La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique qui résulte de diverses mutations dans le gène DMD, codant pour la protéine dystrophine. 70% des patients ont une délétion d'exons ou de parties d'exons provoquant un changement dans le cadre de lecture, résultant en l'apparition d'un codon stop et en l'absence de la protéine dystrophine. Plusieurs traitements potentiels ont été explorés dans les dernières années pour cette maladie, dont le système CRISPR-Cas9, un outil génétique permettant d'éliminer un segment d'ADN à l'aide de la protéine nucléase Cas9 et de deux guides d'ARN ciblant des séquences précises d'ADN. Le plus grand défi avec l'utilisation de cette technologie est sa livraison in vivo. Les vésicules extracellulaires sont des particules membranaires lipidiques qui jouent un rôle dans la communication intercellulaire et sont retrouvées dans tous les biofluides chez les mammifères. Elles pourraient donc être une alternative intéressante pour la livraison du système CRISPR-Cas9. J'ai participé à des travaux de purification de vésicules extracellulaires de sérum par chromatographie par exclusion de taille. Ces vésicules extracellulaires ont été chargées avec la protéine Cas9 et des guides ARN, puis, des injections intramusculaires ont été effectuées dans le Tibialis anterior de trois lignées de souris (Ai9, RAG-mdx et mdx/hDMD) pour établir l'efficacité du traitement. Les résultats ont montré que les vésicules extracellulaires chargées avec la Cas9 et des guides d'ARN provoquent une édition de l'ADN efficace dans le Tibialis anterior des trois lignées de souris utilisées et la restauration de l'expression de la protéine dystrophine dans les fibres musculaires du Tibialis anterior des souris RAG-mdx, modèle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Le traitement a ensuite été modifié pour permettre le ciblage des vésicules extracellulaires aux organes affectés par la dystrophie musculaire de Duchenne, soit le cœur et les muscles squelettiques. Des peptides de ciblage ont été sélectionnés dans la littérature et insérés dans la membrane des vésicules extracellulaires marquées de façon fluorescente à l'aide d'un segment lipidique stéaryl. Les résultats de l'expérience effectuée avec les vésicules extracellulaires ciblées n'ont pas été concluants en raison d'un marquage mal adapté des vésicules injectées, mais de futures expériences permettront d'élucider leur efficacité. L'ajustement du traitement pour permettre une injection systémique rejoignant le cœur et les muscles squelettiques est indispensable à l'application de celui-ci à la clinique. / Duchenne muscular dystrophy is a genetic disease that affects one in 3500 boys and results from mutations in the DMD gene, which codes for dystrophin protein. 70% of patients have an exon deletion, which results in a shift in the reading frame, the apparition of a stop codon, and the absence of the dystrophin protein. Many different potential treatments have been explored for Duchenne muscular dystrophy, including the CRISPRCas9 system. This technology allows for the modification of genomic DNA through a Cas9 nuclease and two guide RNAs designed to target a specific DNA sequence. The biggest challenge with using the CRISPR system is delivery. The classic vectors for CRISPR, such as AAV, can cause many adverse effects like immunological responses. Extracellular vesicles are membranous particles that play a role in intercellular communication and are found in all mammalian biofluids. They are thus an interesting alternative for the delivery of the Cas9 protein and its guide RNAs. I have participated in a research project aiming to purify serum extracellular vesicles by size-exclusion chromatography and to load them with Cas9 and two guide RNAs. These extracellular vesicles were then injected intramuscularly into the Tibialis anterior muscles of three mouse strains (Ai9, RAG-mdx and mdx/hDMD) to assess treatment efficiency. The injection of Cas9 and guide RNA-loaded extracellular vesicles produced efficient gene editing as well as dystrophin expression restauration. To modify the treatment for systemic injection, targeting peptides were added to EV membrane through a lipid stearyl segment. This was done to target the extracellular vesicles to Duchenne muscular dystrophy-affected organs: heart and skeletal muscles. Results of the targeted-extracellular vesicle experiment were inconclusive, however, with more experiments, the efficacy of the targeting peptides should be determinable. It is essential to adjust this treatment to allow for targeted systemic delivery for it to be applicable to the clinic.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique qui résulte de diverses mutations dans le gène DMD, codant pour la protéine dystrophine. 70% des patients ont une délétion d'exons ou de parties d'exons provoquant un changement dans le cadre de lecture, résultant en l'apparition d'un codon stop et en l'absence de la protéine dystrophine. Plusieurs traitements potentiels ont été explorés dans les dernières années pour cette maladie, dont le système CRISPR-Cas9, un outil génétique permettant d'éliminer un segment d'ADN à l'aide de la protéine nucléase Cas9 et de deux guides d'ARN ciblant des séquences précises d'ADN. Le plus grand défi avec l'utilisation de cette technologie est sa livraison in vivo. Les vésicules extracellulaires sont des particules membranaires lipidiques qui jouent un rôle dans la communication intercellulaire et sont retrouvées dans tous les biofluides chez les mammifères. Elles pourraient donc être une alternative intéressante pour la livraison du système CRISPR-Cas9. J'ai participé à des travaux de purification de vésicules extracellulaires de sérum par chromatographie par