Dictyostelium discoideum is a soil dwelling amoeba which has been widely used as a model organism to study cellular processes such as signal transduction, chemotaxis, endocytosis and exocytosis. The process of phagocytosis in Dicytostelium is largely comparable to that of neutrophils and macrophages in the mammalian system. Neutrophils and macrophages are cells of the innate immune system and they engulf infectious bacteria through phagocytosis. Dictyostelium cells uptake yeast and bacteria for their nutrition through phagocytosis, which is an actin dependent mechanism and is a target of multiple signaling inputs. Recent studies have uncovered different proteins involved in the signaling of particle and further studies are required to decipher the intricate mechanism leading to the F-actin rearrangement. Two of the proteins have previously known to be involved in the pathways regulating the F- actin rearrangement name PP2A phosphatase and LKB1 kinase The main objective of this project was to determine how these proteins are affecting the two actin driven particle uptake processes, phagocytosis and fluid uptake. We showed that ablation of PsrA gene which codes the regulatory subunit of PP2A resulted in a defective phagocytosis, whereas the fluid uptake was normal. We also showed for the first time that there was an increase in the phosphorylation of some of the PKB substrate proteins in wild type cell. Cells lacking PsrA gene displayed an aberrant phosphorylation of PKB substrate protein when compared to the wild type cells further confirming the involvement of PKB substrate in phagocytosis. Further, we looked at the effects of LKB1 kinase on phagocytosis by using a LKB1 knockdown construct introduced into wild type cells. The knock down of LKB1 resulted in a higher rate of phagocytosis while introduction of a LKB1 over expressing construct severally decreased the rate of phagocytosis indicating an inhibitory effect of LKB1. Furthermore there was an increase in the PKB substrate protein but a different pattern compared to the psrA- cells. We also carried out adhesion assays on LKB1 knockdown cells and the results showed a higher substrate adhesion as compared to the wild type cells, while psrA- cells had no adhesion defect.

In 2011, Diabetes and prediabetes affected 9 million Canadians and 366 million people worldwide (Canadian Diabetes Website). The underlying pathophysiology of diabetes is beta cell dysfunction leading to loss of appropriate insulin secretion and resulting in hyperglycemia. I have focused on identifying critical molecular regulators of beta cell function and insulin secretion. The CRTC2-CREB pathway is required for maintaining beta cell mass and insulin secretion. I propose that identifying kinases that regulate CRTC-CREB activity will identify other important regulators of pancreatic beta cell survival and function. First, I have identified several AMP kinases as inhibitors of CRTC2-CREB that are activated by an upstream kinase, LKB1. I then went on to generate mice with a beta cell-specific deletion of LKB1 during adulthood. Loss of LKB1 increased insulin secretion and glucose clearance through enhanced beta cell mass and proliferation. The increased insulin secretion was largely the result of loss of AMPK activity and consequent constitutive mTor activity. AMPK is activated under starvation conditions and as such is thought to be a critical regulator of beta cell function. However, the decrease of AMPK activity in high glucose has been a strong argument against it being a critical effector of insulin secretion. I provide genetic evidence supporting the idea that AMPK activity attenuates insulin secretion. During periods of starvation where AMPK activity is high there is a chronic dampening effect on events that prepare beta cells for the next round of insulin secretion. Surprisingly, another downstream kinase of LKB1, SIK2, has opposing functions in the beta cell. I present evidence that the LKB1-AMPK axis attenuates beta cell functions and that targeting this pathway in beta cells may be of therapeutic benefit for T2D.

The LKB1/STRAD/MO25 complex (LSMK) has been identified as the major upstream kinase for AMP-activated protein kinase (AMPK). PKA phosphorylates LKB1 at the Ser428 residue in humans and Ser431 residue in mice. We investigated PKA as an upstream kinase for LSMK. LKB1 that had been incubated with PKA prior to incubation with AMPK experienced up to a 51% increase in AMPK Kinase activity compared to LKB1 alone (p < 0.05). When blocked with a PKA Inhibitor, the kinase effect of PKA on LKB1 was eliminated. Rat epitrochlearis muscle tissue incubated with epinephrine experienced no increase in AMPK activity compared with controls indicating that epinephrine does not cause AMPK activity in this type of tissue. In conclusion, phosphorylation by PKA can increase the AMPKK activity of LKB1-STRAD-MO25 in vitro. Because LKB1 has been found to be constitutively active, it is postulated that phosphorylation by PKA may act to enhance LKB1-AMPK interaction and thus achieve its effect.

