<p> Studies examining the characteristics of membranes that facilitate and affect fusion are central to understanding the intricacies of inter- and intra-cellular fusion processes and expanding the existing knowledge of other roles membranes may have. In this thesis a model membrane system, using Sendai Virus and Egg phosphatidylcholine (EggPC) liposomes containing the receptor glycophorin A (proteoliposomes), was used in examining different fusion with proteoliposomes prepared by different methods. For the first time glycophorin A was incorporated into EggPC liposomes vectorially. This was accomplished separately with two detergents: octylglucoside and CHAPS. Fusion of Sendai Virus with the reconstituted proteoliposomes revealed that octylglucoside reconstituted proteoliposomes exhibited lower fusion compared with CHAPS reconstituted proteoliposomes. Efforts to determine the basis for this difference, using either proteinase K or O-glycosidase digestion and subsequent fragment analysis using SDS-PAGE and silver-staining, were inconclusive. A separate study examined the ability of large membrane-anchored biopolymers (chosen in virtue of their large hydrophilic domains) to sterically stabilize Egg PC liposomes. Glycophorin A, the lipophosphoglycan (LPG) from Leishmania donovani, and a polyethyleneglycol-conjugated phospholipid (PEG5000-PE) were incorporated into Egg PC liposomes. In each case, binding of a soluble fluorescent probe, NeutrAvidin Oregon Green, to liposomes containing biotin-conjugated lipid was restricted. This supports the idea that large membrane-anchored biopolymers are able to sterically stabilize liposomes.</p> / Thesis / Master of Science (MSc)

La barrière hémato-encéphalique protège le cerveau de par son imperméabilité. Cela empêche toutefois le passage de potentielles molécules thérapeutiques contre les maladies du système nerveux central. En effet, à cause de leurs poids moléculaire et de leurs propriétés physicochimiques, nombreuses sont les molécules thérapeutiques développées par l’industrie pharmaceutique qui ne parviennent pas à atteindre leur cible au cerveau car elles sont bloquées par cette barrière. Les objectifs de mes travaux sont donc de valider puis de modifier des formulations d’immunoliposomes PEGylés pour améliorer leur devenir intracellulaire dans les cellules endothéliales des capillaires cérébraux qui forment la barrière hématoencéphalique. Après injection chez la souris, les liposomes atteignent les capillaires mais nous ne sommes pas parvenus à démontrer qu’ils y livrent leur contenu. Pour se faire, différentes formulations ont été testées in vitro et in vivo chez des modèles murins. Cela a permis de confirmer que les anticorps et les lipides formant les immunoliposomes atteignent bien les cellules endothéliales des capillaires du cerveau. Toutefois, le devenir du contenu des immunoliposomes reste incertain. Par la suite, l’idée était d’utiliser des fragments Fab’ à la surface des liposomes plutôt que des anticorps complets. Toutefois, la digestion des anticorps n’est pas complète et l’obtention de fragments Fab’ pures très complexe. Cela reste donc à améliorer avant de conjuguer les fragments aux liposomes.

No / This work investigated the effect of electroporation on human epidermal penetration of a model neutral lipophilic compound (estradiol) from saturated aqueous solution and when encapsulated in ultradeformable liposomes. Total amount penetrated and skin deposition were compared with values obtained from passive diffusion. The effect of electrical pulsing on liposome size was investigated. The action of phosphatidylcholine on skin that was structurally altered by such pulses was determined. Electroporation did not affect liposome size. Skin pulsing considerably increased estradiol penetration and skin deposition from solution, relative to passive delivery, with subsequent partial recovery of skin resistance to molecular penetration. Surprisingly, with liposomes, electroporation did not markedly affect estradiol skin penetration. Importantly, liposomal phosphatidylcholine applied during or after pulsing accelerated skin barrier repair, i.e. provided an anti-enhancer or retardant effect.

