A leptospirose é uma zoonose de importância mundial, causada por leptospiras patogênicas. Aproximadamente 5 a 10% das infecções humanas cursam com a forma grave. A Doença de Weil é a forma mais comum de doença grave e pode apresentarse com duas formas de evolução, aguda progressiva monofásica ou de curso prolongado. A doença grave se caracteriza por uma combinação de hemorragia, mais comumente pulmonar, icterícia e insuficiência renal, com letalidade de 5 a 15%. O rim é um órgão muito acometido na Leptospirose. Clinicamente o envolvimento renal ocorre de 16 a 40%, com manifestações peculiares como poliúria, hipocalemia, e perda de sódio. A disfunção tubular renal, é característica da leptospirose forma grave, com envolvimento dos transportadores renais de sódio ao longo do néfron, levando às manifestações observadas. A terapêutica antimicrobiana é recomendada na Leptospirose, porém com controvérsias à sua indicação após o quarto dia de doença. Quando da instalação da lesão não haveria benefícios com a utilização de antibióticos. O tratamento pode diminuir a morbidade e letalidade, assim como interferir no envolvimento renal e na expressão dos transportadores renais de sódio. A patogênese pode estar relacionada a efeitos diretos da leptospira ou a resposta inflamatória assim como o estresse oxidativo. A utilização de antioxidantes, pode ser considerada como terapia adjuvante. Nós avaliamos a expressão no túbulo proximal do trocador Na+-H+ (NHE3) e na porção espessa da medula ascendente o cotransportador Na+-K+-2Cl- (NKCC2), no modelo de hamster com as duas formas de evolução de doença grave, mimetizando a doença de humanos realizados em dois experimentos. Os experimentos envolveram animais infectados não tratados e tratados com ampicilina associado ou não ao antioxidante, N-acetilcisteína. A presença de antígenos de Leptospira e a expressão dos transportadores foram avaliadas por imunohistoquímica, e o ácido tiobarbitúrico, marcador de estresse oxidativo, (TBARS) foi quantificado.Hamsters infectados, apresentaram altas quantidades de antígenos nos tecidos-alvo, enquanto que a expressão de ambos os transportadores apresentou-se diminuída. O tratamento com ampicilina esteve associado com mínima detecção ou ausência de antígenos, restabelecimento da expressão dos transportadores nos respectivos locais e redução dos níveis de TBARS. O tratamento precoce e tardio com ampicilina restabeleceu os defeitos tubulares na leptospirose forma grave em ambos experimentos, sem benefícios com a utilização da N-acetilcisteína. / Leptospirosis is a zoonosis of worldwide distribution. About 5-10% of all human infections presents with severe forms. Weil\'s syndrome, the most common presentation of severe forms of leptospirosis, may courses either as a single monophasic disease or as a disease with prolonged course, characterized by a combination of hemorrhage, particularly in the lung, renal failure, and jaundice, with fatality rates ranging from 5 to 15%. The kidney is an important target organ in leptospiral infection. Clinically, renal involvement in leptospirosis occurs in 16% to 40% of cases and is unique because of the atypical presentation of polyuria, hypokalemia, and sodium wasting, suggestive of a special form of tubular dysfunction related to the major renal sodium transporters expressed along the nephron. A wide range of antimicrobial therapy for leptospirosis was described and benefits have been disputed for cases with more than four days of clinical disease, because after a threshold of leptospiremia, the delayed use of antibiotics is unlikely to reduce fatality. Antimicrobial therapy is thought to interfere on fatality, renal involvement, and renal sodium transporters expression during severe disease. The pathogenesis may be related to direct effects of leptospiral compounds or inflammatory response due to oxidative stress. Antioxidant could be considered for adjunctive therapy.We evaluated the expression of proximal tubule type 3 Na+/H+ exchanger (NHE3) and thick ascending limb Na+-K+-2Cl- cotransporter (NKCC2) in infected non treated and treated hamsters reproducing the two forms of clinical human presentations of Weil\'s syndrome divided in two experiments. Animals were treated or not with ampicillin and/or N-acetyl-cysteine (NAC). Leptospiral antigen/s and expression of renal transporters were evaluated by immunohistochemistry, and serum thiobarbituric acid (TBARS) was quantified. Infected hamsters had high amounts of detectable leptospiral antigen/s in target tissues while renal expression of NHE3 and NKCC2 decreased. Ampicillin treatment was associated with minimal or no detection of leptospiral antigens, normal expression of NHE3 and NKCC2 transporters, and reduced levels of TBARS. Early and late ampicillin treatment rescued tubular defects in leptospirosis severe disease in both experiments, and there was no evidence of benefit from antioxidant therapy.

