A ovinocultura é um sistema de criação muito antigo em nosso país e ainda continua apresentando uma série de problemas que dificultam a produção econômica desses animais e necessitam de urgentes soluções. Visando minorar estes prejuízos esta pesquisa foi idealizada com o intuito de realizar um estudo minuncioso das principais enfermidades reprodutivas parasitárias e bacterianas. Todos os animais foram submetidos ao exame clínico geral e específico do sistema reprodutor e colheram-se amostras de soro, sêmen, abortamentos, lóquios, secreções, fezes e zaragatoa prepucial e vaginal dependendo da enfermidade a ser estudada. Não foi possível o isolamento nos fetos de nenhum agente etiológico. Conclui-se que a toxoplasmose é a enfermidade de maior importância nos rebanhos de estado de São Paulo e a de maior fator de risco em casos de abortamentos, a neosporose estaria relacionada principalmente com animais que apresentam repetição de cio, leptospirose foi observado em baixa titulação e a mais prevalente foi a Leptospira australis sorovar australis proveniente de animais silvestres, a campilobacteriose e a brucelose são as duas enfermidades da reprodução com menor ocorrência no estado. Foi isolado o primeiro caso de endometrite no Brasil por Histophilus somni. Foi isolado o primeiro caso de orquite por Actinobacillus seminis no estado de São Paulo. / Sheep industry is a traditional system in Brazil and presents a series of issues that complicate economical exploitation and urgently need solution. In order to reduce losses this research was idealized to carefully study the major bacterial and parasitary reproductive diseases. All animals were submitted to a general and specific reproductive system clinical examination. Blood, semen, abortions, lochia, vaginal discharges, feces, and preputial/vaginal swabs were collected according to the studied disease. It was not possible to isolate any etiological agent from aborted fetuses. The conclusion was that toxoplasmosis was the major disease on São Paulo herds and has the biggest risk factor in abortions, neosporosis would be related to animals that present heat repetition, leptospirosis was observed with low antibodies titles and the most prevalent was Leptospira australis sorovar australis arising from wild animals, campilobacteriosis and brucellosis are both the reproductive diseases with the lowest occurrence in the state. The first endometritis case caused by Histophilus somni. In Brazil was isolated. The first orchitis case caused by Actinobacillus seminis in São Paulo state was isolated.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. No mundo, aproximadamente 500.000 casos são reportados a cada ano, com 10% de taxa de mortalidade. Atualmente, vacinas contra leptospirose são compostas por células inativadas e são ineficazes em diferentes aspectos. Após analise do genoma, os genes LIC11121, LIC11087, LIC11228 e LIC11084 foram escolhidos para caracterização da imunogenicidade de suas respectivas proteínas. Esses genes foram clonados no vetor de expressão pAE e as proteínas recombinantes foram purificadas. Os resultados sugerem que essas proteínas podem estar localizadas na membrana externa, são imunogênicas, possivelmente expressas durante a infecção e que podem ter envolvimento em mecanismos de evasão do sistema imune e de patogenicidade da bactéria. Além disso, em um de dois experimentos, a proteína rLIC11084 induziu imunidade protetora parcial em hamsters imunizados frente desafio letal. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. In the world, nearly 500,000 cases are reported each year, with 10% of mortality rate. Currently, vaccines against leptospirosis are composed by inactivated cells that are ineffective in many aspects. After genome analysis, the genes LIC11121, LIC11087, LIC11228 e LIC11084 were chosen for immunogenicity characterization of their respective proteins. These genes were cloned in the pAE expression vector and the proteins encoded by LIC11087, LIC11228 and LIC11084 were purified. The results suggest the localization of these proteins in the bacterial outer membrane, are immunogenic, are possibly expressed during infection and may have involvement in mechanisms of immune system evasion and pathogenicity. Moreover, in one of two experiments, the rLIC11084 protein induced partial protective immunity of immunized hamsters against lethal challenge.