Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-10-18T13:53:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISS-VERSAO FINAL-OK.pdf: 8391072 bytes, checksum: a71d220f51e51349aa9d91fb4e8c2ece (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-10-18T13:53:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISS-VERSAO FINAL-OK.pdf: 8391072 bytes, checksum: a71d220f51e51349aa9d91fb4e8c2ece (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-18T13:53:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISS-VERSAO FINAL-OK.pdf: 8391072 bytes, checksum: a71d220f51e51349aa9d91fb4e8c2ece (MD5) Previous issue date: 2018-05-25 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work aimed at to analyze the relationship among the disposition of the urban solid residues in the city of Manaus and the process health-disease identifying, like this, the unfoldings of the inadequate discard of the residues and their aspects socioambientais, as well as his/her influence on the morbosity in the city, specifically, considering the attack of the leptospirose. The analysis was developed under the perspective urban socioambiental, considering the multiple facets involved in the process, because, it understands each other that the genesis of the problems socioambientais is harnessed, mainly, but no exclusive, to the urban life way, which expressed the inequalities in the extent of the cities marked by the disparities in the distribution of income, service and disposition of the public services of sanitation and health. The data compiled for analysis in this research were obtained in several sources, being, mainly, collected in IBGE, SINAN and DATASUS, among which it worked her the variables of income, education, notifications and internments for leptospirose, sanitation, among others. Descriptive statistical techniques were used for analysis and construction of the indicators socioambientais. Starting from that, it identified the space panorama in that it is the environmental sanitation in the city of Manaus and the process health-disease of the leptospirose. Among the cartographic representations presented in this research the map synthesis of the conditions of environmental sanitation is had in the city of Manaus, that analyzed, jointly, to the map of internments for leptospirose, it demonstrated that it leaves of the population, it is hostage of his/her location in the city of Manaus. The most vulnerable areas to the attack of the pathology analyzing the incidence of internments of the disease for city of Manaus was the neighborhoods of the areas south, west, as well as the area east, regarding the total of cases of internments was the neighborhoods of the areas north and east of Manaus. Those areas also presented the most expressive indexes of inadequate conditions of sanitation environmental as exposed in the map synthesis of the conditions of sanitation for city, it was also observed that those areas of the city possess smaller index of income and education. Therefore, it is necessary the development of effective public politics considering the exposed needs in the city of Manaus, as the exclusion, segregation and inequalities identified socioambientais. / Este trabalho objetivou analisar a relação entre a disposição dos resíduos sólidos urbanos na cidade de Manaus e o processo saúde-doença identificando, assim, os desdobramentos do descarte inadequado dos resíduos e seus aspectos socioambientais, assim como sua influência sobre a morbidade na cidade, especificamente, considerando o acometimento da leptospirose. A análise foi desenvolvida sob a perspectiva socioambiental urbana, considerando as múltiplas facetas envolvidas no processo, pois, entende-se que a gênese dos problemas socioambientais está atrelada, principalmente, mas não exclusiva, ao modo de vida urbano, o qual expressa as desigualdades no âmbito das cidades marcadas pelas disparidades na distribuição de renda, atendimento e disposição dos serviços públicos de saneamento e saúde. Os dados compilados para análise nesta pesquisa foram obtidos em diversas fontes, sendo, principalmente, coletados no IBGE, SINAN e DATASUS, dentre as quais se trabalhou as variáveis de renda, educação, notificações e internações por leptospirose, saneamento, entre outras. Foram utilizadas técnicas estatísticas descritivas para análise e construção dos indicadores socioambientais. A partir disso, identificou-se o panorama espacial em que se encontra o saneamento ambiental na cidade de Manaus e o processo saúde-doença da leptospirose. Dentre as representações cartográficas apresentadas nesta pesquisa tem-se o mapa síntese das condições de saneamento ambiental na cidade de Manaus, que analisado, conjuntamente, ao mapa de internações por leptospirose, demonstrou que parte da população, encontra-se refém da sua localização na cidade de Manaus. As áreas mais vulneráveis ao acometimento da patologia analisando a incidência de internações da doença para cidade de Manaus foram os bairros das zonas sul, oeste, assim como a zona leste, com relação ao total de casos de internações foram os bairros das zonas norte e leste de Manaus. Essas áreas também apresentaram os índices mais expressivos de condições inadequadas de saneamento ambiental conforme exposto no mapa síntese das condições de saneamento para cidade, também se observou que essas zonas da cidade possuem menor índice de renda e escolaridade. Portanto, é necessário o desenvolvimento de políticas públicas eficazes considerando as necessidades expostas na cidade de Manaus, como a exclusão, segregação e desigualdades socioambientais identificadas.

