A produção de leite e queijo de ovelha pode ser considerada recente no Brasil, por isso a necessidade de estudar a composição e o processamento destes alimentos. As bactérias lácticas presentes no leite são empregadas como culturas iniciadoras em queijos e influenciam nas características de qualidade do produto. A qualidade microbiológica e físico-química do leite de ovelha da raça Lacaune e do queijo Fascal produzidos no RS foi avaliada, durante a produção e maturação do queijo. As bactérias lácticas Lactobacillus plantarum LCN 17 e Lactobacillus rhamnosus LCN 43 foram isoladas a partir das amostras e o potencial antimicrobiano, proteolítico e lipolítico destes isolados foi investigado. Com base nos resultados, foi testada a utilização das bactérias lácticas autóctones como culturas iniciadoras para a produção de queijo de ovelha. A combinação entre Lactobacillus plantarum LCN 28 e Lactobacillus rhamnosus LCN 43 demonstrou ser adequada na fabricação de queijo Fascal, em condições experimentais. A caseína precipitada a partir do leite de ovelha foi usada na preparação de caseinatos de sódio e de cálcio. O processo de agregação e formação de géis de caseinato ovino por acidificação e as modificações que estes géis sofreram na presença de açúcares e/ou pequenos co-solutos foi estudada. A concentração de cálcio afetou a solubilidade do caseinato ovino, o grau de compactação e a dureza dos géis. A adição de sacarose e lactose ao caseinato ovino acarretou a formação de partículas coloidais com estrutura mais compacta e menor hidrofobicidade superficial. Em ambos os casos, o caseinato ovino e bovino apresentaram comportamento um pouco distinto. / The production of sheep milk and cheese may be considered a recent activity in Brazil; hence the need to study the composition and processing of these foods. Lactic acid bacteria present in milk are used as starter cultures in cheese production, and influence product quality characteristics. The microbiological and physicochemical quality of milk of the Lacaune sheep breed and of Fascal cheese produced in the state of Rio Grande do Sul, RS, Brazil, was assessed during cheese production and ripening. The lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum LCN 17 and Lactobacillus rhamnosus LCN 43 were isolated from samples to investigate the antimicrobial, proteolytic and lipolytic potentials of each microorganism. The results were used to test the applicability of these autochthonous bacteria as starter cultures in the production of ewe cheese. The mixed culture of Lactobacillus plantarum LCN 28 and Lactobacillus rhamnosus LCN 43 was shown to be appropriate in the production of Fascal cheese, under experimental conditions. The casein precipitated from sheep milk was used in the preparation of sodium and calcium caseinates. The aggregation process and formation of ovine caseinate gels by acidification and the changes these gels undergo in the presence of sugars and/or small cosolutes were investigated. Calcium concentration affected the solubility of ovine caseinate, compactation degree and hardness of gels. The addition of saccharose and lactose to ovine caseinate led to the formation of colloidal particles presenting a more structured and lesser surface hydrophobicity. In both cases, ovine and bovine caseinate presented fairly distinct behaviors.