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Resumo: A leptospirose é uma zoonose de grande impacto mundial na saúde animal e saúde pública. Esta doença tem como agente infeccioso as espiroquetas do gênero Leptospira spp., com espécies patogênicas e não patogênicas. Em animais de produção como os bovinos o quadro clínico manifesta-se geralmente com falhas reprodutivas, como abortos e infertilidade, ocasionando prejuízo econômico nas fazendas, além de representar risco à saúde dos trabalhadores que lidam direta ou indiretamente com os animais. Com o intuito de avaliar o estado sanitário da leptospirose nos bovinos reprodutores de centrais de receptoras de embrião e fazendas de cria da região de Bauru, foram analisadas 400 amostras de sangue e soro destes animais mediante os seguintes testes diagnósticos: cultura em meio de Fletcher, técnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM) e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR). Os resultados indicaram todas as culturas negativas à visualização de formas espiroquetideas. Porém, a análise sorológica mediante SAM, indicou soroprevalência de 83% (331/400); sendo que o sorovares mais frequentes pertencem ao sorogrupo Sejroe (Hardjoprajitno (71,6%), HardjoCTG (62,8%), Wolffi (60,1%) e Hardjo (45,6%). Á PCR de sangue, encontraram-se três (0,7%, 3/400) animais positivos, os quais foram negativos à SAM, indicando estarem na fase aguda da doença. À PCR do sêmen, encontraram-se três (8,1%, 3/37) animais positivos, indicando a probabilidade de transmissão sexual de leptospirose nas fazendas de cria.... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leptospirosis is a worlwide zoonosis of great impact in animal and public health. The etiological agent of this disease are spirochetes of genus Leptospira spp., classified in pathogenic and nonpathogenic species. In farm animals, such as cattle, the clinical presentation involves reproductive failure, like abortion and infertility, causing economical loses in farms, furthermore represents a health risk for workers who keep direct or indirect contact with these animals. Aiming to evaluate the sanitary state of leptospirosis in reproductive cattle of enbryo receptors centers and meet cattle farms of Bauru, 400 blood samples were analysed with three diagnostic tests: Cultured in Fletcher medium, Microagglutination test (MAT) and Polymerase Chain Reaction (PCR). Results shown all cultures negative to visualization of spirochetes forms. However, serological analysis indicated a prevalence of 83% (331/400), with greater frequency of serovars from serogroup Sejroe (Hardjoprajitno (71.6%), HardjoCTG (62.8%) and Hardjo (45. 6%)). Blood PCR showed three (0.7%, 3/400) positive animals, who were also negative to MAT, concluding they were in the acute phase of the disease. PCR of semen showed three (8.1%, 3/37) positive animals, suggesting the chance of leptospirosis´ sexual transmission in the meet farms evaluated. High percentage of positive animals to serogroup Sejroe in MAT, as to the high titles observed, showed concordance to several other studies performed in cattle from Brazil a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-08-30T12:51:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_andre_alex_grassmann.pdf: 4530859 bytes, checksum: 5ae8d428fc82e0464179c0d4fc50987b (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:12:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_andre_alex_grassmann.pdf: 4530859 bytes, checksum: 5ae8d428fc82e0464179c0d4fc50987b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:12:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_andre_alex_grassmann.pdf: 4530859 bytes, checksum: 5ae8d428fc82e0464179c0d4fc50987b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T19:12:54Z (GMT). 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Em hospedeiros suscetíveis, as leptospiras patogênicas se espalham no organismo resultando em uma doença febril com icterícia, seguida de falência renal, hepática e cardíaca, que com frequência leva à morte. A vacinação é a abordagem profilática mais efetiva contra a leptospirose. A bacterina é a única vacina licenciada, sendo usada em todo o mundo para algumas espécies animais, enquanto o uso em humanos é permitido em apenas alguns poucos países. A razão para isso é a resposta imune de curta duração e sorovar-específica induzida por essa vacina, que apresenta ainda, efeitos colaterais adversos. Vários esforços para desenvolver uma vacina recombinante protetora contra diferentes sorovares e com resposta de longa duração, falharam. O pouco conhecimento sobre os fatores de virulência e a patogênese de Leptospira spp. são as principais razões para o lento avanço na