Para relacionar possíveis variáveis para infecção pelos agentes N. caninum, B. abortus e Leptospira spp em rebanhos bovinos do Estado do Pará utilizando a frequência de anticorpos foram colhidas amostras de sangue de 3466 vacas provenientes de 176 propriedades, nas quais um questionário foi aplicado. A prova de RIFI foi utilizada para pesquisa de anticorpos anti-N.caninum; a prova de triagem do AAT seguida pela SAL e 2-ME como confirmatórias para pesquisa de anticorpos anti-B. abortus; e o método de SAM para pesquisar anticorpos contra Leptospira spp., utilizando uma bateria de 22 antígenos. As análises estatísticas foram realizadas pelas provas do Qui-quadrado (X2) e Mann-Whitney, com intervalo de confiança de 95%. A ocorrência de anticorpos anti-N. caninum, B. abortus e Leptospira spp. em bovinos foi de 14,7%, 3,7% e 65,5% em 87,4%, 41,3% e 98,8% das propriedades analisadas, respectivamente. O sorovar Hardjo foi o mais freqüente, seguido por Wolffi, Grippotyphosa e Hebdomadis, e o mais provável causador da infecção nos animais, seguido de Grippotyphosa, a associação Hardjo+Wolffi e a sorovariedade Wolffi. A presença de abortamentos foi associada à ocorrência de N.caninum (p<0,05), assim como a realização de inseminação artificial e o destino inadequado dos produtos de abortamento foram associados à ocorrência de anticorpos anti-B. abortus e a presença de cães, destino inadequado de vacas que abortaram e a inseminação artificial foram variáveis associadas à ocorrência das sorovariedades Hardjo, Grippotyphosa e Hebdomadis. Demonstrou-se a necessidade de um controle sanitário efetivo para neosporose e leptospirose e de mais estudos para determinar a causa da alta ocorrência do sorovar Grippotyphosa, que pode estar relacionada com a degradação ambiental / Aiming for association of possible infection variables with antibodies frequency of the agents N. caninum, B. abortus and Leptospira spp., 3466 female cattle from 176 herds were examined and a inquiry was applied. IFAT was used for research of antibodies against N. caninum; serum samples were examined for B. abortus antibodies using TAA trial test and SAA plus 2-ME for confirmation; and antibodies against Leptospira spp. were searched using MAT, with a 22 antigens battery. Statistical analysis were performed using Chi-Square (X2) and Mann-Whitney tests, with 95% confidence interval. Occurrence of antibodies against N. caninum, B. abortus and Leptospira spp. in cattle was 14,7%, 3,7% and 65,5% in 87,4%, 41,3% and 98,8% of analysed herds, respectively. Serovar Hardjo was the most frequent, followed by Wolffi, Grippotyphosa and Hebdomadis, and also most probable responsible for infection in animals, followed by Grippotyphosa, Hardjo+Wolffi association and serovar Wolffi. Occurrence of anti-N. caninum antibodies was associated with abortion presence (p<0,05), as artificial insemination and inappropriate destination of abortion products were linked with frequency of antibodies against B. abortus and occurrence of antibodies anti-Hardjo, Grippotyphosa and Hebdomadis was associated with dog presence, inappropriate destination of aborting cows and artificial insemination. It was demonstrated lack of sanitary control for neosporosis and leptospirosis and also necessity for more studies to determine causes for serovar Grippotyphosa high occurrence, condition that may be related with environmental destruction

A proteção induzida por uma vacina comercial anti-leptospirose importada, bivalente produzida com estirpes de referência dos sorovares Icterohaemorrhagiae e Canicola, foi comparada a promovida por uma bacterina experimental, bivalente produzida com as estirpes autóctones M64/06 e LO-4, respectivamente dos sorovares Copenhageni e Canicola, isoladas no Brasil e tipificadas com anticorpos monoclonais produzidos pelo Royal Tropical Institut, Laboratório de Referência da Organização Mundial de Saúde. O ensaio foi conduzido pelo teste de potência com desafio em hamsters. A vacina experimental, bivalente foi inativada com fenol a 37%, ajustada para concentração de 108 leptospiras por mL, por sorovar e produzida nas versões com e sem adjuvante hidróxido de alumínio a 0,15%. Os hamsters foram imunizados com 0,25 mL de vacina, via subcutânea em duas aplicações com 15 dias de intervalo. Os desafios foram efetuados com as estirpes LO4 (Canicola) ou L1-130 (Copenhageni) isoladas no Brasil, respectivamente nas diluições de 10-3 e 10-1 no volume de 0,5 mL via intraperitoneal por animal, 15 dias após a última dose da vacina. A estirpe de desafio do sorovar Copenhageni foi caracterizada, por anticorpos monoclonais, como idêntica a M64/06 e foi escolhida devido a apresentar melhor regularidade em termos de patogenicidade para os hamsters. Decorridos 20 dias do desafio os hamsters sobreviventes foram eutanasiados em câmara de CO2, necropsiados e nos seus rins foi efetuada a pesquisa do estado de portador de leptospiras por cultivo em meio de Fletcher. Nos desafios efetuados com a estirpe autóctone, L1-130 do sorovar Copenhageni foi obtida a proteção contra a doença clínica em oito de dez animais, para