exclusion de taille. Ces vésicules extracellulaires ont été chargées avec la protéine Cas9 et des guides ARN, puis, des injections intramusculaires ont été effectuées dans le Tibialis anterior de trois lignées de souris (Ai9, RAG-mdx et mdx/hDMD) pour établir l'efficacité du traitement. Les résultats ont montré que les vésicules extracellulaires chargées avec la Cas9 et des guides d'ARN provoquent une édition de l'ADN efficace dans le Tibialis anterior des trois lignées de souris utilisées et la restauration de l'expression de la protéine dystrophine dans les fibres musculaires du Tibialis anterior des souris RAG-mdx, modèle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Le traitement a ensuite été modifié pour permettre le ciblage des vésicules extracellulaires aux organes affectés par la dystrophie musculaire de Duchenne, soit le cœur et les muscles squelettiques. Des peptides de ciblage ont été sélectionnés dans la littérature et insérés dans la membrane des vésicules extracellulaires marquées de façon fluorescente à l'aide d'un segment lipidique stéaryl. Les résultats de l'expérience effectuée avec les vésicules extracellulaires ciblées n'ont pas été concluants en raison d'un marquage mal adapté des vésicules injectées, mais de futures expériences permettront d'élucider leur efficacité. L'ajustement du traitement pour permettre une injection systémique rejoignant le cœur et les muscles squelettiques est indispensable à l'application de celui-ci à la clinique. / Duchenne muscular dystrophy is a genetic disease that affects one in 3500 boys and results from mutations in the DMD gene, which codes for dystrophin protein. 70% of patients have an exon deletion, which results in a shift in the reading frame, the apparition of a stop codon, and the absence of the dystrophin protein. Many different potential treatments have been explored for Duchenne muscular dystrophy, including the CRISPRCas9 system. This technology allows for the modification of genomic DNA through a Cas9 nuclease and two guide RNAs designed to target a specific DNA sequence. The biggest challenge with using the CRISPR system is delivery. The classic vectors for CRISPR, such as AAV, can cause many adverse effects like immunological responses. Extracellular vesicles are membranous particles that play a role in intercellular communication and are found in all mammalian biofluids. They are thus an interesting alternative for the delivery of the Cas9 protein and its guide RNAs. I have participated in a research project aiming to purify serum extracellular vesicles by size-exclusion chromatography and to load them with Cas9 and two guide RNAs. These extracellular vesicles were then injected intramuscularly into the Tibialis anterior muscles of three mouse strains (Ai9, RAG-mdx and mdx/hDMD) to assess treatment efficiency. The injection of Cas9 and guide RNA-loaded extracellular vesicles produced efficient gene editing as well as dystrophin expression restauration. To modify the treatment for systemic injection, targeting peptides were added to EV membrane through a lipid stearyl segment. This was done to target the extracellular vesicles to Duchenne muscular dystrophy-affected organs: heart and skeletal muscles. Results of the targeted-extracellular vesicle experiment were inconclusive, however, with more experiments, the efficacy of the targeting peptides should be determinable. It is essential to adjust this treatment to allow for targeted systemic delivery for it to be applicable to the clinic.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie récessive liée au chromosome X. Cette pathologie est due à une mutation dans le gène codant pour la dystrophine. Cette protéine est responsable du maintien de l'intégrité de la fibre musculaire. La thérapie cellulaire basée sur la transplantation de cellules souches myogéniques ou myoblastes constitue une approche potentielle pour véhiculer le gène sain de la dystrophine afin de corriger l'absence de la protéine. Cette approche est limitée par la faible migration des myoblastes greffés, le rejet immunitaire des cellules injectées et la mort précoce et massive des myoblastes transplantés durant les 3 premiers jours après la greffe. Nous nous sommes intéressés dans la présente thèse à identifier les différents facteurs qui peuvent être responsables de cette mort importante. Ces facteurs incluent : . la réaction inflammatoire, (2) l'anoikis, (3) le stress physique et (4) l'ischémie/hypoxie. Parmi ces éléments, nous avons évalué le rôle de l'anoikis et de l'hypoxie et nous avons ainsi démontré que ces deux facteurs étaient en partie responsables de la mort des cellules. Dans un second temps, nous avons proposé deux alternatives possibles pour améliorer la survie et le succès des greffes de myoblastes. Une des approches consiste à traiter les myoblastes à un choc thermique avant de les transplanter. Ce traitement a permis d'améliorer le succès des greffes de myoblastes de 4 fois environ. L'exercice physique constitue également une approche qui, associé à une transplantation de cellules myogéniques, potentialise le succès de la transplantation. Par ailleurs, dans le but de faire le suivi des greffes de myoblastes, nous avons développé une technique qui consiste à modifier génétiquement les myoblastes pour qu'ils expriment le transporteur humain du sodium et de l'iode (hNIS). La survie et la prolifération des cellules transplantées sont évaluées en procédant à des injections intrapéritonéale de technétium. On procède ensuite à une radiographie de la région greffée à l'aide d'une camera-y. Nos résultats montrent que la réduction du nombre de myoblastes qui meurent suivant leur transplantation constitue une approche potentielle pour améliorer le succès de greffe.