Skeletal muscle has the ability to increase in size (hypertrophy) after resistance is placed upon it. This hypertrophy is marked by significant upregulation of the mammalian target of rapamycin (mTOR) and its downstream targets. The upstream kinases, protein kinase B (also known as Akt) and AMP-activated protein kinase (AMPK), are two of the many regulators of the mTOR pathway. Recent studies suggest that the widely consumed neuroactive compound caffeine could potentially inhibit mTOR by acting through Akt and/or AMPK. The purpose of this thesis was to: 1) determine if caffeine can inhibit the mTOR pathway and ultimately attenuate skeletal muscle hypertrophy and 2) determine if this inhibition is through LKB1, an upstream regulator of AMPK. First, 3 month old male rats underwent unilateral tenotomy of the gastrocnemius, resulting in overloading (OVLD) of the synergistic plantaris muscle. The contralateral limb was sham-operated (SHAM) on. Rats were given ad libitum access to tap water or tap water + caffeine (1 g/L). The OVLD procedure resulted in significant hypertrophy of the plantaris which was attenuated after 1 wk of caffeine treatment. However, after two wks this effect was not observed. mTOR targets were examined in both the SHAM and OVLD plantaris muscle which showed significant upregulation with OVLD but no impact with caffeine treatment. Akt and AMPK was also assessed in the plantaris muscle which showed diminished Akt phosphorylation in 1 wk treated rats while the phosphorylation of AMPK remained relatively unaffected. Notably, caffeine caused decreased atrophy of the tenotomized gastrocnemius after 1 wk along with decreased body weight gains, food consumption, and retroperitoneal fat pad weight in both 1 and 2 wk treated rats. Second, to elucidate how caffeine could be impacting the mTOR pathway and how LKB1/AMPK might be involved, skeletal muscle specific LKB1 knockout (skmLKB1-KO) mice were subjected to high-frequency electrical stimulation (HFES) of the sciatic nerve resulting in contraction of the tibialis anterior (TA) and extensor digitorum longus (EDL) muscles against the larger gastrocnemius. All mice were given an intraperitoneal injection of saline or saline + caffeine (20 mg/kg BW at 1 g/L). HFES resulted in marked upregulation of mTOR targets in the TA/EDL of mice 0, 3, and 8 h post HFES. mTOR targets remained relatively unchanged with caffeine treatment. We also observed that these markers were consistently upregulated in our skmLKB1-KO mice with or without HFES. Our findings indicate that caffeine, at physiological concentrations, does not impact anabolic signaling. Furthermore, diminished LKB1 levels resulted in increased levels and activation of markers of protein synthesis.

La Liver Kinase B1 (LKB1) est une protéine pléiotrope, impliquée dans divers processus biologiques. Dans le foie, LKB1 est notamment connue pour être un régulateur clé du métabolisme et de la polarité cellulaire. Au cours de notre étude, nous avons investigué l’implication de LKB1 dans le contrôle de la prolifération des hépatocytes au cours du processus de régénération hépatique physiologique (hépatectomie partielle des 2/3). Nous avons démontré que la perte de Lkb1, spécifiquement dans les hépatocytes, favorise la récupération de la masse hépatique après hépatectomie partielle, en induisant une augmentation drastique de la réponse proliférative hépatocytaire, indépendamment de la balance métabolique/énergétique. Ainsi, LKB1 agit comme un senseur négatif de la prolifération et régule la transition G0/G1, en particulier en contrôlant la signalisation de l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Par ailleurs, plus tard pendant la régénération, LKB1 garantit également l’intégrité mitotique. En effet, la suppression de Lkb1 entraîne des altérations majeures de la formation du fuseau mitotique. Nos résultats établissent également que LKB1 contrôle la polarité de la division cellulaire, indépendamment de l'activité de l’AMPK (AMP-activated protein kinase), une cible clé de LKB1. Par conséquent, la perte de LKB1 conduit à une altération majeure du profil de ploïdie, au stade tardif du processus de régénération. L’ensemble de notre étude souligne le double rôle de LKB1, au cours de la régénération hépatique, en tant que gardien de la prolifération hépatocytaire et de l'intégrité génomique. / Liver Kinase B1 (LKB1) is involved in pleiotropic biological processes and known to be a key regulator of hepatic metabolism and polarity. Here, we investigated the contribution of LKB1 in hepatocyte proliferation and liver regeneration process. We demonstrated that loss of hepatic Lkb1 promotes liver mass recovery, through an increase of hepatocytes proliferation, independently on metabolic/energetic balance. LKB1 regulates G0/G1 progression, specifically by controlling Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) signaling. In addition, later during regeneration, LKB1 controls mitotic fidelity. Deletion of Lkb1 results in major alterations of mitotic spindle formation, along the polarity axis, independently of AMP- activated protein kinase (AMPK) activity, a key target of LKB1. Consequently, LKB1 deficiency leads to an alteration of ploidy profile, at late stage of regenerative process. Overall our study highlights the dual role of LKB1, during liver regeneration, as a guardian of hepatocyte proliferation and genomic integrity.

