Com a finalidade de se analisar a dinâmica da evolução dos anticorpos na fase aguda da infecção, através das reações de soroaglutinação microscópica e de fixação do complemento, trinta animais foram inoculados experimentalmente com leptospiras patogênicas, sendo quinze com o sorotipo icterohaemorrhagiae e quinze com o sorotipo canicola. Procurou-se também avaliar a potencialidade do emprego dos antígenos preparados com amostras de leptospiras aquícolas estirpes Patoc I, Rufino e Buenos Aires, em ambas as reações. Os anticorpos fixadores do complemento foram observados na circulação sanguínea a partir do 49 dia após a inoculação em ambos os grupos de animais, enquanto as aglutininas foram detectadas a partir do 7º dia. Estas persistem durante um período maior de tempo, pois 50% dos animais inoculados com o sorotipo icterohaemorrhagiae apresentaram anticorpos circulantes no 56º dia após a inoculação e 80% dos cães inoculados com o sorotipo canicola, no 63º dia pós-infecção. Nessa oportunidade, os anticorpos fixadores do complemento não foram observados nos soros dos animais de ambos os grupos. As estirpes Patoc I e Rufino não foram-eficientes em revelar anticorpos circulantes em ambos os grupos experimentais tanto pela reação de soroaglutinação microscópica como pela reação de fixação do complemento, em proporções que justifiquem seu emprego como antígeno único. Entretanto, 87% dos cães inoculados com o sorotipo icterohaemorrhagiae e 80% dos cães inoculados com o sorotipo canicola foram reagentes quando se empregou a estirpe Buenos Aires nas reações de soroaglutinação microscópica e de fixação do complemento. / In order to evaluate the antibody response to pathogenic leptospira from both serotypes icterohaemorrhagiae and canicola, dogs were experimentally inoculated with these two serotypes. Bach of the serotypes were inoculated in 15 dogs and the antibody response in the acute phase of infection was followed using agglutination, and complement fixation tests. These tests were also performed using non pathogenic leptospira such as Patoc l, Rufino and Buenos Aires. Complement fixing antibodies were detected in both groups, at the 4th day post-infection and agglutinins only appeared in circulation at the 7th day post-infection when homologous antigens were used. On the 63rd day post-infection with canicola serotype and on the 56th day post-infection with the serotype icterohaemorrhagiae complement fixing antibody could no longer be detected but, in both experimental groups, specific agglutinins were present in significant tittles. The antigens Patoc I and Rufino were inefficient to detect circulating antibodies in experimentally infected animals. However, when the Buenos Aires antigen was used 87 percent of the animals infected with the serotype icterohaemorrhagiae and 80 per cent of the animals infected with the serotype canicola showed significant tittles of antibody.

Foi avaliado o desempenho de vacina de subunidade e bactéria completa antileptospirose em matrizes suínas analisando-se os níveis de anticorpos aglutinantes e neutralizantes. A intensidade e duração da imunidade passiva nos leitões, e ativa nas matrizes suínas foi investigada pela soroaglutinação microscópica (SAM) e teste de inibição de crescimento de leptospiras (ICL) em grupos de animais tratados com vacina experimental de subunidade e leptospira completa produzida com a mesma estirpe e com duas bacterinas comerciais. O experimento foi realizado em duas fases, na primeira, sendo utilizadas 33 matrizes. Os animais foram divididos em três grupos: grupo 1 (n=11):controle; grupo 2 (n=11): recebeu duas doses, em intervalo de 30 dias, de vacina anti-leptospirose constituída da subunidade de lipopolissacarídeo (LPS) de leptospira sorovar Canicola. Grupo 3 (n=11): recebeu duas doses, em intervalo de 30 dias, de uma bacterina de bactérias completas antileptospirose. Na segunda fase foram utilizadas 24 matrizes. Os animais foram divididos em três grupos: Grupo A (n=08): recebeu duas doses, em intervalo de 30 dias, de bacterina comercial anti-leptospirose A. Grupo B (n=08): recebeu duas doses, em intervalo de 30 dias, de bacterina comercial antileptospirose B e Grupo C (n=08): controle. Tanto na primeira fase como na segunda, foram realizados exames de SAM e de ICL nas matrizes e nos seus leitões, a fim de se avaliar títulos de aglutininas e de anticorpos neutralizantes obtidos respectivamente com a