Orientador: Lucimara Gaziola de la Torre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-23T18:43:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zompero_RafaelHenriquedeFreitas_M.pdf: 2571362 bytes, checksum: c3df7d704fb350757e99b3e400dee050 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Este trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento e otimização de um processo escalonável de produção de lipossomas contendo ?-caroteno, visando sua posterior aplicação em produtos de interesse da indústria alimentícia. Para tanto, os efeitos das variáveis que influenciam o processo foram analisados, proporcionando um maior conhecimento a respeito da fenomenologia envolvida na produção dos nanoagregados e maior controle sobre as respostas produzidas pelo sistema. O ?-caroteno é um antioxidante natural, pró-vitamínico e que pode ser empregado como corante natural em formulações alimentícias. Porém sua elevada hidrofobicidade dificulta a aplicação em alimentos de base aquosa. Dentre as metodologias disponíveis para produção de lipossomas, o método de injeção de etanol apresenta-se como o mais facilmente adaptável as necessidades da indústria, possuindo baixo custo de implantação e operação. Na primeira etapa deste trabalho o método de injeção de etanol foi investigado visando a otimização dos parâmetros operacionais para a produção de nanoagregados tendo como objetivo obter propriedades físico químicas tais como diâmetro médio e polidispersidade de forma. Análises estatísticas dos resultados foram realizadas para determinação dos efeitos de cada variável e modelos foram desenvolvidos para predição do comportamento do sistema em diferentes condições de processo. Em seguida, a incorporação de ?-caroteno nos lipossomas obtidos na melhor condição foi avaliada em razões ?-caroteno/lipídio pré-definidas. Ensaios de incorporação de ?-caroteno aos lipossomas revelaram que proporções molares ?-caroteno/lipídio de até 0,5% mostram-se estáveis e solúveis em meio aquoso, resultado confirmado pelos ensaios de monocamadas de Langmuir realizados. A formulação otimizada foi submetida a testes de estabilidade em condições controladas de stress e, em um segundo momento, incorporada a nanofibras de álcool polivinílico e óxido de polietileno através de processo de electrospinning, conferindo proteção extra ao ?-caroteno internalizado. Estas nanofibras produzidas foram caracterizadas quanto a morfologia, diâmetro, presença de fosfolipídios, homogeneidade da distribuição de ?-caroteno e estabilidade a exposição a luz ultravioleta. Testes de rehidratação destas nanofibras foram conduzidos, verificando através de microscopia eletrônica de transmissão a liberação de lipossomas na fase aquosa. Dessa forma, a partir dos resultados obtidos conclui-se que o método de injeção de etanol foi otimizado, sendo que os efeitos de cada uma das variáveis de processo foram elucidados, contribuindo para o desenvolvimento tecnológico da técnica. Os ensaios de aplicação de condições de stress mostram que existe uma barreira a ser vencida no que diz respeito a estabilidade de lipossomas em formulações alimentícias complexas, principalmente para situações de elevada concentração de sacarose e altos teores de NaCl. Por fim, os testes de incorporação em nanofibras mostraram-se bastante promissores, mostrando a viabilidade e benefícios que podem ser agregados ao sistema através da utilização de técnica de eletrofiação contribuindo no desenvolvimento de novos materiais e produtos a serem utilizados pelo setor industrial alimentício / Abstract: The main goal of the present work was the development and optimization of a scalable process for production of ?-carotene loaded liposomes, aiming its application in the food industry. In that way, the effects of the variables that have influence on the process were analysed, providing greater information about the phenomenology evolving the production of these nano aggregates and improved control over the system responses. ?-carotene is a natural antioxidant, pro-vitaminic, and can be employed as a natural colorant in food formulations. However, its high hydrophobicity makes it difficult to be applied in water based foods. The development of feasible processes that can be implemented in the food industry for ?-carotene encapsulation is a actual research challenge. On the first step of this work the ethanol injection method was investigated aiming process parameters optimization for liposomes production with controlled size and polidispersity. Statistical analyses of the results were performed for variables effects determination and mathematical models development for system behaviour prediction. Then, ?-carotene incorporation on liposomes produced at the optimized condition was evaluated studying different ?-carotene/lipid ratios. ?-carotene incorporation experiments revealed that 0.5% ?-carotene/lipid ratios show to be stable and soluble in aqueous media, result confirmed by Langmuir monolayer experiments. The optimized formulation was submitted to stability tests under controlled stress conditions and, in a second stage, incorporated to polyvinyl alcohol and polyethylene oxide nanofibers using electrospinning technique for extra ?-carotene protection. The produced nanofibers were characterized regarding morphology, diameter, phospholipids presence, ?