LKB1 est un gène suppresseur de tumeur qui code une kinase « maitre » dont l’activité contrôle la polarité et la prolifération cellulaire en les coordonnant avec l’état métabolique de la cellule. Ce travail a abouti à l’identification d’une nouvelle isoforme LKB1 appelée ∆N-LKB1 qui est générée par transcription alternative et initiation interne de la traduction de l'ARNm LKB1. La protéine ∆N-LKB1 est délétée de sa partie N-terminale incluant une partie de son domaine kinase. Bien que la protéine N-LKB1 soit catalytiquement inactive, elle potentialise l'effet activateur de la protéine LKB1 sur sa cible principale l’APMK, senseur énergétique de la cellule, via une interaction directe avec le domaine d'auto-inhibition de l’AMPK. En revanche, ∆N-LKB1 interfère négativement avec la capacité de LKB1 à induire la polarité cellulaire. Enfin, en utilisant des approches in vitro et in vivo, nous avons montré que N-LKB1 possède une propriété oncogénique intrinsèque. N-LKB1 est exprimée seule dans la lignée NCI-H460 issue du cancer du poumon. L’inhibition de l’expression de N-LKB1 dans les cellules NCI-H460 induit une diminution de la survie de ces cellules et inhibe leur pouvoir oncogénique quand elles sont greffées dans la souris nude. Nous avons donc identifié une nouvelle isoforme LKB1 qui stimule l’adaptation métabolique LKB1-dépendante, mais qui inhibe la polarité cellulaire contrôlée par LKB1. Le suppresseur de tumeur LKB1 ainsi que l’oncogène N-LKB1 sont codé par le même gène, ce qui peut expliquer certains des effets paradoxaux de LKB1 durant la tumorigenèse. / The LKB1 tumor suppressor gene encodes a master kinase that coordinates the regulation of energetic metabolism, cell growth and cell polarity. We now report the identification of a novel isoform of LKB1 named N-LKB1 that is generated through alternative transcription and internal initiation of translation of the LKB1 mRNA. The N-LKB1 protein lacks the N-terminal region and a portion of the kinase domain. Although N-LKB1 is catalytically inactive, it potentiates the stimulating effect of LKB1 on the AMP-activated protein kinase (AMPK) metabolic sensor through a direct interaction with the regulatory auto-inhibitory domain of AMPK. Contrasting, N-LKB1 negatively interferes with the LKB1 polarizing activity. Finally, combining in vitro and in vivo approaches, we showedthat N-LKB1 has an intrinsic oncogenic property. N-LKB1 is expressed solely in the lung cancer cell line, NCI-H460. Silencing of N-LKB1 decreased survival of NCI-H460 cells and inhibited their tumorigenicity when engrafted in nude mice. In conclusion, we have identified a novel LKB1 isoform that enhances the LKB1-controlled AMPK metabolic activity but inhibits LKB1-induced polarizing activity. Both, the LKB1 tumor suppressor and the oncogene, N-LKB1, are expressed from the same locus and this may account for some of the paradoxical effects of LKB1 during tumorigenesis.