Les cellules souches embryonnaires humaines (hESCs) et les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs) ont démontré leur capacité d'auto-renouvellement et peuvent potentiellement se différencier en tous les types de lignées cellulaires. Elles représentent donc une source illimitée de cellules pour le développement de thérapies curatives pour les maladies dégénératives, telles que la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Cette maladie héréditaire est le résultat de diverses mutations dans le gène de la dystrophine. Ces mutations engendrent un changement dans le cadre de lecture du gène de la dystrophine, abolissant ainsi son expression. Elle se caractérise cliniquement par une progression rapide de la dégénérescence musculaire qui débute tôt dans la vie. Les hiPSCs dystrophiques ont été corrigées par notre collaborateur, le Dr. Hotta, en insérant une paire de bases dans l’exon 45 avec les Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) pour rétablir le cadre de lecture du gène. Notre laboratoire a mis au point une procédure en deux étapes pour différencier des hiPSCs en cellules myogéniques. Nous avons d'abord utilisé un milieu de culture myogénique préparé spécialement dans le laboratoire (appelé MB1) pour promouvoir la différenciation des hiPSCs en cellules de type mésenchymateuses. Nous les avons ensuite transduites avec un lentivirus exprimant MyoD, un facteur de transcription myogénique sous le contrôle du promoteur synthétique CAG, afin d'induire leur différenciation en myoblastes. Ces myoblastes modifiés ont été greffés dans le muscle Tibialis anterior d’une souris Rag/mdx, un animal immunodéficient et dystrophique, et ont par la suite fusionné avec les fibres musculaires existantes. La présence de la protéine dystrophine humaine a été confirmée par immunohistofluorescence dans les muscles greffés avec les cellules corrigées génétiquement ainsi que dans le contrôle positif réalisé avec des myoblastes provenant d'un donneur sain. La thérapie cellulaire homotypique à partir de cellules corrigées génétiquement présente de grands avantages pour les patients souffrant de DMD, car elle permet l’expression d’un gène capable de produire une dystrophine fonctionnelle dans les fibres musculaires, de diminuer les risques de rejet de la greffe et d’accroitre la capacité de régénération du muscle et la force musculaire. / Human embryonic stem cells (hESCs) and human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have shown self-renewal capacity and can potentially differentiate into all types of cell lineages. They represent an unlimited source of cells for the therapy of degenerative diseases, such as Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), a disease characterized by a rapid degeneration of muscles that starts early in life. Dystrophic hiPSCs have been corrected by our collaborator, Dr. Hotta, by inserting of a single base pair in the exon 45 with Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) to restore the reading frame of the gene. Our laboratory has developed a two-step procedure to differentiate hiPSCs into myogenic cells. We first used a myogenic culture medium especially developped in the laboratory (called MB-1) to promote the differentiation of hiPSCs into mesenchymal-like precursor cells. We next transduced them with a lentivirus expressing the myogenic transcription factor MyoD under the control of the composite CAG promoter, in order to induce their differentiation into myoblasts. Transduced cells have been grafted in the Tibialis anterior muscle of Rag/mdx mice where they fused with existing muscle fibers. The presence of the human dystrophin protein has been confirmed by immunohistofluorescence in muscles grafted with the genetically corrected cells and in a control graft with myoblasts of a healthy donor. Cell therapy shows great promises for DMD patients since it allows the expression of a normal gene capable of producing a functional dystrophin in muscle fibers and increase the regenerative capacity of the muscle and the muscle strength.

Le muscle strié squelettique est un tissu richement vascularisé. Cependant, les vaisseaux ne sont pas seulement des pourvoyeurs d'oxygène et de nutriments, mais participent activement à l'homéostasie tissulaire en interagissant avec les cellules souches musculaires. La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie associée à un dommage musculaire, des cycles de nécrose/régénération, un remodelage tissulaire et une plasticité vasculaire. Nous avons en effet, démontré par des études in vivo un défaut d'organisation du réseau vasculaire en 3D grâce au croisement entre une souris mdx et une souris Flk1-GFP (modèle murin de la DMD fluorescente pour les cellules endothéliales), ainsi qu'une atteinte histologique du réseau vasculaire (analyse quantitative et morphométrique des vaisseaux) incluant un défaut de vascularisation des fibres musculaires. L'atteinte histologique est associée à un défaut de perfusion du muscle que nous avons démontré en RMN (résonnance magnétique nucléaire), une technique sophistiquée et non invasive nous permettant d’étudier à la fois la perfusion et le métabolisme énergétique. Dans le modèle du muscle strié squelettique, qui régénère complètement après une lésion, l'angiogenèse et la myogenèse sont concomitantes. Notre hypothèse générale est que le couplage entre myogenèse et angiogenèse est altéré dans les myopathies dégénératives mais leurs mécanismes cellulaires et moléculaires restent mal connus. Nos travaux ont mis en évidence l'existence d'un couplage cellulaire et moléculaire fonctionnel entre