Ein großes Anwendungsgebiet des Flugzeuglaserscannings ist in Bereichen der Forstwirtschaft und der Forstwissenschaft zu finden. Die Daten dienen flächendeckend zur Ableitung von digitalen Gelände- und Kronenmodellen, aus denen sich die Baumhöhe ableiten lässt. Aufgrund der Aufnahmerichtung aus der Luft lassen sich spezielle bodennahe Baumparameter wie Stammdurchmesser und Kronenansatzhöhe nur durch Modelle schätzen. Der Einsatz terrestrischer Laserscanner bietet auf Grund der hochauflösenden Datenakquisition eine gute Ergänzung zu den Flugzeuglaserscannerdaten. Inventurrelevante Baumparameter wie Brusthöhendurchmesser und Baumhöhe lassen sich ableiten und eine Verdichtung von digitalen Geländemodellen durch die terrestrisch erfassten Daten vornehmen. Aufgrund der dichten, dreidimensionalen Punktwolken ist ein hoher Dokumentationswert gegeben und eine Automatisierung der Ableitung der Geometrieparameter realisierbar. Um den vorhandenen Holzvorrat zu kontrollieren und zu bewirtschaften, werden in periodischen Zeitabständen Forstinventuren auf Stichprobenbasis durchgeführt. Geometrische Baumparameter, wie Baumhöhe, Baumposition und Brusthöhendurchmesser, werden gemessen und dokumentiert. Diese herkömmliche Erfassung ist durch einen hohen Arbeits- und Zeitaufwand gekennzeichnet. Aus diesem Grund wurden im Rahmen dieser Arbeit Algorithmen entwickelt, die eine automatische Ableitung der geometrischen Baumparameter aus terrestrischen Laserscannerpunktwolken ermöglichen. Die Daten haben neben der berührungslosen und lichtunabhängigen Datenaufnahme den Vorteil einer objektiven und schnellen Parameterbestimmung. Letztendlich wurden die Algorithmen in einem Programm zusammengefasst, das neben der Baumdetektion eine Bestimmung der wichtigsten Parameter in einem Schritt realisiert. An Datensätzen von drei verschiedenen Studiengebieten werden die Algorithmen getestet und anhand manuell gewonnener Baumparameter validiert. Aufgrund der natürlich gewachsenen Vegetationsstruktur sind bei Aufnahmen von einem Standpunkt gerade im Kronenraum Abschattungen vorhanden. Durch geeignete Scankonfigurationen können diese Abschattungen minimiert, allerdings nicht vollständig umgangen werden. Zusätzlich ist der Prozess der Registrierung gerade im Wald mit einem zeitlichen Aufwand verbunden. Die größte Schwierigkeit besteht in der effizienten Verteilung der Verknüpfungspunkte bei dichter Bodenvegetation. Deshalb wird ein Ansatz vorgestellt, der eine Registrierung über die berechneten Mittelpunkte der Brusthöhendurchmesser durchführt. Diese Methode verzichtet auf künstliche Verknüpfungspunkte und setzt Mittelpunkte von identischen Stammabschnitten in beiden Datensätzen voraus. Dennoch ist die größte Unsicherheit in der Z-Komponente der Translation zu finden. Eine Methode unter Verwendung der Lage der Baumachsen sowie mit einem identischen Verknüpfungspunkt führt zu besseren Ergebnissen, da die Datensätze an dem homologen Punkt fixiert werden. Anhand eines Studiengebietes werden die Methoden mit den herkömmlichen Registrierungsverfahren über homologe Punkte verglichen und analysiert. Eine Georeferenzierung von terrestrischen Laserscannerpunktwolken von Waldbeständen ist aufgrund der Signalabschattung der Satellitenpositionierungssysteme nur bedingt und mit geringer Genauigkeit möglich. Deshalb wurde ein Ansatz entwickelt, um Flugzeuglaserscannerdaten mit terrestrischen Punktwolken allein über die Kenntnis der Baumposition und des vorliegenden digitalen Geländemodells zu verknüpfen und zusätzlich das Problem der Georeferenzierung zu lösen. Dass ein terrestrischer Laserscanner nicht nur für Forstinventuren gewinnbringend eingesetzt werden kann, wird anhand von drei verschiedenen Beispielen beleuchtet. Neben der Ableitung von statischen Verformungsstrukturen an Einzelbäumen werden beispielsweise auch die Daten zur Bestimmung von Vegetationsmodellen auf Basis von Gitterstrukturen (Voxel) zur Simulation von turbulenten Strömungen in und über Waldbeständen eingesetzt. Das aus Laserscannerdaten abgeleitete Höhenbild einer Rinde führt unter Verwendung von Bildverarbeitungsmethoden (Texturanalyse) zur Klassifizierung der Baumart. Mit dem terrestrischen Laserscanning ist ein interessantes Werkzeug für den Einsatz im Forst gegeben. Bestehende Konzepte der Forstinventur können erweiterte werden und es eröffnen sich neue Felder in forstwirtschaftlichen und forstwissenschaftlichen Anwendungen, wie beispielsweise die Nutzung eines Scanners auf einem Harvester während des Erntevorganges. Mit der stetigen Weiterentwicklung der Laserscannertechnik hinsichtlich Gewicht, Reichweite und Geschwindigkeit wird der Einsatz im Forst immer attraktiver. / An important application field of airborne laser scanning is forestry and the science of forestry. The captured data serve as an area-wide determination of digital terrain and canopy models, with a derived tree height. Due to the nadir recording direction, near-ground tree parameters, such as diameter at breast height (dbh) and crown base height, are predicted using forest models. High resolution terrestrial laser scanner data complements the airborne laser