descoberta de antígenos protetores. Esta tese apresenta várias abordagens diferentes de estudos em leptospirose na tentativa de acrescentar ao conhecimento acerca da doença e seu agente etiológico: O cenário atual de desenvolvimento de novas vacinas contra a leptospirose é devidamente revisado. Uma nova cepa virulenta de L. interrogans isolada de um cão com leptospirose aguda foi caracterizada e pode ser utilizada em experimentos de infecção em modelo animal, ou, ainda, para o entendimento de mecanismos de virulência. Foi desenvolvido um protocolo para obtenção de leptospiras adaptadas ao hospedeiro, através do cultivo destes organismos dentro de Câmaras de Membrana de Diálise (DMC) implantadas na cavidade peritoneal de ratos. Este protocolo foi utilizado para identificar, a partir do sequenciamento de RNA total (RNA-seq), genes relacionados com as mudanças sofridas pela Leptospira spp. para se adaptar ao hospedeiro durante a infecção, novos fatores de virulência e seleção de alvos para mutagênese. Finalmente, uma via alternativa para infecção de hamsters por L. interrogans virulenta foi descrita, mimetizando a entrada natural pela via transcutânea de leptospiras no hospedeiro. Esta metodologia pode substituir a injeção intraperitoneal de leptospiras. Juntos, estes achados representam um progresso substancial no campo de estudo da leptospirose e possivelmente irão contribuir para a descoberta futura de antígenos protetores para utilização no desenvolvimento de vacinas aperfeiçoadas contra leptospirose. / Leptospirosis is a widespread neglected tropical zoonotic disease responsible for at least 873,000 human cases and 49,000 deaths each year globally. The causative agent belongs to the genus Leptospira, a unique and genetically and antigenically diverse group of spirochetes divided into nine pathogenic species, 24 serogroups and more than 250 serovars. Leptospires can infect virtually any mammalian species. Rodents can carry spirochetes in their renal tubules and shed large numbers in their urine, the main source of leptospires for new infections. In susceptible hosts, pathogenic leptospires spread throughout the body, resulting in a febrile icteric illness, followed by renal, hepatic and cardiac failure that can lead to death. Vaccination is the most effective approach for leptospirosis prophylaxis. Bacterins are the only licensed vaccines, and are used worldwide in certain animals, however, human vaccination is approved in only a few countries. The reason for this is that the vaccine induces a serovar specific, short-term immune response that has several adverse side effects. Efforts to develop a new recombinant vaccine with long-term, cross-protective immunity have failed. The lack of knowledge of Leptospira spp. virulence factors and pathogenesis is the main reason for the slow progress in the discovery of protective antigens. This thesis describes several different approaches in leptospirosis studies in an attempt to improve understanding of the disease and its causative agent: The current scenario of leptospirosis vaccine development is comprehensively reviewed. A new L. interrogans virulent strain isolated from a dog presenting with acute leptospirosis was characterized and can be used for experimental infections in animal models, or for understanding virulence mechanisms. A protocol to obtain host-adapted leptospires cultivated within Dialysis Membrane Chambers (DMC) implanted in rat peritoneum was developed. This protocol was applied to the identification, by total RNA sequencing (RNA-seq), of several genes related to the changes that leptospires undergo during adaptation to infection, new virulence determinants and selection of targets for mutagenesis. Finally, an alternative route of infection of hamsters by virulent L. interrogans is described, mimicking the natural transcutaneous entry of leptospires into the host. This methodology could replace the intraperitoneal injection of leptospires. Together, these findings represent substantial progress in the field of leptospirosis, possibly contributing to the future discovery of protective antigens for the development of improved vaccines against leptospirosis.