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Os objetivos foram: a) desenvolver uma metodologia de criação de G. mellonella, avaliando quatro dietas diferentes sobre crescimento larval, volume da hemolinfa, quantidade de hemócitos e resposta à infecção por meio da curva de sobrevivência b) avaliar os efeitos de L. rhamnosus sobre G. mellonella analisando: curva de sobrevivência; contagem de hemócitos, melanização da hemolinfa, produção de óxido nítrico na hemolinfa e os efeitos de L. rhamnosus sobre macrófagos RAW 264.7 desafiados por S. aureus ou E. coli, analisando o perfil de indução de citocinas e óxido nítrico. Os resultados foram analisados estatisticamente (ANOVA e Tukey, 5%) e a curva de morte e estimativa das diferenças na sobrevivência foram determinadas por Log-rank (Mantel-Cox, 5%). As rações a base de fubá e pólen apresentaram os melhores resultados, sendo semelhantes entre si e diferentes das demais rações (p < 0,05), sendo a ração a base de fubá escolhida por apresentar resultados semelhante ao pólen e menor custo. Os resultados in vivo demontraram diminuição na mortalidade das lagartas no grupo com inoculação de L. rhamnosus, entretanto, sem diferença estatística. Houve aumento na contagem de hemócitos quando G. mellonella foi inoculada com S. aureus e E. coli, com ou sem inoculação de L. rhamnosus, além de haver melanização da hemolinfa, demonstradno que o L. rhamnosus melhorou a resposta de G. mellonella quando desafiada por bactérias. Os resultados in vitro demonstram que L. rhamnosus induziu alta produçaõ de TNF-α, igualmente aos demais grupos (p ≤ 0,05), não havendo produção de IL-1β e IL-6 no grupo estimulado apenas por L. rhamnosus. Nos grupos que receberam o segundo estímulo ou apenas o contato com S. aureus ou E. coli, houve produção de IL-1β, IL-6 e IL-10. As maiores produções de óxido nítrico foram observadas nos grupos estimulados com S. aureus. Houve diminuição na contagem de UFC/mL de S. aureus e E. coli, quando os macrófagos foram estimulados com lactobcilos. Isso sugere que L. rhamnosus inativado foi capaz de modular produção de citocinas e óxido nítrico quando as células foram desafiadas por S. aureus e E. coli, além de diminuir a contagem de CFU/mL, sugerindo melhorar a capacidade fagocitária dos macrófagos. / Galleria mellonella is used to study microorganisms virulence and antimicrobial power. This study aimed to standardize the creation of worms used in In vivo assays and evaluate the effect of heat-killed probiotic, Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469, on this model and in in vitro studies. The objectives were: a) developing a methodology for breeding G. mellonella with four different diets influence on larval growth, hemolymph volume, quantity of hemocytes and infection response by means of survival curve; b) evaluating the effects of L. rhamnosus on G. mellonella by means of the following analyzes: survival curve, hemocytes counting, hemolymph melanization, nitric oxide release, and the effects of L. rhamnosus on macrophages RAW 264.7 challenged by S. aureus or E. coli by means of cytokines and nitric oxide production. Results were statistically analyzed (ANOVA and Tukey, 5%). Death curve and estimation of differences in survival were determined by Log-rank (MantelCox, 5%). Cornmeal and pollen-based rations showed the best results, being similar to each other and different from the other ones (p <0.05).Cornmeal ration was chosen since it presents results similar to pollen and lower cost. In vivo results showed reduction in mortality of caterpillars in the group inoculated with L. rhamnosus, with no statistical difference. Hemocyte counting increased when G. mellonella was inoculated with S. aureus and E. coli, with or without inoculation of L. rhamnosus, add to that hemolymph melanization, showing that L. rhamnosus improved G. mellonella response challenged by bacteria. In vitro results show that L. rhamnosus induced high production of TNF-α, like other groups (p = 0.05), with no production of IL-1β and IL-6 in the group stimulated only by L. rhamnosus. The groups which received only the second stimulus or only the contact with S. aureus or E. coli, there was IL-1β, IL-6 and IL-10 production. The highest nitric oxide production was observed in the groups challenged with S. aureus. S. aureus and E. coli CFU/mL counting decreased when macrophages were stimulated with lactobacilli. This suggests that heat-killed L. rhamnosus was capable of modulating cytokine and nitric oxide production when cells were challenged with S. aureus and E. coli and reduce the CFU/mL counting, suggesting that there was enhancement in the phagocytic capacity of macrophages.