-carotene homogeneity and stability to UV light exposure. Nanofibers rehydration tests were conducted, verifying using transmission electron microscopy that liposomes were released in the aqueous media. In that way, from the obtained results we can conclude that the ethanol injection method was successfully optimized and the evaluation of the effects of each variable was elucidated, contributing to the technological development of the technique. Experiments regarding application of different stress conditions to liposomes formulations show that there is a barrier that must be overcome related to stability of liposomes to complex food formulations. Finally, incorporation tests on nanofibers showed to be promising, demonstrating the feasibility and benefits that can be aggregated to the system by using electrospinning, contributing to the development of new materials and products to be used by the food processing industries / Mestrado / Engenharia Química / Mestre em Engenharia Química

Oximas têm sido extensivamente usadas como antídoto para envenenamento por organofosforados e como desontaminante. Micelas e vesículas, utilizadas como catalisadores e transportadores de drogas, constituem agentes potenciais para tratamento e descontaminação. Neste trabalho descrevemos a reação de p-Nitrofenildifenilfosfato (PNPDPP), um substrato modelo para organofosforado, com: acetofenoxima (I); ácido 10- fenil-10-hidroxiiminodecanóico (II); 4-(9-carboxinonanil)-1-(9-carboxi-1-hidroiimino nonanil) benzeno (III); cloreto de N-dodecilpiridina (IV); cloreto N-metilpiridina 2-aldoxima (V), na presença de micelas catiônicas e zwitteriônicas de cloreto de hexadeciltrimetilamônio, CTAC e N-Hexadecil-N,N-dimetil-1-propano sulfonato, HPS, respectivamente, e vesículas catiônicas de dioctadecildimetilamônio, DODAC. O pKa aparente, pKap, das oximas em agregados de anfifilicos, a constante de velocidade de segunda ordem de oximólise em micelas ou vesículas, km, e as constantes de velocidade observadas para a oximólise de PNPDPP, kobs, foram determinadas espectrofotometricamente, a pH constante, variando-se a concentração dos anfifílicos. Os resultados foram analisados usando as teorias: modelo de pseudofase (PP) e modelo de pseudofase com considerações de troca iônica (PIE), descrita na literatura pelo nosso grupo. As constantes de segunda ordem para oximólise de PNPDPP em água, kox, determinadas foram 6,5 M^-1 min^-1 (I, II e III) e 2,8 M^-1 min^-1 (IV e V). O kobs máximo em micelas e vesículas, kobsmax, e o kobs em água, kw, no mesmo pH, foram utilizadas para calcular o fator de aceleração máxima, AF, para cada anfifílico (AF = kobsmax/kw). Os agregados catalisam a decomposição de PNPDPP e os valores de AF (e km) foram da ordem de 10^4 (32 min^-1), 10^4 (125 min^-1) e 10^6 (80 min^-1) para a reação da oxima IV com CTAC, HPS e DODAC, respectivamente. A análise quantitativa da dependência da concentração de agregados anfifílicos na oximólise mostrou um considerável aumento da constante de velocidade da reação produzido por micelas e vesículas (maior que 8 x 10^6 vezes). Esse efeito é parcialmente devido a: concentração local dos reagentes, efeitos nos pKas dos nucleófilos e, mais importante, mudança na reatividade intrínseca das oximas. / Oximes have been extensively used as antidotes and decontaminants of organophosphates. Micelles and vesicles, catalysts and drug transport agents, constitute potential vehicles for Oxime treatment. Here we describe the reaction of p-nitrophenyldiphenylphosphate (PNPDPP) with: acetophenoxime (I); 10-phenyl-10-hydroxyiminodecanoic acid (II); 4-(9-carboxynonanyl)-1-(9-carboxy-1-hydroyiminononanyl) benzene (III); N-dodecylpyridinium chloride (IV); N-methylpyridinium 2-aldoxime chloride (V), in the presence of cationic and zwitterionic micelles, hexadecyltrimethylammonium chloride, CTAC and N-Hexadecyl-N,N-dimethyl-1-propanesulfate, HPS, respectively, and cationic vesicles of dioctadecyldimethylammonium, DODAC. The apparent pKa, pKap, of the oximes in the amphiphile aggregates, the second order rate constants of oximolysis in micelles and vesicles, km, and the observed rate constants for PNPDPP oximolysis, kobs, were determined spectrophotometrically at constant varying amphiphilic concentrations. The results were analyzed using the pseudo-phase theory (PP) and pseudo-phase / ion exchange (PIE). The second order rate constant for (uncatalyzed) oximolysis of PNPDPP were 6.5 M^-1 min^-1 (I, II and III) and 2.77 M^-1 min^-1 (IV and V). From the maximum value of kobs in micelles and vesicles, kobsmax, and the value of kobs in water, kox, at the same pH, the maximum acceleration factor, AF, were calculated (AF = kobsmax / kw). The amphiphiles catalyzed the oximolysis of PNPDPP and the values of AF (and km) were ca 10^4 (32 min^-1), 10^4 (125 min^-1) and 10^6 (80 min^-1) for the reactions of Oxime IV in CTAC, HPS and DODAC, respectively. Quantitative analysis of the amphiphile concentration-dependence of rates demonstrated that the considerable rate increase produced by micelles and vesicles on the rate of oximolysis (up to 8 x 10^6 fold) is partly due to reagent concentration in the aggregate, effects on the pKas of the nucleophiles and, more importantly, catalysis.

Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-07-24T21:35:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FreitasJunior_BasilinoBarbosade_M.pdf: 3155817 bytes, checksum: 30e64c9192c504a966de16830fe25bf2 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Ácaros encontrados na poeira doméstica são aracnídeos que representam uma das principais fontes desencadeadores de doenças alérgicas. Dentre esses ácaros existe a espécies Blomia Tropicalis, causadora de Rinite Alérgica. As glicoproteínas encontradas no corpo dos ácaros Blomia Tropicalis são os componentes alergenos responsáveis pelo desencadeamento do processo alérgico. Um dos problemas enfrentados na imunoterapia de doenças alérgicas é a qualidade do alergeno empregado e a regularidade de exposição do alergeno ao sistema imunológico, a qual é ainda pouco definida. O desenvolvimento de terapias alternativas na forma de apresentação controlada do alergeno ao sistema imunológico é de extrema importância no entendimento do mecanismo de ação dos imunoterápicos e no tratamento de doenças alérgicas. Lipossomas ou vesículas lipídicas, são estruturas ocas formadas por fosfolipídios agregados, capazes de encapsularem substâncias de natureza tanto hidrofílica como hidrofóbica. Essas características fazem dos lipossomas um sistema muito promissor para diversas aplicações, dentre as quais a liberação controlada de medicamentos. Neste trabalho realizou-se a extração e caracterização das glicoproteínas alergênicas existentes no corpo dos ácaros da espécie Blomia Tropicalis, bem como o seu encapsulamento em lipossomas e caracterização das vesículas obtidas / Abstract: House dust mites represent one of the major sources of allergic diseases. Among them, there is a class named Blomia Tropicalis which causes Allergic Rhinitis. The substances mainly responsible for the beginning of the allergic are glycoproteins from Blomia Tropicalis. One of the problems of immunotheraphy related to allergic diseases is the quality of allergen used and the regularity of exposition to immunological system, these parameters are not well defined in immunoytheraphy yet. Developing new immunotherapicis is a very important issue in order to excell the existing treatments and promote a comprehensive analysis of the mechanism of immunotherapicis action. Liposomes or lipid vesicles are empty particles composed of phospholipids able to encapsulate hydrophilic and hydrophobic molecules. Liposomes are very powerful systems for several applications including controlled drug delivery. This work focuses on the encapsulation and characterization of liposome containing glycoproteins extracted from Blomia Tropicalis mites. The encapsulation and separation process has beer analysed in terms of efficiency as function of protein/lipid ratio in the initial solution / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T09:51:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_BeatrizZanchetta_M.pdf: 8346831 bytes, checksum: e0ef805cafa3599b49c6d357c8849853 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Atualmente, os lipossomas elásticos têm se destacado em relação aos lipossomas convencionais (LC), pela capacidade de atingir as camadas mais profundas da pele. Neste trabalho, lipossomas elásticos foram preparados e caracterizados quanto às suas propriedades físico-químicas, de permeação in vitro e ex vivo, e aplicados ao tratamento tópico da leishmaniose cutânea. Estes lipossomas foram compostos de lecitina de ovo, e tiveram a sua superfície modificada pela incorporação do tensoativo PEG:8L, formando os lipossomas peguilados (LP). O fármaco encapsulado foi uma chálcona sintética nitrogenada (CH8), que vem se destacando como substância antiprotozoária e apresenta dificuldade de permeação através da pele. Os resultados obtidos mostram que o PEG-8L é incorporado na bicamada lipídica dos LC, produzindo maior fluidez e elasticidade. A incorporação do PEG-8L também modifica a tensão superficial e o potencial zeta dos LC. A encapsulação da CH8 foi verificada em ambos os casos (LC e LP), com modificações na morfologia, diâmetro médio, tensão superficial e temperatura de transição de fase em relação aos LC vazios. Os estudos de permeação em membranas sintéticas de nanoporos (in vitro) mostraram que os LP possuem maior capacidade de permeação que os LC, e que a CH8 produz elasticidade aos LC aumentando sua capacidade de permeação em relação aos LP contendo CH8. Os estudos de permeação em pele de orelha de porco (ex vivo) mostraram que a CH8, em ambos os tipos de lipossomas, foi capaz de permear as camadas da pele e atingir a derme. Os resultados in vivo no tratamento da leishmaniose em camundongos mostraram que as formulações lipossomais foram mais eficientes que a CH8 livre, destacando-se a eficácia da CH8 em LC, cuja ação foi semelhante à aplicação da CH8 livre intralesional. Os resultados obtidos mostram o desenvolvimento tecnológico da preparação de LC e LP contendo CH8, e contribuem para o tratamento mais eficaz da leishmaniose cutânea. / Abstract: Nowadays, elastic liposome (EL), has gained attention when compared with conventional liposome (CL), by its capacity of reach the skin's deepest layers. In this work, elastic