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-07T15:33:57Z No. of bitstreams: 1 Acidalia Claudino Machado.pdf: 1261012 bytes, checksum: b14728c52e587b92663812a40c6b23a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-07T15:33:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Acidalia Claudino Machado.pdf: 1261012 bytes, checksum: b14728c52e587b92663812a40c6b23a8 (MD5) Previous issue date: 2013-02-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The aim of the present study was to characterize the epidemiological situation and spatial distribution of Leptospira spp. infection of small ruminants in the Agreste and Sertão regions of the state of Pernambuco (Brazil). The search for antibodies was conducted with 902 animals (476 goats and 426 sheep), which were at least a year old, on 23 separate properties. The microscopic agglutination test (MAT) was applied, using 23 pathogenic serovars of Leptospira spp. as antigens. The cutoff point used was 1:100. A standardized investigative questionnaire was used to study the risk factors. This questionnaire contained objective questions for the breeder related to the general characteristics of the property, as well as reproduction and sanitary conditions on the property. Of the 902 samples analyzed, 213 (23.6% C.I. 20.9% - 26.5%) were positive, which included 27.3% (130/476 C.I 23.4% - 31.6%) of goats and 19.5% (83/426 C.I. 15.9% - 23.6%) of sheep. The most common serovars were Autumnalis (54.1%), Icterohaemorrhagiae (15.0%) and Copenhageni (10.8%) among goats and Autumnalis (32.4%), Icterohaemorrhagiae (14.0%) and Castellonis (9.8%) among sheep. The most widespread serovar was Autumnalis in goats and Icterohaemorrhagiae in sheep. There was at least one positive animal (from one or both species) on all of the properties. In total, 87.5% (14/16) of the properties were considered to contain foci associated with goats. This figure was 92.8% (13/14) for sheep. It was possible to identify areas of a greater density of foci, which were higher risk areas, such as the Sertão for goats and three of the micro-regions studied for sheep. In terms of the risk factors, significant differences were found for the gender of goats (OR=0.40; C.I. 0.18 – 0.88) and sheep (OR=0.38; C.I. 0.14 – 0.99), the breeding system used (OR=2.03; C.I. 1.07 – 3.84), the type of herd (OR=2.28; C.I. 1.39 – 3.72), an absence of rats in food (OR=0.55; C.I. 0.34 – 0.91) and restricted surface water (OR=0.60; C.I. 0.37 – 0.99) for sheep. Many factors can affect the occurrence of leptospirosis in herds of small ruminants in the Agreste and Sertão regions of Pernambuco. Health education and employee training programs related to prevention and control methods for leptospirosis and other infectious diseases could help to reduce the number of infections and consequently, the economic losses caused by this disease. / Objetivou-se com este estudo caracterizar a situação epidemiológica da infecção por Leptospira spp. em pequenos ruminantes nas mesoregiões Agreste e do Sertão do Estado de Pernambuco, Brasil. O inquérito soro-epidemiológico foi realizado em 902 animais (476 caprinos e 426 ovinos) com idade superior a um ano, em 23 propriedades. Utilizou-se a técnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM), empregando-se 23 sorovares patogênicos de Leptospira spp. como antígenos; o ponto de corte utilizado foi 1:100. Para o estudo de fatores de risco aplicou-se um questionário investigativo padronizado, constituído por perguntas objetivas ao criador, referentes às características gerais da propriedade, ao manejo produtivo, reprodutivo e sanitário. Das 902 amostras analisadas, 213 (23,6%; I.C. 20,9% - 26,5%) foram positivas, sendo 27,3% (130/476; I.C. 23,4% - 31,6%) caprinos e 19,5% (83/426; I.C. 15,9% - 23,6%) ovinos. Os sorovares mais prevalentes em caprinos foram Autumnalis (54,1%), Icterohaemorrhagiae (15,0%) e Copenhageni (10,8%), enquanto nos ovinos foram Autumnalis (32,4%), Icterohaemorrhagiae (14,0%) e Castellonis (9,8%). Houve maior dispersão do sorovar Autumnalis em caprinos e do Icterohaemorrhagiae em ovinos. Em relação ao número de focos, observou-se que para a espécie caprina 87,5% (14/16) das propriedades foram consideradas focos, enquanto para ovinos foram 92,8% (13/14). Foi possível ainda identificar áreas de maior densidade de focos, apontadas como de maior risco, sendo para caprinos o Sertão e para ovinos as três microrregiões estudadas. Quanto aos fatores de risco, foram observadas diferenças significativas entre sexo para caprinos (OR=0,40; I.C. 0,18 – 0,88) e ovinos (OR=0,38; I.C. 0,14 – 0,99); sistema de criação (OR=2,03; I.C. 1,07 – 3,84), tipo de rebanho (OR=2,28; I.C. 1,39 – 3,72), ausência do acesso de ratos a ração (OR=0,55; I.C. 0,34 – 0,91) e restrição a águas de superfície (OR=0,60; I.C. 0,37 – 0,99) para a espécie ovina. São múltiplos os fatores que podem influenciar a ocorrência da leptospirose nos rebanhos de pequenos ruminantes do Agreste e do Sertão de Pernambuco. A implantação de programas de educação em saúde e o treinamento da mão de obra em métodos de prevenção e controle da leptospirose e outras doenças infecciosas podem ser úteis na redução dos casos de infecção e na minimização das perdas econômicas causadas por esta enfermidade.