scanner data. Forest inventory parameters, such as dbh and tree height can be derived directly and digital terrain models are created. As a result of the dense three dimensional point clouds captured, a high level of detail exists, and a high degree of automation of the determination of the parameters is possible. To control and manage the existing stock of wood, forest inventories are carried out at periodic time intervals, on the base of sample plots. Geometric tree parameters, such as tree height, tree position and dbh are measured and documented. This conventional data acquisition is characterised by a large amount of work and time. Because of this, algorithms are developed to automatically determine geometric tree parameters from terrestrial laser scanner point clouds. The data acquisition enables an objective and fast determination of parameters, remotely, and independent of light conditions. Finally the majority of the algorithms are combined into a single program, allowing tree detection and the determination of relevant parameters in one step. Three different sample plots are used to test the algorithms. Manually measured tree parameters are also used to validate the algorithms. The natural vegetation structure causes occlusions inside the crown when scanning from one position. These scan shadows can be minimized, though not completely avoided, via an appropriate scan configuration. Additional the registration process in forest scenes is time-consuming. The largest problem is to find a suitable distribution of tie points when dense ground vegetation exists. Therefore an approach is introduced that allows data registration with the determined centre points of the dbh. The method removes the need for artificial tie points. However, the centre points of identical stem sections in both datasets are assumed. Nevertheless the biggest uncertainness is found in the Z co-ordinate of the translation. A method using the tree axes and one homologous tie point, which fixes the datasets, shows better results. The methods are compared and analysed with the traditional registration process with tie points, using a single study area. Georeferencing of terrestrial laser scanner data in forest stands is problematic, due to signal shadowing of global navigation satellite systems. Thus an approach was developed to register airborne and terrestrial laser scanner data, taking the tree positions and the available digital terrain model. With the help of three examples the benefits of applying laser scanning to forest applications is shown. Besides the derivation of static deformation structures of single trees, the data is used to determine vegetation models on the basis of a grid structure (voxel space) for simulation of turbulent flows in and over forest stands. In addition, the derived height image of tree bark using image processing methods (texture analysis) can be used to classify the tree species. Terrestrial laser scanning is a valuable tool for forest applications. Existing inventory concepts can be enlarged, and new fields in forestry and the science of forestry are established, e. g. the application of scanners on a harvester. Terrestrial laser scanners are becoming increasingly important for forestry applications, caused by continuous technological enhancements that reduce the weight, whilst increasing the range and the data rate.

Untersuchungen zur Kantenfestigkeit von Gläsern zeigen, dass diese in Abhängigkeit des Herstellers und der Kantenbearbeitungsart nach DIN 1249-11 stark variiert. Insbesondere der Bearbeitungsprozess des Schleifens weist eine Vielzahl von Parametern auf, welche die resultierende Oberflächenbeschaffenheit der Glaskante beeinflussen, allerdings noch unzureichend untersucht sind. Eine objektive Erfassung der Oberflächenbeschaffenheit über Kennwerte der Rauheit könnte helfen, Prozessparameter bewertbar zu machen und eine Korrelation zwischen dem Bearbeitungsprozess und der Kantenfestigkeit zu schaffen. Im Rahmen einer ersten Vorstudie wurden Rauheitskennwerte geschliffener und polierter Kantenoberflächen von drei Herstellern mittels konfokalem Laserscanning-Mikroskop ermittelt und hinsichtlich ihrer Eignung zur Bewertung der Bearbeitungsprozesse geprüft. / Roughness examination of processed glass edges under a confocal laser scanning microscope. Findings on the edge strength show that, it varies depending on the manufacturer and the type of edge finishing. In particular the grinding process has a large number of parameters that influence the surface quality of the glass edge, which have not yet been fully investigated. The determination of objective roughness parameters could help to evaluate the grinding processes and further correlate the surface quality with the edge strength. Within the scope of a preliminary study, roughness parameters were calculated for ground and polished glass edges of three manufacturers using a confocal laser scanning microscope. Finally the method was tested regarding to its suitability for a determination of characteristic roughness parameters that could be used to evaluate the grinding processes.