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. O sequenciamento do genoma completo de L. interrogans sorovar Copenhageni tem permitido a obtenção e caracterização de proteínas potencialmente envolvidas na patogênese desta bactéria, como lipoproteínas e proteínas de membrana externa. Neste trabalho, foram estudados três genes, OmpL1, LIC10731 e LIC10645, dos quais o gene OmpL1 foi o mais frequente em diferentes espécies de Leptospira. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade ao metal. As três proteínas recombinantes promoveram resposta humoral e celular após imunização em camundongos. Ensaios de adesão mostraram que as proteínas se ligam à laminina e plasminogênio, e adicionalmente a proteína OmpL1 se liga ao fibrinogênio e fibronectina plasmática. A proteína OmpL1 foi bastante reativa com soro de pacientes de leptospirose. Os resultados sugerem que as proteínas referentes aos genes estudados podem desempenhar um papel na patogênese da bactéria. / Leptospirosis is a zoonosis caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. Annotation of the genome sequences of L. interrogans serovar Copenhageni allows the identification and characterization of proteins potentially involved in the pathogenesis of this bacterium, such as lipoproteins and outer-membrane proteins. The present study characterized three genes, OmpL1, LIC10731 and LIC10645, and one of them, OmpL1, was the most frequent among different species of Leptospira. The recombinant proteins were purified by metal-chelating chromatography. All three recombinant proteins promoted humoral and cellular response after immunization in mice. Binding assays showed that all proteins interact to laminin and plasminogen, and additionally protein OmpL1 binds to fibrinogen and plasma fibronectin. OmpL1 was highly reactive with positive-leptospirosis human sera. The results suggest that the proteins encoded by these genes may play a role in the bacterium pathogenesis.

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Resultados experimentais demonstraram que a patogênese pode estar relacionada com a capacidade destas bactérias em aderir a proteínas da matriz extracelular, escapar da resposta imune do hospedeiro e de produzir toxinas. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas por Leptospira interrogans sorovar Pomona estirpe Fromm kennewicki (patogênica) e Leptospira biflexa sorovar Patoc estirpe Patoc I (saprófita), através de análise proteômica. As leptospiras foram cultivadas em meio EMJH suplementado com soro de coelho ou albumina bovina. Os sobrenadantes foram filtrados, dialisados e liofilizados para aplicação das tecnologias de análise proteômica utilizando gel bidimensional e análise em solução. A análise dos peptídeos obtidos, nos dois procedimentos, foi realizada utilizando-se LC/MS/MS. Foi possível a identificação de 159 proteínas diferentes nas amostras de L.interrogans, entre as quais 64 foram positivas em pelo menos uma das ferramentas usadas para a predição. Em L. biflexa, 104 proteínas diferentes foram identificadas, entre elas 43 proteínas foram positivas pela análise in silico. Entre as proteínas identificadas, estão aquelas que possuem peptídeo sinal sec ou tat dependentes. Em outras, a predição da localização celular é desconhecida ou podem ter múltiplos sítios de localização, e ainda, proteínas que não possuem peptídeo sinal e que podem ser secretadas por mecanismos não convencionais. Muitos destas são proteínas hipotéticas sem domínios conservados detectados. No que diz respeito à atividade proteolítica, foi identificada a presença de metaloproteases no secretoma de L.interrogans. Não houve detecção da presença significativa de proteases bacterianas em amostras de L. biflexa. A identificação e a caracterização funcional de proteínas secretadas poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos patogênicos e no desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento e prevenção de leptospirose. / Leptospirosis is a zoonosis of worldwide distribution caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira. The mechanisms by which leptospires invade the host and cause the disease are not yet fully understood. Experimental results have shown that the pathogenesis may be related to the ability of these bacteria to bind to extracellular matrix proteins, to escape hosts immune responses and to produce toxins. This work aimed to identify secreted proteins by Leptospira interrogans serovar Pomona strain Fromm kennewicki (pathogenic) and Leptospira biflexa serovar strain Patoc Patoc I (saprophyte) through proteomic analysis. The leptospires were grown in EMJH supplemented with rabbit serum or BSA. Supernatants were filtered, dialyzed and lyophilized to proteomic technology, two-dimensional gel and non-gel. The analysis of the obtained peptides in two procedures was performed using LC/MS/LC. It was possible to identify 159 different proteins in the samples of L.interrogans; among them, 64 were positive proteins in at least one of the tools used for prediction. In L. biflexa, 104 different proteins were identified; among them, 43 positive proteins were positive by in silico analysis. Among the identified proteins are those that possess sec or tat dependent signal peptide. In others, the prediction of the cellular location is unknown or may have multiple sites of localization, and even proteins which have no signal peptide can be secreted by unconventional mechanisms. Many of these are hypothetical proteins with no detected putative conserved domains. The presence of metalloproteases has been identified in the L.interrogans´ secretome, using proteolytic assay. There was no significant detection of the presence of bacterial proteases in samples of L. biflexa. The identification and functional characterization of secreted proteins may contribute to the elucidation of pathogenic mechanisms and in the developing of new strategies for the treatment and prevention of leptospirosis.

A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas que possuem estratégias para driblar a ação do sistema complemento ao interagir com diversos reguladores negativos, como a vitronectina. Neste projeto, avaliou-se a interação de vitronectina com três proteínas de membrana de Leptospira: LigA, LigB e LcpA. Verificou-se que essas interações ocorrem nas porções C-terminais das proteínas e nos domínios de ligação com heparina da vitronectina. Essas proteínas também se ligam a C9 e são capazes de impedir a formação do poro in vitro e a formação do MAC em um ensaio clássico de hemólise. Essas proteínas de Leptospira interagem com diversos reguladores negativos do sistema complemento. Ensaios de competição demonstram que estes reguladores interagem simultaneamente com as proteínas através de sítios distintos. A caracterização funcional de proteínas e a descoberta de novos mecanismos utilizados por esse patógeno para sobreviver no hospedeiro podem auxiliar nossa compreensão no que diz respeito a aspectos relacionados à clínica e à prevenção da leptospirose. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira that have strategies to escape the action of the complement system interacting with several negative regulators, such as vitronectin. In this project, we evaluated the interaction of vitronectin with three Leptospira membrane proteins: LigA, LigB and LcpA. It has been found that such interactions occur at the C-terminal portions of these proteins and the heparin binding domain of vitronectin. These proteins also bind to C9 and are capable of preventing the formation of the pore in vitro and the formation of MAC in a classical test of hemolysis. These proteins interact with various Leptospira negative regulators of the complement system. Competition assays demonstrated that both interact with these regulatory proteins through distinct sites. The functional characterization of these proteins and the discovery of new mechanisms used by this pathogen to survive in the host may help our understanding with regard to clinical aspects and prevention of leptospirosis.