liposome were prepared and characterized by its physic-chemical properties, in vivo and ex vivo permeation, and its application for cutaneous leishimania topical treatment. The liposome was composed by egg lecithin, and had it surface modified by the incorporation of PEG-8L tensoactive, forming PEGylated liposome (PL). The encapsulated drug was a synthetic nitrogened chalcone (CH8), which has aroused as anti-protozoa substance and presents difficult permeation through the skin. Results obtained shows that PEG-8L was incorporated on LC's lipid bilayer, producing enhanced elasticity and fluidity. PEG- 8L incorporation also modifies the superficial tension and zeta's potencial of the CL. CH8's encapsulation was observed in both cases, presenting modification at morphology, mean diameter, superficial tension and phase transition's temperature when related with empty CL. The permeation studies in synthetic nanopores' membranes (in vitro) showed that PL has higher permeation capacity than CLf and CH8 produced some elasticity to CL increasing its permeation capacity even when related to PL containing CH8. The pig's ear skin permeation studies (ex vivo) showed that CH8 in both liposome types was capable of permeate the skin layers, reaching the dermis. Mice leishimania treatment in vivo results showed that the liposomal formulation was more efficient that free CH8, underling CH8's efficiency in CL, in which the action was similar to free CH8 intra-wound application. Results showed the technological development of CL and PL containing CH8 that contribute to a more efficiency treatment of coetaneous leishmania. / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Eneida de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T06:03:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Couto_VeronicaMuniz_M.pdf: 2320216 bytes, checksum: fdeaa0b57898e701ff2245fa5c39eded (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os anestésicos locais (AL) são utilizados para se bloquear a sensação de dor em procedimentos clínicos e odontológicos. Porém, os AL são moléculas pequenas que facilmente se redistribuem no sitio de ação, limitando a duração da anestesia. A dibucaína (DBC) é um anestésico local da família das amino-amidas e tem uso predominante como anestésico tópico. Este trabalho teve por finalidade desenvolver um novo sistema de liberação sustentada para o anestésico local dibucaína baseado em lipossomas de fosfatidilcolina de soja hidrogenada e colesterol com gradiente iônico transmembranar, para uso parenteral. Primeiramente, avaliamos uma metodologia analítica para quantificação de DBC por cromatografia líquida de alta eficiência. Entao, foram então desenvolvidas formulações de lipossomas unilamelares (LUV) e multivesiculares (LMVV) com gradiente iônico (citrato e sulfato), para encapsulação da DBC a 0,012%. As formulações foram caracterizadas quanto à eficiência de encapsulação (%EE) potencial zeta, diâmetro e polidispersão. O potencial zeta de todas as formulações foi sempre negativo (ca. -30 mV). Formulações de LUV contendo sulfato (LUVDBC5.5+sulfin/7.4ex) apresentaram %EE (62,6% ± 4,3) significativamente maior que as demais formulações. As LUV apresentaram tamanho médio de 500 nm, sendo mais estáveis e menos polidispersas que as LMVV. As formulações LUV foram selecionadas para a continuidade do estudo, sendo caracterizadas morfologicamente por microscopia eletrônica de transmissão e testadas quanto a sua estabilidade química, liberação in vitro, viabilidade celular e atividade antinociceptiva em camundongos. As micrografias das LUV confirmaram a formação de vesículas esféricas e unilamelares. Nenhuma formulação apresentou níveis de peroxidação lipídica significativa (> 0,5% de lipídios totais) durante 150 dias de armazenamento a 4oC. A formulação LUVDBC5.5+sulfin/7.4ex apresentou o melhor perfil de liberação sustentada in vitro e aumento significativo no tempo de bloqueio sensorial (27 h) in vivo, em comparação com solução de DBC (11 h) de igual concentração. Nos testes de viabilidade celular não houve mudança significativa no perfil da citotoxicidade induzida por DBC, encapsulada ou não. Portanto, nesse trabalho reportamos o preparo e caracterização de uma formulação lipossomal de liberação sustentada para DBC, com alta eficiência de encapsulação e capaz de promover um significativo aumento (ca. 2,5 vezes) no tempo de analgesia in vivo / Abstract: Local anesthetics (LA) are used in medical and dental procedures to decrease pain sensation. However, LA are small molecules that easily diffuse in the site of action, restricting the duration of anesthesia. Dibucaine (DBC) is an amino-amide local anesthetic, which major use as a topical agent. This study aimed the development of a new drug delivery system for dibucaine based on liposomes with transmembrane ion-gradient, for parenteral drug administration. First, an analytical methodology for DBC quantification through high performance liquid chromatography was determined. Then, large unilamellar (LUV) and multivesicular (MLVV) liposome formulations were prepared with internal ionic-gradients for the encapsulation of DBC (0.012 %). The formulations were characterized regarding their