as duas vacinas experimentais, no entanto, entre os sobreviventes, houve portadores renais de leptospiras, em maior número para a vacina sem adjuvante (n=5), quando comparado a vacina acrescida de Al(OH)3, (n=3); para a vacina comercial a proteção foi total, tanto contra a doença como quanto a infecção não havendo qualquer morte por leptospirose e todos os cultivos renais dos sobreviventes foram negativos para leptospiras. Nos desafios efetuados com a estirpe autóctone, LO4 do sorovar Canicola, a proteção conferida pelas três vacinas ensaiadas foi total, não havendo mortes por leptospirose e todos os sobreviventes apresentaram resultados negativos para leptospiras nos cultivos de tecido renal. Os números de DL50 empregadas nos inóculos de desafio foram superiores a 10.000, para os dois sorovares ensaiados, pois na titulação dos inóculos morreram mais do que 50% dos animais até a última diluição testada. Foi, portanto, demonstrado a existência de proteção cruzada entre os sorovares Copenhageni e Icterohaemorrhagiae e que a bacterina importada foi capaz de induzir proteção contra a doença e contra a infecção para estirpes de leptospiras autóctones dos sorovares Canicola e Copenhageni isoladas no Brasil. Nos desafios efetuados com o sorovar Canicola a vacina experimental induziu proteção contra a doença e contra a infecção, mas nos que empregaram o sorovar Copenhageni houve proteção apenas contra a doença, constatando-se menor número de portadores renais de leptospiras entre os animais imunizados com a bacterina experimental acrescida do adjuvante de hidróxido de alumínio. / The protection induced by an imported commercial bivalent anti-leptospirosis vaccine produced with the reference strain of the serovars Icterohaemorrhagiae and Canicola was compared to one promoted by an experimental, bivalent bacterial vaccine produced with the indigenous strains M64/06 and LO-4, respectively of the serovars Copenhageni and Canicola isolated in Brazil and typified with monoclonal antibodies produced by the Royal Tropical Institut, Reference Laboratory of the World Health Organization. The assay was conducted by using the potency test with challenge in hamsters. The experimental bivalent vaccine was inactivated with 37% phenol and adjusted at a concentration of 108 leptospires/mL, for each serovar and produced in the versions with and without adjuvant (0.15% aluminium hydroxide). The hamsters were immunized by 0.25 mL of vaccine, by subcutaneous route in two applications with 15 days of interval. Fifteen days after receiving the last dose of the vaccine, the challenges were performed by employing the strains LO4 (Canicola) or L1-130 (Copenhageni), which were isolated in Brazil, respectively at the dilution of 10-3 and 10-1, in the volume of 0.5 mL/each animal by the intraperitoneal route. The challenge strain serovar Copenhageni has been characterized as identical to M64/06 strain by means of monoclonal antibodies and it was chosen due to its better regularity in terms of pathogenicity determined in hamsters. After 20 days of the challenge, the surviving hamsters were sacrificed in CO2 chamber, submitted to necropsy and the kidneys were examined to test the carrier state of leptospires by cultivation in Fletcher\'s medium. In the challenges effectuated with the indigenous strain, L1-130 of the serovar Copenhageni the protection was obtained against the clinical disease in eight of ten animals, for two experimental vaccines, however, among the survivors, there were renal carriers of leptospires, in higher number for the vaccine without containing the adjuvant (n=5), when compared to the one added with Al (OH) (n=3). For the commercial vaccine, the protection was total both against the disease and as for infection, when no death was found in consequence of leptospirosis and all the renal cultures of the survivors were negative for leptospires. In the challenges performed with the indigenous strain LO4 of the serovar Canicola, the protection conferred by the three vaccines tested was total, without observing any deaths due to leptospirosis and all the survivors presented negative culturing results for leptospires in the renal tissue. The challenge doses of the inocula were superior to 10,000 LD50, for the two serovars tested, since in the titration of the inocula have died more than 50 % of the animals up to the last tested dilution. So, the crossed protection existing between the serovars Copenhageni and Icterohaemorrhagiae was demonstrated and that the imported bacterial vaccine was able to induce protection against the disease and against the infection for the native strains of leptospires serovars Canicola and Copenhageni isolated in Brazil. In the challenges effectuated with the serovar Canicola, the experimental vaccine induced protection against the disease and against the infection, but in vaccine employing the serovar Copenhageni, protection was found only against the disease, when less number of renal carriers of leptospires was observed among the animals immunized with the experimental vaccine added with the aluminium hydroxide adjuvant.