Suburothelial myofibroblasts (sMF) are located underneath the urothelium in close proximity to afferent nerves and show spontaneous calcium activity in vivo and in vitro. They express purinergic receptors and calcium transients can be evoked by ATP. Therefore they are supposed to be involved in afferent signaling of the bladder fullness. Myofibroblast cultures, established from cystectomies, were challenged by exogenous ATP in presence or absence of purinergic antagonist. Fura-2 calcium imaging was used to monitor ATP (10-16 to 10-4 mol/l) induced alterations of calcium activity. Purinergic receptors (P2X1, P2X2, P2X3) were analysed by confocal immunofluorescence. We found spontaneous calcium activity in 55.18% ± 1.65 (mean ± SEM) of the sMF (N=48 experiments). ATP significantly increased calcium activity even at 10-16 mol/l. The calcium transients were partially attenuated by subtype selective antagonist (TNP-ATP, 1μM; A-317491, 1μM), and were mimicked by the P2X1, P2X3 selective agonist α,β-methylene ATP. The expression of purinergic receptor subtypes in sMF was confirmed by immunofluorescence. Our experiments demonstrate for the first time that ATP can modulate spontaneous activity and induce intracellular Ca2+ response in cultured sMF at very low concentrations, most likely involving ionotropic P2X receptors. These findings support the notion that sMF are able to register bladder fullness very sensitively, which predestines them for the modulation of the afferent bladder signaling in normal and pathological conditions.

This thesis analyses ice-rich mountain permafrost with regard to its genesis, distribution, deformation and interaction with other environmental factors. The processes influencing ground ice formation in ice-rich and ice-poor mountain permafrost are highlighted. Factors influencing the presence of ice-rich permafrost are identified and their individual or combined effect on frozen ground is determined. Based on these findings, a new permafrost distribution map of Switzerland was created, which specifies permafrost temperature and ice contents and considers rock glacier creep paths. The deformation of rock glaciers is investigated with newly developed monitoring systems and concepts. This enables a better understanding of the processes leading to rock glacier acceleration at different time scales.

Suburothelial myofibroblasts (sMF) are located underneath the urothelium in close proximity to afferent nerves and show spontaneous calcium activity in vivo and in vitro. They express purinergic receptors and calcium transients can be evoked by ATP. Therefore they are supposed to be involved in afferent signaling of the bladder fullness. Myofibroblast cultures, established from cystectomies, were challenged by exogenous ATP in presence or absence of purinergic antagonist. Fura-2 calcium imaging was used to monitor ATP (10-16 to 10-4 mol/l) induced alterations of calcium activity. Purinergic receptors (P2X1, P2X2, P2X3) were analysed by confocal immunofluorescence. We found spontaneous calcium activity in 55.18% ± 1.65 (mean ± SEM) of the sMF (N=48 experiments). ATP significantly increased calcium activity even at 10-16 mol/l. The calcium transients were partially attenuated by subtype selective antagonist (TNP-ATP, 1μM; A-317491, 1μM), and were mimicked by the P2X1, P2X3 selective agonist α,β-methylene ATP. The expression of purinergic receptor subtypes in sMF was confirmed by immunofluorescence. Our experiments demonstrate for the first time that ATP can modulate spontaneous activity and induce intracellular Ca2+ response in cultured sMF at very low concentrations, most likely involving ionotropic P2X receptors. These findings support the notion that sMF are able to register bladder fullness very sensitively, which predestines them for the modulation of the afferent bladder signaling in normal and pathological conditions.:1. Introduction............................................................................ 1 1.1. Anatomy and histology of the human urinary bladder..................... 1 1.1.1. Anatomy of the human urinary bladder..................................... 1 1.1.2. Structure of the human urinary bladder wall............................... 2 1.2. Normal bladder function and bladder dysfunction.......................... 3 1.2.1 Normal bladder function......................................................... 3 1.2.2 Sensory aspect.................................................................... 4 1.2.3 Overactivity or hypersensitivity of bladder.................................. 5 1.3 The role of functional cell types and interaction in urinary bladder... 6 1.3.1 The role of urothelium.......................................................... 