A produção de leite e queijo de ovelha pode ser considerada recente no Brasil, por isso a necessidade de estudar a composição e o processamento destes alimentos. As bactérias lácticas presentes no leite são empregadas como culturas iniciadoras em queijos e influenciam nas características de qualidade do produto. A qualidade microbiológica e físico-química do leite de ovelha da raça Lacaune e do queijo Fascal produzidos no RS foi avaliada, durante a produção e maturação do queijo. As bactérias lácticas Lactobacillus plantarum LCN 17 e Lactobacillus rhamnosus LCN 43 foram isoladas a partir das amostras e o potencial antimicrobiano, proteolítico e lipolítico destes isolados foi investigado. Com base nos resultados, foi testada a utilização das bactérias lácticas autóctones como culturas iniciadoras para a produção de queijo de ovelha. A combinação entre Lactobacillus plantarum LCN 28 e Lactobacillus rhamnosus LCN 43 demonstrou ser adequada na fabricação de queijo Fascal, em condições experimentais. A caseína precipitada a partir do leite de ovelha foi usada na preparação de caseinatos de sódio e de cálcio. O processo de agregação e formação de géis de caseinato ovino por acidificação e as modificações que estes géis sofreram na presença de açúcares e/ou pequenos co-solutos foi estudada. A concentração de cálcio afetou a solubilidade do caseinato ovino, o grau de compactação e a dureza dos géis. A adição de sacarose e lactose ao caseinato ovino acarretou a formação de partículas coloidais com estrutura mais compacta e menor hidrofobicidade superficial. Em ambos os casos, o caseinato ovino e bovino apresentaram comportamento um pouco distinto. / The production of sheep milk and cheese may be considered a recent activity in Brazil; hence the need to study the composition and processing of these foods. Lactic acid bacteria present in milk are used as starter cultures in cheese production, and influence product quality characteristics. The microbiological and physicochemical quality of milk of the Lacaune sheep breed and of Fascal cheese produced in the state of Rio Grande do Sul, RS, Brazil, was assessed during cheese production and ripening. The lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum LCN 17 and Lactobacillus rhamnosus LCN 43 were isolated from samples to investigate the antimicrobial, proteolytic and lipolytic potentials of each microorganism. The results were used to test the applicability of these autochthonous bacteria as starter cultures in the production of ewe cheese. The mixed culture of Lactobacillus plantarum LCN 28 and Lactobacillus rhamnosus LCN 43 was shown to be appropriate in the production of Fascal cheese, under experimental conditions. The casein precipitated from sheep milk was used in the preparation of sodium and calcium caseinates. The aggregation process and formation of ovine caseinate gels by acidification and the changes these gels undergo in the presence of sugars and/or small cosolutes were investigated. Calcium concentration affected the solubility of ovine caseinate, compactation degree and hardness of gels. The addition of saccharose and lactose to ovine caseinate led to the formation of colloidal particles presenting a more structured and lesser surface hydrophobicity. In both cases, ovine and bovine caseinate presented fairly distinct behaviors.

A produção de leite e queijo de ovelha pode ser considerada recente no Brasil, por isso a necessidade de estudar a composição e o processamento destes alimentos. As bactérias lácticas presentes no leite são empregadas como culturas iniciadoras em queijos e influenciam nas características de qualidade do produto. A qualidade microbiológica e físico-química do leite de ovelha da raça Lacaune e do queijo Fascal produzidos no RS foi avaliada, durante a produção e maturação do queijo. As bactérias lácticas Lactobacillus plantarum LCN 17 e Lactobacillus rhamnosus LCN 43 foram isoladas a partir das amostras e o potencial antimicrobiano, proteolítico e lipolítico destes isolados foi investigado. Com base nos resultados, foi testada a utilização das bactérias lácticas autóctones como culturas iniciadoras para a produção de queijo de ovelha. A combinação entre Lactobacillus plantarum LCN 28 e Lactobacillus rhamnosus LCN 43 demonstrou ser adequada na fabricação de queijo Fascal, em condições experimentais. A caseína precipitada a partir do leite de ovelha foi usada na preparação de caseinatos de sódio e de cálcio. O processo de agregação e formação de géis de caseinato ovino por acidificação e as modificações que estes géis sofreram