Les analogues de nucléosides (AN), sont des agents importants dans le traitement d’hémopathies malignes et de certaines tumeurs solides. Le catabolisme rapide, la résistance cellulaire au traitement et le grand volume de distribution dans le corps limitent potentiellement l’efficacité thérapeutique des AN. Notre objectif est de concevoir un vecteur permettant un ciblage de ces molécules vers les tissus cancéreux, assurant son internalisation cellulaire et sa protection dans les milieux biologiques. Trois types de vecteurs de taille micronique, submicronique et moléculaire ont été élaborés et caractérisés : microparticules polymériques à base de poly(ε-caprolactone) (PCL), liposomes multilamellaires et complexes d’inclusion de la prodrogue de la cytarabine (Ara-C), qui est active sur certaines lignées cellulaires résistantes à l’Ara-C, l’AraC-SATE (bis(tbutyl-S-acyl-2-thioethyl)-cytidine monophosphate).Les microparticules ont été préparées par la méthode de « double émulsion - évaporation de solvant » en utilisant comme surfactants des copolymères amphiphiles composés de blocs biodégradables de PCL et de blocs bio-éliminables de polyéthylène glycol (PEG). Une série de copolymères mPEG-PCL avec des blocs PCL de différents poids moléculaires a été synthétisée et l’effet de la longueur de chaînes de PCL sur les caractéristiques physico-chimiques des particules a été étudié. Une efficacité d’encapsulation satisfaisante a pu être obtenue, qui a été dix fois plus importante que celle des microparticules à base de PCL seul. Les liposomes ont été préparés par la méthode d’injection d’éthanol. Une étude de formulation a été réalisée afin de sélectionner la formule permettant d’obtenir la meilleure efficacité d’encapsulation. Le test d’internalisation cellulaire et du comportement aérodynamique des liposomes nébulisés ont montré la pertinence des liposomes élaborés pour le ciblage des cellules pulmonaires qui pourrait être d'un grand intérêt pour le traitement des métastases au niveau des poumons.L’encapsulation moléculaire de l’AraC-SATE dans l’hydroxyporpyl-β-cyclodextrine a été réalisée pour augmenter la solubilité apparente de la prodrogue. L’évaluation des complexes sur des cultures de cellules leucémiques murines a montré une activité cytotoxique comparable à celle de la prodrogue indiquant que l’inclusion moléculaire ne modifie pas l’activité biologique de la prodrogue. / Nucleoside analogues (NA) are important agents in the treatment of haematological malignancies and solid tumours. Their rapid catabolism, cell resistance and overdistribution in the body jeopardize the NA chemotherapy. Our objective is to design a vector for these molecules targeting cancerous tissue and ensuring its cellular internalization and protection in the biological media. Micro-sized, nano-sized and molecular vectors were developed and characterized: polymeric microparticles of poly (ε-caprolactone) (PCL), multilamellar liposomes and inclusion complexes of the prodrug of cytarabine (Ara-C), which is active on some cell types resistant to treatment, the AraC-SATE (bis(tbutyl-S-acyl-2-thioethyl)-cytidine monophosphate).The microparticles were prepared by the "double emulsion - solvent evaporation" method using as surfactants, amphiphilic copolymers consisting of biodegradable blocks (PCL) and bio-removable blocks (polyethylene glycol, PEG). A series of copolymers mPEG-PCL with PCL blocks of different molecular weights was synthesized and the effect of PCL chain length on the particle physico-chemical properties was studied. Satisfactory encapsulation efficiency could be obtained, which was 10 times greater than that of microparticles prepared with PCL alone. Liposomes were prepared by the ethanol injection method. A formulation study was conducted in order to select the formula having the optimal encapsulation efficiency. Investigations about the cell internalization and the aerodynamic behaviour of the nebulized liposomes showed the relevance of developed liposomes for targeting lung cells that could be of great interest for the treatment of metastases in the lungs. The molecular encapsulation of the AraC-SATE in the hydroxyporpyl-β-cyclodextrin was carried out in order to increase the apparent solubility of the prodrug. The evaluation of inclusion complexes on murine leukemic cell cultures showed a cytotoxic activity comparable to that of the prodrug indicating that the molecular inclusion does not alter the biological activity of the prodrug.