la myogenèse et l'angiogenèse en utilisant des modèles in vitro et in vivo dans lesquels les cellules endothéliales (ECs) et les cellules précurseurs myogéniques (MPCs) sont associées. Nos résultats montrent que MPCs et ECs s'attirent réciproquement, suggérant la sécrétion de facteurs chimiotactiques spécifiques. Les ECs stimulent fortement l'entrée des cellules souches du muscle dans le programme de différenciation myogénique (prélude indispensable à la formation des structures multinucléées et contractiles). Nous avons également démontré, grâce à une technique de coculture en 3 dimensions, que les MPCs présentent un potentiel pro-angiogénique important, permettant la formation de structures vasculaires différenciées. Ces résultats ont été validés in vivo (angiogenèse en plug sous-­‐cutanés) et démontrent ainsi que la myogenèse et l'angiogenèse sont des processus couplés au cours de la régénération musculaire. Nous avons identifié trois déterminants moléculaires mis en jeu, suite à l’analyse d’un transcriptome des cellules souches musculaires et des cellules endothéliales, isolées à partir du muscle à différents temps au cours de la régénération. Ces données indiquent que l'environnement vasculaire contrôle le destin des cellules souches musculaires, qui en retour, interagissent sur leur environnement proche. Par ces interactions, les cellules vasculaires jouent donc un rôle central dans le remodelage tissulaire après un phénomène destructif. Ce travail montre pour la première fois que l'organisation et la fonction des vaisseaux sont altérées au cours des pathologies musculaires dégénératives et l'importance des interactions entre cellules souches du parenchyme et cellules endothéliales des vaisseaux dans la régulation de l'homéostasie tissulaire, et ouvrent une réflexion sur la prise en compte du processus d'angiogenèse associé étroitement à la réparation tissulaire – ici la myogenèse – dans une perspective thérapeutiques. / Skeletal muscle is highly vascularized and has the outstanding capacity to regenerate ad integrum after an injury. Beyond oxygen and nutriment supply, new functions for vessels have been recently identified, through the interactions vessel cells establish with muscle stem cells. Duchenne Muscular Dystrophy is characterized by the lack of dystrophin, a sarcolemma anchoring protein, and by cycles of necrosis/regeneration, tissue and vessel remodeling that lead to progressive loss of muscle force. In this severe context, our aim was to decipher alterations of the vascular network structural organization and better understand the functional repercussions on the muscle tissue. We performed a confrontation between morphological and functional approaches using a non-invasive protocol. Histology and morphometry were performed using Flk1GFP/+ crossed with mdx mice (model for the human DMD where all blood vessels express GFP). Multiparametric and functional nuclear magnetic resonance consisted in simultaneous acquisition of arterial spin labelling imaging of perfusion and 31P spectroscopy of phosphocreatine kinetic. We demonstrated for the first time that the vascular system displayed marked alterations in 12 month--‐old mdx mice, more specifically at the capillary scale. Histological results confirmed these observations showing strong perturbations of the microvascular network that are directly linked to the muscle lesions. In parallel, we analyzed the repercussions of these disruptions on skeletal muscle physiology. Our results demonstrated that after a hypoxic stress, blood perfusion was decreased in mdx mouse. During skeletal muscle regeneration, myogenic precursor cells (MPCs) interact with neighboring cells to expand and differentiate. Among them, endothelial cells (ECs) have to be considered. Their close proximity suggests that myogenesis and angiogenesis take place together during muscle regeneration. Our aim was to investigate the existence of such a coupling and to identify the underlying molecular mechanisms. We demonstrated a functional interplay between the two cell types as both cells attracted each other, suggesting the secretion of specific attractive factors. ECs strongly stimulated MPC differentiation and using 3D co-cultures, we revealed that MPCs promoted angiogenesis. These results were validated in vivo using matrigel plug assay. By analyzing transcriptomic from ECs and MPCs sorted at different time points during muscle regeneration, we evidenced and validated the role of the 3 novel molecules regulating angiogenesis/myogenesis coupling: Apelin, Oncostatin M and Periostin, that each plays specific roles during early and late phases of muscle regeneration. Thus, interactions between vessel cells and MPCs seem to play a central role in the tissue remodeling after an injury. Collectively our results point out, for the first time, strong perturbations of the vascular network with functional repercussions on muscle tissue perfusion in dystrophinopathic muscle. In light of our results evidencing the coupling between myogenesis and angiogenesis during skeletal muscle regeneration, due to the specific interactions between ECs and MPCS, it is likely that, coupling between myogenesis and angiogenesis could be affected in pathological context.

Reproduction de : Habilitation à diriger des recherches : Sciences naturelles : Lille 1 : 2005. / Synthèse des travaux en français. Articles en anglais non reproduits dans la version électronique. N° d'ordre (Lille 1) : 491. Curriculum vitae. Titre provenant de la page de titre du document numérisé. Bibliogr. p. 99-111. Liste des publications et des communications.