7 1.3.2Theroleofsuburotheliamyofibroblast...................................... 7 1.3.3Theroleofdetrusorsmoothmusclecells.................................. 9 1.3.4 Possible interactions in urinary bladder cell types........................ 10 1.4 ATP function and Purinergic signalling in bladder........................... 11 1.5 Spontaneous activity of bladder................................................... 13 2. Objective.................................................................................. 15 3. Material and methods............................................................... 16 3.1. Ethics Statement........................................................................ 16 3.2. Cell preparation.......................................................................... 16 3.3. Solutions and chemicals............................................................. 19 3.4. Intracellular calcium measurements............................................. 20 2.4.1. Preparing cells for Calcium Imaging.......................................... 20 2.4.2. Preparing workspace of calcium imaging................................... 20 2.4.3. Calcium imaging recording...................................................... 22 3.5 Data analysis with automated Fluorescence analysis..................... 22 3.6 Confocal Immunofluorescence.................................................... 25 3.7 Statistics................................................................................. 26 4. Results.................................................................................. 27 4.1 Spontaneous calcium activity of sMF........................................... 27 4.2 ATP effects on calcium response in sMF...................................... 27 4.3 Analysis of purinergic receptors involved.................................... 30 3.3.1 Agonist stimulation.............................................................. 30 3.3.2 Signal inhibition by specific antagonists................................... 31 4.4 Confocal immunofluorescence of purinergic receptors.................. 32 5. Discussion............................................................................. 34 5.1 Myofibroblast identification....................................................... 34 5.2 Spontaneous activity in the bladder............................................ 36 5.3 ATP modulated calcium activity in sMF....................................... 37 5.4 purinergic signalling in sMF........................................................ 39 6. Summary................................................................................ 42 7. References.............................................................................. 45 Declaration............................................................................. 50 Acknowledgements................................................................. 51

This thesis analyses ice-rich mountain permafrost with regard to its genesis, distribution, deformation and interaction with other environmental factors. The processes influencing ground ice formation in ice-rich and ice-poor mountain permafrost are highlighted. Factors influencing the presence of ice-rich permafrost are identified and their individual or combined effect on frozen ground is determined. Based on these findings, a new permafrost distribution map of Switzerland was created, which specifies permafrost temperature and ice contents and considers rock glacier creep paths. The deformation of rock glaciers is investigated with newly developed monitoring systems and concepts. This enables a better understanding of the processes leading to rock glacier acceleration at different time scales.

Die Interaktion von S100-Proteinen mit dem Rezeptor für advanced glycation endproducts (RAGE) wird als hoch relevant bei der Entstehung, Manifestation und Progression verschiedener entzündlicher Erkrankungen sowie bei der Tumorigenese gewertet. Das tiefergehende Verständnis der Interaktion von S100-Proteinen mit RAGE in vivo stellt eine wissenschaftliche Herausforderung dar und ist ein Ansatz für therapeutische Interventionen. Darüber hinaus stellen Untersuchungen zum Metabolismus von extrazellulär zirkulierenden S100-Proteinen in vivo einen vielversprechenden Forschungsansatz zur Analyse von S100-Protein-assoziierten Erkrankungen dar. Die einzigartigen Eigenschaften der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) als nicht-invasives bildgebendes Verfahren erlauben die Darstellung und quantitative Erfassung biochemischer Prozesse mit der Möglichkeit zelluläre und molekulare Reaktionswege aufzuzeigen sowie in vivo-Mechanismen von Krankheiten