Le foie est un organe qui exerce un rôle majeur dans le contrôle de l’homéostasie métabolique et énergétique de l’organisme en maintenant la glycémie à un taux constant. LKB1 est une sérine-thréonine kinase qui joue un rôle clef dans la physiologie cellulaire en couplant le contrôle du métabolisme au statut énergétique de la cellule. A l’aide de modèles murins ayant une délétion de LKB1 dans les hépatocytes adultes, nous avons identifié un rôle complexe pour LKB1 au sein de l’homéostasie énergétique. L’objectif de ma thèse était de caractériser ce phénotype et d’en comprendre les bases physiologiques. Nos résultats montrent une hyperglycémie à jeun chez les animaux mutants, associée à une perte de masse maigre (muscle), une accumulation du glycogène à jeun et une activation constitutive de la voie de l’insuline, qui, à long terme, conduit à une cachexie. Nos résultats suggèrent que Lkb1 hépatique exercerait un dialogue complexe avec la signalisation insuline dans le contrôle de la gluconéogenèse avec une dépendance énergétique aux acides aminés. Nous avons aussi montré qu’il existait un dialogue complexe entre LKB1 et la voie Wnt/β-caténine dans le foie. En effet, les carcinomes hépatocellulaires (CHC) mutés CTNNB1 ont des caractéristiques phénotypiques en termes de polarité et de métabolisme (absence de stéatose). Nous avons émis l’hypothèse que ce phénotype pouvait être secondaire à l’activation du gène suppresseur de tumeurs LKB1. Les mutations CTNNB1 sont en effet capable d’induire l’expression protéique de LKB1 dans les lignées hépatomateuses humaines, et les CHC mutés CTNNB1 présentent une expression protéique accrue de LKB1. De plus, dans deux modèles murins d’invalidation hépatospécifique de Lkb1, LKB1 est apparu comme requis pour l’activation du programme transcriptionnel de β-caténine mais de façon dépendante du stade de développement et du contexte nutritionnel. / The liver plays a major role in the control of both metabolic and energetic homeostasis in the body by maintaining glycemia. LKB1 is a serine-threonine kinase that plays a crucial role in cell physiology by controlling cell metabolism and cell energetic status. Using murine model with LKB1 hepatospecific deletion, we identified a complex role for LKB1 in energy homeostasis. The aim of my thesis was to characterize this phenotype and to understand its physiological basis. Our results show a hyperglycemia at fasted state in mutants animals, associated with a loss of dry mass, a glycogen accumulation and a constitutive activation of insulin signaling, which leads to a cachexia at long term. Our results suggest that hepatic Lkb1 is involved in a cross talk with insulin signaling in the control of neoglucogenesis with amino acid dependence. We also showed a cross talk between LKB1 and Wnt/β-catenin signaling in the liver. Indeed, CTNNB1-mutated hepatocellular carcinoma (HCC) have phenotypic features in terms of polarity and metabolism (lack of lipid accumulation). Our hypothesis is that this phenotype would be secondary to the activation of the tumour suppressor gene LKB1. CTNNB1 mutations induce LKB1 proteic expression in human hepatoma cell lines and CTNNB1-mutated HCC show an increased proteic LKB1 expression. In two murine models of Lkb1 hepatospecific invalidation, LKB1 seems to be necessary for the activation of the β-catenin transcriptional program in a way that is dependent on developpemental state and nutritional context.