A proteção induzida por uma vacina comercial anti-leptospirose importada, bivalente produzida com estirpes de referência dos sorovares Icterohaemorrhagiae e Canicola, foi comparada a promovida por uma bacterina experimental, bivalente produzida com as estirpes autóctones M64/06 e LO-4, respectivamente dos sorovares Copenhageni e Canicola, isoladas no Brasil e tipificadas com anticorpos monoclonais produzidos pelo Royal Tropical Institut, Laboratório de Referência da Organização Mundial de Saúde. O ensaio foi conduzido pelo teste de potência com desafio em hamsters. A vacina experimental, bivalente foi inativada com fenol a 37%, ajustada para concentração de 108 leptospiras por mL, por sorovar e produzida nas versões com e sem adjuvante hidróxido de alumínio a 0,15%. Os hamsters foram imunizados com 0,25 mL de vacina, via subcutânea em duas aplicações com 15 dias de intervalo. Os desafios foram efetuados com as estirpes LO4 (Canicola) ou L1-130 (Copenhageni) isoladas no Brasil, respectivamente nas diluições de 10-3 e 10-1 no volume de 0,5 mL via intraperitoneal por animal, 15 dias após a última dose da vacina. A estirpe de desafio do sorovar Copenhageni foi caracterizada, por anticorpos monoclonais, como idêntica a M64/06 e foi escolhida devido a apresentar melhor regularidade em termos de patogenicidade para os hamsters. Decorridos 20 dias do desafio os hamsters sobreviventes foram eutanasiados em câmara de CO2, necropsiados e nos seus rins foi efetuada a pesquisa do estado de portador de leptospiras por cultivo em meio de Fletcher. Nos desafios efetuados com a estirpe autóctone, L1-130 do sorovar Copenhageni foi obtida a proteção contra a doença clínica em oito de dez animais, para as duas vacinas experimentais, no entanto, entre os sobreviventes, houve portadores renais de leptospiras, em maior número para a vacina sem adjuvante (n=5), quando comparado a vacina acrescida de Al(OH)3, (n=3); para a vacina comercial a proteção foi total, tanto contra a doença como quanto a infecção não havendo qualquer morte por leptospirose e todos os cultivos renais dos sobreviventes foram negativos para leptospiras. Nos desafios efetuados com a estirpe autóctone, LO4 do sorovar Canicola, a proteção conferida pelas três vacinas ensaiadas foi total, não havendo mortes por leptospirose e todos os sobreviventes apresentaram resultados negativos para leptospiras nos cultivos de tecido renal. Os números de DL50 empregadas nos inóculos de desafio foram superiores a 10.000, para os dois sorovares ensaiados, pois na titulação dos inóculos morreram mais do que 50% dos animais até a última diluição testada. Foi, portanto, demonstrado a existência de proteção cruzada entre os sorovares Copenhageni e Icterohaemorrhagiae e que a bacterina importada foi capaz de induzir proteção contra a doença e contra a infecção para estirpes de leptospiras autóctones dos sorovares Canicola e Copenhageni isoladas no Brasil. Nos desafios efetuados com o sorovar Canicola a vacina experimental induziu proteção contra a doença e contra a infecção, mas nos que empregaram o sorovar Copenhageni houve proteção apenas contra a doença, constatando-se menor número de portadores renais de leptospiras entre os animais imunizados com a bacterina experimental acrescida do adjuvante de hidróxido de alumínio. / The protection induced by an imported commercial bivalent anti-leptospirosis vaccine produced with the reference strain of the serovars Icterohaemorrhagiae and Canicola was compared to one promoted by an experimental, bivalent bacterial vaccine produced with the indigenous strains M64/06 and LO-4, respectively of the serovars Copenhageni and Canicola isolated in Brazil and typified with monoclonal antibodies produced by the Royal Tropical Institut, Reference Laboratory of the World Health Organization. The assay was conducted by using the potency test with challenge in hamsters. The experimental bivalent vaccine was inactivated with 37% phenol and adjusted at a concentration of 108 leptospires/mL, for each serovar and produced in the versions with and without adjuvant (0.15% aluminium hydroxide). The hamsters were immunized by 0.25 mL of vaccine, by subcutaneous route in two applications with 15 days of interval. Fifteen days after receiving the last dose of the vaccine, the challenges were performed by employing the strains LO4 (Canicola) or L1-130 (Copenhageni), which were isolated in Brazil, respectively at the dilution of 10-3 