na presença de açúcares e/ou pequenos co-solutos foi estudada. A concentração de cálcio afetou a solubilidade do caseinato ovino, o grau de compactação e a dureza dos géis. A adição de sacarose e lactose ao caseinato ovino acarretou a formação de partículas coloidais com estrutura mais compacta e menor hidrofobicidade superficial. Em ambos os casos, o caseinato ovino e bovino apresentaram comportamento um pouco distinto. / The production of sheep milk and cheese may be considered a recent activity in Brazil; hence the need to study the composition and processing of these foods. Lactic acid bacteria present in milk are used as starter cultures in cheese production, and influence product quality characteristics. The microbiological and physicochemical quality of milk of the Lacaune sheep breed and of Fascal cheese produced in the state of Rio Grande do Sul, RS, Brazil, was assessed during cheese production and ripening. The lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum LCN 17 and Lactobacillus rhamnosus LCN 43 were isolated from samples to investigate the antimicrobial, proteolytic and lipolytic potentials of each microorganism. The results were used to test the applicability of these autochthonous bacteria as starter cultures in the production of ewe cheese. The mixed culture of Lactobacillus plantarum LCN 28 and Lactobacillus rhamnosus LCN 43 was shown to be appropriate in the production of Fascal cheese, under experimental conditions. The casein precipitated from sheep milk was used in the preparation of sodium and calcium caseinates. The aggregation process and formation of ovine caseinate gels by acidification and the changes these gels undergo in the presence of sugars and/or small cosolutes were investigated. Calcium concentration affected the solubility of ovine caseinate, compactation degree and hardness of gels. The addition of saccharose and lactose to ovine caseinate led to the formation of colloidal particles presenting a more structured and lesser surface hydrophobicity. In both cases, ovine and bovine caseinate presented fairly distinct behaviors.

Les EPS bactériens peuvent servir d' agents texturants dans l' industrie alimentaire et certaines propriétés santé leur sont proposées. Les séquences des gènes des opérons responsables de la biosynthèse des EPS de Lactobacillus rhamnosus RW-9595M, ATCC 9595, R et RW-6541M montrent très peu de différences, bien que la quantité d'EPS produite par ces souches soit différente (543, 108, 212 et 179 mg d'EPS/l, respectivement). Le but de ce projet est d'établir des liens entre la production d'EPS de ces souches et l'expression de différents gènes, lors de la croissance sur glucose. La technique de rétrotranscriptase-PCR quantitative (qR T -PCR) a été utilisée pour mesurer l'expression de gènes connus et impliqués dans la biosynthèse des EPS. Les 12 gènes ciblés sont associés à la synthèse des sucres précurseurs, à la polymérisation des unités répétitives ou sont des régulateurs de la transcription. La souche RW-9595M montre une surexpression de la des 12 gènes cibles en phase exponentielle de croissance, par rapport à la phase stationnaire, comparativement à la surexpression de seulement trois ou quatre gènes, dans les mêmes conditions, pour les souches ATCC 9595, R et RW-6541M. Ces résultats suggèrent que la quantité totale d'EPS produite par la souche RW-9595M (la plus productrice) est le reflet d'une plus grande activité trancriptionnelle de cette souche lors de la croissance logarithmique, ayant des effets potentiels sur l'activité métabolique durant cette phase. Les souches R et RW-6541M (productions d'EPS moyennes) ne montrent aucune différence d'expression significative des gènes ciblés entre elles. Aussi, dans les conditions utilisées, la souche ATCC 9595 semble moins efficace dans la production de biomasse, ce qui est réflété par sa faible production d'EPS. Afin de découvrir si d'autres différences transcriptionnelles entre les souches sont à l'origine de leurs productions d'EPS différentes, une méthode d'affichage différentiel (cDNA-AFLP), visant la comparaison de l'ensemble des transcriptomes, a également été explorée. Sur trois gènes ainsi ciblés, un seul a montré une différence réelle d'expression entre les souches RW-6541M et RW-9595M. En somme, il apparaît que les différences de production d'EPS entre les souches de L. rhamnosus seraient plutôt causées par des différences globales de transcription, et ainsi peut-être par d'autres différences de métabolisme, que par des différences d'expression des gènes des opérons EPS spécifiquement.