im Kontext eines physiologischen Umfeldes darzulegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Fluor-18-markierte S100-Proteine (18F-S100) herzustellen, diese biochemisch, radiochemisch und radiopharmakologisch zu charakterisieren und deren Metabolismus und Interaktion mit RAGE in vivo mittels Kleintier-PET am Tiermodell zu untersuchen. Es wurden die mit RAGE interagierenden S100-Proteine S100A1, S100A12 und S100B in biologisch funktioneller Form hergestellt. Dazu wurden die entsprechenden S100-Gene in den prokaryotischen Expressionsvektor pGEX-6P-1 kloniert. Mit diesen Konstrukten wurden E. coli-Zellen transformiert, aus denen nachfolgend die S100-Proteine isoliert und gereinigt werden konnten. Es konnte eine Reinigung unter nativen, milden Bedingungen etabliert werden, die es ermöglichte, S100A1, S100A12 und S100B in biologisch aktiver Form und in hohen Reinheitsgraden (> 95%) für die nachfolgenden Experimente bereitzustellen. Diese S100-Proteine wurden über den 18F-tragenden Aktivester N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoesäure ([18F]SFB) radioaktiv markiert und charakterisiert. Dabei konnte sichergestellt werden, dass die 18F-S100-Proteine in vitro und in vivo stabil sind. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die radioaktive Markierung keine Beeinträchtigung auf die biologische Funktionalität der S100-Proteine hat. Dies wurde anhand von sRAGE-Bindungsuntersuchungen sowie Zell-Interaktionsuntersuchungen an konfluenten Endothelzellen (HAEC) und an zu Makrophagen differenzierten THP-1-Zellen (THP-1-Makrophagen) verifiziert. Für die Untersuchung der RAGE-Bindung war die Produktion des löslichen sRAGE bzw. die Generation von flRAGE-berexprimierenden Zellen erforderlich. Beide Konstrukte wurden in geeigneten Zellsystemen exprimiert und das sRAGE-Protein wurde in biologisch aktiver Form synthetisiert und gereinigt (Reinheitsgrad > 97%). Die 18F-S100-Bindung an THP-1-Makrophagen und HAEC wurde in Gegenwart von glykierten LDL (glykLDL) sowie sRAGE signifikant inhibiert, was auf eine RAGE-Interaktion hinweist. Weiterhin konnten durch den Einsatz von Scavenger-Rezeptor-Liganden, wie z. B. Maleinanhydrid-modifiziertes BSA (malBSA) bzw. von Lektinen inhibierende Effekte erzielt werden. Dies ist ein Indiz für die 18F-S100-Interaktion mit Scavenger-Rezeptoren und Glykokonjugaten an der Zelloberfläche. Durch die Untersuchungen mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie an THP-1-Makrophagen wurde eine Zellaufnahme des Fluoreszein-markierten S100A12 festgestellt. Weiterhin konnten Kolokalisationen mit Lektinen detektiert werden. Das metabolische Schicksal extrazellulär zirkulierender 18F-S100-Proteine in vivo wurde mit Hilfe dynamischer PET-Untersuchungen bzw. anhand von Bioverteilungs-Untersuchungen in männlichen Wistar-Ratten analysiert. Die Hauptakkumulation der Radioaktivität wurde in der Leber und in den Nieren detektiert. In diesen Organen findet der Metabolismus bzw. die glomeruläre Filtration der 18F-S100-Proteine statt. In den Untersuchungen zur Genexpression mittels Echtzeit-PCR sowie im immunchemischen Proteinnachweis am Western Blot wurde eine hohe Expression und Proteinbiosynthese des RAGE in der Lunge ermittelt. Die Lunge eignet sich daher als „Referenz“-Organ für eine funktionelle in vivo-Charakterisierung von RAGE mit 18FS100-Proteinen. Bei den durchgeführten PET-Untersuchungen konnte eine temporäre 18F-S100-Interaktion mit dem Lungengewebe festgestellt werden. Die Retention des 18FS100A12 in der Lunge wurde in Gegenwart von sRAGE inhibiert. Dies ist ein Hinweis dafür, dass 18F-S100-Proteine auch in vivo an RAGE binden können. Die Radioaktivitäts-Akkumulation in den Organen Leber und Milz, die eine Vielzahl von sessilen Makrophagen aufweisen, wurde durch die Applikation von malBSA inhibiert. Dies ist ein Indiz dafür, dass 18F-S100-Proteine in vivo mit Scavenger-Rezeptoren interagieren können. Die vorliegende Arbeit liefert deutliche Hinweise darauf, dass RAGE nicht der alleinige Rezeptor für 18F-S100-Proteine ist. Der Einsatz von 18F-S100-Proteinen als experimentelles Werkzeug in dynamischen PET-Untersuchungen birgt das Potential einer Charakterisierung von S100-Protein-assoziierten, pathophysiologischen Prozessen. / Members of the S100 family of EF-hand calcium binding proteins play important regulatory roles not only within cells but also exert effects in a cytokine-like manner on definite target cells once released into extracellular space or circulating blood. Accordingly, increased levels of S100 proteins in the circulating blood have been associated with a number of disease states, e.g., diabetes, cancer, and various inflammatory disorders. As the best known target protein of