La myopathie de Duchenne est une maladie génétique qui se caractérise principalement par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques dont la cause est l'absence de dystrophine fonctionnelle dans les muscles. A ce jour, il n'existe toujours pas de traitement efficace contre ces maladies. Comme le plus grand gène connu chez l'Homme, la dystrophine code pour une protéine de 427kDa. La protéine connecte l'actine avec le DAPC (Dystrophin Associated Protein Complex) dans les muscles striés. Pour l'instant, il y a 3 hypothèses concernant le mécanisme du DMD. L'absence de la dystrophine peut supprimer le lien physique entre les protéines structurales de la membrane basale (laminines) et les protéines structurales du cytosquelette (filaments intermédiaires et actine), ou la distribution et la fonction des canaux ioniques, ou des voies de signalisation nécessaires à la survie du muscle. Caenorhabditis elegans ne possède qu'un homologue du gène de la dystrophine humaine, le gène dys-1. La protéine DYS-1 présente 37% d'homologie avec la dystrophine humaine. Le double mutant dys-1(cx18) ; hlh-1(cc561) présente une forte dégénérescence musculaire. Comme le sarcomère de C. elegans ressemble au sarcomère de mammifère, C. elegans est modèle pertinent d'étude la maladie. En vue de comprendre la raison du DMD chez les mammifères et chez les vers, le groupe L. SEGALAT a effectué des cribles pour identifier les molécules et les gènes qui peuvent supprimer la dégénérescence musculaire. On a trouvé un gène pkc-2 qui est capable de supprimer la dégénérescence musculaire chez C. elegans. La protéine PKC-2 est l'orthologue de la Protein Kinase C Alpha (PKC) humaine et appartient à la famille du serine/threonine protéine kinase. Afin d'étudier la fonction du gène pkc-2, on a analysé l'expression du gène avec les construits différents in vivo et a utilisé la technique de double-hybride dans la levure. De plus, le crible par EMS (éthane méthyle sulfonâtes) a identifié une molécule sérotonine (5-HT) qui est un neuromédiateur, et supprime partiellement la dégénérescence musculaire des doubles mutants dys-1; hlh-1. La sérotonine a aussi un effet fort sur le mutant pkc-2(ok328), puisqu'elle provoque un phénotype blister. Ça nous permet de rechercher le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. Le crible génétique peut contribuer à la connaissance du rôle pkc-2. [...]. Elle sert aussi de plate-forme de voie de signalisation intracellulaire. L'identification de Y59A8A.3 propose la possibilité que pkc-2 modifie la filamin A par l'intermédiaire de la filamin A interacting protéine 1. Le crible génétique par EMS pour rechercher des suppresseurs de l'effet blister de la sérotonine sur les mutants pkc-2(ok328) a donné 8 candidats sur 5000 F1s : cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276. Les mutations ont été localisées sur les chromosomes par SNP mapping avec une souche de C. elegans très polymorphe, mais le temps a manqué pour leur identification exacte. L'expérience valide notre approche à étudier le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. En résumé, le but de la thèse était de rechercher la fonction du gène pkc-2 dans les mécanismes moléculaires conduisant à la nécrose musculaire en absence de dystrophine. Les résultats présentés dans la thèse apportent des réponses aux questions fondamentales sur pkc-2 et aussi demandent des expériences supplémentaires afin de élucider plus avant les mécanismes de la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante.

La transplantation de cellules souches de muscle possède un grand potentiel pour la réparation à long terme du muscle dystrophique. Cependant, la croissance ex vivo des cellules souches musculaires réduit de manière significative l'efficacité de leur greffe puisque le potentiel myogénique est considérablement réduit lors de la mise en culture. La voie de signalisation Notch a émergé comme un régulateur majeur des cellules souches musculaires (MuSCs) et il a également été décrit que la sur-activation de Notch est crucial pour le maintien du caractère souche des MuSC. Cette découverte pourrait être traduite comme un bénéfice thérapeutique potentiel. Des MuSCs murines ont été fraîchement isolées et ensemencées sur des boîtes de culture recouverte de Dll1-Fc, le domaine extracellulaire de Delta-like-1 est fusionné au fragment Fc humain, afin d'activer la voie de signalisation Notch et avec un IgG hu-main comme contrôle. Nous avons utilisé le rAAV afin d’exprimer le Dll1 spécifique-ment dans les muscles de souris. Les souris P3 ont été traitées avec de l’AAV pendant 3 semaines et 6 semaines afin d’étudier l'effet de Dll1 au cours du développement postnatal. Afin d’étudier le processus de régénération, l'AAV a également été injecté dans les muscles de souris mdx alors que les souris de type sauvage ont été utilisées comme contrôle. Un potentiel caractère souche supérieur (marquée avec le Pax7) est observé dans les cultures des MuSCs qui sont recouverte de Dll1-Fc par rapport à leurs homologues contrôles, par contre le taux de proliférer est réduit. Au cours du développement postnatal, la sur-activation de la voie de signalisation Notch par Dll1 sur les fibres musculaires a été en mesure d'élargir le pool des cellules Pax7+, cependant elle entraîne une diminution de la masse musculaire avec réduction de la taille des fibres et ceci sans affecter l'accumulation des myonuclei. Dans les MuSCs quiescentes (de type sauvage), la sur-activation de la voie de signalisation Notch ne présente pas de réel effet. La surexpression