Un procédé de fermentation basé sur une coculture des souches probiotiques Lactobacillus rhamnosus R et Lactobacillus rhamnosus RW9595M a été utilisé pour coproduire des exopolysaccharides (EPS) de poids moléculaires modulés. Dans cette étude, les deux souches ont été cultivées séparément et en coculture. Les souches ont été cultivées durant 72 h, à 37 °C, sous contrôle de pH à 6.0, et avec une agitation de 100 r.p.m. Deux milieux de culture ont été testés, le milieu minimum basai supplémenté (BMM-S) avec 1.1% (v/v) de tryptone et le perméat de lactosérum supplémenté (PLS) avec 1.1% (v/v) de tryptone, 0.5 mg /L de MgS04, 0.05 mg /L de MnS04 et 0.1% de Tween 80. La croissance cellulaire des souches et le poids moléculaire ont été mesurés au cours de la fermentation par dénombrement sur gélose et par HPLC-SEC, respectivement. Lorsque les souches ont été cocultivées dans le BMM-S en proportion de 1 :1, 991 ±30 mg/L d'EPS avec des poids moléculaires de 1.0 ± 0.21 x 106, 1.6 ± 0.16 x 106 Da, et 1.9 ± 0.18 x 105 Da, ont été obtenus. Dans le milieu PLS, les souches ont été cocultivées en proportion de 9:1 (R/RW9595M), 657 ± 90 mg/L d'EPS avec des poids moléculaires de 5.59 ± 0.82 x 104Da, ont été obtenus. La croissance cellulaire individuelle a été mesurée par qPCR-TaqMan pour les essais dans le milieu PLS. La concentration cellulaire maximale pour chaque souche était de 2.05 x 109 UFC/mL pour Lb. rhamnosus R, et de 3.67 x 108 UFC/mL pour Lb. rhamnosus RW9595M. Ce procédé est simple et économique pour la culture des probiotiques à haute valeur ajoutée en fabrications alimentaires.

Le lactosérum est un coproduit de l'industrie de fabrication du fromage et de la caséine et se caractérise par une forte demande chimique et biologique en oxygène. Les énormes quantités de lactosérum générées dans le monde, sa composition particulière et son utilisation limitée dans l'industrie alimentaire rendent nécessaire la recherche d'autres moyens d'ajouter de la valeur à cet ingrédient en vue d'augmenter la rentabilité de la transformation du lait. Dans ce contexte, la technologie de l'électro-activation (EA) offre la possibilité de valoriser le lactosérum par la conversion in situ d'une partie du lactose en lactulose, un prébiotique bien connu et éprouvé. De plus, l'EA cathodique du lactosérum a montré une formation des bases de Schiff suite à la glycation avec différents sucres des protéines, des peptides et des acides aminés libres dans le processus d'électro-isomérisation du lactose en lactulose. Ces produits sont connus pour leur forte activité antioxydante. Ainsi, l'EA ouvre une possibilité de générer un ingrédient fonctionnel avec une valeur ajoutée significative. Dans ce contexte, l'objectif principal de ce projet de doctorat était d'étudier et de démontrer la faisabilité technologique de l'utilisation du lactosérum électro-activé comme ingrédient fonctionnel à haut potentiel prébiotique dans la production de différents produits laitiers fermentés. La première étape de ce projet a été l'évaluation du comportement du lactosérum électro-activé dans la matrice de gel de lait fermenté. Une comparaison entre le pourcentage de matière grasse du lait, l'inoculum de lactosérum et le type de lactosérum a été effectuée. À cette fin, des échantillons de lait fermenté ont été préparés avec un ajout de 3, 6 et 9 % de lactosérum des deux types (électro-activé et non électro-activé). Il a été constaté que le lactosérum électro-activé prolongeait le temps d'obtention d'un pH de 4,6 en fonction de la quantité ajoutée. Ceci a été attribué à la capacité tampon plus élevée du lactosérum électroactivé; les résultats de l'acidité titrable ayant démontré des niveaux élevés de groupes acides libres. La microstructure du gel obtenu avec l'ajout du lactosérum électro-activé a montré une structure uniforme et moins poreuse, ce qui était en accord avec les résultats de la réduction de la synérèse. Pour confirmer ces résultats, un autre produit laitier fermenté avec un ajout de lactosérum électro-activé a été également développé. Le kéfir enrichi