and 10-1, in the volume of 0.5 mL/each animal by the intraperitoneal route. The challenge strain serovar Copenhageni has been characterized as identical to M64/06 strain by means of monoclonal antibodies and it was chosen due to its better regularity in terms of pathogenicity determined in hamsters. After 20 days of the challenge, the surviving hamsters were sacrificed in CO2 chamber, submitted to necropsy and the kidneys were examined to test the carrier state of leptospires by cultivation in Fletcher\'s medium. In the challenges effectuated with the indigenous strain, L1-130 of the serovar Copenhageni the protection was obtained against the clinical disease in eight of ten animals, for two experimental vaccines, however, among the survivors, there were renal carriers of leptospires, in higher number for the vaccine without containing the adjuvant (n=5), when compared to the one added with Al (OH) (n=3). For the commercial vaccine, the protection was total both against the disease and as for infection, when no death was found in consequence of leptospirosis and all the renal cultures of the survivors were negative for leptospires. In the challenges performed with the indigenous strain LO4 of the serovar Canicola, the protection conferred by the three vaccines tested was total, without observing any deaths due to leptospirosis and all the survivors presented negative culturing results for leptospires in the renal tissue. The challenge doses of the inocula were superior to 10,000 LD50, for the two serovars tested, since in the titration of the inocula have died more than 50 % of the animals up to the last tested dilution. So, the crossed protection existing between the serovars Copenhageni and Icterohaemorrhagiae was demonstrated and that the imported bacterial vaccine was able to induce protection against the disease and against the infection for the native strains of leptospires serovars Canicola and Copenhageni isolated in Brazil. In the challenges effectuated with the serovar Canicola, the experimental vaccine induced protection against the disease and against the infection, but in vaccine employing the serovar Copenhageni, protection was found only against the disease, when less number of renal carriers of leptospires was observed among the animals immunized with the experimental vaccine added with the aluminium hydroxide adjuvant.

A leptospirose é a zoonose mais disseminada no mundo e uma das principais causas de perda econômica no agronegócio. O estudo de novos antígenos de superfície de Leptospira interrogans, é intrigante e pode fornecer conhecimento na interação inicial patógeno-hospedeiro. Os genes LIC13059 e LIC10879, escolhidos por bioinformática, com predição de localização na superfície celular, foram clonados e as proteínas recombinantes expressas em E. coli, para avaliar a interação com componentes do hospedeiro. Após purificação, as proteínas encontravam-se estruturadas e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas recombinantes interagem com plasminogênio, fibrinogênio e laminina. rLIC13059, nomeada Lsa25.6, quando ligada ao fibrinogênio é capaz de inibir a formação de coágulo de fibrina e rLIC10879, nomeada Lsa16, interage com e-caderina, sugerido envolvimento na cascata de coagulação e ligação com o hospedeiro, respectivamente. O plasminogênio ligado às proteínas é convertido em plasmina, o que poderia ajudar a penetração bacteriana no hospedeiro. / Leptospirosis is the most widespread zoonosis and also a major cause of economic loss in animal production worldwide. The study of new surface antigens of Leptospira interrogans is intriguing and may shed light into the initial pathogen-host interactions. We set out to study two novel coding sequences LIC13059 and LIC10879 predicted to be located at the cell surface. The genes were cloned and the recombinant proteins were expressed in E. coli. The purified recombinant proteins presented secondary structures, and interacted with plasminogen, fibrinogen and laminin human components. rLIC13059, named Lsa25.6, when bound to fibrinogen was capable of inhibiting the formation of fibrin clot, while rLIC10879, named Lsa16, interacted with e-cadherin, a mammalian cell receptor, suggesting participation in coagulation pathway and host-cell binding, respectively. The plasminogen captured by both recombinant proteins could be converted into plasmin, a mechanism that could help bacterial penetration in the host.