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement du cancer qui utilise la combinaison d'un photosensibilisant, de la lumière et d'oxygène moléculaire. L'application de nanosubstances liposomales pour délivrer les photosensibilisants dans la tumeur est devenu un sujet important de la recherche en PDT.La présente étude porte sur les formulations liposomales conventionnelles et stériquement stabilisées de photosensibilisant mTHPC, Foslip® et Fospeg®, dans le but de déterminer les paramètres pour l'optimisation de la PDT liposomale. La caractérisation du comportement in vitro de la mTHPC liposomale a été étudiée, particulièrement sa localisation, l'état d'agrégation et les propriétés photophysiques des drogues dans les liposomes. Nous avons démontré l'état monomérique de la mTHPC dans les vésicules lipidiques et une localisation partielle du mTHPC dans Fospeg® dans la partie PEG des liposomes, alors que la majeure partie est liée à la bicouche lipidique. Nous avons ensuite étudié les cinétiques de relargage des drogues, le mode de liaison aux protéines et la destruction des liposomes dans le sérum. Dans ce but, une méthodologie basée sur la fluorescence pour estimer le relargage de la mTHPC à la fois in vitro et in vivo a été développée. Le relargage de la mTHPC des liposomes PEGylés a été retardé par rapport aux liposomes conventionnels et la destruction des liposomes a été considérablement diminuée. La connaissance de tous ces paramètres permet de mieux prédire le taux de relargage de la drogue, les paramètres pharmacologiques et l'effet tumoricide in vivo. Le traitement PDT pourrait être plus avantageux avec le Fospeg® comparé à la mTHPC incorporée dans les liposomes conventionnels / Photodynamic therapy (PDT) is a photochemical-based modality of cancer treatment that uses a combination of a photosensitizer, light and molecular oxygen. Application of liposomal nanocarriers to deliver photosensitizers to tumor targets has become a major direction of PDT research. The present study investigates conventional and sterically stabilized liposomal formulations of the photosensitizer mTHPC, Foslip® and Fospeg®, with a view to determine the parameters for optimizing liposomal PDT. The characterization of in vitro behaviour of liposomal mTHPC was conducted, with an emphasis on drug localization, aggregation state and photophysical properties of the compounds in liposomes. We demonstrated the monomeric state of mTHPC in lipid vesicles and a partial localisation of mTHPC in Fospeg® in a PEG shell, while the main part was bound to the lipid bilayer. We further studied the drug release kinetics and binding pattern to serum proteins and the destruction of liposomes in serum. With this aim, a fluorescence-based methodology of estimating mTHPC release both in vitro and in vivo was developed, as well as an in vitro assay to characterize liposome destruction. The release of mTHPC from PEGylated liposomes was delayed compared with conventional liposomes along with greatly diminished liposome destruction. Knowledge of these parameters allows to better predict the drug release rate, pharmacological parameters and in vivo tumoricidal effect. The PDT treatment could be more advantageous with Fospeg® compared to mTHPC embedded in conventional liposomes

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement du cancer qui utilise la combinaison d'un photosensibilisant, de la lumière et d'oxygène moléculaire. L'application de nanosubstances liposomales pour délivrer les photosensibilisants dans la tumeur est devenu un sujet important de la recherche en PDT. La présente étude porte sur les formulations liposomales conventionnelles et stériquement stabilisées de photosensibilisant mTHPC, Foslip® et Fospeg®, dans le but de déterminer les paramètres pour l'optimisation de la PDT liposomale. La caractérisation du comportement in vitro de la mTHPC liposomale a été étudiée, particulièrement sa localisation, l'état d'agrégation et les propriétés photophysiques des drogues dans les liposomes. Nous avons démontré l'état monomérique de la mTHPC dans les vésicules lipidiques et une localisation partielle du mTHPC dans Fospeg® dans la partie PEG des liposomes, alors que la majeure partie est liée à la bicouche lipidique. Nous avons ensuite étudié les cinétiques de relargage des drogues, le mode de liaison aux protéines et la destruction des liposomes dans le sérum. Dans ce but, une méthodologie basée sur la fluorescence pour estimer le relargage de la mTHPC à la fois in vitro et in vivo a été développée, ainsi que d'un essai in vitro pour caractériser la destruction des liposomes. Le relargage de la mTHPC des liposomes PEGylés a été retardé par rapport aux liposomes conventionnels et la destruction des liposomes a été considérablement diminuée. La connaissance de tous ces paramètres permet de mieux prédire le taux de relargage de la drogue, les paramètres pharmacologiques et l'effet tumoricide in vivo. Le traitement PDT pourrait être plus avantageux avec le Fospeg® comparé à la mTHPC incorporée dans les liposomes conventionnels.

Thesis (M.Sc.)--Memorial University of Newfoundland, 2003. / Bibliography: leaves 96-124.