encapsulation efficiency (%EE), zeta potential, average size and polydispersity. The zeta potential of all formulations was always negative (ca. -30 mV). Sulfate-containing LUV formulations (LUVDBC5.5 sulfin/7.4out) showed 62.6% ± 4.3 EE, which was significantly higher than all other formulations. LUV presented an average size of 500 nm and proved to be less polidisperse and more stable than LMVV, being selected for further morphological (by transmission electron microscopy), storage chemical stability, in vitro release, cell viability and in vivo analgesic tests. Micrographs proved that LUVs were spherical and unilamellar shape. No formulation showed lipid peroxidation level higher than 0.5 % of total lipids during 150 days of storage at 4oC. LUVDBC5.5 sulfin/7.4out presented increased in vitro sustained release profile and significant increase in sensory block duration (27 h) in vivo, than a equivalent DBC solution (11 h). No changes in the cytotoxicity effect of the anesthetic were observed for DBC free or encapsulated. Therefore, this study reports the successful preparation and characterization of a liposomal formulation for the sustained release of DBC with high encapsulation efficiency and that is able to significantly prolong (ca. 2.5 times) the duration of analgesia in vivo / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestra em Ciências

Neste trabalho foram sintetizadas seis novas aminas lipofílicas fluorescentes contendo cadeias alquílicas de diferentes tamanhos, derivadas de compostos heterocíclicos do tipo 2-(2'-hidroxifenil)benzazólicos. Suas estruturas foram confirmadas através das técnicas de Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e Carbono, bem como Espectroscopia de Absorção na região do Infravermelho e Espectrometria de Massas de Alta Resolução. As moléculas sintetizadas foram incorporadas em lipossomas compostos por fosfatidilcolina (PC) da lecitina de soja e lipossomas de PC contendo o anfifílico glicoconjugado (C22PEG900GlcNAc), em proporção de 1:1. Ambos foram obtidos pelo método de evaporação em fase reversa. A caracterização destes se deu por experimentos de potencial zeta (PZ) e espalhamento de luz dinâmico (DLS). Os lipossomas apresentaram altos valores de potencial zeta, mesmo após um período de 30 dias mantidos à temperatura ambiente, sugerindo que estes sistemas apresentam estabilidade coloidal contra processos de agregação. Análises feitas por DLS indicaram que os lipossomas apresentam um diâmetro de 100 nm, tanto na ausência como na presença das moléculas sintetizadas. Foi realizado o estudo fotofísico das aminas em solventes orgânicos e em solução de tampão fosfato salino (pH 7,2), através de medidas de absorção na região do UV–Vis e emissão de fluorescência. Além disso, através de estudo fotofísico, foi avaliada a inserção das aminas nos lipossomas. O coeficiente de partição das moléculas nos lipossomas foi determinado e os altos valores apresentados indicam alta lipofilicidade das mesmas, além disso, através destas medidas foi verificado que estas tendem à saturação com o aumento da cadeia alifática indicando maior afinidade pelo ambiente hidrofóbico do sistema estudado. Foi avaliada a interação dos lipossomas de PC contendo o anfifílico glicoconjugado (C22PEG900GlcNAc) com a lectina WGA, tanto na ausência como na presença das aminas. Testes de interação das aminas com albumina sérica bovina indicaram alta interação através de um mecanismo de supressão de fluorescência estático. / In this work six new benzazolic based fluorescent lipophilic amines presenting alkyl chains of different sizes were synthesized. Their structures were confirmed by classical spectroscopic techniques, as well as, High Resolution Mass Spectrometry. The photophysical study of the amines was carried out in organic solvents and in phosphate buffered saline solution (pH 7.2), by absorption measurements in the UV–Vis region and fluorescence emission. These compounds present absorption in the UV–region and emission in the visible region of the spectra. The synthesized molecules were incorporated into liposomes composed of phosphatidylcholine (PC) from soy lecithin and PC liposomes containing the amphiphilic glycoconjugate (C22PEG900GlcNAc), in a ratio of 1:1 (w/w). Both were obtained by the reverse phase evaporation method. The liposomes were characterized by zeta potential (PZ) and dynamic light scattering (DLS). The liposomes presented high values of zeta potential suggesting that these systems present colloidal stability against aggregation processes. DLS data indicated that the liposomes have a diameter of 100 nm. In addition, the insertion of the amines into the liposomes was evaluated by fluorescence emission spectroscopy. The coefficient of partition of the molecules in the liposomes was also determined. The high values indicated high lipophilicity of the synthesized compounds. The interaction of liposomes PC containing the glycoconjugate C22PEG900GlcNAc with WGA, both in the absence and presence of the amines, was evaluated. Overall, the synthesized compounds showed potential application staining liposomes and as optical sensor for BSA in solution through a static fluorescence suppression mechanism.