imunidade ativa e passiva. Os resultados das comparações dos títulos de anticorpos aglutinantes dos grupos tratados, 2 e 3, na primeira fase, apresentaram diferença aos 32 e 68 dias pós-vacinação. Não houve diferença para os anticorpos neutralizantes. No 30º dia de vida não foram detectados anticorpos aglutinantes nos leitões das matrizes vacinadas com LPS, e para anticorpos neutralizantes, os títulos médios foram de 0,832 no grupo 2 e 0,930 no grupo 3. Os títulos de anticorpos aglutinantes dos grupos A e B, na segunda fase, apresentaram diferença entre os sorovares das bacterinas comerciais, aos 60, 90 e 120 dias pós-vacinação. Aos 60 dias, houve diferença para o sorovares Copenhageni e Icterohaemorrhagiae. Em relação aos níveis de anticorpos neutralizantes das matrizes para o sorovar Hardjo, houve persistência de títulos de anticorpos neutralizantes nas sete avaliações realizadas nas duas bacterinas comerciais empregadas, e, em títulos baixos. Nos leitões foi constatada a transferência da imunidade colostral, somente com a bacterina comercial B confirmada pela presença de anticorpos aglutinantes, aos três e oito dias de vida. A vacina de LPS de bactéria completa apresentou perspectivas para emprego na prevenção da leptospirose suína. Houve diferença e baixa resposta imunológica nas bacterinas comerciais A e B anti-leptospirose, principalmente, para os sorovares Canicola, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae e Pomona, Copenhageni para a bacterina comercial B. A imunidade passiva, medida por anticorpos aglutinantes conferida pelas bacterinas comerciais A e B, foi de curta duração. / It was evaluated the performance of a subunit and whole culture bacterin vaccines against leptospirosis in sows by the analysis of agglutinating and neutralizing antibodies level. The intensity and duration of passive immunity in the offspring and active immunity in sows were investigated with microscopic agglutination test (MAT) and leptospira growth inhibition (LGI) in groups of animals treated with experimental subunit vaccine and whole bacterin produced with the same serotype and with two commercial bacterin vaccines. The experiment was performed in two phases. First, 33 sows were divided into three groups of eleven animals each: group 1 was the control and group 2 received two doses with 30 days interval of anti-leptospirosis lipopolysaccharid (LPS) subunit vaccine serovar Canicola and group 3 received two doses with 30 days interval of whole leptospira bacterin. On a second phase 24 sows were divided into three groups of eight animals each: group A received two doses with 30 days interval of the commercial leptospira bacterin A. Group B received two doses with 30 days interval of a commercial leptospira bacterin B and group C was the control. Either in the first phase as in the second one, MAT and LGI were performed in the sows and its piglets in order to evaluate titers of agglutinins and neutralizing antibodies obtained with active and passive immunities respectively. The comparison of agglutinating titers of groups 2 and 3 at the first phase showed differences on days 32 and 68 post vaccination. There was no difference in relation to neutralizing antibodies. Agglutinating antibodies were not detected on thirty days old piglets, born from sows vaccinated with LPS, and for neutralizing antibodies, mean titers were 0.832 on group 2 and 0.930 on group 3. Agglutinating antibodies titers of groups A and B, on the second phase, presented differences between the commercial vaccines serovars at 60, 90 and 120 post vaccination days. At 60 days, there were differences for serovars Copenhageni and Icterohaemorrhagiae. There was persistency of low titers of neutralizing antibodies to serovar Hardjo in the sows, for the seven measurements performed with the two commercial bacterins. It was observed colostral immunity transfer to piglets with three and eight days old only for commercial vaccine B, with detectable agglutinating antibodies. LPS bacteria vaccine presented perspectives to prevent swine leptospirosis. There was difference and low immunological response for commercial vaccines A and B, especially for serovars Canicola, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae and Pomona; and for serovar Copenhageni only for commercial vaccine B. The passive immunity conferred by commercial vaccines A and B and measured by agglutinating antibodies had low duration.