de lactosérum électro-activé présentait également une phase de fermentation prolongée. Les particules de lactosérum EA ont été incorporées de manière homogène dans la matrice du gel de kéfir. Par conséquent, aucune synérèse n'était visible dans les échantillons de kéfir additionnés de lactosérum EA à 9 %. De plus, les deux produits contenaient des niveaux élevés d'acides organiques (lactique, citrique, acétique, propionique et butyrique) lorsqu'ils étaient supplémentés avec du lactosérum EA. La production d'acide butyrique a été induite par l'ajout de lactosérum des deux types. L'analyse HPLC a révélé qu'environ 75-85% des niveaux initiaux de lactulose ont été conservés dans les produits avec du lactosérum EA après le processus de fermentation, ce qui démontre que la consommation de tels produits pourrait constituer une source de lactulose pour le consommateur. La deuxième étape de cette recherche a été d'optimiser l'utilisation du lactosérum électro-activé en tant qu'ingrédient par son incorporation dans le produit qui convient à sa couleur et aux caractéristiques de la réaction de Maillard et des conjugués entre les matières azotées avec les sucres. Le lait fermenté cuit, Ryazhenka, a été testé comme une matrice alimentaire appropriée pour véhiculer le lactosérum EA enrichi en lactulose. L'extension du temps de fermentation a été moins importante pour ce produit. Ainsi, le Ryazhenka additionné de lactosérum à 9% a atteint un pH de 4,6 après 4 h de fermentation. Le produit additionné de lactosérum EA (9%) a atteint ce niveau après 6,5 h. De plus, le lactosérum EA a amélioré la capacité antioxydante de Ryazhenka. Au cours de cette étape, nous avons démontré par des tests in vitro que l'électro-activation du lactosérum peut diminuer l'allergénicité de la β-lactoglobuline de 19,52 mg/kg à 7,56 mg/kg, qui s'est stabilisée à 12,13 mg/kg après neutralisation. Comme le protocole de production de Ryazhenka comprend une étape de cuisson de 3 à 5 h à 97-100°C, on considère qu'il présente des taux d'allergénicité plus faibles en raison des changements de conformation des protéines induits par la chaleur. Ainsi, l'ajout de lactosérum électro-activé ne contribue pas à l'augmentation de l'allergénicité de ce produit. Le troisième objectif de cette étude était de démontrer un potentiel prébiotique du lactosérum électro-activé en cultivant des bactéries probiotiques Lactobacillus rhamnosus subsp, Lactobacillus rhamnosus GG et Lactobacillus acidophilus ATCC4356. La densité optique(OD₆₀₀), le dénombrement sur plaques de Petri, la stabilité durant l'entreposage à 4 °C et la tolérance aux acides et à la bile des bactéries cultivées pendant 24 heures dans du lactosérum électro-activé ont été étudiés et comparés aux résultats obtenus par la culture sur du lactosérum, du lactosérum additionné de lactulose, du MRS et du MRS avec ajout de lactulose. Les valeurs OD₆₀₀ les plus élevées (>2) ont été obtenues dans les biomasses de lactosérum EA pour toutes ces bactéries. Cependant, les numérations sur plaque de Petri n'ont pas confirmé un nombre plus élevé de cellules bactériennes dans du lactosérum électro-activé. On peut donc conclure que le lactosérum électro-activé a probablement stimulé un métabolisme distinct chez les bactéries testées, ce qui est conforme à la définition des prébiotiques qui ont la particularité d'induire une stimulation de la croissance et/ou de l'activité des bactéries probiotiques afin de conférer des avantages pour la santé. En résumé, cette recherche a validé la faisabilité technologique de l'utilisation du lactosérum électro-activé comme ingrédient dans la production de lait fermenté et source de lactulose qui reste stable durant l'entreposage pendant 14 jours à 4 °C. Également, ce projet a montré que le lactosérum électro-activé est un ingrédient fonctionnel prometteur pour une éventuelle utilisation potentielle comme additif alimentaire fonctionnel et prébiotique dans l'industrie laitière. De plus, il peut être utilisé comme agent protecteur pour améliorer la viabilité et l'activité des probiotiques.