A leptospirose é uma zoonose, amplamente difundida pelo mundo, causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais silvestres e domésticos. A transmissão ocorre, principalmente, pelo contato direto com água e solo contaminados com a urina de animais infectados que podem ser clinicamente assintomáticos. As leptospiras patogênicas invadem os tecidos do hospedeiro através da penetração da pele lesada ou mucosas da boca, narina e olhos. Logo após ultrapassar as superfícies de contato, as bactérias chegam rapidamente à corrente sanguínea e espalham-se para todos os órgãos causando lesões, principalmente, no fígado e rins onde produzem hemorragia e necrose tecidual. Após a entrada no hospedeiro, a progressão da infecção envolve a adesão das bactérias às células eucarióticas e às proteínas de matriz extracelular seguida pela invasão aos tecidos. Estudos recentes demonstraram que as leptospiras são capazes de se translocarem através das monocamadas celulares, o que poderia ser um mecanismo de evasão do sistema imune e também facilitaria a entrada e saída da corrente sanguínea para infectar órgãos-alvo. O mecanismo envolvido na invasão do patógeno através das barreiras extracelulares não está bem elucidado. Enzimas capazes de degradar proteínas da matriz extracelular poderiam contribuir com a motilidade e quimiotaxia das bactérias durante a invasão. Bactérias patogênicas sintetizam e secretam diferentes tipos de proteases, que atuam degradando colágeno e glicoproteínas entre outras proteínas do hospedeiro. Recentemente, um estudo, utilizando gelatina e caseína como substratos e lisado bacteriano, mostrou haver uma variedade de proteases em Leptospira spp. Análises do genoma indicam a presença de vários genes que codificam prováveis proteases. A comprovação experimental da existência e a caracterização funcional destas proteínas poderão contribuir no entendimento da patogenia da leptospirose. Neste sentido, este trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e caracterização funcional de uma provável colagenase (ColA) de L.interrogans sorovar Copenhageni. As sequências codificantes do domínio de colagenase 1 (D1), do domínio de colagenase 2 (D2) e de ambos os domínios (Full) da ColA foram amplificadas por PCR a partir de DNA genômico de Leptospira e clonadas no vetor de expressão pAE. Os fragmentos D1, D2 e Full da ColA foram expressos em E. coli BL21 - SI e purificados a partir das frações insolúveis por cromatografia de afinidade a níquel. Os fragmentos recombinantes purificados foram utilizados na obtenção dos antissoros policlonais, e as atividades enzimáticas de cada um foram avaliadas. Os antissoros policlonais produzidos em coelho apresentaram elevados níveis de anticorpos detectados por ELISA. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína ColA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. As proteínas Full e D2 apresentaram atividade catalítica sobre o colágeno desnaturado e sobre peptídeo sintético e atividade hemorrágica em camundongos. Estes resultados indicam que ColA é provavelmente uma proteína de leptospira envolvidas na invasão de tecidos do hospedeiro. / Leptospirosis is a zoonosis widespread throughout the world, caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira, which colonize the renal tubules of wild and domestic animals. Transmission occurs mainly through direct contact with water and soil contaminated with urine of infected animals that may be clinically asymptomatic. Pathogenic leptospires invade host tissues by penetrating damaged skin or the mucous membranes of the mouth, nostrils and eyes. Soon after passing the contact surfaces, leptospires come quickly into the bloodstream and spread to all organs causing damage mainly in the liver and kidneys where they produce hemorrhage and tissue necrosis after entering the host, the progression of the infection involves the adhesion of bacteria to eukaryotic cells and extracellular matrix proteins followed by invasion of tissues. Recent studies have shown that leptospires are able to translocate across cell monolayers, which could be a mechanism for evasion of the immune system and also facilitate the entry and exit from the bloodstream to infect target organs. The mechanism involved in pathogen invasion through extracellular barriers is not well elucidated. Enzymes capable of degrading extracellular matrix proteins could contribute to motility and chemotaxis of bacteria during the invasion. Pathogenic bacteria synthesize and secrete different types of proteases that degrade collagen and glycoproteins among other host proteins. Recently, a study using gelatin and casein as substrates and bacterial lysate showed a variety of proteases in Leptospira spp. Analysis of the genome indicate the presence of several genes encoding probable protease. The experimental proof of the existence and functional characterization of these proteins may contribute to the understanding of the pathogenesis of leptospirosis. In this sense, this work aimed the cloning, expression and functional characterization of a probable collagenase (ColA) from L.interrogans serovar Copenhageni. Coding sequences of the collagenase domain 1 (D1), collagenase domain 2 (D2), and both domains (Full) of the ColA gene were amplified by PCR from genomic Leptospira DNA and cloned into the pAE expression vector. The D1, D2 and Full fragments of ColA protein were expressed in E. coli BL21-SI and purified from the insoluble fractions by nickel affinity chromatography. The purified fragments were used to obtain the polyclonal antiserum, and their enzymatic activities were evaluated by zymography. Rabbit polyclonal antiserum against the recombinant protein fragments were produced with a high antibody level detected by ELISA. Western-blotting experiments demonstrated the presence of ColA protein in different pathogenic serovars of Leptospira. The Full and D2 proteins showed catalytic activity on denatured collagen and synthetic peptide and hemorrhagic activity in mice. These results indicated that ColA is probably a leptospiral protein involved in invasion of host tissues.

