one reagent in the Perus district. Of the total of 31 samples analyzed by PCR, 10 were positive for Leishmania sp., among which six were identified, three as species L. (V.) shawi/L (V.) lainsoni and three as L. (L.) infantum chagasi. Conclusions: The spatial analysis of the AVL human cases notified suggests the direction to be followed for future investigation of a possible autochthonous transmission in the municipality. There are epidemiological links which suggest that the canine cutaneous and visceral leishmaniases are emergent diseases in the municipality. Possibly the canine cases of visceral leishmaniasis found in this study region are part of its dissemination along the west-east axis of the diseases expansion in the state of São Paulo along the highways.