Les souches Lactobacillus rhamnosus RW-9595M et ATCC 9595 possèdent 17 cadres de lecture ouverts (ORF) identiques à 99 % identifiés comme gènes de biosynthèse putatifs des EPS. Par contre, les quantités produites diffèrent avec 543 mg l-1 pour RW-9595M et 108 mg l-1 pour ATCC 9595. La phosphorylation réversible a été proposée comme mécanisme pour réguler la polymérisation des EPS chez les bactéries lactiques. Parmi les protéines participant à la polymérisation, on propose la tyrosine kinase, la tyrosine phosphatase et la co-polymérase. Cette étude cherche à démontrer l’impact de la phosphorylation de ces protéines, surtout la co-polymérase (Wzd), sur le complexe de ces protéines chez L. rhamnosus. Afin de tester l’effet de la phosphorylation sur leurs interactions, Wzd (co-polymérase) et Wze (kinase) ont été exprimées chez L. lactis ou chez E. coli. Chez L. lactis ssp. cremoris, certaines combinaisons de gènes peuvent être associées à la production d'EPS in vivo. Chez E. coli, l'expression des gènes peut être contrôlée, permettant d'exprimer et de purifier des protéines dans le but d'effectuer l'étude de leurs interactions in vitro. Les clones de la souche L. lactis ssp. cremoris MG1363 (naturellement non productrice d’EPS) transformée avec l’opéron EPS de RW-9595M ou ATCC 9595 produisent respectivement 326 et 302 mg l-1, mais avec des rendements inférieurs à la production chez la souche d'origine RW-9595M. Lors des essais in vitro, Wzd et Wze ne s’autophosphorylent pas lorsqu'elles sont seules, mais ensemble elles forment un complexe. Le complexe entre ces deux protéines non phosphorylées permet la phosphorylation de Wzd par Wze en présence d’ATP. Wze est libérée par la déstabilisation de cette interaction suivant la phosphorylation. L’existence de Wzd phosphorylée et de l’ATP conduit à l’auto-phosphorylation de Wze par une interaction transitoire. De plus, l’activité de Wzd est modulée par la phosphorylation des tyrosines en permettant l’autophosphorylation de Wze. Or, la phosphorylation de Wzd peut être une étape de phosphorylation réversible pour la polymérisation des EPS. Cette étude contribue à la compréhension de la relation entre les caractéristiques et les fonctions biologiques des polymères d'EPS. / Lactobacillus rhamnosus RW-9595M and ATCC 9595 have 99 % identical 17 open reading frames (ORFs) identified as putative genes coding for EPS biosynthesis and both strains produce very different EPS amounts: 543 mg l-1 (RW-9595M) and 108 mg l-1 (ATCC 9595). Reversible phosphorylation has been proposed as a mechanism to regulate the polymerization of EPS in lactic acid bacteria and three proteins, tyrosine kinase, tyrosine phosphatase and co-polymerase are proposed to be responsible for this regulation. The aim of this project was to demonstrate the impact of the phosphorylation of these proteins, especially the co-polymerase (Wzd), on the protein complex for EPS polymerization in L. rhamnosus. To test the effect of phosphorylation on their interactions, Wzd and Wze were expressed in L. lactis subsp. cremoris and E. coli. In L. lactis subsp. cremoris, the presence of certain combinations of genes can be associated with EPS production yields. In E. coli, gene expression can be controled and the proteins purified in order to study their interactions and phosphorylation state in vitro. Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363, a non EPS-producing strain, was transformed with two recombinant plasmids coding for the genes required for EPS synthesis. These transformants with operons from either RW-9595M or ATCC 9595 produce 326 and 302 mg l-1 respectively, with lower yields than RW-9595M. The proteins encoded by wzd and wze are respectively the co-polymerase and the kinase which theoretically participate in determining the chain length of the EPS. These two proteins do not autophosphorylate when they are alone, but together form a complex. The non-phosphorylated complex of two proteins allows the phosphorylation of Wzd by Wze, in the presence of ATP. This phosphorylation destabilizes the protein interaction with Wze. The transient interaction with phosphorylated Wzd leads to autophosphorylation of Wze in the presence of ATP. In addition, the activity of Wzd is modulated by tyrosine phosphorylation allowing autophosphorylation of Wze. Thus, the phosphorylation of Wzd may be an additional step of reversible phosphorylation for polymerization of EPS. This study may help advance our understanding of the relationship between the characteristics and biological functions of these polymers.