A leptospirose é uma zoonose de importância mundial, causada por leptospiras patogênicas. Aproximadamente 5 a 10% das infecções humanas cursam com a forma grave. A Doença de Weil é a forma mais comum de doença grave e pode apresentarse com duas formas de evolução, aguda progressiva monofásica ou de curso prolongado. A doença grave se caracteriza por uma combinação de hemorragia, mais comumente pulmonar, icterícia e insuficiência renal, com letalidade de 5 a 15%. O rim é um órgão muito acometido na Leptospirose. Clinicamente o envolvimento renal ocorre de 16 a 40%, com manifestações peculiares como poliúria, hipocalemia, e perda de sódio. A disfunção tubular renal, é característica da leptospirose forma grave, com envolvimento dos transportadores renais de sódio ao longo do néfron, levando às manifestações observadas. A terapêutica antimicrobiana é recomendada na Leptospirose, porém com controvérsias à sua indicação após o quarto dia de doença. Quando da instalação da lesão não haveria benefícios com a utilização de antibióticos. O tratamento pode diminuir a morbidade e letalidade, assim como interferir no envolvimento renal e na expressão dos transportadores renais de sódio. A patogênese pode estar relacionada a efeitos diretos da leptospira ou a resposta inflamatória assim como o estresse oxidativo. A utilização de antioxidantes, pode ser considerada como terapia adjuvante. Nós avaliamos a expressão no túbulo proximal do trocador Na+-H+ (NHE3) e na porção espessa da medula ascendente o cotransportador Na+-K+-2Cl- (NKCC2), no modelo de hamster com as duas formas de evolução de doença grave, mimetizando a doença de humanos realizados em dois experimentos. Os experimentos envolveram animais infectados não tratados e tratados com ampicilina associado ou não ao antioxidante, N-acetilcisteína. A presença de antígenos de Leptospira e a expressão dos transportadores foram avaliadas por imunohistoquímica, e o ácido tiobarbitúrico, marcador de estresse oxidativo, (TBARS) foi quantificado.Hamsters infectados, apresentaram altas quantidades de antígenos nos tecidos-alvo, enquanto que a expressão de ambos os transportadores apresentou-se diminuída. O tratamento com ampicilina esteve associado com mínima detecção ou ausência de antígenos, restabelecimento da expressão dos transportadores nos respectivos locais e redução dos níveis de TBARS. O tratamento precoce e tardio com ampicilina restabeleceu os defeitos tubulares na leptospirose forma grave em ambos experimentos, sem benefícios com a utilização da N-acetilcisteína. / Leptospirosis is a zoonosis of worldwide distribution. About 5-10% of all human infections presents with severe forms. Weil\'s syndrome, the most common presentation of severe forms of leptospirosis, may courses either as a single monophasic disease or as a disease with prolonged course, characterized by a combination of hemorrhage, particularly in the lung, renal failure, and jaundice, with fatality rates ranging from 5 to 15%. The kidney is an important target organ in leptospiral infection. Clinically, renal involvement in leptospirosis occurs in 16% to 40% of cases and is unique because of the atypical presentation of polyuria, hypokalemia, and sodium wasting, suggestive of a special form of tubular dysfunction related to the major renal sodium transporters expressed along the nephron. A wide range of antimicrobial therapy for leptospirosis was described and benefits have been disputed for cases with more than four days of clinical disease, because after a threshold of leptospiremia, the delayed use of antibiotics is unlikely to reduce fatality. Antimicrobial therapy is thought to interfere on fatality, renal involvement, and renal sodium transporters expression during severe disease. The pathogenesis may be related to direct effects of leptospiral compounds or inflammatory response due to oxidative stress. Antioxidant could be considered for adjunctive therapy.We evaluated the expression of proximal tubule type 3 Na+/H+ exchanger (NHE3) and thick ascending limb Na+-K+-2Cl- cotransporter (NKCC2) in infected non treated and treated hamsters reproducing the two forms of clinical human presentations of Weil\'s syndrome divided in two experiments. Animals were treated or not with ampicillin and/or N-acetyl-cysteine (NAC). Leptospiral antigen/s and expression of renal transporters were evaluated by immunohistochemistry, and serum thiobarbituric acid (TBARS) was quantified. Infected hamsters had high amounts of detectable leptospiral antigen/s in target tissues while renal expression of NHE3 and NKCC2 decreased. Ampicillin treatment was associated with minimal or no detection of leptospiral antigens, normal expression of NHE3 and NKCC2 transporters, and reduced levels of TBARS. Early and late ampicillin treatment rescued tubular defects in leptospirosis severe disease in both experiments, and there was no evidence of benefit from antioxidant therapy.