O principal problema no desenvolvimento de vacinas de segunda geração é a baixa resposta contra os antígenos, geralmente extremamente purificados. Isto tem levado à busca de novos adjuvantes que sejam mais eficientes e menos tóxicos. Este trabalho objetivava o estudo de uma proteína de choque térmico de Mycobacterium leprae - 18kDa-hsp - recombinante, produzida em levedura, veiculada em lipossomos, como modelo de proteína carregadora para antígenos fracos. Além de um estudo de estabilização de lipossomos por liofilização. A 18kDa-hsp apresenta certas características peculiares que levaram ao desenvolvimento de um método de dosagem próprio e extensível a outras proteínas com baixo teor em aminoácido cromóforos. Tendo uso potencial como proteína carregadora, a 18kDa-hsp é estável, suportando bem aquecimento, liofilização, acilação e associação com lipossomos de fosfolípides, sem perda significativa de sua atividade. Estudos paralelos de estabilização de lipossomos unilamelares mostraram que se pode usar trealose como crioprotetora no processo de liofilização-reidratação, sem perdas significativas do conteúdo dos lipossomos e com manutenção das estruturas das vesículas. Finalmente, o sistema lipossomos-18kDa-hsp mostra-se promissor como um sistema estável para veiculação de imunógenos fracos. / The major problem on development of second generation vaccines is the poor response against some immunogens. It has leading an intense research to find other substances non toxic and more efficient on enhancement of the immunological response. The aim of this work was the study of a heat-shock protein from Mycobacterium leprae - 18kDa-hsp - produced in yeast and vehiculated in liposomes, as a protein carrier model for weak immunogens. Furthermore, there was a study on stabilization of liposomes by lyophilization. The peculiar protperties of the 18kDa-hsp lead us to develop a new method for quantification that can be extended to other proteins with low chromophore content. Potentially a carrier protein, the 18kDa-hsp is very stab1e: it has no significant loss of its antigenic reactivity when heated, lyophilized, acylated and associated to liposomes. Parallel studies on liposomes stabilisation show trehalose as a good cryoprotector. The sugar can avoid the leakage of the entrapped marker (protein) and maintain the vesicles structures on the lyophilisation-rehydration processo Finally, the system liposomes-18kDa-hsp is promising for vehiculation of weak immunogens.

Os osteoblastos são responsáveis pelo início do processo de biomineralização óssea mediada pela liberação de vesículas da matriz (MVs). As MVs surgem por brotamento das superfícies laterais dos osteoblastos e são secretadas para a matriz. A membrana das MVs possuem níveis elevados de Fosfatase Alcalina (TNAP), entre outra enzimas/proteínas, bem como de Chol, em comparação com a membrana plasmática. O objetivo deste estudo foi a construção de proteolipossomos constituídos por Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) ou Dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), com Colesterol (Chol) em diferentes proporções para a caracterização cinética da TNAP, utilizando os substratos ATP, PPi e ADP, a fim de se obter um sistema que mimetize as MVs. O aumento da concentração de Chol dificultou a incorporação da TNAP aos sistemas constituídos com DPPC, e facilitou a sua incorporação aos constituídos por DOPC. A presença do Chol em todos os sistemas miméticos preparados afetou os parâmetros cinéticos de hidrólise da TNAP para todos os substratos estudados. Entretanto, independentemente da presença do Chol, a hidrólise do PPi apresentou sempre uma maior eficiência (maior kcat/K0.5), sugerindo que este substrato provavelmente possa ser hidrolisado preferencialmente. O tratamento com 2 mM de ciclodextrina (bmCD), resultou na remoção de apenas 70% do Chol de proteolipossomos constituídos por DPPC:Chol 36% mol. Estudos de calorimetria diferencial (DSC) revelaram que a bmCD fica ligada ao sistemas vesiculares causando interferência para os demais ensaios. Quando 36% mol de colestenona (Achol), um análogo de Chol, foi empregado na construção dos proteolipossomos de DPPC, foram encontrados comportamentos cinéticos distintos para a TNAP. O ATP foi hidrolisado com uma Vmáx menor que a os sistemas constituídos por DPPC:Chol 36% e maior do que para sistemas de DOPC:Chol 36% mol. Os valores de K0.5 foram menores para DPPC:Achol 36 % mol em comparação aos sistemas análogos. Com relação a hidrolise do PPi, os parâmetros cinéticos foram similares, em relação aos sistemas estudados contendo DPPC:Chol ou DOPC:Chol. Por fim, foi avaliada a capacidade de propagação de nódulos de mineralização pelos sistemas vesiculares contendo DPPC, DPPC:Chol e DPPC:Achol (com e sem TNAP incorporada), utilizando o ATP como substrato. A mineralização foi cerda de 16 vezes mais eficiente na presença de protelipossomos que continham tanto Chol ou colestenona, do que para o sistema somente constituído por DPPC (cerca de 4 vezes), quando comparados com os respectivos sistemas de lipossomos (na ausência de enzima). Diante destas diferenças apresentadas, tanto no comportamento cinético, quanto na capacidade de mineralização, pode-se suger que o microambiente lipídico tem um importante papel das MVs. Uma explicação que pode ser sugerida é que fatores termodinâmicos como: a diminuição da entalpia de transição; perda de pré-transição; presença de cargas superficiais; presença de diferentes substratos; bem como, orientações das ligações de hidrogênio com a molécula de água na superfície dos proteolipossomos, podem acarretar em modificações conformacionais na TNAP. A relevância dos resultados apresentados pode contribuir no entendimento da função dos lipídios e de suas interações com as proteínas presentes na MVs no processo de biomineralização. / Osteoblasts are responsible for initiating the bone biomineralization process mediated by the release of matrix vesicles (MVs). The MVs arise by budding from the membrane of the osteoblasts and are secreted into the matrix. The MVs membrane has high levels of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), among other enzymes/proteins, as well as cholesterol, compared with the plasma membrane. The objective of this study was to build proteoliposomes constituted by Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) or dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), with cholesterol (Chol) in different molar ratios for the kinetic characterization of TNAP, using the substrates ATP, ADP and PPi, in order to obtain systems that mimic the MVs. The increase in the cholesterol concentration hampered the incorporation of TNAP into the DPPC systems, but favored its incorporation into the DOPC liposomes. The presence of cholesterol in all prepared mimetic systems affected the kinetic parameters of hydrolysis for all substrates studied. Regardless of the presence of cholesterol, PPi hydrolysis always showed greater catalytic efficiency (kcat/K0.5), suggesting a preferential hydrolysis of this substrate. Treatment with 2 mM cyclodextrin (BMCD) resulted in removal of 70% of the cholesterol from the proteoliposome constituted of DPPC:Cholesterol 36% (molar ratio). Differential scanning calorimetry (DSC) studies showed that BMCD was bound to the vesicular systems interfering with the other assays. When 36% of cholestenone (Achol), an analogue of cholesterol, was employed in the construction of DPPC proteoliposomes, a different kinetic behavior was observed for TNAP. The Vmax for ATP hydrolysis was lower compared with the systems constituted of DPPC:Chol 36% and higher than that obtained for the DOPC:Chol 36% system. The values of K0.5 were lower for DPPC:Achol 36% compared to the similar systems. With respect to the hydrolysis of PPi, the kinetic parameters were similar for the systems constituted of DPPC:Chol and DOPC:Chol. Finally, we evaluated the ability of the vesicular systems containing DPPC, DPPC:Chol and DPPC:Achol (with and without TNAP incorporated) to propagate mineralization nodules, using ATP as substrate. The mineralization was about 16 times more efficient in the presence of proteoliposomes containing Chol or Achol than for the system constituted of DPPC only (about 4 times more efficient) compared with the corresponding liposome (in the absence of enzyme). Given the differences observed for both the kinetic behavior and the mineralization ability of the different systems, we suggest that the lipid microenvironment plays an important role in MVs function. A possible explanation for these differences is that thermodynamic factors such as the decrease in the enthalpy of transition and the loss of pre-transition, as well as the presence of surface charges, the presence of different substrates, and the orientation of hydrogen bonds with the water molecule on the surface of the proteoliposomes, may cause conformational changes in TNAP molecule. These relevant results can contribute for the understanding of the role of lipids and their interactions with proteins present in MVs in the biomineralization process.