In etlichen Studien konnte die gesundheitsfördernde Wirkung von probiotischen Bakterien nachgewiesen werden. Heutzutage werden diese zahlreich in der Nahrungsmittel- und Kosmetikindustrie verwendet, um das Immunsystem des Menschen positiv zu beeinflussen. Probiotische Bakterien oder deren Extrakte können zum Beispiel die Produktion von Zytokinen anregen oder herabsetzen und dadurch Entzündungsreaktionen verhindern oder die körpereigene Abwehr steigern. Auch die Produktion des humanen Beta-Defensins-2 (hBD-2) kann durch probiotische Bakterien verändert werden. Dieses wirkt im menschlichen Körper wie ein körpereigenes Antibiotikum und wird von verschiedenen Zellen kontinuierlich gebildet. Gerade in entzündetem Gewebe unterliegt es einer gesteigerten Produktion. Inwieweit sich die hBD-2-Produktion in oralen Keratinozyten der Zelllinie OKF6/hTERT-2 verändert, während diese mit den Extrakten der probiotischen Bakterien Lactobacillus salivarius (L.s.) und Lactobacillus rhamnosus GG (L.GG.) inkubiert wurden, war das Ziel dieser Arbeit. Die Ergebnisse zeigen deutlich eine verringerte hBD-2-Produktion der oralen Keratinozyten nach der Stimulation mit den Bakterienextrakten zu verschiedenen Konzentrationen und Zeiten. Ein günstiger Therapieansatz durch die Gabe von probiotischen Bakterienextrakten bei entzündlichen Erkrankungen der Mundschleimhaut, wäre durch eine gesteigerte hBD-2-Produktion denkbar. Dieses bekämpft nämlich pathogene Erreger und unterstützt somit die Immunabwehr. Mit den Bakterienextrakten von L.s. und L.GG. ließ sich die Produktion von hBD-2 in den oralen Keratinozyten nicht steigern. Einen anti-inflammatorischen Effekt der Extrakte auf die Zellen ist dennoch nicht auszuschließen, da die hBD-2-Konzentration auch indirekt als Indikator einer Entzündung angesehen werden kann und hier mit zunehmender Bakterienextraktkonzentration sinkt. Jedoch sind andere Ursachen für den Konzentrationsabfall ebenso denkbar.

In the gastrointestinal tract, probiotics have been shown to promote host immunity and to regulate immune signaling pathways. This study used Caco-2 cell line to examine the effects of a Lactobacillus rhamnosus isolate from “amabere amaruranu” a Kenyan traditional cultured milk, on the production inflammatory cytokines in enterocytes. Live Lactobacillus rhamnosus (MRS6AN), its cytoplasmic fraction (CF), filtered spent broth (FSB) or heat inactivated FSB (HIB) were used as treatments on differentiated Caco-2 cell monolayer in transwells. Cytokine content in the cell lysates, apical and basolateral supernatants were determined using ELISA. Caco-2 cell lysate treatments showed significantly increased anti-inflammatory TGF-β (ng/ml) levels on average about 100x more compared to the increase in pro-inflammatory IL-8 (pg/ml) levels. These levels were significantly reduced after inhibition of NF-κB. In conclusion, live Lactobacillus rhamnosus, its CF, FSB or HIB seemed to modulate the production of inflammatory cytokines in enterocytes partly via the NF-κB signaling pathway.