Leptospirose é uma zoonose mundial que acomete várias espécies de mamíferos, incluindo humanos, causada por espécies de bactérias patogênicas do gênero Leptospira. Possui um quadro de manifestação clínico muito variado, podendo apresentar desde sintomas comuns a outras doenças como febre, calafrios, cefaleia, dores musculares, enjoo, vômitos, diarreia e uma forma mais severa da infecção denominada síndrome de Weill. Seguindo a estratégia de genômica funcional, foram selecionados genes de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, LIC10377, LIC11122, LIC11184 e LIC12287, tendo como critério a predição de localização das proteínas na membrana. Os fragmentos referentes aos genes LIC11122 e LIC12287 foram clonados no vetor pGEM-T Easy e subclonados no vetor de expressão pAE. As proteínas avaliadas interagem com laminina e plasminogênio, de forma dose-dependentes e saturáveis, sugerindo atuam nos processos de patogênese da bactéria. A presença de um fator sigma na superfície celular desempenhando um papel secundário, sugere que a rLIC11122 pode ser uma proteína moonlight. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis that affects several species of mammals, including humans, caused by species of pathogenic bacteria of the genus Leptospira. It has a very varied clinical manifestation board and may have symptoms from common tropical diseases such as fever, chills, headache, muscle aches, nausea, vomiting, diarrhea and a severe syndrome of infection known as Weill syndrome. Following the functional genomics strategy, genes were selected from Leptospira interrogans serovar Copenhageni, LIC10377, LIC11122, LIC11184 and LIC12287, with the criterion of the prediction location of proteins in the membrane. The fragments related to genes LIC11122 and LIC12287 were cloned into pGEM-T Easy vector and subcloned into the expression vector pAE. The evaluated proteins interact with laminin and plasminogen, dose-dependent and saturable manner, suggesting participation in bacterial pathogenesis processes. The presence of a sigma factor on the cell surface plays a secondary role, suggests that performs a moonlight rLIC11122 protein.

A leptospirose é a zoonose mais disseminada no mundo e uma das principais causas de perda econômica no agronegócio. O estudo de novos antígenos de superfície de Leptospira interrogans, é intrigante e pode fornecer conhecimento na interação inicial patógeno-hospedeiro. Os genes LIC13059 e LIC10879, escolhidos por bioinformática, com predição de localização na superfície celular, foram clonados e as proteínas recombinantes expressas em E. coli, para avaliar a interação com componentes do hospedeiro. Após purificação, as proteínas encontravam-se estruturadas e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas recombinantes interagem com plasminogênio, fibrinogênio e laminina. rLIC13059, nomeada Lsa25.6, quando ligada ao fibrinogênio é capaz de inibir a formação de coágulo de fibrina e rLIC10879, nomeada Lsa16, interage com e-caderina, sugerido envolvimento na cascata de coagulação e ligação com o hospedeiro, respectivamente. O plasminogênio ligado às proteínas é convertido em plasmina, o que poderia ajudar a penetração bacteriana no hospedeiro. / Leptospirosis is the most widespread zoonosis and also a major cause of economic loss in animal production worldwide. The study of new surface antigens of Leptospira interrogans is intriguing and may shed light into the initial pathogen-host interactions. We set out to study two novel coding sequences LIC13059 and LIC10879 predicted to be located at the cell surface. The genes were cloned and the recombinant proteins were expressed in E. coli. The purified recombinant proteins presented secondary structures, and interacted with plasminogen, fibrinogen and laminin human components. rLIC13059, named Lsa25.6, when bound to fibrinogen was capable of inhibiting the formation of fibrin clot, while rLIC10879, named Lsa16, interacted with e-cadherin, a mammalian cell receptor, suggesting participation in coagulation pathway and host-cell binding, respectively. The plasminogen captured by both recombinant proteins could be converted into plasmin, a mechanism that could help bacterial penetration in the host.