La leptospirose constitue un réel problème de santé publique en Nouvelle-Calédonie et dans les autres collectivités Françaises du Pacifique. Reconnue depuis de nombreuses années comme une pathologie majeure (avec une incidence dépassant parfois les 100 cas pour 100,000 habitants), elle est une pathologie infectieuse endémique de premier plan qui connait une recrudescence et un caractère épidémique lors des années à forte pluviométrie. Cette maladie a été étudiée de façon historique à l'Institut Pasteur de Nouvelle-Calédonie (IPNC), qui a ainsi développé les outils utiles à son diagnostic et à son étude et acquis au cours des années une expertise reconnue sur cette maladie. Du fait du caractère zoonotique et environnemental de cette maladie, une approche multifactorielle de son étude est mise en place à l'IPNC, et s'articule autour de 3 axes, répondant à 3 constats : L'épidémiologie et l'écologie de cette maladie humaine et animale comportant une large composante environnementale demeurent insuffisamment connues, notamment en Nouvelle-Calédonie. Leur description a longtemps été basée sur une taxonomie strictement sérologique, actuellement obsolète et dont l'avènement de la génétique moléculaire a mis en évidence de nombreuses limites. Dans le cadre d'un site pilote, mais aussi en collaboration avec les acteurs de l'élevage, l'éco-épidémiologie de la leptospirose en Nouvelle-Calédonie est revisitée avec une approche moléculaire. Les critères pronostiques manquent fréquemment aux cliniciens pour différencier, lors d'une leptospirose nécessitant une prise en charge hospitalière, les cas graves de ceux qui évolueront rapidement vers une guérison. Du fait du tableau de choc septique fréquemment observé dans les leptospiroses sévères, il est possible que des indicateurs pronostiques du choc septique aient également une application dans le cadre de la leptospirose. A la suite de travaux sur modèle animal sensible, des critères biologiques à valeur pronostiques seront évalués dans des cas de leptospirose hospitalisés en Nouvelle-Calédonie. Enfin, le diagnostic clinique de leptospirose est délicat, du fait de la diversité des formes cliniques et la confirmation par le diagnostic biologique, nécessaire, est complexe et demande des techniques spécialisées. En contraste, l'accès à ces techniques spécialisées n'est que rarement offert aux régions ou aux zones où l'incidence de la leptospirose est la plus élevée. Notre troisième volet d'étude concerne la mise au point puis la validation d'un test de diagnostic rapide, de type bandelette, qui permettrait la détection d'antigènes de leptospires pathogènes dans les liquides biologiques. Parallèlement, la mise en place du diagnostic biologique de leptospirose dans plusieurs instituts du Réseau International des Instituts Pasteur s'efforcera de documenter la présence de la leptospirose dans des régions où elle n'est pas décrite, ou de mieux évaluer son impact réel sur la santé publique de ces régions.