Les flavonoïdes sont des pigments d’origine naturelle conférant leurs couleurs aux fleurs et aux fruits, identifiés dans plus de quatre milles espèces. Les flavonoïdes sont classés selon leur structure chimique de base formée par deux cycles aromatiques reliés par trois carbones : C6-C3-C6, chaîne souvent fermée en un hétérocycle oxygéné hexa- ou pentagonal. Les flavonoïdes présentent des activités physiologiques qui leurs permettent d’être utilisés comme médicaments notamment pour leur pouvoir à piéger les radicaux libres. Les activités de flavonoïdes ont fait l’objet de nombreux articles de revue. Parmi les flavonoïdes, la quercétine est la molécule la plus distribuée dans la nature qui présente la meilleure activité anti radicalaire et aussi antiinflammatoire comparativement aux autres molécules de la même famille. En général, les flavonoïdes et la quercétine en particulier présentent une solubilité très limitée dans l’eau, cette limitation réduit leur absorption/pénétration et donc leur efficacité. En partant de l’idée que la peau est le l’organe le plus grand du corps humain et aussi l’organe le plus exposé au stress oxydant lié aux radiations UV et aux produits corrosifs et irritants, la quercétine est donc une molécule antioxydante de choix pour être appliquée sur la peau. Le premier objectif de thèse a été de développer plusieurs formulations nanométriques de quercétine afin d'augmenter sa solubilité dans l’eau et améliorer ses propriétés physico chimiques. Le deuxième objectif sera de comparer ces formulations en termes de capacité de chargement de quercétine, de toxicité vis à vis des cellules HaCaT (kératinocytes) THP-1 (monocytes) et Vero (épithéliale), et enfin le maintien de l’activité de la quercétine sur les cellules in vitro, pour mettre in fine en évidence une augmentation de la pénétration cutanée la quercétine in vivo.Dans ce projet, trois approches de formulations nanométriques (smartCrystals®, nanocapsules lipidiques et liposomes) ont été testées pour améliorer la solubilité de la quercétine. Les formulations sont optimisées en termes de procédé de préparation (transposition industrielle) et de composition des excipients pour augmenter la quantité de quercétine formulée. Les formulations ont été caractérisées sur plusieurs paramètres : taille, PDI, taux de chargement en quercétine, état cristallin et cinétique de libération de quercétine in vitro. Ensuite, les formulations ont été comparées entre elles sur les cellules HaCaT et THP-1 avec détermination de leur toxicité et activité protectrice. Enfin, deux formulations (quercétine smartCrystals® avec le TPGS et quercétine LNC 20) ont été sélectionnées et comparées in vivo pour évaluer l’amélioration de la pénétration cutanée de quercétine. Ce projet propose une solution pour formuler la quercétine d’une façon pertinente et efficace qui pourra être extrapolée au niveau industriel pour des applications cutanées de molécules peu solubles dont l'efficacité est limitée par leur faible pénétration cutanée. / Flavonoids are plants pigments. Flavonoids can be observed by the naked eye as they form the amazing colors of flower petals. Flavonoids are classified on the basis of their chemical structure composed of two aromatic cycles connected by three carbons: C6-C3-C6, chains are closed in hexa- or pentagonal oxygenated heterocyclic ring. Flavonoids present interesting physiological activates that permit their usefulness as medicaments, especially for their free radical scavenging ability. Indeed, flavonoids activates were the object of numerous review articles.Among flavonoids, quercetin is the molecule the most distributed in nature that presents the strongest antioxidant and antiinflammatory activities in comparison to other molecules of this family. In general flavonoids and specially quercetin present poor water solubility, thus limiting their absorption/penetration and as a result their efficiency.Starting for the idea that the skin is the largest organ of the human body and the organ, which the most exposed to oxidative stress due to UV irradiation or other corrosive and irritating chemicals. Quercetin is a candidate for skin supplementation with exogenous antioxidant. The first objective of the thesis is to develop several formulations at the nanometric range for quercetin, in order to increase its water solubility and to enhance its physicochemical properties. The second objective is to compare these formulations in terms of quercetin loading capacity, cellular toxicity of quercetin and its formulations on HaCaT cells (keratinocytes), THP-1 cells (monocytes) and Vero cells (epithelial). Then, the protective activity of quercetin in vitro on cells to finally put in evidence the increase of quercetin in vivo skin penetration in formulations.In this project, three nanoformulations approaches (smartCrystals®, lipid nanocapsules and liposomes) were tested for the increase of quercetin water solubility. The formulations were optimized for scale up to industrial scale at the level of preparation method, also in the excipients compositions for higher affinity to quercetin. The formulations were characterized in terms of particle size, PDI, quercetin loading, crystallinity evaluation and quercetin in vitro release profile. Then, formulations were compared in interaction with HaCaT and THP-1 cells for their cellular toxicity and protective activity. Finally, two formulations (quercetin smartCrystals® with TPGS and quercetin lipid nanocapsules 20) were selected and compared for the enhancement of the in vivo skin penetration of quercetin.This project propose a solution for the successful formulation of quercetin enabling its efficient skin delivery. This project can be extrapolated to industrial level for quercetin and other poorly water soluble molecules that present limited efficiency due to their low skin penetration capacity.