A leptospirose é considerada a zoonose mais difundida do mundo, assim como uma doença reemergente. Esta enfermidade, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, possui altas taxas de infecção em países em desenvolvimento, ocasionando graves prejuízos econômicos e de saúde pública. Até o momento, não existem vacinas humanas licenciadas contra leptospirose. Após o seqüenciamento do genoma de três espécies de Leptospiras vários genes foram apontados como candidatos vacinais promissores. Uma categoria importante de genes candidatos são aqueles com possível atividade hemolítica. Neste trabalho, clonamos e expressamos diversas proteínas com possível atuação hemolítica. As proteínas recombinantes obtidas, no entanto, não exibiram atividade hemolítica. Uma destas proteínas, TlyC, foi investigada quanto à sua capacidade de interagir com os componentes da matriz extracelular (MEC). Os resultados obtidos indicam que TlyC liga-se com alta afinidade a diversos componentes da MEC, e que esta proteína é capaz de inibir competitivamente a adesão de Leptospiras à um material biológico que se assemelha à MEC. A transcrição e expressão destas proteínas foi detectada em cultura de Leptospira. Algumas das proteínas recombinantes foram utilizadas em um desafio animal contra leptospirose, mas nenhum delas foi protetora. Concluímos que estas proteínas não parecem ser bons candidatos vacinais e que TlyC é uma proteína que interage com componentes da MEC. / Leptospirosis is considered the most disseminated zoonosis of the world, and also a reemerging disease. This disease, caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira, has high rates of infection in developing countries, leading to severe economic and medical costs. There is not a licensed vaccine against leptospirosis for human use. After the genome sequencing of three species of leptospires, several genes were pointed to be promising vaccinal candidates. An important category of these candidates are those with putative hemolytic activity. In this work, we cloned and expressed some proteins with putative hemolytic activity. The recombinant proteins obtained, however, did not show hemolytic activity. One of these proteins, TlyC, was investigated with regard to its possible ability to interact to extracellular matrix (ECM) components. The results obtained indicate that TlyC binds with high affinity to several ECM components and that this protein can inhibit the Leptospira bind to a biological material that ressambles the ECM. The transcription and expression of these proteins were detected in leptospires cultures. Some of the recombinant proteins were used in an animal challenge against leptospirosis, but none of them were protective. We conclude that these proteins do not seem to be good vaccine candidates and that TlyC is a protein that interacts with the ECM and its components.

Orientador: Marcos Cesar Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Geociencias / Made available in DSpace on 2018-08-12T04:43:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_GustavoGarciaFontes_M.pdf: 15063352 bytes, checksum: 7b4213ab9b6c6bef35c34ca0423b1db2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Este trabalho trata das endemias de leptospirose que ocorreram na cidade de São Paulo em 2006. Através de um viés geográfico, amparado nas facilidades proporcionadas pelos Sistemas de Informação Geográfica, busca-se enumerar e hierarquizar feições espaciais das áreas mais acometidas, para assim estabelecer uma relação entre o espaço geográfico e a doença, para então posteriormente elaborar um mapa de áreas de risco. Após uma breve apresentação da paisagem das áreas endêmicas, a zona leste da cidade de São Paulo tornase objeto para aplicação do método geográfico. Aspectos físicos e sociais são analisados conjuntamente por uma de uma matriz geográfica, portanto, através das abordagens corológica e espacial do espaço geográfico. No ambiente computacional, os Sistemas de Informação Geográfica tornam possível um estudo através dos pesos de evidência, que consiste na elaboração de probabilidades do acontecimento de um fenômeno a priori, sem intervenções, e a posteriori, com novas probabilidades de chance de acontecimento após a inserção de novas informações. Tais informações recebem neste trabalho o rótulo de planos de Informação. Para lidar com as endemias na zona leste os seguintes planos de informação foram utilizados no modelo: uso do solo, declividade, rede hidrográfica e setores censitários com residências que depositam seu lixo nos rios ou em terrenos baldios. Estes planos de informação são trabalhados no software ArcSDM3.1 para se identificar, através dos pesos de evidência, quais mais contribuem para a espacialização da doença. Após a enumeração dos constituintes desses planos de informação mais importantes para o fenômeno, elaborase o mapa de probabilidades posterior, que identifica na zona leste de São Paulo as áreas que apresentam o maior risco para o contágio da doença. / Abstract: This thesis deals with the leptospirosis endemics that occurred in the city of São Paulo during 2006. The goal of this work is to list and prioritize spatial features of the most affected areas and is accomplished by entering a spatial bias using a Geographic Information System. Those areas identified as high-risk are further displayed on a map in order to establish a relationship between the disease and the geographic space. After performing a brief spatial analysis of the endemic areas, the Eastern Zone of the city of São Paulo stood out as most prominent for the implementation