de Dll1 dans le muscle mdx a diminué la masse musculaire et agrandit le pool de cellules souches musculaires, ce-pendant le taux de régénération n'a pas été affecté. L’augmentation des MuSCs est attribuée à une différenciation entravée des cellules souches musculaires. En étudiant la stimulation de la voie de signalisation Notch dans les MuSCs à la fois in vitro et in vivo, nous démontrons que sur-activation de Notch préserve le caractère souche des cellules via l’inhibition de la prolifération et de la différenciation myogénique des MuSCs. / Muscle stem cell transplantation possesses great potential for long-term repair of dys-trophic muscle. However expansion of muscle stem cells ex vivo significantly reduces their engraftment efficiency since the myogenic potential is dramatically lost in culture. The Notch signaling pathway has emerged as a major regulator of muscle stem cells (MuSCs) and it has recently been discovered that high Notch activity is crucial for maintaining stemness in MuSCs. This feature might be exploited and developed into a novel therapeutic approach.Murine MuSCs were freshly isolated and seeded on culture vessels coated with Dll1-Fc, which fused Delta-like-1 extracellular domain with human Fc, to activate Notch sig-naling and with human IgG as a control. The rAAV gene delivery system was em-ployed to express Dll1 in murine muscles. P3 mice were treated with AAV for 3 weeks and 6 weeks to investigate the effect of Dll1 during postnatal development. To investi-gate the regeneration process, AAV were injected into mdx muscles whereas wild-type mice were used as control.Higher potential stemness (marked by Pax7 positivity) was observed in MuSCs grow-ing on a Dll1-Fc surface as compared to their counterparts on the control surface, while their proliferation rate was reduced. During postnatal development, overstimulation of Notch signaling by Dll1 on the mus-cle fibers was able to enlarge the Pax7+ cell pool, while also resulting in decreased muscle mass and smaller muscle fibers without affecting the accretion of myonuclei into the fiber. In quiescent (wild-type) MuSCs, overstimulation of Notch signaling did not have any discernible effect. Overexpression of Dll1 in mdx muscle decreased the muscle mass and enlarged the muscle stem cell pool, while muscle regeneration re-mained unaffected. By investigating Notch stimulation in MuSCs both in vitro and in vivo, we demonstrate that high Notch activity preserves stemness via inhibition of MuSCs proliferation and myogenic differentiation. Our findings point out that the Dll1 molecule, as a canonical Notch ligand, might have a therapeutic potential in cell-based therapies against muscu-lar dystrophies.

Résumé de l'étude in vitro. L'objectif de cette étude in vitro était de créer un fantôme avec la même architecture musculaire (fibre, aponévrose ...) et les mêmes propriétés mécaniques que le muscle en condition passive et active. Deux fantômes homogènes ont été fabriqués avec différentes concentrations de plastisol pour simuler les propriétés élastiques du muscle en condition passive (50% plastisol) et active (70% de plastisol). Pour cela, des fils en Téflon (d = 0,9 mm) ont été insérés dans la partie supérieure du fantôme (50%) pour représenter les fibres musculaires. De plus, une feuille en matière plastique (8 x 15 cm) a également été placée au milieu du fantôme pour imiter la structure de l'aponévrose. Ensuite, des tests ERM ont été effectués à 90 Hz avec deux stimulateurs pneumatiques de différentes formes (tube en silicone, membrane circulaire) pour analyser l'effet du type du stimulateur sur la propagation des ondes. La longueur d'onde a été mesurée à partir des images phase et les propriétés élastiques (module de cisaillement) ont été calculées. Les deux fantômes (50% et 70%) ont montré des propriétés élastiques similaires à celles du muscle à l’état passif (2,40 ± 0,18 kPa) et actif (6,24 ± 0,21 kPa). Le stimulateur en forme de tube a donné des valeurs plus élevées (environ 1,2 kPa à 1,53 kPa). L'analyse du comportement des ondes a révélé un glissement le long de la feuille plastique. Ce phénomène a aussi été observé in vivo le long de l’aponévrose. L'onde a également été sensible à la présence des fils en téflon car des coupures, des trous, ont été identifiés au cours de la propagation de l’onde. Une nouvelle méthode de post-traitement a été créée pour mesurer les paramètres G' et G" à partir de tests ERM réalisés à plusieurs fréquences (60, 80, 100 Hz) et en utilisant des modèles rhéologiques. Cette méthode a été testée sur un fantôme (50%) qui n’avait pas d’inclusion. Les résultats des mesures viscoélastiques (G', G") ont été validés avec la technique HFVS (Hyper-Fréquence viscoélastique Spectroscopy). Des valeurs similaires, G' et G’’, ont été obtenues avec les deux techniques. Ce dernier résultat valide la nouvelle méthode de post-traitement pour mesurer les propriétés viscoélastiques. Résumé de l'étude in vivo. L'objectif de cette étude in vivo a été de développer des protocoles ERM pour caractériser les propriétés élastiques (module de cisaillement) des neuf muscles de la cuisse. Ces tests ont été effectués à une seule fréquence (90 Hz). Différents modules de cisaillement ont été trouvés entre les muscles. Le gracilis a révélé des propriétés élastiques plus élevées que les autres muscles. Ces différentes élasticités peuvent être dues à différentes compositions physiologiques et architecturales entre les tissus. Ensuite, les propriétés viscoélastiques des muscles ischio (ST, SM, et la BC) et du muscle