A leptospirose é uma doença endêmica causada por Leptospiras. O genoma da Leptospira interrogans sorovar Copenhageni foi analisado para seleção de potenciais antígenos vacinais. Oito genes foram selecionados e clonados para expressão e purificação dos antígenos. A salmonela SL3261 foi usada como carregadora dos genes de leptospira em vetor pAEsox para expressão das proteínas in vivo. As salmonelas recombinantes induziram resposta imune quando administradas em camundongos por via intraperitoneal. Hamsters foram imunizados com as salmonelas, observando-se que a SLLIC10191 induziu proteção parcial no desafio com L. interrogans sorovar Pomona. Vetores híbridos foram construídos para expressão simultânea de dois antígenos em salmonelas in vivo. Observamos indução de anticorpos específicos, porém, os ensaios de desafio não foram conclusivos. Vários parâmetros do desafio com sorovar Copenhageni foram estudados, como contagem das bactérias e ajuste de dose, variação de virulência por passagens em cultivo e interferência da idade dos animais. / Leptospirosis is an endemic disease caused by Leptospira. The genome of Leptospira interrogans serovar Copenhageni was analyzed for screening potential vaccine antigens. Eight genes were selected and cloned for expression and purification. Salmonella SL3261 was used as carrier of the genes of leptospira in pAEsox vector for in vivo proteins expression of proteins in vivo. Recombinant Salmonella induced immune response when administered intraperitoneally in mice intraperitoneally. Hamsters were immunized with salmonella, resulting we observed that the SLLIC10191 induced partial protection against on challenge with L. interrogans serovar Pomona. Hybrid vectors were constructed for expression of two antigens simultaneously by salmonella in vivo. We observed induction of specific antibodies, however, the challenge tests were not conclusive. Several parameters of the challenge assay with serovar Copenhageni were studied, such as the counting of bacteria count and dose adjustment, changes in virulence by passages in culture and interference backgroundof from the age of animals.

A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas que possuem estratégias para driblar a ação do sistema complemento ao interagir com diversos reguladores negativos, como a vitronectina. Neste projeto, avaliou-se a interação de vitronectina com três proteínas de membrana de Leptospira: LigA, LigB e LcpA. Verificou-se que essas interações ocorrem nas porções C-terminais das proteínas e nos domínios de ligação com heparina da vitronectina. Essas proteínas também se ligam a C9 e são capazes de impedir a formação do poro in vitro e a formação do MAC em um ensaio clássico de hemólise. Essas proteínas de Leptospira interagem com diversos reguladores negativos do sistema complemento. Ensaios de competição demonstram que estes reguladores interagem simultaneamente com as proteínas através de sítios distintos. A caracterização funcional de proteínas e a descoberta de novos mecanismos utilizados por esse patógeno para sobreviver no hospedeiro podem auxiliar nossa compreensão no que diz respeito a aspectos relacionados à clínica e à prevenção da leptospirose. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira that have strategies to escape the action of the complement system interacting with several negative regulators, such as vitronectin. In this project, we evaluated the interaction of vitronectin with three Leptospira membrane proteins: LigA, LigB and LcpA. It has been found that such interactions occur at the C-terminal portions of these proteins and the heparin binding domain of vitronectin. These proteins also bind to C9 and are capable of preventing the formation of the pore in vitro and the formation of MAC in a classical test of hemolysis. These proteins interact with various Leptospira negative regulators of the complement system. Competition assays demonstrated that both interact with these regulatory proteins through distinct sites. The functional characterization of these proteins and the discovery of new mechanisms used by this pathogen to survive in the host may help our understanding with regard to clinical aspects and prevention of leptospirosis.