of the following geographic method. Physical and social aspects are examined jointly through a geographic matrix using chorological and spatial approaches of the geographic space. Geographic Information Systems make possible the configuration of a study based on the weight of evidence, an elaboration of the event probabilities of a phenomenon a priori, without intervention, and a posteriori, with new probabilities of occurrence after the insertion of new information. Such information in this work receives the label of 'information plans.' In order to deal with eastern São Paulo's endemics, the following information plans were used in the model: land use, slope, hydrological network, and census tracts containing the number of homes that discharge their waste into rivers or abandoned land. These information plans are put into practice using ArcSDM3.1 software in order to identify, through the weight of evidence, which ones contribute the most to the spread of the disease. After listing the information plans' most important constituents in regard to the phenomenon, a probability map is created, which identifies what areas within East São Paulo represent the greatest risk of spreading the disease. / Mestrado / Análise Ambiental e Dinâmica Territorial / Mestre em Geografia

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_gustavo_cerqueira.pdf: 757400 bytes, checksum: 75fc7b471af1fa029ccf13d06c0042eb (MD5) Previous issue date: 2006-03-31 / Pathogenic Leptospira species contain one or more genes of the lig family, which code for Lig-family proteins. Lig proteins ( Leptospiral immunoglobulin-like proteins ) are considered important virulence factors, and they may be involved in tissue penetration and adhesion to host cells. Lig proteins have been implicated as the main factors involved in pathogenesis of Leptospira spp. Three genes, ligA, ligB and ligC are known, which code for proteins with the same name. The increasing interest in the characterization of the genes code for Lig proteins is due to their strong immunoprotective and diagnosis potential. Thus, it was necessary to evaluate the degree of conservation among Lig genes and proteins in order to predict their usefulness as antigens for the induction of a broad range protection. Four of the pathogenic species of Leptospira had the lig genes sequenced in this study, comprising L. interrogans, L. noguchii, L. weilli and L. borgpetersenii. Among the LigB proteins sequenced so far, LigB from L. interrogans Copenhageni FIOCRUZ L1-130 appears as the most conserved when compared to LigB from other species. The sequencing and comparative analysis of lig genes and proteins demonstrated a low identity among the different genomospecies of Leptospira spp. The alignment of lig genes sequences from all the genomospecies enabled us to design primers that allowed the amplification of a fragment from each gene. Such approach demonstrated that ligB gene is present in all the pathogenic species, while ligA gene is only found in L. interrogans and L. kirschneri and ligC gene is present in L. interrogans, L. kirschneri, L. weilli and some serovars of L. noguchii. The sequencing of the amplified fragment, derived from 33 serovars which comprise 6 genomospecies, and their comparative analysis together with the corresponding region from ligB sequences available in GenBank, enabled a phylogenetic analysis. It was possible to differentiate pathogenic species based on the DNA sequence of this ligB fragment. / Leptospiras patogênicas carregam um ou mais genes lig, os quais codificam para proteínas da família Lig. As proteínas Lig ( Leptospiral immunoglobulin-like ) são importantes fatores de virulência, e acredita-se que estejam envolvidos na penetração do tecido e na adesão da Leptospira às células do tecido hospedeiro. Até o presente momento, as proteínas Lig são apontadas como um dos principais fatores envolvidos na patogênese de Leptospira spp. Três genes, ligA, ligB e ligC são conhecidos, os quais codificam para proteínas com o mesmo nome. O interesse pela caracterização dos genes que codificam para as proteínas Lig surgiu pelo fato destas apresentarem potencial imunoprotetor e como antígenos para testes de diagnóstico. Frente a esta constatação, fez-se necessário conhecer o grau de conservação destes genes para inferir se a utilização de uma destas proteínas como antígeno vacinal seria capaz de induzir uma imunidade de amplo espectro. Dentre as espécies patogênicas de Leptospira, 4 tiveram seus genes lig seqüenciados neste estudo, as quais compreendem L. interrogans, L. noguchii, L. weilli e L. borgpetersenii. Entre as proteínas Lig seqüenciadas até o momento, LigB oriunda de L. interrogans Copenhageni FIOCRUZ L1-130 aparece como a mais conservada quando comparada com LigB de outras espécies. Com o alinhamento da seqüência dos genes lig das diversas espécies, foi possível desenhar primers capazes de amplificar por PCR um fragmento interno de cada um dos três genes. Esta abordagem permitiu comprovar a presença do gene ligB em todas as espécies patogênicas, enquanto ligA aparece apenas em L. interrogans e L. kirschneri, e ligC é encontrado nas espécies L. interrogans, L. kirschneri, L. weilli e alguns sorovares de L. noguchii. O seqüenciamento do fragmento de ligB amplificado por PCR a partir do DNA de 33 sorovares de 6 espécies, e sua análise comparativa juntamente com o fragmento correspondente pertencente aos genes ligB depositados no GenBank, possibilitou uma análise filogenética onde verificou-se que é possível diferenciar as espécies pela seqüência deste fragmento.