A la recherche d’innovations, l’industrie cosmétique est constamment en quête de nouvelles matières premières. Les ingrédients naturels sont particulièrement en vogue. Ces travaux de thèse ont poursuivis trois objectifs. Tout d’abord, une étude a permis d’évaluer l’impact des formulations cosmétiques sur les développements microbiens. En second lieu, le développement d’un ingrédient antimicrobien naturel pour les cosmétiques a été engagé dans le cadre d’un projet collaboratif : Natubaval. Un extrait végétal a tout particulièrement été étudié. Il a été optimisé pour une incorporation en formulation simplifiée. L’activité antimicrobienne de l’extrait optimisé a été validée grâce au challenge test. Ayant noté que l’un des métabolites contenus dans l’extrait antimicrobien participant fortement à l’activité pouvait présenter une instabilité dans certaines circonstances. De plus, les conservateurs naturels sont connus pour présenter une activité moins durable que ceux issus de la synthèse. Nous avons donc développé un système d’encapsulation et vectorisation d’actifs naturels. Les extraits végétaux étant des mélanges très complexes, il nous à paru judicieux, dans un premier temps, de développer le modèle d’encapsulation à partir de deux analytes modèles : la rutine et la naringénine. Un système vésiculaire a été développé et optimisé. Des mesures granulométriques, des rendements d’encapsulation et d’adsorption, une cinétique de fuite, un test d’activité biologique et des essais d’incorporations en formulations cosmétiques ont été réalisés pour valider le modèle. Une fois développé, Celui-ci a été appliqué avec succès à l’extrait végétal antimicrobien. / Looking for innovation, cosmetic industry used even more new materials. Natural products are specially used. Our study evaluated the impact of cosmetic formulations on microbial developments. Then, a natural antimicrobial ingredient for cosmetics was developed. One vegetal extract was particulary studied. It was optimized for an easy introduction in cosmetic products. Antimicrobial activity of the natural extract was confirmed with challenge test. As some metabolites of the interesting extract could be instable in specific conditions and as natural preservatives are often less actives than the synthetics ones, an encapsulated system was developed. Vegetal extracts are complex mix of differents molecules. that is why, the encapsulated system was first developed with the standards: rutin and naringenin. A multilamellar vesicles system was developed and optimized. Particles sizes, encapsulation and adsorption yields, leak kinetik, biological test of activity and cosmetic incorporation were done to validate the model. Finally, the encapsulated system was applied with success for the encapsulation of the natural extract.

Dans ce travail, nous avons pu sélectionner par la méthode SELEX un aptamère à ARN modifié, appelé Apt1, qui se lie avec une haute affinité au récepteur CD44. L'aptamère sélectionné a été modifié avec par des 2'-F-pyrimidines afin d’augmenter sa stabilité vis-à-vis des nucléases pour une application thérapeutique. Cet aptamère a été ensuite greffé sur des liposomes contenant des séquences de siRNA dirigées contre un gène rapporteur, dans le but d’un ciblage actif des cellules tumorales exprimant le récepteur CD44. Cette fonctionnalisation a été réalisée par la conjugaison d’un dérivé 3'-thiol de Apt1 et un dérivé maléimide de phospholipides, directement à la surface des liposomes, ou bien séparément puis par post-insertion sur les liposomes. Les liposomes ainsi formulés présentent une forte affinité pour les cellules exprimant le CD44 sans déclencher de réponse inflammatoire au sein de ces cellules. En outre, nous montrons que l'inhibition du gène rapporteur est augmentée et prolongée lorsque l’aptamère est couplé aux liposomes chargés aux siRNA, in vitro ainsi qu’in vivo sur un modèle murin orthotopique de cancer du sein. De tels vecteurs de siRNA constituent donc un outil prometteur pour le ciblage actif de tumeurs exprimant le récepteur CD44. L'étape suivante consistera charger ces vecteurs par des séquences de siRNA permettant de réprimer des oncogènes. / In this work we succeeded to select a modified RNA aptamer, named Apt1, to bind the human CD44 receptor protein with high affinity using the Systemaic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) method. The selected aptamer was modified with 2'-F-pyrimidines to increase its stability against nucleases for therapeutic applications. Furthermore, we designed and characterized aptamer-functionalized liposomes loaded with siRNA molecules against a reporter gene as a model drug delivery system for the active targeting CD44-expressing tumor cells in vitro and in vivo. Such functionalization was performed by conjugation of 3'-thiol-modified Apt1 to maleimide-modified phospholipids, either on the surface of liposomes, or separately, followed by post-insertion onto liposomes. The targeted liposomes displayed high affinity for CD44-positive cells without triggering any inflammatory response within these cells. Moreover, we show that a higher and prolonged inhibition of the targeted gene can be achieved when siRNA-loaded liposomes are functionalized by the aptamer, both in vitro and in vivo on a murine orthotopic breast cancer model. Such a delivery system may thus be a useful tool for the active targeting of CD44-expressing tumors and silencing oncogenes in vivo.