Incluída dentre as doenças tropicais negligenciadas (DTNs), a leishmaniose se apresenta como um complexo de doenças de variados graus de gravidade, ocasionando desde uma lesão cutânea a uma progressiva infecção visceral fatal. O desenvolvimento de novas terapias é imprescindível, devido ao limitado e complexo arsenal terapêutico. Sendo assim, o presente projeto realizou o estudo in vitro e experimental em modelo de hamster infectado com L. (Leishmania) infantum de novas terapias para a leishmaniose visceral, utilizando três abordagens: i) reposicionamento de fármacos em uso na clínica para o tratamento de outras patologias; ii) sistemas de liberação controlada e sustentada de fármacos como os lipossomos e iii) avaliação de análogos sintéticos de naftoquinonas, bem como, análogos sintéticos de quelantes de ferro. O fármaco nitazoxanida (NTZ) foi amplamente estudado, apresentando atividade anti-Leishmania contra amastigotas intracelulares e um índice de seletividade (IS) de 2,5. Quando avaliado em modelo experimental, foi incapaz de reduzir a densidade parasitária no baço e fígado na forma livre, porém a encapsulação em lipossomos (NTZ-LP) conferiu maior direcionamento, resultando em uma eficácia de 50 e 82% no baço e fígado, respectivamente. A captação, in vitro, da NTZ-LP também foi avaliada em macrófagos sadios e infectados demonstrando uma ampla distribuição no citoplasma de ambos os grupos. Os parâmetros físico-químicos avaliados da NTZLP demonstraram uma formulação unilamelar, negativa com diâmetro inferior a 200nm. Estudos farmacocinéticos em modelo murino da NTZ e NTZ-LP demonstraram uma meia vida plasmática (T1/2) similar para ambas às formulações (6,5 minutos para NTZ e 8,7 minutos para NTZ-LP), porém tanto a exposição (AUC) e concentração plasmática máxima (Cmax) resultaram em valores quatro vezes maiores para os lipossomos, justificando a eficácia da formulação no estudo préclínico. Foi realizada ainda a triagem de 10 fármacos antihistamímicos, porém somente a cinarizina apresentou atividade no amastigota intracelular. O estudo experimental demonstrou que o fármaco foi incapaz de reduzir a densidade parasitária tanto no baço como no fígado dos animais, porém quando encapsulado em lipossomos foi observada uma eficácia de 54% apenas no fígado. Outros dois fármacos estudados apresentaram atividade anti-Leishmania, a amiodarona (antiarrítmico) e a sertralina (anti-depressivo). Apesar de a amiodarona ter apresentado potente atividade contra os amastigotas, com Concentração Efetiva 50% (CE50) de 0,5 ?M e um elevado IS de 56, não demonstrou atividade tanto no baço como no fígado no modelo experimental. Sertralina foi o fármaco mais promissor do trabalho, apresentando uma CE50 de 1,8 ?M e IS de 10, alcançando níveis de tratamento de 58% no baço e 87% no fígado dos animais. Novos compostos sintéticos também foram estudados. Dentre os 36 compostos análogos sintéticos de naftoquinonas, 14 demonstraram atividade contra as formas amastigotas intracelulares, destacando cinco compostos com IS >5. Ainda, os compostos sintéticos, quelantes de ferro, não foram capazes de eliminar o amastigota intracelular. O projeto teve como objetivo primordial a obtenção de um novo candidato a fármaco, livre ou encapsulado em lipossomos, que pudesse contribuir com novas perspectivas para estudos de novas terapias para a leishmaniose visceral. / Included among the neglected tropical diseases (NTDs), leishmaniasis present itself as a complex of varying degrees of serious diseases, resulting from a skin lesion to a progressive fatal visceral infection. The development of new therapies is essential, due to the limited and complex therapeutic arsenal. Thus, this project conducted the in vitro and in vivo studies using infected hamsters with L. (L.) infantum for new therapies against visceral leishmaniasis, using the three following approaches: i) drug repurposing; ii) controlled and sustained systems for drug delivery, such as liposomes, and iii) synthetic analogs of naphthoquinones, as well as, analogs of synthetic iron chelators. The nitazoxanide drug (NTZ) has been studied extensively, showing anti-Leishmania activity against intracellular amastigotes and selectivity index (SI) of 2.5. When it was evaluated in an experimental model, was unable to reduce the parasite burden in the spleen and liver in free form. However, when was encapsulated in liposomes (NTZ-LP), it has conferred higher direction, resulting in an efficiency of 50 to 82% in the spleen and liver, respectively. The in vitro uptake of NTZ-LP was evaluated in healthy and infected macrophages demonstrating a broad distribution in the cytoplasm of both groups. The NTZ-LP physical-chemical parameters were evaluated and showed a unilamellar formulation, negative and with diameter lower than 200nm. Pharmacokinetics studies in the murine model with NTZ and NTZ-LP showed a half-life (T1/2) similar for both formulations (6.5 minutes to NTZ and 8.7 minutes to NTZ-LP). However, the exposure (AUC) and maximum plasma concentration (Cmax), resulted, for the liposomes values, four times higher, which justify the efficacy of liposomal formulation in preclinical study. Additionally, 10 antihistamines drugs were evaluated, but only cinnarizine showed activity in the intracellular amastigotes. The experimental study showed that the drug was unable to reduce the parasite burden in both, spleen and liver infected animals. Nevertheless, when it was encapsulated in liposomes, a 54% efficacy, only, in the liver was observed. Other two drugs were studied relating Leishmania activity: amiodarone (antiarrhythmic) and sertraline (antidepressant). Although amiodarone have shown potent activity against amastigotes with Effective Concentration 50% (EC50) of 0.5 ?M and a high SI of 56, no activity was seen in spleen and liver in the experimental model. On the other hand, sertraline was the most promising drug, showing an IC50 of 1.8 ?M and SI of 10, increasing the treatment levels of 58% in the spleen and 87% in the liver of the animals. Novel synthetic compounds were also studied. Among 36 synthetic analogues of naphthoquinones, 14 demonstrated activity against intracellular amastigotes, highlighting five compounds with SI>5. Moreover, synthetic analogues of iron chelators were not able to eliminate intracellular amastigotes. The project had as its primary objective the attainment of a new drug candidate, free or encapsulated into liposomes, and it could contribute with new perspectives for studies towards novel therapies against visceral leishmaniasis.