A leptospirose é causada por bactérias do gênero Leptospira e constitui um problema de saúde pública mundial, por acometer humanos e animais. Sua patogênese ainda é pouco esclarecida, especialmente quanto aos processos de invasão, adesão e colonização dos hospedeiros. Recentemente, proteínas secretadas por leptospiras foram identificadas por proteômica e análises in silico, algumas das quais apresentam possível envolvimento no desenvolvimento de quadros hemorrágicos, bem como podem ser possíveis antígenos para diagnóstico. Sendo assim, o presente trabalho propôs a clonagem em vetor de expressão heteróloga bacteriano das sequências codificantes das proteínas Sph2, LipA, ColA e LipL32 de L. interrogans sorovar Copenhageni, caracterização funcional das proteínas recombinantes purificadas e estudo do seu potencial uso no diagnóstico para a leptospirose. Essas proteínas foram escolhidas por possivelmente estarem envolvidas na patogênese de leptospiras. Para tanto, as sequências correspondentes aos genes das proteínas foram clonadas nos vetores de expressão em Brevibacillus choshinensis e Escherichia coli. A produção de soro policlonal e técnicas de ELISA, western-blotting e imuno-histoquímica foram realizadas para avaliar a funcionalidade das proteínas recombinantes purificadas. Também foram realizados testes de comprovação e caracterização da atividade enzimática para proteína LipA, que se apresenta como uma provável lipase na análise in silico. Os resultados obtidos mostraram que o sistema de expressão em Brevibacillus foi eficiente na expressão das proteínas, porém com baixo rendimento na purificação das proteínas Sph2, ColA e LipA. A proteína recombinante LipL32 purificada não apresentou diferença na sua atividade antigênica, em relação aos dois sistemas de expressão utilizados. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína LipA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. A proteína LipA apresentou atividade lipásica sobre ésteres graxos de p-nitrofenil, sendo uma provável lipase euritérmica. Os dados obtidos com a análise de imuno-histoquímica sugerem que esta proteína possa participar dos eventos que levam a lesões na membrana celular no tecido hepático. Resultados de ELISA com soro de pacientes mostraram que as proteínas ColA e Sph2 são potenciais antígenos para diagnóstico da leptospirose. Apenas a proteína ColA apresentou ação hemorrágica na pele de camundongos. Estes resultados indicam que as proteínas LipA, ColA e Sph2 podem estar envolvidas em mecanismos patogênicos na leptospirose. / Leptospirosis is caused by bacteria of the genus Leptospira and it is a public health problem worldwide, for affecting humans and animals. Its pathogenesis is still unclear, especially regarding the processes of invasion, adhesion and colonization of hosts. Recently, proteins secreted by leptospires were identified by proteomics and in silico analyzes, some of which present possible involvement in the development of hemorrhagic conditions, as well they could be possible antigens for the diagnosis. Thus, the present work proposed the cloning into bacterial heterologous expression vectors of the coding sequences of the Sph2, LipA, ColA and LipL32 proteins of L. interrogans serovar Copenhageni, the functional characterization of the purified recombinant proteins and the study of their potential use in the diagnosis for the Leptospirosis. These proteins were chosen because they may be involved in the pathogenesis of leptospires. To that end, the coding sequences were cloned into the expression vectors in Brevibacillus choshinensis and Escherichia coli. The production of polyclonal serum and ELISA, Western-blotting and immunohistochemistry techniques were performed to evaluate the functionality of the purified recombinant proteins. Also, tests were carried out to prove and characterize the enzymatic activity of LipA protein, which presents as a probable lipase in the in silico analysis. The obtained results showed that the expression in the Brevibacillus system was efficient, but with low yield in the purification of Sph2, ColA and LipA proteins. The purified recombinant LipL32 protein showed no difference in its antigenic activity, in relation to the two expression systems used. Western-blotting experiments demonstrated the presence of LipA protein in different pathogenic serovars of Leptospira spp. The LipA protein showed lipase activity on p-nitrophenyl fatty esters, being a probable eurythermic lipase. The data obtained with the immunohistochemical analysis suggest that this protein can participate in the events that lead to cell membrane lesions in the hepatic tissue. ELISA results using serum from patients showed that ColA and Sph2 proteins are potential antigens for the diagnosis of leptospirosis. Only the ColA protein presented hemorrhagic action on the mice skin. These results indicate that LipA, ColA and Sph2 proteins may be involved in pathogenic mechanisms in leptospirosis.