Gr ont été déterminées en appliquant la nouvelle méthode de post-traitement des données (précédemment validée sur le fantôme 50%) avec des tests ERM multi fréquences (70, 90 et 120 Hz) et en utilisant des modèles rhéologiques. Les résultats ont montré que deux modèles rhéologiques, Zener et springpot, peuvent être utilisés pour mesurer les propriétés viscoélastiques des muscles à l’état passif. De plus, des résultats similaires ont été trouvés entre G "/ G ', obtenus expérimentalement à 90 Hz, et la valeur α du modèle de springpot. / Summary of the vitro studies. The objective of this in vitro study was to create a phantom witch the same muscle architecture (fiber, aponeurosis …) and mechanical properties of muscle in passive and active states. Two homogeneous phantoms were manufactured with different concentrations of plastisol to simulate the muscle elastic properties in passive (50% of plastisol) and active (70% of plastisol) muscle conditions. Moreover, teflon tubing pipes (D = 0.9 mm) were thread in the upper part of the phantom (50%) to represent the muscle fibers and a plastic sheet (8 x 15 cm) was also included in the middle of the phantom to mimic the aponeurosis structure. Subsequently, MRE tests were performed at 90Hz with two different pneumatic drivers, tube and round shapes, to analyze the effect of the type of driver on the wave propagation. The wavelength was measured from the phase images and the elastic properties (shear modulus) were calculated. Both phantoms revealed elastic properties which were in the same range as in vivo muscle in passive (2.40 ± 0.18 kPa) and active (6.24 ± 0.21 kPa) states. The impact of the type of driver showed higher values with the tube (range: 1.2 kPa to 1.53 kPa). The analysis of the wave behavior revealed a sliding along the plastic sheet as it was observed for in vivo muscle study. The wave was also sensitive to the presence of the fibers where gaps were identified. A new post processing method was established to measure G’ and G” from experimental multi frequencies (60, 80, 100 Hz) MRE (MMRE) tests and rheological models. This method was tested on the phantom (50%) made without fiber. Cross validation of the viscoelastic (G’, G”) results was made with Hyper-Frequency Viscoelastic Spectroscopy (HFVS). Both techniques showed similar range of values for G’ and G” at the same frequencies. This last result validated our new data processing for the viscoelastic measurement. Summary of the in vivo studies. The objective of this in vivo study was to develop MRE protocols to characterize the elastic properties (shear modulus) of the nine thigh muscles. These tests were performed at a single frequency (90Hz). Different shear moduli were found between the muscles. The gracilis revealed the highest elastic properties compared to all the other muscles. These different elasticities may be due to different physiological and architectural compositions between the tissues. Then the viscoelastic properties of the ischio (ST, SM, and BC) and Gr muscles were determined based on our new data-processing method (validated on the phantom 50%) using MMRE tests (70, 90 and 120Hz) and rheological models. The results revealed that two rheological models, zener and springpot, can be used to measure the viscoelastic properties in passive state. A similar trend was found between the experimental ratios G”/G’ obtained at 90 Hz and the α value of the springpot model. The present MRE muscle protocol, and the viscoelastic data base, could be used as non-invasive diagnostic tools to evaluate tissue alterations, the progression of diseases, and the effect of treatments, such as the ongoing therapeutic trials for Duchenne muscular dystrophy.

La myopathie de Duchenne est une maladie génétique qui se caractérise principalement par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques dont la cause est l’absence de dystrophine fonctionnelle dans les muscles. A ce jour, il n’existe toujours pas de traitement efficace contre ces maladies. Comme le plus grand gène connu chez l’Homme, la dystrophine code pour une protéine de 427kDa. La protéine connecte l’actine avec le DAPC (Dystrophin Associated Protein Complex) dans les muscles striés. Pour l’instant, il y a 3 hypothèses concernant le mécanisme du DMD. L’absence de la dystrophine peut supprimer le lien physique entre les protéines structurales de la membrane basale (laminines) et les protéines structurales du cytosquelette (filaments intermédiaires et actine), ou la distribution et la fonction des canaux ioniques, ou des voies de signalisation nécessaires à la survie du muscle. Caenorhabditis elegans ne possède qu’un homologue du gène de la dystrophine humaine, le gène dys-1. La protéine DYS-1 présente 37% d’homologie avec la dystrophine humaine. Le double mutant dys-1(cx18) ; hlh-1(cc561) présente une forte dégénérescence musculaire. Comme le sarcomère de C. elegans ressemble au sarcomère de mammifère, C. elegans est modèle pertinent d’étude la maladie. En vue de comprendre la raison du DMD chez les mammifères et chez les vers, le groupe L. SEGALAT a effectué des cribles pour identifier les molécules et les gènes qui peuvent supprimer la dégénérescence musculaire. On a trouvé un gène pkc-2 qui est capable de supprimer la dégénérescence musculaire chez C. elegans. La protéine PKC-2 est l’orthologue de la Protein Kinase C Alpha (PKC) humaine et appartient à la famille du serine/threonine protéine kinase. Afin d’étudier la fonction du gène pkc-2, on a analysé l’expression du gène avec les construits différents in vivo