Orientador: Luiz Augusto do Amaral / Banca: Fernando Antonio de Avila / Banca: Gisele Maria de Andrade / Banca: Halim Atique Netto / Banca: Anna Monteiro Lima Ribeiro / Resumo: O objetivo desse trabalho foi verificar a ação de marcas diferentes de estreptomicinas polivalentes para o tratamento da leptospirose bovina em dose única (25 mg de estreptomicina por kg de peso corpóreo). O trabalho foi realizado com 14 touros adultos sorologicamente reagentes para Leptospira interrogans sorovar Hardjo, com título mínimo de 800 e com cultivo positivo. Os animais foram separados em 2 grupos de acordo com a marca da estreptomicina utilizada no tratamento, grupo 1: estreptomicina A e grupo 2: estreptomicina B. Os bovinos controles não receberam nenhum tratamento. Foram obtidas amostras de sangue e urina dos animais tratados e controles nos dias -1, 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15 e 25; considerando-se o dia do tratamento como dia 0. Na urina dos bovinos tratados e controle foi realizada a reação em cadeia da polimerase (PCR) e isolamento com inoculação em hamsters. Observou-se que a estreptomicina da marca A, em dose única de 25 mg/kg de peso corpóreo, conseguiu eliminar a leptospirúria no grupo de touros após 24h do tratamento. Já no grupo de touros tratados com a estreptomicina da marca B, foi constatado a leptospirúria entre 48h e 72h, após o tratamento. Em ambos os grupos tratados, a resposta sorológica apresentou uma variação da queda dos níveis dos títulos de anticorpos aglutinantes, sendo que embora a estreptomicina A tenha aparentemente apresentado um melhor eficiência quando comparada com as médias geométricas dos títulos do grupo tratado com a estreptomicina B as médias não diferiram entre si pelo Teste de Tukey (P > 0,05). Nos bovinos tratados a leptospirúria foi intermitente e a média geométrica dos títulos foi menor que a média geométrica dos títulos dos bovinos controles. A diferença do efeito da ação das diferentes marcas de estreptomicina está possivelmente na qualidade da matéria prima produzida pelos laboratórios / Abstract: The objective of the present work was to evaluated two different commercial streptomycin brands used for the treatment of bovine leptospirosis, administrated in a single dose (25mg/body weight). Thirty serologically reactive bulls for Leptospira interrogans serovar Hardjo were utilized. The bulls presented a 800 minimum antibody titer and positive results at urine samples isolation test. The animals were separated into 2 groups according to the streptomycin brand. Treatments consisted of: group 1: streptomycin A and group 2: streptomycin B. The control animals received no application of any streptomycin product. Blood and urine samples of treated and controls bulls were collected at -1, 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15 and 25 days considering the treatment day as D0. Detection of leptospira genetic material was carried out in all bulls urine samples using the PCR assay. It was observed that the streptomycin A eliminated leptospiruria 24h after treatment. The elimination of leptospiruria was evidente 48 and 72hs in bulls treated with the streptomycin B. In both treated groups, the serological response varied considering antibodies titers decreasing. Streptomycin A group 1 showed a better performance accordingly to geometric means in comparison to antibodies titers of the streptomycin B group 2, although there were no significant difference found by the Tukey Test (P > 0.05). In the bovine control group the leptospiruria was intermittent and the treated bovines antibody titers average was lower than the average of the bovine controls, during all the experimental period. The action effect difference of the diferent streptomycin brands used is possibly due to the quality of the raw material used to produced the products manufactured by the pharmaceutical laboratories / Doutor

Orientador: Iveraldo dos Santos Dutra / Banca: Vera Claudia Magalhães Curci / Banca: Luis Antonio Mathias / Banca: Luiz Augusto do Amaral / Banca: Márcia Marinho / Resumo: O estudo objetivou caracterizar a suinocultura em Mossoró, Rio Grande do Norte, nos seus aspectos sanitários, identificando os riscos de zoonoses e, especificamente, conhecer a realidade da brucelose e da leptospirose no rebanho local. A pesquisa compreendeu um estudo epidemiológico quantitativo, com delineamento descritivo em que foi realizado um diagnóstico situacional das 20 principais criações comerciais de suínos, por meio de visitas e entrevistas com os produtores. Também compreendeu um delineamento transversal no qual foram coletadas 412 amostras sanguíneas de suínos para a detecção de anticorpos anti-Brucella spp., através dos testes de antígeno acidificado tamponado (AAT) e reação de fixação de complemento (RFC), e detecção de anticorpos anti-Leptospira spp., pela