Este trabalho visa investigar a resposta sorológica para glicolipoproteína (GLP) de leptospiras com a finalidade de padronizar o uso deste antígeno em testes sorológicos para o diagnóstico da leptospirose humana. Dentre as proteínas envolvidas na patogenicidade das leptospiras, a GLP ainda não foi estudada quanto a imunogenicidade e quanto ao seu emprego como antígeno na detecção de anticorpos específicos. Assim, dot-ELISA para detecção de anticorpos IgG e IgM, com o emprego de GLP de leptospiras patogênica e não patogênica, foi padronizado. Foram testadas amostras pareadas de soros de 90 pacientes com leptospirose confirmada sorologicamente por MAT, sendo as primeiras amostras colhidas na fase aguda da doença e as segundas amostras após 10 a 15 dias. Foram testadas também amostras únicas de 30 pacientes de diferentes patologias, que apresentaram resultados negativos no MAT, pertencentes ao grupo controle. A detecção de anticorpos IgG não mostrou resultados satisfatórios, tendo sido, o seu estudo, descontinuado. Os resultados do dot-ELISA IgM mostraram sensibilidade de 100% nas amostras colhidas após soroconversão no MAT e a precocidade de detecção foi demonstrada pela alta positividade nas amostras colhidas na fase aguda da doença (76,6% para dot-ELISA com antígeno de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni e 90% com antígeno de Leptospira biflexa sorovar Patoc). A especificidade foi alta (96,6%), porém o dot-ELISA utilizando ambos os antígenos apresentou 3,3% de resultados falso-positivos. Este estudo demonstrou a importância da resposta imune humoral ao antígeno GLP de leptospiras. A utilização da GLP, no teste dot-ELISA para detecção de anticorpos IgM permitiu realizar o diagnóstico sorológico de forma simples, rápida e com alta eficiência diagnóstica. / The aim of this work was the study of serologic response against leptospira glycolipoprotein (GLP) for the purpose of standardizing its use as an antigen on serological tests to diagnose human leptospirosis. Among the proteins involved in the pathogenicity, GLP is yet to be studied regarding its immunogenicity and its use as an antigen in the detection of specific antibodies. That led to our standardization of dot-ELISA for detecting IgG and IgM antibodies, using GLP extracted from either pathogenic Leptospira interrogans serovar Copenhageni or nonpathogenic Leptospira biflexa serovar Patoc. Paired serum samples were taken from 90 patients with serologically confirmed leptospirosis, by MAT, with the first samples collected on the disease\'s acute phase and the second samples after a period of 10 to 15 days. We also tested single samples taken from 30 patients with other diseases, MAT negative, belonging to the control group. Detection rates for IgG antibodies were unsatisfactory, so the study for that use was discontinued. The dot-ELISA IgM results yielded 100% sensitivity on the samples taken after MAT seroconversion. The early detection pattern was evidenced by the high positivity rate on the samples taken during the disease\'s acute phase (76,6% dot-ELISA using Leptospira interrogans serovar Copenhageni antigen and 90% using Leptospira biflexa sorovar Patoc antigen). Specificity rates were high (96.6%), although a 3.3% rate of false-positive results was observed for dot-ELISA using both antigens. The present study revealed the importance of the humoral immune response against the GLP antigen. The use of GLP, on the dot-ELISA test for IgM antibodies afforded a simple, quick and effective diagnosis.