et a utilisé la technique de double-hybride dans la levure. De plus, le crible par EMS (éthane méthyle sulfonâtes) a identifié une molécule sérotonine (5-HT) qui est un neuromédiateur, et supprime partiellement la dégénérescence musculaire des doubles mutants dys-1; hlh-1. La sérotonine a aussi un effet fort sur le mutant pkc-2(ok328), puisqu’elle provoque un phénotype blister. Ça nous permet de rechercher le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. Le crible génétique peut contribuer à la connaissance du rôle pkc-2. […]. Elle sert aussi de plate-forme de voie de signalisation intracellulaire. L’identification de Y59A8A.3 propose la possibilité que pkc-2 modifie la filamin A par l’intermédiaire de la filamin A interacting protéine 1. Le crible génétique par EMS pour rechercher des suppresseurs de l’effet blister de la sérotonine sur les mutants pkc-2(ok328) a donné 8 candidats sur 5000 F1s : cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276. Les mutations ont été localisées sur les chromosomes par SNP mapping avec une souche de C. elegans très polymorphe, mais le temps a manqué pour leur identification exacte. L’expérience valide notre approche à étudier le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. En résumé, le but de la thèse était de rechercher la fonction du gène pkc-2 dans les mécanismes moléculaires conduisant à la nécrose musculaire en absence de dystrophine. Les résultats présentés dans la thèse apportent des réponses aux questions fondamentales sur pkc-2 et aussi demandent des expériences supplémentaires afin de élucider plus avant les mécanismes de la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked progressive muscle disease which is caused by mutations in the dystrophin gene. Until now, there is no effective therapy for DMD. As the largest gene in human beings, it produces a 427-kDa cytoskeleton protein: Dystrophin. Dystrophin links actin and dystrophin associated protein complex (DAPC) in muscles. Currently, there are 3 hypotheses to explain the mechanisms of DMD. They suggest that the absence of dystrophin could lead to periodic muscle cell membrane ruptures, or affect the distribution and function of ion channels, or perturb signal transduction pathways. In Caenorhabditis elegans, there is only one homologue of mammalian dystrophin gene named dys-1, and the nematode protein DYS-1 presents 37% similar to the human one. The double mutant dys-1; hlh-1 exhibits a severe progressive muscle degeneration. The protein composition of the sarcomere has been studied and it has revealed a high degree of similarity with mammalian sarcomere. These allow C. elegans be a relevant animal model to study DMD.To understand why the lack of dystrophin induces muscle degeneration in mammals and worms, and to find new drugs that might help in reducing muscle degeneration, L. Ségalat and his coworkers performed several screens for drugs and genes suppressing muscle degeneration. An interesting gene pkc-2 came out and was considered as a possible regulator in the process of muscle degeneration in C. elegans. The protein that is encoded by this gene in C. elegans is an orthologous of the human gene Protein Kinase C Alpha (PKC), which belongs to the family of serine/threonine specific protein kinases. To study the function of pkc-2, we generated different recombinant constructs, analyzed the expression pattern of pkc-2 with immunocytochemistry, and performed yeast two-hybrid to search for PKC-2 binding partners. In addition, a neurotransmitter serotonin (5-HT) was found by drug screening to be an active blocker of striated muscle degeneration. As C. elegans lacking PKC-2 displays a severe blister phenotype in exogenous 5-HT, studying the correlation between PKC-2 and 5-HT therefore seems to be an opportunity to explore the reasons of muscle degeneration. A genetic screen with EMS (ethane methyl sulfonate) to search serotonin resistant mutant in strain pkc-2 (ok328) would help us study further about the role of pkc-2.In this thesis, different clones myo3::pkc-2 and pkc-2::gfp were made to inject into wild-type animals. The results revealed that pkc-2 expressed intensely in neurons and pharynx, but was not found in body-wall muscles. Mutants dys-1;hlh-1 fed with pkc-2 RNAi did not reduce muscle degeneration statistically comparing to triple mutant pkc-2;dys-1;hlh-1. This indicated that PKC-2 may be dominantly acting in neurons. A yeast two-hybrid screen identified the gene Y59A8A.3, which is a homologue to mammalian filamin A interacting protein 1 isoform 3, as a binding partner of PKC-2. Filamin A is a cytoskeleton protein, anchoring various trans-membrane proteins to the actin cytoskeleton and may also function as an important signaling scaffold. The result suggested that PKC-2 may therefore modulate filamin A activity through the filamin interacting protein 1. Genetic screen by EMS presented 8 candidates named cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276, which were mapped on chromosomes by SNP mapping using a polymorphic C. elegans strain, but time was too short to identify these genes formally. The experiment also offered possibilities of searching links between PKC-2 and serotonin pathways.In summary, this work studied the gene pkc-2 in order to reveal the function of PKC-2 and its involvement in muscle degeneration. The present results answered some questions about pkc-2, and needed further researches to elucidate the in vivo role of PKC-2 protein and its interaction with other proteins in the mechanism of muscle dystrophy in C. elegans.