La protéine arginine méthyltransférase 5 est la majeure arginine méthyltransférase de type II chez les mammifères, responsable de la génération de la majorité des arginines protéiques symétriquement diméthylées. Elle est impliquée dans divers processus oncogéniques tel que la progression tumorale et la croissance indépendante de l'ancrage. PRMT5 est surexprimée dans plusieurs cancers comme le cancer de l'ovaire, des poumons et du colon. Cependant, son expression dans le cancer du sein n'est pas assez étudiée. Dans ce projet de thèse, nous avons analysé l'expression de PRMT5 dans une cohorte de 440 tumeurs mammaires. Nos résultats montrent que son expression nucléaire est un facteur de bon pronostic, notamment dans les tumeurs ERa-positives. Nous avons aussi mis en évidence une corrélation entre PRMT5 et la sérine/thréonine kinase LKB1, suggérant un lien entre ces deux protéines. Plusieurs approches in vitro et in cellulo nous ont permis de démontrer que PRMT5 et LKB1 interagissent dans le cytoplasme des cellules mammaires épithéliales. Bien que PRMT5 soit incapable de méthyler LKB1, nous avons montré pour la première fois que PRMT5 est un substrat de cette kinase. Nous avons par la suite identifié les Thr132, 139 et 144 comme cibles de la phosphorylation, au niveau du tonneau TIM en N-terminal de PRMT5. La mutation des thréonines T139/144 en alanine diminue significativement l'activité de PRMT5, probablement suite à une perte de son interaction avec des protéines régulatrices comme MEP50, pICLn et RiOK1. De plus, la modulation de l'expression de LKB1 altère l'activité de PRMT5, témoignant d'un nouveau mécanisme de régulation médié par la phosphorylation identifiée / Protein arginine methyltrasferase 5 is the major type II arginine methyltransferase in humans. It symmetrically dimethylates arginine residues on target proteins in both the cytoplasm and the nucleus. PRMT5 was reported to be an oncoprotein implicated in anchorage independent growth and tumor progression. So far, it has been involved in various cancers such as ovarian cancer, lung cancer and colon cancer, but its expression pattern in breast cancer has not been deeply studied. In this thesis project, we analyzed PRMT5 expression in a cohort of 440 breast tumor samples and we found that its nuclear expression is a good prognosis factor, mainly in ERa-positive tumors. Interestingly, our clinical results analysis showed that PRMT5 expression is correlated with the serine/threonine kinase LKB1, suggesting a relationship between both proteins. Several in vitro and in cellulo approaches gave evidence that PRMT5 and LKB1 interact directly in the cytoplasm of mammary epithelial cells. Moreover, although PRMT5 is not able to methylate LKB1, we found that PRMT5 is a bona fade substrate for LKB1. We next identified Thr132, 139 and 144 residues as target sites for phosphorylation, located in the TIM barrel domain of PRMT5. Interestingly, the Thr139/144 mutation to alanine decreased drastically PRMT5 methyltransferase activity, probably due to the loss of PRMT5 interaction with regulatory proteins such as MEP50, pICLn and RiOK1. In addition, the modulation of LKB1 expression modifies PRMT5 enzymatic activity, highlighting a new regulatory mechanism mediated by the discovered posttranslational modification of this arginine methyltransferase

Parallèlement à leur action nucléaire, les œstrogènes exercent également des effets via une signalisation cytoplasmique par des mécanismes pas complètement élucidés. Nous avons mis en évidence la méthylation de ERα (mERα) sur arginine est l’évènement clé de la signalisation non génomique des œstrogènes dans les cellules tumorales mammaires. Cette méthylation entraîne la formation d’un complexe contenant ERα/SRc/PI3K/FAK qui active des cascades de phosphorylation régulant la prolifération cellulaire. La production d’un anticorps spécifique de la forme méthylée a permis de montrer que ERα est hyperméthylé dans 55% des tumeurs mammaires. Afin de comprendre les mécanismes de régulation de la méthylation, nous avons recherché de nouveaux partenaires impliqués dans ce processus. Au cours de ma thèse, j’ai montré que la protéine kinase LKB1 est impliquée dans la signalisation non génomique des œstrogènes. Dans les cellules MCF-7, les œstrogènes entraînent rapidement le recrutement de LKB1 au sein du complexe précédemment décrit. De plus, LKB1 est indispensable à la formation de ce macro complexe ainsi qu’à la phosphorylation de Bad en aval. En effet, par cette action, LKB1 participe au rôle protecteur des œstrogènes contre l’apoptose orchestré par les œstrogènes. De plus, une étude de l’expression de mERα et LKB1, sur une série de tumeurs mammaires, a montré une corrélation significative entre l’expression de ces deux protéines associée à l’envahissement ganglionnaire. Ces résultats révèlent une signification biologique de l’interaction