Leptospirosis is a zoonotic disease of global importance caused by pathogenic Leptospira species. Dogs are reservoir hosts for pathogenic Leptospira and can act as potential transmission sources of the disease. Identification of such individuals and characterization of leptospires involved in chronic infections may promote a better understanding of the role of dogs in the epidemiology of particular leptospiral strains and the overall contribution of dogs to environmental contamination in urban and rural scenarios. The present work describes the identification of dogs presenting asymptomatic urinary shedding of different pathogenic Leptospira species among stray and sheltered dog populations, as well as the characterization of leptospiral strains isolated from chronic carriers. Blood and urine samples were taken from three different populations: (I) 92 dogs kept in a public shelter at the University of São Paulo campus; (II) seven stray dogs living inside the University of São Paulo campus; and (III) 24 dogs kept in a public shelter from the city of Mogi das Cruzes. Dogs identified as urinary shedders by PCR-based DNA detection were prospectively evaluated in order to confirm persistent renal carriage of the pathogen and to recover viable leptospires for proper characterization. Leptospiruric dogs were identified in all populations studied. Quantitative PCR targeting the lipL32 gene and the 16S rRNA detected urinary shedding in 10 dogs (10,87%) from population I: two of these dogs were recently admitted at the facility and one dog was adopted immediately after presenting large quantities of leptospires in urine. Prospective evaluation of nine leptospiruric dogs enabled the identification of two chronic carriers, allowing the recovery of leptospires from both dogs. The strains were further characterized by MLST analysis and serogrouping, thus confirming infection caused by L. interrogans serogroup Canicola and L. santarosai serogroup Sejroe. Two leptospiruric dogs (28,5%) were detected in population II by 16S and secY PCR amplification; one dog presented persistent urinary shedding of L. interrogans, but no isolates could be recovered. The other leptospiruric dog presented asymptomatic infection caused by L. santarosai and could not be reevaluated. Only one dog from population III (4,1%) presented leptospiruria detected by PCR; the dog could not be reevaluated, however sequence analysis revealed infection caused by L. santarosai. The results indicate the first report of L. santarosai infection in dogs. Asymptomatic infection caused by this leptospiral species was observed in all populations studied, thus indicating a possible role of dogs in the chain of transmission of this particular pathogen. The results also suggest a possible genetic distinction between lineages of Brazilian L. santarosai maintained by dogs and other animal hosts. Isolation and persistent chronic carriage of L. santarosai found shows that dogs can persistently harbor leptospires other than L. interrogans. This study also points out that dogs can be inadvertently admitted and adopted in dog shelters, potentially increasing the risks of occupational and zoonotic transmission by bringing infected animals closer to shelter workers, adopters and their households. / A leptospirose é uma doença zoonótica de importância global causada por espécies patogênicas do gênero Leptospira. Cães são hospedeiros de manutenção de leptospiras patogênicas e podem atuar como potenciais fontes de infecção da doença. A identificação de tais indivíduos e a caracterização de leptospiras envolvidas na infecção crônica podem ajudar a compreender o papel dos cães na epidemiologia da doença tanto em ambientes rurais quanto urbanos. O presente trabalho descreve a identificação de cães errantes e mantidos em abrigos coletivos com eliminação assintomática de leptospiras patogênicas, além de descrever também a caracterização das diferentes estirpes obtidas de cães cronicamente infectados. Amostras de sangue e urina foram coletadas de 3 populações distintas: (I) 92 cães mantidos em um abrigo coletivo localizado dentro da Universidade de São Paulo; (II) sete cães errantes capturados dentro do campus da Universidade de São Paulo; e (III) 24 cães mantidos em um abrigo coletivo localizado na cidade de Mogi das Cruzes. Cães identificados como leptospirúricos por técnicas moleculares (PCR) foram prospectivamente avaliados para confirmar a persistência da eliminação bacteriana e para obter isolamento da cepa infectante e sua subsequente caracterização. A amplificação de fragmentos dos genes 16S rRNA e lipL32 permitiu a identificação de 10 cães (10,87%) leptospirúricos na população I. Dois dos 10 cães haviam sido recentemente admitidos no local, e outro cão foi adotado logo após apresentar grandes quantidades de leptospiras na urina. A avaliação prospectiva de nove animais leptospirúricos permitiu a caracterização da infecção crônica e assintomática em dois cães, o que possibilitou o isolamento de leptospiras de ambos os animais. As cepas foram tipificadas pelas técnicas de MLST e sorogrupagem, caracterizando duas cepas distintas, sendo elas L. interrogans sorogrupo Canicola e L. santarosai sorogrupo Sejroe. Dois cães leptospirúricos (28,5%) foram identificados na população II pela amplificação por PCR dos genes 16S rRNA e secY; um deles apresentou eliminação persistente de L. interrogans, no entanto não foi possível o isolamento do patógeno. O outro cão leptospirúrico não pôde ser reavaliado, entretanto a análise filogenética permitiu identificar infecção causada por L. santarosai. Apenas um cão da população III (4,1%) apresentou eliminação de leptospiras na urina, que foi confirmada pela amplificação de fragmento dos genes 16S rRNA e secY; o cão não pôde ser reavaliado, no entanto a análise filogenética dos fragmentos amplificados confirmou infecção causada por L. santarosai. Os resultados indicam o primeiro registro de infecção causada por L. santarosai em cães. A ocorrência da infecção assintomática causada por essa espécie nas três populações avaliadas indica um possível papel dos cães na cadeia de transmissão desse patógeno em centros urbanos, além de demonstrar que cães podem se tornar portadores de diferentes espécies de leptospiras. Os resultados sugerem uma possível distinção genotípica de cepas de L. santarosai mantidas por cães quando comparadas com estirpes desta espécie isoladas de outros hospedeiros. O presente estudo também foi capaz de demonstrar que cães leptospirúricos podem ser inadvertidamente admitidos ou adotados em abrigos coletivos, aumentando potencialmente os riscos de transmissão ocupacional e zoonótica da doença.