Os problemas decorrentes de doenças alérgicas é tema em destaque atualmente devido ao aumento de pessoas que vêm apresentando sintomas e sofrendo as consequências de mudanças aceleradas nos costumes da nossa sociedade. Apesar das diversas terapias oferecidas, pacientes alérgicos ainda sofrem com efeitos colaterais decorrentes do uso de medicamentos anti-alérgicos. Assim, a busca por novas alternativas que possam amenizar os sintomas alérgicos torna-se relevante. As substâncias naturais tem sido alvo de intensa investigação devido às propriedades farmacológicas no tratamento de diversas doenças incluindo as alérgicas. Neste contexto, este trabalho foi focado no extrato Vimang e seu componente majoritário, a mangiferina (Mgf), que tem apresentado atividades biológicas diversas. Sabendo-se que a atividade biológica de um extrato pode ser potencializada pelo sinergismo entre seus componentes, foi avaliado o efeito sinérgico de substâncias isoladas do Vimang, tais como mangiferina, quercetina, catequina, ácido gálico e benzóico. Esses componentes foram combinados e as misturas avaliadas quanto à capacidade em inibir a desgranulação mastocitária. O Vimang, a quercetina e mangiferina inibem a desgranulação mastócitária enquanto catequina, ácido gálico e benzóico não são ativos; e porisso, não foram incluídos na determinação do isobolograma de aditividade, adotado no estudo de sinergismo. O isobolograma de aditividade mostra sinergismo para as concentrações de mangiferina iguais a 5, 10, 20 e 40 ?M e quercetina iguais a 0,2, 1 e 1,6 ?M; e mostra antagonismo para mangiferina 80 ?M e quercetina 0,4 e 0,8 ?M. Tais resultados sugerem que altas concentrações de mangiferina atrapalham a interação sinérgica entre estas substâncias e altas concentrações de quercetina exercem um efeito contrário, ou seja, favorecem o sinergismo entre quercetina e mangiferina. A baixa solubilidade de flavonóides em meio fisiológico levou ao estudo da interação da Mgf com lipossomos de Dimiristoil-L-?-Fosfatidilcolina (DMPC) para aplicação nos ensaios biológicos. A Interação da Mgf com lipossomos de DMPC, bem como a estabilidade lipossomal, foram avaliadas quanto aos efeitos de pH, força iônica e presença de colesterol. O pH influencia a eficiência de incorporação (EI) da Mgf que é maior em pHs ácidos. Em soluções de pH ácido ou fisiológico há aumento de tamanho do lipossomo na presença de Mgf, o que reforça a hipótese de interação desta com a bicamada lipídica. O aumento da força iônica, na ausência de Mgf, diminui a estabilidade do lipossomo. Na ausência de sal, a Mgf favorece a formação de agregados e diminui a estabilidade dos lipossomos e na presença de sal, a Mgf previne a agregação e estabiliza os agregados lipossomais. A EI da Mgf nos lipossomos de DMPC preparados pelo método da injeção etanólica, em pH fisiológico, foram ao redor de 13%. A tentativa de otimizar a EI foi realizada pela adição de colesterol em diferentes proporções lipídio:colesterol. Um aumento de 13% para 17% foi observado para a proporção DMPC:colesterol (9:1). A Mgf livre inibe a desgranulação dos mastócitos de forma concentração-dependente; mas a presença de lipossomos, preparados pelo método da injeção etanólica não altera significativamente esse perfil. A EI da mangiferina em lipossomos de DMPC:colesterol (9:1), preparados pelo método do filme lipídico, foi igual a 45%. Os resultados de potencial antialérgico, para este caso, mostraram que os lipossomos de DMPC favorecem o potencial antialérgico da Mgf em concentrações acima de 25 ?M. Esses resultados abrem perspectivas na busca de sistemas lipossomais mais estáveis e que possam ser aplicados em ensaios biológicos in vitro e in vivo. / The problems due to allergic diseases are currently a highlighted topic due to the increase of people who are showing symptoms and suffering the consequences of rapid changes in the habits of our society. Despite various therapies offered, allergic patients still suffer side effects from the use of anti-allergic drugs. Thus, the search for new alternatives that can alleviate the allergic symptoms becomes relevant. Natural substances have been the subject of intense research due to the pharmacological properties in the treatment of several diseases, including allergic ones. In this context, this work was focused on Vimang extract and its major component, the mangiferin (Mgf), which has shown several biological activities. Given that the biological activity of an extract can be enhanced by the synergism between its components, the synergistic effect of compounds isolated from Vimang such as mangiferin, quercetin, catechin, gallic acid and benzoic acid was evaluated. These components were combined and the mixtures tested for their ability to inhibit mast cell degranulation. The Vimang, quercetin and mangiferin inhibit mast cell degranulation while catechin, gallic acid and benzoic acid are not active and for that reason they were not included in the determination of the isobologram adopted in the synergism study. The isobologram of additivity shows synergism for the concentration of mangiferin equal to 5, 10, 20 and 40 ?M and quercetin equal 0.2, 1 and 1.6 ?M, and shows antagonism for mangiferin 80 ?M and quercetin 0.4 and 0.8 ?M. The low solubility of flavonoids in physiological medium led to the study of the interaction of Mgf with liposomes of L-?-dimyristoyl-phosphatidylcholine (DMPC) for application in biological assays. The interaction of Mgf with DMPC liposomes as well as the liposomal stability was evaluated considering the effects of pH, ionic strength and cholesterol presence. The pH influences the incorporation efficiency (IE) of mangiferin, which is higher in acidic pHs. In solutions of acidic or physiological pH, the liposome size increases in the presence of Mgf, which reinforces the hypothesis of interaction of Mgf with the lipid bilayer. The increased ionic strength in the absence of Mgf decreases the stability of the liposome. In the absence of salt, Mgf favors the formation of aggregates and decreases the stability of the liposomes. When in presence of salt, Mgf prevents the aggregation and stabilizes the liposomal aggregates. The IE of mangiferin in DMPC prepared by the ethanol injection method, at physiological pH, were around 13%. The attempt to optimize the IE was performed by the addition of cholesterol in different proportions lipid:cholesterol. An increase from 13% to 17% was observed for the proportion of DMPC:cholesterol (9:1). Free mangiferin inhibits mast cells degranulation in a dose-dependent manner, but the presence of liposomes prepared by the ethanol injection method does not significantly change this profile. The IE of mangiferin in liposomes of DMPC:cholesterol (9:1), prepared by the method of lipidic film was equal to 45%.The results of antiallergic potential in this case show that DMPC liposomes favor the mangiferin antiallergic potential at concentrations above 25 mM. These results open perspectives in the search for more stable liposomal systems and can be applied to biological assays in vitro and in vivo.