LKB1/mERα, suggérant un rôle oncogénique putatif de LKB1 / Besides its nuclear action, estrogens mediate also cytoplasmic signaling, however the mechanisms are not fully understood. We recently showed that arginine methylation of estrogen receptor alpha (Erα) is required for the recruitment of PI3K and Src, activating downstream kinases. An antibody that specifically recognized Erα dimethylated was generated allowing the detection of Erα hypermethylation in 55% of breast tumors. To decipher the molecular mechanisms that regulate Erα methylation in non genomic pathways, we investigated new partners of the methylated form of Erα (mERα). We identified the tumor suppressor LKB1, a Ser/Thr kinase involved in cell metabolism and cell polarity as a new partner of mERα. To ascribe a biological role to this interaction, we analyzed the protein complexes containing mErα and LKB1. LKB1 is part of the complexe involved in Erα non genomic pathway. LKB1 is essential for Erα methylation and the formation of the macrocomplex Erα/p85/Src suggesting a functional role of LKB1 in Erα methylation and then activation of downstream signaling pathways. Using a phosphospecific antibody microarray, we observed that LKB1 was required for Bad phosphorylation, suggesting its involvement in apoptosis. Indeed, we found that LKB1 participes in the protective role of estrogen against apoptosis. Interestingly, an IHC study on human breast tumors points a correlation between the expression of LKB1 and mErα : their expression is correlated with lymph node metastasis. Altogether, these results reveal biological significance of mErα/LKB1 interaction, suggesting a putative oncogenic role to LKB1

Le cancer du sein représente une cause de mortalité élevée chez la femme. Le cancer du sein est un cancer hormono-dépendant. De ce fait, il est extrêmement important de définir le rôle joué par les différents acteurs protéiques de la signalisation hormonale, notamment la signalisation œstrogénique. Parallèlement aux effets nucléaires de ERa où l'hormone lie le récepteur nucléaire et régule la transcription génique, il existe une voie dite non génomique. L'équipe a montré que les œstrogènes induisent la méthylation de ERa, qui est un prérequis au recrutement de la Pl3K et de la tyrosine kinase Src, conduisant à l'activation de molécules de signalisation telles que les MAPK et Akt, induisant prolifération et survie cellulaire. Durant ma thèse, j'ai pu démontrer que le complexe mERa/Src/Pl3K existe in vivo et constitue un nouveau biomarqueur indépendant de mauvais pronostique. La recherche de nouveaux partenaires du complexe mERa/Src/Pl3K nous a permis d'identifier le suppresseur de tumeur LKB1 et l'arginine déméthylase JMJD6. De façon surprenante, l'étude de l'expression de LKB1 par immunohistochimie dans une cohorte de tumeurs mammaires a montré une dualité fonctionnelle selon sa localisation subcellulaire. De plus, nous avons démontré que JMJD6 s'associe à ERa méthylé lorsque le récepteur est complexé à Src et Pl3K, et permet ainsi la déméthylation de ERa et la dissociation du complexe mERa/Src/Pl3K. Ce travail a ainsi pu mettre en évidence que les différents acteurs de cette signalisation peuvent constituer des éléments clés au diagnostique mais également lors de la décision thérapeutique, puisque qu'il existe des drogues peuvant cibler cette voie de signalisation / Estrogen receptor a {ERa}, belonging to the superfamily of hormone nuclear receptors, regulates many physiological processes, notably the growth and survival of breast tumor cells, acting as a ligand-dependent transcription factor. Besides to the well described transcriptional effects, estrogen also mediate extranuclear events called non genomic signaling via its receptor. /n fact, team shows that ERa is methylated and that this event is a prerequisite for the recrutement of Src and P/3K and the activation of Akt which orchestrate cell proliferation and survival. During my PhD, / demonstrated that the non genomic signaling complex mERa/Src/P/3K exists in vivo and is operative. /n addition, the complex is found to be an independent prognostic factor for disease free survival. This is an emergent concept that estrogen non genomic pathway is operative in vivo and can constitute a new therapeutic targets. The search for new partners of the complex has allowed us to identify the tumor suppressor LKB1 and arginine demethylase JMJD6. Expression of LKB1 in immunohistochemistry revealed dual properties based on its subcellular localization. When LKB1 is complexed with mERa/Src/P/3K it may acquire oncogenic properties. /n addition, JMJD6 interacts with methylated ERa when the receptor is associated with Src and P/3K, and allows the demethylation of ERa and the dissociation of the complex mERa/Src/P/3K. This work showed that estrogenic non genomic players can constitute new therapeutic targets in Breast tumors