extracellular S100 proteins, the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) is of significant importance. However, the role of extracellular S100 proteins during etiology, progression, and manifestation of inflammatory disorders still is poorly understood. One reason for this is the shortage of sensitive methods for direct assessment of the metabolic fate of circulating S100 proteins and, on the other hand, measurement of functional expression of extracellular targets of S100 proteins, e.g., RAGE in vivo. In this line, small animal PET provides a valuable tool for noninvasive imaging of physiological processes and interactions like plasma or vascular retention, tissue-specific receptor binding, accumulation or elimination in vivo. To address this question, human S100 proteins were cloned in the bacterial expression vector pGEX-6P-1, expressed in E. coli BL21, and purified by affinity chromatography and anion exchange chromatography. Purified S100A1, S100B and S100A12 proteins were then radiolabeled with the positron emitter fluorine-18 (18F) by N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB). Radiolabeling of S100 proteins resulted in radiochemical yields of 3-10% (corrected for decay) and effective specific radioactivities of 1 GBq/µmol, respectively. For investigations about RAGE binding soluble RAGE (sRAGE) was expressed and purified using pSecTag2B. A radioligand binding assay confirmed specific binding of 18F-S100A12, 18F-S100A1, and 18F-S100B to immobilized sRAGE, also showing an order of affinity with S100A12 > S100A1 > S100B. These results indicate that radioactive labelling of S100 proteins did not affect their overall affinity to RAGE. Cellular association studies in human THP-1 macrophages and human aortic endothelial cells (HAEC) showed specific binding of all 18F-S100 proteins to the non-internalizing RAGE as confirmed by inhibitory effects exerted either by other RAGE ligands, e.g., glycated LDL, or by soluble RAGE. Of interest, 18F-S100 proteins were also shown to interact with other putative binding sites, e.g. scavenger receptors as well as proteoglycans. In this line, uptake of 18F-S100 proteins in THP-1 and HAEC could be inhibited by various scavenger receptor ligands, in particular by maleylated BSA as well as by lectines (e.g. ConA and SBA). Confocal laser scanning microscopy analysis showed a major part of the fluoresceinated S100A12 bound to the surface of THP-1 macrophages. Beyond this, uptake of S100A12 could be determined indicating an interaction of S100A12 with both non-internalizing, e.g., RAGE, and internalizing receptors, e.g. scavenger receptors. By evaluation of the relative contribution of 18F-S100A12 association to RAGE-overexpressed CHO cells (using pIres2-AcGFP1), 18F-S100A12 showed a significantly higher association to CHO-RAGE cells compared with CHO-mock cells. Based on these findings and due to their crucial role in inflammatory disorders the metabolic fate of S100 proteins was further investigated in dynamic small animal Positron emission tomography (PET) studies as well as in biodistribution studies in Wistar rats in vivo. For interpretation of in vivo investigations in rats, expression of RAGE was analyzed by quantitative real time RT-PCR as well as western blotting in various organs. Lung tissue expressed the highest level of RAGE protein compared to the other tissues. PET studies in rats revealed a comparatively long mean residence time of circulating 18F-S100 proteins. A major contributor to this phenomenon seems to be a sustained temporary interaction with tissues overexpressing RAGE, e.g., the lung. On the other hand, renal clearance of 18F-S100 via glomerular filtration is a major elimination pathway. However, scavenger receptor-mediated pathways in the liver, the spleen and, to a minor extent, in the kidneys, also seem to contribute to the overall clearance. The presence of sRAGE revealed a decreased retention of 18F-S100A12 in the lung, indicating in vivo binding to RAGE. In vivo blocking studies using maleylated BSA demonstrated a strong inhibition of putative binding sites in rat tissues enriched in cells expressing scavenger receptors like liver and spleen. In conclusion, 18F-labeling of S100 proteins and the use of small animal PET provide a valuable tool to discriminate the kinetics and the metabolic fate of S100 proteins in vivo. Furthermore, the results strongly suggest an involvement of other putative receptors beside RAGE in distribution, tissue association and elimination of circulating proinflammatory S100 proteins. Moreover, the approach provides novel probes for imaging of functional expression of RAGE and scavenger receptors in peripheral inflammatory compartments.