Orientador: Raul José Silva Girio / Banca: Iveraldo dos Santos Dutra / Banca: Luís Antonio Mathias / Banca: Humberto Eustáquio Coelho / Banca: Sonia Regina Pinheiro / Resumo: No presente estudo, 100 fêmeas bovinas foram divididas em cinco tratamentos de 20 animais cada. Os grupos experimentais receberam quatro diferentes vacinas comerciais (B, C, D e E), e um grupo permaneceu como controle. Amostras foram colhidas no dia da aplicação da primeira dose e nos dias 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 120, 150 e 180 pós-vacinação (pv). A triagem dos animais foi feita pela análise sorológica com 24 antígenos de leptospiras, escolhendo-se os animais não reagentes. Os títulos de anticorpos foram monitorados pela soroaglutinação microscópica (SAM) com os sorovares Canicola, Grippotyphosa, Hardjo, Icterohaemorrhagiae, Pomona e Wolffi. Todas as vacinas induziram, aos 3 dias pv, títulos de anticorpos aglutinantes para os sorovares Hardjo e Wolffi, que persistiram até o 150o dia pv. Os sorovares Hardjo e Wolffi induziram os maiores títulos de anticorpos aglutinantes. A vacina D, apesar de não possuir o sorovar Wolffi em sua composição, foi capaz de induzir anticorpos aglutinantes contra este sorovar. Somente foram detectados anticorpos contra o sorovar Canicola nos animais vacinados com a bacterina D. A vacina que induziu os maiores títulos médios de anticorpos, considerando todos os sorovares testados, foi a D. Há a necessidade de melhoria no poder imunogênico e na concentração dos sorovares utilizados como antígenos nas vacinas comerciais. / Abstract: In this research 100 heifers were used, divided in 5 groups of 20 animals each. The four experimental groups were vaccinated using distinct commercial polyvalent bacterines: A, B, C and D, and a group was the control. Samples were collected at the days 0, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 42, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 120, 150 and 180 from the first injection of the vaccine. The selection of the animals for the experimental groups was done based on a serological screening with 24 antigens of Leptospira sp., constituted by non-reagent animals. The vaccine titres were monitored using the microscopic agglutination test (MAT) for Canicola, Grippotyphosa, Hardjo, Icterohaemorrhagiae, Pomona and Wolffi serovars. All vaccines used were capable to product agglutinins for the Hardjo and Wolffi serovars observed at 3 days after vaccination, remaining until the 150th day; these serovars induced the highest titres of agglutinins. The vaccine D, in spite of not containing the Wolffi serovar, was able to induce the production of agglutinins to this serovar. Agglutinins to the Canicola serovar were only observed in the animals vaccinated with the D bacterine. The vaccine D induced the highest average titres of antibodies to all serovars tested. The improvement of the immunogenic power and serovars concentration utilized as antigens of the commercial vaccines are necessary. / Doutor