Mestre -- Escola Nacional de Saude Publica, Rio de Janeiro, 2001.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-11-11Bitstream added on 2014-06-13T18:44:25Z : No. of bitstreams: 1 arduino_ggc_dr_jabo.pdf: 1086799 bytes, checksum: 087abbf6d5907c0059a4db75a0b3028d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No presente estudo, 100 fêmeas bovinas foram divididas em cinco tratamentos de 20 animais cada. Os grupos experimentais receberam quatro diferentes vacinas comerciais (B, C, D e E), e um grupo permaneceu como controle. Amostras foram colhidas no dia da aplicação da primeira dose e nos dias 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 120, 150 e 180 pós-vacinação (pv). A triagem dos animais foi feita pela análise sorológica com 24 antígenos de leptospiras, escolhendo-se os animais não reagentes. Os títulos de anticorpos foram monitorados pela soroaglutinação microscópica (SAM) com os sorovares Canicola, Grippotyphosa, Hardjo, Icterohaemorrhagiae, Pomona e Wolffi. Todas as vacinas induziram, aos 3 dias pv, títulos de anticorpos aglutinantes para os sorovares Hardjo e Wolffi, que persistiram até o 150o dia pv. Os sorovares Hardjo e Wolffi induziram os maiores títulos de anticorpos aglutinantes. A vacina D, apesar de não possuir o sorovar Wolffi em sua composição, foi capaz de induzir anticorpos aglutinantes contra este sorovar. Somente foram detectados anticorpos contra o sorovar Canicola nos animais vacinados com a bacterina D. A vacina que induziu os maiores títulos médios de anticorpos, considerando todos os sorovares testados, foi a D. Há a necessidade de melhoria no poder imunogênico e na concentração dos sorovares utilizados como antígenos nas vacinas comerciais. / In this research 100 heifers were used, divided in 5 groups of 20 animals each. The four experimental groups were vaccinated using distinct commercial polyvalent bacterines: A, B, C and D, and a group was the control. Samples were collected at the days 0, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 42, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 120, 150 and 180 from the first injection of the vaccine. The selection of the animals for the experimental groups was done based on a serological screening with 24 antigens of Leptospira sp., constituted by non-reagent animals. The vaccine titres were monitored using the microscopic agglutination test (MAT) for Canicola, Grippotyphosa, Hardjo, Icterohaemorrhagiae, Pomona and Wolffi serovars. All vaccines used were capable to product agglutinins for the Hardjo and Wolffi serovars observed at 3 days after vaccination, remaining until the 150th day; these serovars induced the highest titres of agglutinins. The vaccine D, in spite of not containing the Wolffi serovar, was able to induce the production of agglutinins to this serovar. Agglutinins to the Canicola serovar were only observed in the animals vaccinated with the D bacterine. The vaccine D induced the highest average titres of antibodies to all serovars tested. The improvement of the immunogenic power and serovars concentration utilized as antigens of the commercial vaccines are necessary.

Submitted by Mayara Nascimento (mayara.nascimento@ufba.br) on 2017-06-22T10:24:10Z No. of bitstreams: 1 2017.06.17_Dissertacao_Nivison.pdf: 11864411 bytes, checksum: a479ab92d8893463bed31d083c4e01f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Reis (vanessa.jamile@ufba.br) on 2017-06-29T11:25:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017.06.17_Dissertacao_Nivison.pdf: 11864411 bytes, checksum: a479ab92d8893463bed31d083c4e01f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T11:25:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017.06.17_Dissertacao_Nivison.pdf: 11864411 bytes, checksum: a479ab92d8893463bed31d083c4e01f4 (MD5) / A leptospirose é uma doença febril aguda, negligenciada, que atinge populações de diversas regiões tropicais do planeta. São aproximadamente 1 milhão de casos anuais de leptospirose no mundo, sendo que 5-15% destes casos podem desenvolver a forma grave, alcançando quase 60.000 óbitos. As principais causas que levam a óbito os indivíduos doentes por leptospirose com as mesmas características clínicas dos sobreviventes ainda não foram identificadas. No entanto, estudos recentes indicam que a resposta imunológica difere entre indivíduos sobreviventes e mortos. A técnica de microarranjos em amostras de pacientes hospitalizados com desfechos de cura e óbito tem sido utilizada com a finalidade de identificar possíveis associações dos genes ao desfecho clínico. Isso demanda tempo por parte dos especialistas para analisarem a expressão gênica. Adicionalmente, os riscos de erro humano na análise empregada estimulam ainda mais a adoção de técnicas computadorizadas para o auxílio destas atividades. Neste sentido, o presente trabalho propôs o desenvolvimento de modelos de predição baseado em dados clínicos e epidemiológicos para auxiliar no diagnóstico da leptospirose. Uma metodologia para análise do conjunto completo de expressão gênica foi proposta com o intuito de predizer o desfecho clínico. Os resultados obtidos foram avaliados como relevantes por especialistas e podem contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o tratamento de casos graves da leptospirose. Assim, os modelos resultantes deste trabalho podem auxiliar os profissionais de saúde na rotina diária do hospital, especialmente em áreas endêmicas de leptospirose, acelerando o tratamento e minimizando a exacerbação e mortalidade da doença.