Die Interaktion von S100-Proteinen mit dem Rezeptor für advanced glycation endproducts (RAGE) wird als hoch relevant bei der Entstehung, Manifestation und Progression verschiedener entzündlicher Erkrankungen sowie bei der Tumorigenese gewertet. Das tiefergehende Verständnis der Interaktion von S100-Proteinen mit RAGE in vivo stellt eine wissenschaftliche Herausforderung dar und ist ein Ansatz für therapeutische Interventionen. Darüber hinaus stellen Untersuchungen zum Metabolismus von extrazellulär zirkulierenden S100-Proteinen in vivo einen vielversprechenden Forschungsansatz zur Analyse von S100-Protein-assoziierten Erkrankungen dar. Die einzigartigen Eigenschaften der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) als nicht-invasives bildgebendes Verfahren erlauben die Darstellung und quantitative Erfassung biochemischer Prozesse mit der Möglichkeit zelluläre und molekulare Reaktionswege aufzuzeigen sowie in vivo-Mechanismen von Krankheiten im Kontext eines physiologischen Umfeldes darzulegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Fluor-18-markierte S100-Proteine (18F-S100) herzustellen, diese biochemisch, radiochemisch und radiopharmakologisch zu charakterisieren und deren Metabolismus und Interaktion mit RAGE in vivo mittels Kleintier-PET am Tiermodell zu untersuchen. Es wurden die mit RAGE interagierenden S100-Proteine S100A1, S100A12 und S100B in biologisch funktioneller Form hergestellt. Dazu wurden die entsprechenden S100-Gene in den prokaryotischen Expressionsvektor pGEX-6P-1 kloniert. Mit diesen Konstrukten wurden E. coli-Zellen transformiert, aus denen nachfolgend die S100-Proteine isoliert und gereinigt werden konnten. Es konnte eine Reinigung unter nativen, milden Bedingungen etabliert werden, die es ermöglichte, S100A1, S100A12 und S100B in biologisch aktiver Form und in hohen Reinheitsgraden (> 95%) für die nachfolgenden Experimente bereitzustellen. Diese S100-Proteine wurden über den 18F-tragenden Aktivester N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoesäure ([18F]SFB) radioaktiv markiert und charakterisiert. Dabei konnte sichergestellt werden, dass die 18F-S100-Proteine in vitro und in vivo stabil sind. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die radioaktive Markierung keine Beeinträchtigung auf die biologische Funktionalität der S100-Proteine hat. Dies wurde anhand von sRAGE-Bindungsuntersuchungen sowie Zell-Interaktionsuntersuchungen an konfluenten Endothelzellen (HAEC) und an zu Makrophagen differenzierten THP-1-Zellen (THP-1-Makrophagen) verifiziert. Für die Untersuchung der RAGE-Bindung war die Produktion des löslichen sRAGE bzw. die Generation von flRAGE-berexprimierenden Zellen erforderlich. Beide Konstrukte wurden in geeigneten Zellsystemen exprimiert und das sRAGE-Protein wurde in biologisch aktiver Form synthetisiert und gereinigt (Reinheitsgrad > 97%). Die 18F-S100-Bindung an THP-1-Makrophagen und HAEC wurde in Gegenwart von glykierten LDL (glykLDL) sowie sRAGE signifikant inhibiert, was auf eine RAGE-Interaktion hinweist. Weiterhin konnten durch den Einsatz von Scavenger-Rezeptor-Liganden, wie z. B. Maleinanhydrid-modifiziertes BSA (malBSA) bzw. von Lektinen inhibierende Effekte erzielt werden. Dies ist ein Indiz für die 18F-S100-Interaktion mit Scavenger-Rezeptoren und Glykokonjugaten an der Zelloberfläche. Durch die Untersuchungen mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie an THP-1-Makrophagen wurde eine Zellaufnahme des Fluoreszein-markierten S100A12 festgestellt. Weiterhin konnten Kolokalisationen mit Lektinen detektiert werden. Das metabolische Schicksal extrazellulär zirkulierender 18F-S100-Proteine in vivo wurde mit Hilfe dynamischer PET-Untersuchungen bzw. anhand von Bioverteilungs-Untersuchungen in männlichen Wistar-Ratten analysiert. Die Hauptakkumulation der Radioaktivität wurde in der Leber und in den Nieren detektiert. In diesen Organen findet der Metabolismus bzw. die glomeruläre Filtration der 18F-S100-Proteine statt. In den Untersuchungen zur Genexpression mittels Echtzeit-PCR sowie im immunchemischen Proteinnachweis am Western Blot wurde eine hohe Expression und Proteinbiosynthese des RAGE in der Lunge ermittelt. Die Lunge eignet sich daher als „Referenz“-Organ für eine funktionelle in vivo-Charakterisierung von RAGE mit 18FS100-Proteinen. Bei den durchgeführten PET-Untersuchungen konnte eine temporäre 18F-S100-Interaktion mit dem Lungengewebe festgestellt werden. Die Retention des 18FS100A12 in der Lunge wurde in Gegenwart von sRAGE inhibiert. Dies ist ein Hinweis dafür, dass 18F-S100-Proteine auch in vivo an RAGE binden können. Die Radioaktivitäts-Akkumulation in den Organen Leber und Milz, die eine Vielzahl von sessilen Makrophagen aufweisen, wurde durch die Applikation von malBSA inhibiert. Dies ist ein Indiz dafür, dass 18F-S100-Proteine in vivo mit Scavenger-Rezeptoren interagieren können. Die vorliegende Arbeit liefert deutliche Hinweise darauf, dass RAGE nicht der alleinige Rezeptor für 18F-S100-Proteine ist. Der Einsatz von 18F-S100-Proteinen als experimentelles Werkzeug in dynamischen PET-Untersuchungen birgt das Potential einer Charakterisierung von S100-Protein-assoziierten, pathophysiologischen Prozessen. / Members of the S100 family of EF-hand calcium binding proteins play important regulatory roles not only within cells but also exert effects in a cytokine-like manner on definite target cells once released into extracellular space or circulating blood. Accordingly, increased levels of S100 proteins in the circulating blood have been associated with a number of disease states, e.g., diabetes, cancer, and various inflammatory disorders. As the best known target protein of extracellular S100 proteins, the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) is of significant importance. However, the role of extracellular S100 proteins during etiology, progression, and manifestation of inflammatory disorders still is poorly understood. One reason for this is the shortage of sensitive methods for direct assessment of the metabolic fate of circulating S100 proteins and, on the other hand, measurement of functional expression of extracellular targets of S100 proteins, e.g., RAGE in vivo. In this line, small animal PET provides a valuable tool for noninvasive imaging of physiological processes and interactions like plasma or vascular retention, tissue-specific receptor binding, accumulation or elimination in vivo. To address this question, human S100 proteins were cloned in the bacterial expression vector pGEX-6P-1, expressed in E. coli BL21, and purified by affinity chromatography and anion exchange chromatography. Purified S100A1, S100B and S100A12 proteins were then radiolabeled with the positron emitter fluorine-18 (18F) by N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB). Radiolabeling of S100 proteins resulted in radiochemical yields of 3-10% (corrected for decay) and effective specific radioactivities of 1 GBq/µmol, respectively. For investigations about RAGE binding soluble RAGE (sRAGE) was expressed and purified using pSecTag2B. A radioligand binding assay confirmed specific binding of 18F-S100A12, 18F-S100A1, and 18F-S100B to immobilized sRAGE, also showing an order of affinity with S100A12 > S100A1 > S100B. These results indicate that radioactive labelling of S100 proteins did not affect their overall affinity to RAGE. Cellular association studies in human THP-1 macrophages and human aortic endothelial cells (HAEC) showed specific binding of all 18F-S100 proteins to the non-internalizing RAGE as confirmed by inhibitory effects exerted either by other RAGE ligands, e.g., glycated LDL, or by soluble RAGE. Of interest, 18F-S100 proteins were also shown to interact with other putative binding sites, e.g. scavenger receptors as well as proteoglycans. In this line, uptake of 18F-S100 proteins in THP-1 and HAEC could be inhibited by various scavenger receptor ligands, in particular by maleylated BSA as well as by lectines (e.g. ConA and SBA). Confocal laser scanning microscopy analysis showed a major part of the fluoresceinated S100A12 bound to the surface of THP-1 macrophages. Beyond this, uptake of S100A12 could be determined indicating an interaction of S100A12 with both non-internalizing, e.g., RAGE, and internalizing receptors, e.g. scavenger receptors. By evaluation of the relative contribution of 18F-S100A12 association to RAGE-overexpressed CHO cells (using pIres2-AcGFP1), 18F-S100A12 showed a significantly higher association to CHO-RAGE cells compared with CHO-mock cells. Based on these findings and due to their crucial role in inflammatory disorders the metabolic fate of S100 proteins was further investigated in dynamic small animal Positron emission tomography (PET) studies as well as in biodistribution studies in Wistar rats in vivo. For interpretation of in vivo investigations in rats, expression of RAGE was analyzed by quantitative real time RT-PCR as well as western blotting in various organs. Lung tissue expressed the highest level of RAGE protein compared to the other tissues. PET studies in rats revealed a comparatively long mean residence time of circulating 18F-S100 proteins. A major contributor to this phenomenon seems to be a sustained temporary interaction with tissues overexpressing RAGE, e.g., the lung. On the other hand, renal clearance of 18F-S100 via glomerular filtration is a major elimination pathway. However, scavenger receptor-mediated pathways in the liver, the spleen and, to a minor extent, in the kidneys, also seem to contribute to the overall clearance. The presence of sRAGE revealed a decreased retention of 18F-S100A12 in the lung, indicating in vivo binding to RAGE. In vivo blocking studies using maleylated BSA demonstrated a strong inhibition of putative binding sites in rat tissues enriched in cells expressing scavenger receptors like liver and spleen. In conclusion, 18F-labeling of S100 proteins and the use of small animal PET provide a valuable tool to discriminate the kinetics and the metabolic fate of S100 proteins in vivo. Furthermore, the results strongly suggest an involvement of other putative receptors beside RAGE in distribution, tissue association and elimination of circulating proinflammatory S100 proteins. Moreover, the approach provides novel probes for imaging of functional expression of RAGE and scavenger receptors in peripheral inflammatory compartments.