técnica de soroaglutinação microscópica (SAM). Os resultados demonstraram que a suinocultura em Mossoró-RN apresentava um perfil de subsistência, com emprego de mão de obra familiar, e o sistema de criação mostrou sérios problemas sanitários, tendo sido detectados vários riscos para a ocorrência de zoonoses. A prevalência da brucelose nos animais foi de 27,0% no teste de AAT e 17,5% na RFC; em 55% das propriedades pesquisadas havia pelo menos um animal positivo, e a prevalência nestas variou de 6,7% a 80,0%; os fatores de risco que estavam influenciando a ocorrência da doença foram a presença de ratos nas criações, o contato com bovinos e a faixa etária jovem dos animais. A prevalência da leptospirose foi de 78,6%, sendo as amostras positivas para 15 sorovares, com predominância dos sorovares Icterohaemorrhagiae e Pomona; em todas (100%) as propriedades trabalhadas existiam animais reagentes, e o percentual da infecção em cada propriedade variou de 25% a 100%; os fatores de risco que estavam associados à leptospirose foram o sistema de confinamento dos animais e o saneamento ruim ... / Abstract: The study aimed to characterize the pig industry in Mossoró, Rio Grande do Norte, in its health aspects, identifying the risks of zoonoses and specifically know the reality of brucellosis and leptospirosis in the local herd. The research included a quantitative epidemiological study, with descriptive design in which a situational analysis of the top 20 commercial swine farms was conducted through visits and interviews with producers. Also comprised a cross-sectional design in which 412 blood samples from pigs were collected for the detection of antibodies anti-Brucella ssp., through the buffered acidified antigen (TAA) and the complement fixation test (RFC) tests, and detection of antibodies anti-Leptospira spp., by microscopic agglutination test (MAT). The results showed that the swine in Mossoró-RN presented a profile of subsistence, with the use of family labor, and farming system showed serious health problems, several risks have been detected for the occurrence of zoonoses. The prevalence of brucellosis in animals was 27.0% in the AAT test and 17.5% in the RFC; 55% of the surveyed properties had at least one positive animal, and these prevalence ranged from 6.7% to 80.0%; the risk factors that were influencing the occurrence of the disease were the presence of rats in the creations, contact with cattle and the young age of the animals. The prevalence of leptospirosis was 78.6%, with positive samples for 15 serovars, with prevalence of serovars Icterohaemorrhagiae and Pomona; there were reactors in all the worked farms (100%), and the percentage of infection for each farm ranged from 25% to 100%; the risk factors that were associated with leptospirosis were the containment system of animals and bad sanitation of breeding facilities; the use of treated water for watering the animals was a protective factor. These findings revealed that the swine had serious health problems; etiological ... / Doutor

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-08-29T11:52:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_thais_larre_oliveira.pdf: 616408 bytes, checksum: 404ac55ee19b90246334aac10658a361 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-08-29T19:49:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_thais_larre_oliveira.pdf: 616408 bytes, checksum: 404ac55ee19b90246334aac10658a361 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-08-29T19:49:43Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_thais_larre_oliveira.pdf: 616408 bytes, checksum: 404ac55ee19b90246334aac10658a361 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T19:49:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_thais_larre_oliveira.pdf: 616408 bytes, checksum: 404ac55ee19b90246334aac10658a361 (MD5) Previous issue date: 2014-08-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A leptospirose é uma doença infecciosa emergente causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, com complicações humana e veterinária. Essa doença é transmitida através do contato direto com um animal reservatório ou com o ambiente contaminado com a urina destes animais. O desenvolvimento de vacinas seguras e multivalentes contra leptospirose, que substituam as bacterinas existentes, permanece um desafio. Bacterinas são reatogênicas e conferem imunidade sorovar-específica e de curta duração. Esforços para o desenvolvimento de vacinas recombinantes tem focado em proteínas de membrana externa (OMPs). A proteína de membrana externa OmpL37 é conservada entre diferentes sorovares de Leptospira e atua na adesão aos tecidos do hospedeiro. Neste estudo, nós relatamos pela primeira vez, a avaliação do potencial imunoprotetor de OmpL37 como antígeno vacinal em hamsters, sob diferentes estratégias: vacina de subunidade, vacina de DNA e prime-boost. A caracterização da resposta imune através de ELISA indireto e qRT-PCR demonstrou que os maiores níveis de IgG foram estimulados pela vacina de subunidade, a qual também induziu resposta inflamatória. A vacina de DNA falhou em induzir imunidade humoral, porém também estimulou TNF-α. Apesar da resposta induzida, nenhuma formulação protegeu significativamente os animais contra a doença. / Leptospirosis is an emerging infectious disease caused by pathogenic spirochetes of Leptospira genus, of human and veterinary concern. This infectious disease is transmitted through direct contact with an animal reservoir or an environmental contaminated with their urine. The development of safe and multivalent vaccines against leptospirosis, which replace existing bacterins, remains a challenge. Bacterins are reactogenic and afford serovar specific and short-term immunity. Efforts to develop recombinant vaccines against leptospirosis have focused on outer membrane proteins (OMPs). The outer membrane protein OmpL37 is conserved among different Leptospira serovars and plays a role in adherence to host tissues. In this study we report for the first time, the evaluation of OmpL37 immunoprotective potential as a vaccine antigen in hamsters, under different strategies: subunit vaccine, DNA vaccine and prime-boost. The characterization of the immune response by indirect ELISA and qRT-PCR showed that higher levels of IgG were stimulated by the vaccine subunit, which also induced an inflammatory response. The DNA vaccine failed to induce humoral immunity, but also stimulated TNF-α. Despite the induced response, no formulation significantly protected the animals against the disease.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-08-29T13:03:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_karina_colonetti.pdf: 1293824 bytes, checksum: 7b2f2dd5717e841df6224f67290648ff (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-08-29T19:50:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_karina_colonetti.pdf: 1293824 bytes, checksum: 7b2f2dd5717e841df6224f67290648ff (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-08-29T19:50:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_karina_colonetti.pdf: 1293824 bytes, checksum: 7b2f2dd5717e841df6224f67290648ff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T19:50:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_karina_colonetti.pdf: 1293824 bytes, checksum: 7b2f2dd5717e841df6224f67290648ff (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A leptospirose humana e animal é uma doença de ocorrência mundial. Várias tentativas tem sido realizadas visando o desenvolvimento de novas abordagens para a prevenção, diagnóstico e tratamento da doença.... / The human and animal leptospirosis diseases are both worldwide spread......

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-08-30T12:11:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_amilton_seixas_neto.pdf: 1214618 bytes, checksum: 70b8eeecc3cf0dfb3f4b6426f0b70ca4 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:11:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_amilton_seixas_neto.pdf: 1214618 bytes, checksum: 70b8eeecc3cf0dfb3f4b6426f0b70ca4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:12:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_amilton_seixas_neto.pdf: 1214618 bytes, checksum: 70b8eeecc3cf0dfb3f4b6426f0b70ca4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T19:12:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tese_amilton_seixas_neto.pdf: 1214618 bytes, checksum: 70b8eeecc3cf0dfb3f4b6426f0b70ca4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-08-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / A leptospirose é uma zoonose que possui distribuição mundial, causando um importante impacto econômico no setor agropecuário. Atualmente, as vacinas empregadas para a prevenção da enfermidade são formuladas com culturas de leptospiras inteiras inativadas, as quais possuem sucesso limitado, já que induzem uma imunidade de curta duração e proteção sorovar-específica. Resultados preliminares revelaram que fragmentos recombinantes das proteínas Ligs (Leptospiral immunoglobulin-like) são antigênicas, imunogênicas e conferem proteção total ou parcial contra o desafio homólogo em hamsters. Dessa forma, fragmentos rLigs são candidatos potenciais para uma vacina de subunidade contra a leptospirose humana e animal. Assim sendo, a proposta deste projeto foi avaliar preparações vacinais com as proteínas recombinantes LigA625-1224aa (rLigANI), LigB131-649aa (rLigBRep), LigB625-1044aa (rLigB7-11) e LigA131-1224aa (rLigAFull) quando administradas com Hidróxido de Alumínio como adjuvante, individualmente ou combinadas, a fim de identificar quais formulações serão capazes de induzir uma resposta protetora contra o desafio homólogo. Hamsters machos e fêmeas foram imunizados com as preparações através da via intramuscular, nos dias 0 e 14, e o desafio homólogo foi realizado através da via intraperitoneal, no dia 28, utilizando Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130. Após a expressão e purificação das quatro proteínas, obteve-se quatro lotes com pureza de 90%. Todas as quatro proteínas recombinantes apresentaram antigenicidade, reagindo contra soro de humanos e animal convalescentes de leptospirose. A imunização dos hamsters contendo as preparações com rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11 e rLigAFull conferiram proteções variáveis (0-100%) contra o desafio homólogo. Embora nenhuma preparação tenha induzido a uma proteção esterilizante, evidenciada através das técnicas de reisolamento e imunofluorescência, a associação entre rLigANI e rLigBRep foi capaz de conferir proteção significativa (p<0,05) em todos os experimentos. Em contrapartida, o fragmento inteiro de LigA, assim como rLigB7-11, não conferiram proteção. Nosso estudo propôs uma nova abordagem para o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra a leptospirose. É o primeiro estudo que testou a proteína LigA recombinante em sua forma inteira. Além disso, foi possível obter a sua expressão na forma solúvel. Embora a proteína obtida tenha sido reconhecida por soros de humanos convalescentes in vitro, foi capaz de conferir apenas níveis de sobrevivência significativa (p<0,05) aos animais desafiados, mas não em relação à mortalidade. Por outro lado, a associação entre rLigBRep e rLigANI, outra abordagem inédita, demonstrou que mesmo testando-se em diferentes doses (40g ou 60g) de cada alvo, tanto a análise de mortalidade quanto a de sobrevivência revelou resultados significativos (p<0,01) em três dos cinco experimentos realizados. Os resultados obtidos em nosso estudo representam uma contribuição importante para o desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis, causing a major economic impact on the agricultural sector. Currently, the vaccines used to prevent disease in cattle are formulated with inactivated Leptospira whole-cell bacterins, which have limited success, since they induce an immunity of short duration and serovar-specific protection. Preliminary results from our group showed that recombinant fragments of Lig (leptospiral immunoglobulin-like) proteins are antigenic, immunogenic and confer full or partial protection against homologous challenge in hamster model. Thus, rLigs fragments are potential candidates for a subunit vaccine against human and animal leptospirosis. Therefore, the purpose of this study was to evaluate vaccine preparations with recombinant proteins LigA625-1224aa (rLigANI), LigB131-649aa (rLigBRep), LigB625-1044aa (rLigB7-11) and LigA131-1224aa (rLigAFull) when administered with Alum Hydroxide as adjuvant, either individually or combined, in order to identify formulations that are capable of inducing a protective response against homologous challenge. Male and female hamsters were immunized with the preparations by intramuscular injection on days 0 and 14, and the homologous challenge was performed using Leptospira interrogans serovar Copenhageni strain Fiocruz L1-130, by intraperitoneal injection on day 28. Following expression and purification of the four proteins were obtained four batches with a purity of 90%. All four recombinant proteins showed antigenicity, reacting against human sera with convalescent leptospirosis. Immunization of hamsters with preparations containing rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11, and rLigAFull conferred variable protection (0-100%) against homologous challenge. Although no preparation has induced a sterilizing protection, evidenced by the isolation and immunofluorescence techniques, the association between rLigANI and rLigBRep was able to confer significant protection (p <0.05) in all experiments. In contrast, the LigAFull as well as rLigB7-11, did not provide protection. Our study has proposed a new approach for the development of a recombinant vaccine against bovine leptospirosis. It is the first study that tested the rLigA in its entire form. Furthermore, it was possible to obtain expression in soluble form. Although the protein obtained has been recognized by sera from convalescent human in vitro, it was only capable of conferring significant levels of survival (p <0.05) to challenged animals but not in relation to mortality. Moreover, the association between rLigBRep and rLigANI, another novel approach, testing showed that even at different doses (40 g ou 60 g) of each target, both the analysis of the mortality and survival showed significant results (p <0.01) in three of the five experiments. The results obtained in our study represent an important contribution to the development of a vaccine against leptospirosis.

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Os antígenos protéicos da membrana externa parecem ser a melhor alternativa para substituir as vacinas atualmente disponíveis, porém, após diversos estudos, nenhum apresentou resultados satisfatórios. O objetivo deste trabalho foi avaliar antígenos recombinantes e preparações vacinais, capazes de conferir proteção de amplo espectro, em hamsters (Mesocricetus auratus). Neste estudo, quatro novas proteínas recombinantes de Leptospira spp foram obtidas e testadas no modelo de leptospirose aguda em hamster para avaliar vacinas experimentais. A análise in silico do genoma de L. interrogans sorogrupo Icterohaemorrhagie sorovar Copenhageni cepa FIOCRUZ L1-130 foi realizada para identificar genes alvo potenciais para o desenvolvimento de vacinas de subunidade. Quatro genes foram selecionados para expressão de proteínas recombinantes em sistema de expressão heteróloga em Escherichia coli: lic10260, lic10365, lic11207 e lic11360, que codificam para prováveis lipoproteína de membrana externa. Os genes foram amplificados a partir do DNA genômico de L. borgpeterseni sorogrupo Ballum cepa 4E. Os procedimentos de clonagem resultaram nos vetores recombinantes pAE/lic10260, pAE/lic10365, pAE/lic11207 e pAE/lic11360. As proteínas recombinantes foram eficientemente expressas nesse sistema de expressão e posteriormente, utilizadas na imunização de hamsters que foram subsequentemente desafiados com dose letal de L. borgpeterseni sorovar Ballum 4E. A resposta imune humoral induzida pelas proteínas foi avaliada por ensaio imunoenzimático (ELISA) e verificou-se que, pelo menos uma das formulações vacinais para cada proteína produziu resposta humoral significativa estatisticamente (p < 0,05). As proteínas rLIC10260, rLIC10365, rLIC11207 e rLIC11360 mostraram-se imunogênicas, tornando promissora sua utilização como vacinas contra leptospirose. / Leptospirosis is a widespread zoonosis caused by spirochetes from genus Leptospira. The disease is considered a problem in both public health and veterinary areas, affecting mainly tropical and subtropical developing countries. In veterinarian medicine, leptospirosis is an important disease for both clinic and production sectors due to the public health risks, reproductive failures and death, culminating in considerable economic losses for the area. Animal vaccination is taken as a prevention measure, however the acquired protection by the vaccines is, in most cases, weak and allows the spreading of the disease. The outer membrane antigens seems to be the best alternative to substitute the currently available vaccines, however, after several studies, none of them presented satisfactory results. The aim of the present work was the production and evaluation of four recombinant antigens in order to elicit broad spectrum protection in hamster, the susceptible experimental model (Mesocricetus auratus). An in silico analysis in L. interrogans serogroup icterohaemorrhagie serovar Copenhageni strain FIOCRUZ L1-130 was run in order to identify potential genes for subunit vaccine development. Four genes were selected, amplified, cloned into vectors and expressed in Escherichia coli: lic10260, lic10365, lic11207, lic11360. These gene products are potential outer membrane lipoproteins and were amplified from L. borgpeterseni serugroup Ballum strain 4E. The cloning procedures resulted in the recombinant vectors pAE/LIC10260, pAE/LIC10365, pAE/LIC11207 and pAE/LIC11360 and its purified products were inoculated in hamsters and their humoral response was evaluated per Enzyme-linked Immunossorbent Assay (ELISA). It was possible to verify that at least one of the vaccinal preparations for each protein was able to induce statistically significant humoral response (p < 0.05). The four obtained proteins showed immunogenic response, making them promising recombinant antigens for use against leptospirosis.