Orientador: José Luiz Laus / Banca: Aline Adriana Bolzan / Banca: Fabrício Villela Mamede / Banca: Delphim da Graça Macoris / Banca: Marcia Rita Fernandes Machado / Resumo: A doença endógena inflamatória uveal em equinos constitui resposta imunopatogênica complexa, onde se admite a participação de uma variedade de antígenos. A uveíte recorrente dos equinos (URE), também denominada ophthalmia periódica ou moon blindness, é uma panuveíte e constitui-se na causa mais comum de diminuição da percepção visual, cuja patogênese permanece, ainda, sob investigação. Inúmeras pesquisas apontam para a hipótese de hipersensibilidade a antígenos bacterianos. A maioria dos estudos mostra evidências de infecção por Leptospira sp.. Examinaram-se, ao acaso, os olhos de 29 animais e coletaram-se o soro, o humor aquoso e o corpo vítreo para proteinograma e aglutinação microscópica para Leptospira sp.. Outrossim, fragmentos de córnea, íris, retina e coróide para histopatologia e imunoistoquímica. A prova de aglutinação microscópica identificou 14 animais positivos, seis animais com titulação igual a 40 e nove indivíduos negativos para as amostras de soro. Houve um animal positivo na amostra de humor aquoso e na de corpo vítreo e outro negativo na de soro (titulação 40), mas positivo na de corpo vítreo. Foram encontrados os sorovares icterohaemorrhagiae, autumalis, patoc, sentot, habdomadis. Foram identificadas, à eletroforese do soro, as proteínas: imunoglobulina A; ceruloplasmina; trasnferrina; hemopexina; albumina; anti-tripsina; imunoglobulina G de cadeia pesada; haptoglobina; glicoproteína ácida; imunoglobulina G de cadeia leve e proteína de 25kda. A única proteína que mostrou resultado estatístico significativo foi a ceruplasmina (p=0,05) com animais soropositivos para leptospirose. À histopatologia a espessura da córnea foi significativamente maior nos animais soropositivos (p=0,0347). O exame imunistoquímico para pesquisa da bactéria Leptospira sp. mostrou maior... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Endogenous uveal inflammatory disease in the horse represent a complex immunopathological response to a range of presumed antigens. Equine recurrent uveitis (ERU) is a panuveitis and the most commmon cause of blindness in horses. Many researchers favour the hypothesis that ERU is delayed type hypersensitivity response to bacterial antigens. New findings show evidence of leptospiral infection in ERU eyes. Fifity eight eyeballs from twenty nine horses randomly selected were studied using histopathology and immunohistochemistry. The serum from 29 animals, aqueous humor an vitreous body from 58 eyes were collected for proteinogram and microscopic agglutination test (MAT) for Leptospira sp.. The microscopic agluttination test was identified 14 positive animals, six with titer 40 and nine negative in serum samples. One seropositive animal was positive in aquaeous humor and vitreous body and another seronegative horse was positive in vitreous body. Were found five serovars from 26 studied from Leptospira interrogans: icterohaemorrhagiae, autumalis, patoc, sentot, habdomadis. Were identified by serum electrophoresis, the following proteins: immunoglobulin A; ceruloplasmin; trasnferrina; hemopexina; albumin, anti-trypsin, the heavy chain of immunoglobulin G; haptoglobin; glycoprotein, immunoglobulin G and the light chain protein, 25kda. The only protein that showed significant results with seropositive horses was ceruplasmin (p = 0.05). The pathomorphologic changes on HE-stained sections showed that seropositive animals for leptospirosis had corneal thickness significantly higher than the seronegative (p = 0.0347). The immunohistochemistry test for Leptospira sp. showed higher positivity in samples of cornea, and some animals were seronegative but positive for this test. At immunohistochemistry was observed that the anti-metalloproteinase... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor