In the post smallpox era, vaccinia virus (VACV) has emerged as an important candidate vaccine vector. As yet, the binding receptors and entry mechanisms utilised by the two infectious forms, IMV and EEV, in dendritic cells (DCs) are unknown. We have investigated the interactions between VACV and C-type lectin receptors (CLRs) that are known to be utilised by many other viruses for binding and entry in DCs. Using a variety of CLR ligands and inhibitors we were unable to inhibit IMV or EEV binding to MDDCs and we conclude that they do not bind to CLRs. We have also investigated VACV entry in MDDCs and show that both IMV and EEV enter MDDCs via an endocytic pathway. Using a variety of drugs that inhibit cellular processes we found IMV and EEV entry to be actin- and calcium-dependent. EEV entry was also cholesterol- and energy-dependent, whereas IMV entry was only partially dependent on these factors. Both IMV and EEV colocalised with endolysosomal markers. This data suggests that EEV may enter DCs via caveolin-mediated endocytosis whereas IMV entry can occur via multiple complementary mechanisms, including endocytosis and fusion. Macropinocytosis may also constitute a minor route of entry for IMV as entry was partially inhibited by dimethyl amiloride and the virus colocalised with dextran. Finally we have provided a comprehensive flow cytometric analysis of Toll-like receptor (TLR) expression at the protein level in MDDCs and monocyte-derived Langerhans cells (MDLCs) as models for different myeloid DC subsets. We found TLR expression to be cell type-specific and MDDCs expressed the full repertoire of TLRs 1-9, including small amounts of TLR8 and TLR9 on the cell surface. The expression of these TLRs that recognise nucleic acids on the surface of cells may constitute an early warning system for signalling the presence of viral invaders that would normally subvert the function of DCs. We also found TLR expression in mature cells to be dependent on the nature of the maturation stimulus (lipopolysaccharide versus cytokine/prostaglandin cocktail) and VACV infection induced profound down-regulation of all TLRs. These findings will have important implications for the rational design of VACV-vectored vaccines.

Made available in DSpace on 2015-04-17T14:55:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In many parts of the world leguminous plant is one of the most widely known plants previously reported. There are many different types of plants in the family leguminous used as food, in this case, the genus Canavalia comprises a group of some 48 species. The term lectin (derived from the latin word legere, meaning, among other things, to select) represent a heterogeneous group of proteins ranging from size, structure, molecular organization and constitution of interaction points as well as performing several biological activities such as anti-inflammatory, antifungal and antibiotic. Until now, the lectins of plants are one of the most studied, although some lectins in animals are well-specified. This research aim to isolate, purify and define biological activities of a new lectin present in the seeds of the Canavalia maritime. The results indicate the presence of a new lectin with a preference to agglutinate native erythrocytes of rabbit. These lectins were both purified in column chromatography of Sephadex G-50 and chitin, molecular exclusion in HPLC system, respectively. The purity and molecular weight (approximate) of the new lectin (from 50 to 55 kDa) was detected by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The new lectin did not cause hemolysis in human erythrocytes type A, O and AB, it reflects the interaction level of the sugars. According to sugar inhibition assays, the new lectin (content 71,5μg) indicates it is specific for arabinose, fructose, maltose, saccharose and xylose. On the other hand, the new lectin did not prevent the growth of tested bacterial strains, however, it is able to promote the proliferation these microorganisms. It also presented an anti-inflammatory activity as peritonitis induced by carrageenan in mice reducing the migration of neutrophils in the peritoneum of mice and permeability of the blood vessels. It also produced antifungal activity on the growth of the fungus C. neoformans, on its growth assay, evidenced by CIM determination, in this case, the results demonstrates no growth in the presence of the new lectin. / As leguminosas estão entre as plantas mais conhecidas pelas pessoas de diversas partes do mundo. Nesta família, muitas são as plantas que usamos como alimento. O gênero Canavalia ao qual pertence o feijão da praia, dentro da família Leguminosae, é formado por um pequeno grupo de 48 espécies. O termo lectina (do latim legere , que significa escolher, selecionar), representa um grupo heterogêneo de proteínas que variam amplamente em tamanho, estrutura, organização molecular, bem como na constituição de seus sítios de interação, desempenhando atividades biológicas diversas como antiinflamatórias, antifúngicas e antibióticas. As lectinas de plantas são as mais estudadas até então, embora algumas presentes em animais e microorganismos já tenham sido bem caracterizadas. O objetivo geral deste trabalho foi isolar, purificar e determinar atividades biológicas de uma nova lectina presente em sementes da leguminosa Canavalia maritima. Os resultados indicaram a presença de uma nova lectina com preferência em aglutinar eritrócitos nativos de coelho, purificada através de cromatografias de afinidade em Sephadex G-50 e quitina, e de exclusão molecular em sistema HPLC, respectivamente. Por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS, foi constatada a pureza e o peso molecular aproximado da nova lectina de 50 a 55 kDa. A nova lectina não promoveu hemólise em eritrócitos humanos dos tipos A, O e AB, em graus variáveis, o que reflete a sua especificidade de interação com diferentes açúcares. Com uma composição de 71,5 μg de carboidratos, a nova lectina demonstrou, pelo teste de inibição por açúcares, especificidade para os açúcares arabinose, frutose, maltose, sacarose e xilose. Por outro lado, a nova lectina, não inibiu o crescimento das linhagens bacterianas testadas, entretanto, observou-se que ela é capaz de promover a proliferação destes microorganismos. Apresentou atividade antiinflamatória, no modelo de peritonite induzido por carragenina em camundongos, reduzindo a migração dos neutrófilos no peritônio de camundongos e a permeabilidade dos vasos sanguíneos. Também produziu atividade antifúngica sobre o crescimento dos fungos C. neoformans, nos ensaios de crescimento das cepas, evidenciado pela determinação da CIM, onde os resultados demonstraram que não houve crescimento na presença da nova lectina.

Approved for entry into archive by Érica Barros(ericabarros@ufc.br) on 2012-11-12T22:46:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_adbatista.pdf: 1701467 bytes, checksum: abfe96b694704dbc9dc0aed6b729f9f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-12T22:46:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_adbatista.pdf: 1701467 bytes, checksum: abfe96b694704dbc9dc0aed6b729f9f6 (MD5) / Dioclea megacarpa Rolfe is the correct synonym for D. relexa var. grandiflora. This species belongs to Fabaceae, the legume family. Previous studies, realized in our research group, showed the presence of active proteins for several phytopathogenic fungi in the seeds of this species, among of them Aspergillus niger. Thus, the present work was proposed with the objective of determining the bioactivity of protein(s) from D.megacarpa seeds against fungi, leading to its/their purification and partial characterization and further investigation of its/their action mechanism. Another approach of this work it was analyze the insecticidal potential of glucose/mannose-specific lectin, isolated from D.megacarpa seeds (Moreira et al., 1983), against the cowpea bruchid Callosobruchus maculatus. For this, seed flour was placed in contact with 0.15 M NaCl (1:5, w/w), followed by stirring for 3 h, filtration through a nylon cloth, re-extraction for 1 h, centrifugation at 11,500 x g, for 30 min, at 4 oC. The supernatant obtained, named total extract, showed antifungal activity against A. niger and presented several bioactive proteins, including lectin (129.27 UH/mgP, using trypsinized rabbit erythrocytes), trypsin inhibitor (18.91 mg de tripsina inibida/gF), urease (47.50 U/gF), toxin (LD50 119.60 mgP/Kg mice body weight ), chitinase (1.66 nKat/mgP) e β-1,3-glucanase (0.55 nKat/mgP). On the other hand, peroxidasic and proteolytic activities were not detected. For purification of antifungal principle, several chromatographies were performed on Sephadex G-50, Chitin and Resource Q, this last connected to an FPLC system. The purified antifungal protein, named Dm-PAF, with apparent molecular mass of 67-68 kDa (SDS-PAGE), did not show any haemagglutinating or chitinolytic activity and presented its NH2-terminal sequence blocked. Dm-PAF, at a very low concentration (0.015 µgP/µL), it was able to inhibit the growth of Saccharomyces cerevisiae and Candida tropicalis yeasts. The investigation of the antifungal action mechanism excluded the possibility of interaction between Dm-PAF and H+-ATPase pumps. In addition, the glucose/mannose-specific lectin, obtained from Sephadex G-50 column, exhibited a potent insecticidal activity against C. maculatus, interfering in important parameters related to life cycle of this insect. These data show to be the D. megacarpa seeds a rich source of biologically interesting proteins, possibly involved in the defense mechanism of plants / Dioclea megacarpa Rolfe é usada como sinonímia de D. relexa var. grandiflora, uma espécie pertencente à família Fabaceae (Leguminosae). Estudos prévios, realizados por nosso grupo de pesquisa, demonstraram a presença em suas sementes de proteínas ativas contra fungos fitopatogênicos, dentre esses Aspergillus niger. Assim, o presente trabalho foi proposto no intuito de avaliar a bioatividade de proteínas de sementes de D. megacarpa contra fungos, conduzindo à sua purificação e caracterização parcial, bem como à investigação de seu mecanismo de ação. Outro objetivo deste trabalho foi examinar o potencial inseticida da lectina com especificidade por glucose-manose, isolada de sementes de D. megacarpa (Moreira et al., 1983), contra o bruquídeo do feijão-caupi Callosobruchus maculatus. Para tanto, farinha de sementes foi posta em contato com NaCl 0,15 M (1:5, p/v), seguida de agitação contínua por 3 h, filtração em pano de trama fina, re-extração por 1 h e centrifugação a 11.500 x g, 30 min, 4 oC. O sobrenadante obtido, denominado de extrato total, se mostrou ativo contra A. niger e apresentou várias proteínas bioativas, compreendendo lectina (129,27 UH/mgP, com eritrócitos tripsinizados de coelho), inibidor de tripsina (18,91 mg de tripsina inibida/gF), urease (47,50 U/gF), toxina (DL50 119,60 mgP/Kg de peso corpóreo de camundongo), quitinase (1,66 nKat/mgP) e β-1,3-glucanase (0,55 nKat/mgP). Por outro lado, atividades peroxidásica e proteolítica não foram detectadas. Para purificação da proteína antifúngica, foram realizadas cromatografias em matrizes de Sephadex G-50, Quitina e Resource-Q, essa última acoplada ao sistema de FPLC. A proteína antifúngica purificada de sementes de D. megacarpa, denominada de Dm-PAF, com massa molecular aparente de 67-68 kDa (PAGE-SDS), não mostrou atividades hemaglutinante e quitinásica e apresentou sua seqüência NH2-terminal bloqueada. Dm-PAF, em concentração baixíssima (0,015 µgP/µL), se mostrou capaz de inibir o crescimento das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida tropicalis, cuja investigação do mecanismo de ação não revelou envolvimento dessa proteína com bombas de H+-ATPase. Em adição, a lectina ligante a glucose-manose, obtida na cromatografia em Sephadex G-50, mostrou potente atividade inseticida contra C. maculatus, interferindo em parâmetros importantes relacionados ao ciclo de vida do inseto. Os dados apresentados mostram as sementes de D. megacarpa como uma rica fonte de proteínas interessantes, possivelmente envolvidas no mecanismo de defesa das plantas

BEZERRA, Maria Júlia Barbosa. Resolução da estrutura tridimensional da lectina de Dioclea violacea Mart para estudo da relação estrutura-função. 2011. 71 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-29T12:46:55Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjbbezerra.pdf: 3567822 bytes, checksum: 02df5a11f781364615e5b2190b539688 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:12:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjbbezerra.pdf: 3567822 bytes, checksum: 02df5a11f781364615e5b2190b539688 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:12:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjbbezerra.pdf: 3567822 bytes, checksum: 02df5a11f781364615e5b2190b539688 (MD5) Previous issue date: 2011 / Lectins from subtribe Diocleinae belong to the family from Leguminosae and are characterized by high homology among their amino acid sequences. Despite this high structural similarity the same is not true in the biological activities from this lectin family. Studies show that the modification of a few amino acids can cause large changes in biological activities of these lectins. Thus more detailed understanding of three dimensional structures of these proteins is essential for structure/function analyses. The Dioclea violacea lectin was purified by affinity chromatography on a column of Sephadex G-50. The protein was crystallized in the presence of the ligand X-Man and the crystals were obtained by the vapor diffusion method in hanging drop by sparse matrix. Crystallization kits “Crystal Screen I and II” from Hampton Research were used to obtain protein crystals and the better condition was 33 from kit I4 M sodium formate. The crystal was diffracted to 2.61Å with space group I222 with unit cell dimensions a = 61.34; b = 66.11; c = 106.69Å and α = β = γ = 90º. It was observed the presence of a monomer in asymmetric unit containing 42.04% of solvent in the crystal. The molecular replacement was made using Dioclea rostrata structure (PDB: 2ZBJ). The final refinement obtained Rfactorof 0.23 and Rfree of 0.27 in absence of any amino acid in regions not allowable in Ramachandran plot. The structure of X-Man was co-crystallized and observed perfectly placed in the carbohydrate recognition domain. Regarding the balance of the dimmer-tetramer associations of plant lectins, the lectin from Dioclea violacea has the amino acid HIS 131 and the position of HIS 51 is similar to the same amino acid in Dioclea grandiflora lectin, characterizing these lectins as a tetramer even at low pH. It was made comparisons between the differences in biological activities of other lectins from Diocleainae and the distances of the residues from carbohydrate site. It was observed that differences in biological activities in vasorelaxant effects on vascular smooth muscle are probably related to the distances between the residues that compose the carbohydrate domain. / As lectinas da subtribo Diocleinae pertencem à família de Leguminosas e são caracterizadas pela alta homologia entre suas sequências de aminoácidos. Apesar da alta similaridade estrutural o mesmo não acontece nas atividades biológicas das lectinas dessa família. Estudos mostram que a modificação de poucos aminoácidos em suas sequências é capaz de provocar grandes alterações nas atividades biológicas dessas lectinas, dessa forma o entendimento mais detalhado das estruturas tridimensionais dessas proteínas é essencial para a análise da relação entre estrutura e função. A lectina de Dioclea violacea foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex G-50. A proteína foi cristalizada na presença do ligante X-Man e os cristais foram obtidos pelo método de difusão de vapor em matriz esparsa por gota suspensa. Foram utilizando os kit “cristal screen” I e II da Hampton Research e a condição que obteve melhor cristal foi a condição 33 do kit I composta por 4M Formato de sódio. O cristal foi difratado a 2,61Å e apresenta grupo espacial I222 com cela unitária com dimensões de a = 61,34, b = 66,11, c = 106,69Å e ângulos de α = β = γ = 90º. Foi observada a presença de um monômero na unidade assimétrica contendo 42,04% de solvente no cristal. A substituição molecular foi feita utilizando a estrutura da lectina de Dioclea rostrata (PDB: 2ZBJ). O refinamento final obteve Rfactor de 0,23 e Rfree de 0,27 com ausência aminoácidos em regiões não permitidas do gráfico de Ramachandran. O ligante X-Man foi co-cristalizado e sua estrutura foi observada perfeitamente encaixada no domínio de reconhecimento a carboidratos. Em relação ao equilíbrio dímero tetrâmero, a lectina de Dioclea violacea apresenta o aminoácido HIS 131 e a posição da HIS 51 é semelhante ao mesmo aminoácido da Dioclea grandiflora, caracterizando esta lectina como tetrâmero mesmo em pH baixo. Foram feitas comparações entre as atividades biológicas de outras lectinas do gênero Dioclea e as distâncias entre os resíduos do sítio de ligação a carboidrato. Essa analise mostrou que a variação nessas distâncias influi no efeito e eficácia da atividade vasorelaxante em aorta de ratos.

MOURA, Tales Rocha de. Determinação da estrutura tridimensional de uma lectina de sementes de Canavalia boliviana por cristalografia de raios X. 2009. 73 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-11T14:00:52Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_tsmoura.pdf: 11624774 bytes, checksum: d71d11ce7ece3611dd6f8e8a0ea9a90c (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:21:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_tsmoura.pdf: 11624774 bytes, checksum: d71d11ce7ece3611dd6f8e8a0ea9a90c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:21:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_tsmoura.pdf: 11624774 bytes, checksum: d71d11ce7ece3611dd6f8e8a0ea9a90c (MD5) Previous issue date: 2009 / Lectins are proteins of non immune origin with non-catalytic site that bind reversibly and specific carbohydrates, containing or not a catalytic-site. Plant lectins are the most studied group of carbohydrate binding proteins. Despite the high similarity between the members of the Diocleinae sub tribe (Leguminosae) group, they present different biological activities. Canavalia boliviana lectin (Cbol) was purified using a Sephadex G-50 column and crystallized in the presence of X-Man by hanging-drop vapor diffusion at 293K. After optimizations crystals suitable for diffraction were obtained under the condition 0.1 M HEPES pH 7.5 and 3.0 M sodium formate. The crystal belongs to the monoclinic space group C2, with unit-cell parameters a = 126.70 Å, b = 66.64 Å, c = 64.99 Å and the angles α = 90.0° β = 120.8° γ = 90.0°. A complete data set was collected at 1.5 Å resolution. Assuming the presence of a dimmer in the asymmetric unit, the solvent content was estimated to be about 46%. The structure was solved at 1.6 Å using molecular replacement to solve the phase problem and CGL coordinates was used as model. The refinement was satisfactory Rfactor and Rfree were respectively 17.98 and 20.71 and all amino acids residues were found in allowed regions. The primary structure showed 98% of identity to ConA and others ConA like lectins. The tridimensional structure observed showed high similarity to others already described structures, but some differences could be observed mainly on loop regions. These differences could be responsible for the distinct biological effects of these proteins / Lectinas de plantas são proteínas de origem não-imune contendo pelo menos um domínio não-catalítico, capaz de se ligar específica e reversivelmente a mono ou oligossacarídeos, podendo ou não apresentar sítios catalíticos. As lectinas de planta são o grupo mais estudado dessas proteínas. Apesar da alta similaridade dos membros da subtribo Diocleinae, apresentam diferenças na especificidade a carboidratos e atividades biológicas variadas. A lectina de sementes de Canavalia boliviana foi purificada utilizando cromatografia de afinidade em matriz de Sephadex G-50 e cristalizada por difusão de vapor a 293 K. Após otimizações bons cristais foram obtidos utilizando a condição de 0,1M de HEPES pH 7,5 com 3,0 M de formato de sódio. Os cristais apresentavam o grupo espacial monoclínico C2, com parâmetros de cela de a = 126,70 Å, b = 66,64 Å, c = 64,99 Å e ângulos de α = 90,0° β = 120,8° γ = 90,0°. Observando a presença de um dímero na unidade assimétrica foi estimada uma concentração de 46% de solvente no cristal. A estrutura foi resolvida a 1,6 Å usando substituição molecular para resolver o problema das fases e as coordenadas da CGL foram utilizadas como modelo. O refinamento foi satisfatório com Rfator e Rfree 17,89 e 20,71 respectivamente e todos os resíduos de aminoácidos se mostraram em regiões permitidas no gráfico de Ramachandran. A estrutura primaria apresentou identidade de 98% com a ConA e outras lectinas do tipo ConA. A estrutura tridimensional se mostrou semelhante com outras estruturas já descritas, mas algumas diferenças foram observadas principalmente em regiões de “loop”. Essas diferenças podem ser responsáveis pelas diferenças nas atividades biológicas dessas proteínas

BEZERRA, Leonardo Primo. Glicoproteínas séricas ligantes da lectina de dioclea altíssima no estudo de doenças prostáticas. 2014. 100 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T14:42:07Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_lpbezerra.pdf: 1859149 bytes, checksum: 2c776f3983043f6b85d171f25f35a1d3 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:29:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_lpbezerra.pdf: 1859149 bytes, checksum: 2c776f3983043f6b85d171f25f35a1d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:29:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_lpbezerra.pdf: 1859149 bytes, checksum: 2c776f3983043f6b85d171f25f35a1d3 (MD5) Previous issue date: 2014 / Nowadays there are an increase number of studies based on the change of glycoproteomics profiles in several diseases, especially in the search for serum biomarkers for cancer. The direct identification and quantification of serum glycoprotein of low abundance are difficult, because proteins very abundance in the blood can difficult the identification. Thus, fractionation tools are necessary to isolate efficiently changed protein glycoforms on the blood proteome. Given the specific and reversible interaction of lectins to glycoconjugates, the use of immobilized lectins on chromatographic matrix has been frequent in order to fractionate complex mixtures, involving glycoprotein for analysis for mass spectrometry. In this context, the goal of this work was to investigate the use of binding glucose/ mannose lectin from Dioclea altíssima seed (DaL) immobilized on Sepharose chromatography matrix 4B® (DaL-Sepharose), on the fractionation of serum glycoproteins and research of potential biomarkers for prostate cancer (PC). Glycoproteins from the retained fraction obtained by chromatography of blood serum on DaL-Sepharose matrix were identified and quantified by mass spectrometry and it was obtained the protein profile to the three groups: control, benign prostatic hyperplasia and PC. The identification of differentially expressed proteins between the groups showed 132 glycoproteins, in which 29 were only identified on the group with prostate cancer or showed one reason of ln greater than 1.2 when compared to quantification on control group. After an analysis, considering the confiability of the identification, estimated by score, and the evidences on the literature that justified a possible involvement of the protein on prostate cancer, stood out: alpha-1-acid glycoprotein, thrombospondin-5 complement C4 A, haptoglobin, pregnancy zone protein, isoform 3 of alpha 1-antitrypsin, alpha-2 glycoprotein rich in leucine and Zinc finger protein. The analysis of fractionated bood serum by DaL-Sepharose matrix with prior depletion of Human Serum Albumin and IgG allowed the identification of alpha 1-antitrypsin and the IGK protein “only” on the group with CaP and the pregnancy zone protein and protein like alfa-1 mieloma up regulated on CaP when compared to the control group. The identification of these glycoproteins generates new perspectives and suit as indicative for guiding research and validation methods development of these results for clinical uses. / Atualmente é crescente o número de estudos com base na alteração de perfis glicoproteômicos em diversas doenças, principalmente na busca de biomarcadores séricos para o câncer. A identificação e quantificação direta, de glicoproteínas sorológicas pouco abundantes, são difíceis, pois proteínas muito abundantes no sangue podem dificultar a identificação. Assim, ferramentas de fracionamento são necessárias para isolar, eficientemente, glicoformas proteicas aberrantes no proteoma sanguíneo. Tendo em vista a interação específica e reversível de lectinas com glicoconjugados, o uso de lectinas imobilizadas em matriz cromatográfica tem sido frequente, visando fracionar misturas complexas, envolvendo glicoproteínas, para posterior análise por espectrometria de massas. Mediante este contexto, o objetivo do presente trabalho foi investigar o uso da lectina glucose/ manose ligante de sementes de Dioclea altíssima (DaL) imobilizada em matriz cromatográfica Sepharose 4B® (DaL-Sepharose), no fracionamento de glicoproteínas séricas e na pesquisa de potenciais biomarcadores para o câncer de próstata (CaP). As glicoproteínas da fração retida, obtidas pela cromatografia do soro sanguíneo na matriz de DaL-Sepharose, foram identificadas e quantificadas, por espectrometria de massas, e assim, foi obtido o perfil proteico para os três grupos estudados: controle, hiperplasia prostática benigna e CaP. A identificação das proteínas diferentemente expressas entre os grupos revelou 132 glicoproteínas, destas, 29 foram unicamente identificadas no grupo com câncer de próstata ou apresentaram uma razão de ln maior que 1,2, quando comparado à quantificação no grupo controle. Após uma análise considerando a confiabilidade da identificação, estimada pelo escore, e as evidencias na literatura que justifiquem um possível envolvimento da proteína no câncer de próstata, destacaram-se: alfa-1-glicoproteína ácida, trombospondin-5, complemento C4 A, heptaglobina, pregnancy zone protein, isoforma 3 de alfa-1-antitripsina, alfa-2-glicoproteína rica em leucina e Zinc finger protein. A análise do soro sanguíneo fracionado pela matriz DaL-Sepharose, com prévia depleção de Albumina sérica humana e IgG, permitiu a identificação de alfa-1-antitripsina e a proteína IGK “únicas” no grupo com CaP e a pregnancy zone protein e a proteína like alfa 1 mieloma up reguladas no CaP quando comparadas ao grupo controle. A identificação destas glicoproteínas gera novas perspectivas e servem de indicativo para nortear a pesquisa e desenvolvimento de métodos de validação destes resultados para usos clínicos.

LEITÃO, Cíntia Camurça Fernandes. Caracterização estrutural parcial e biológica de duas lectinas do gênero Canavalia. 2015. 80 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Vitor Campos (vitband@gmail.com) on 2016-09-01T23:25:08Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_ccfleitao.pdf: 6460190 bytes, checksum: 6ff95b685ea2f9836771bc15fb9edf9f (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T21:25:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_ccfleitao.pdf: 6460190 bytes, checksum: 6ff95b685ea2f9836771bc15fb9edf9f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T21:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_ccfleitao.pdf: 6460190 bytes, checksum: 6ff95b685ea2f9836771bc15fb9edf9f (MD5) Previous issue date: 2015 / Lectins are proteins that bind carbohydrates specifically and reversibly. The legume lectins represent the best studied and established group, from the point of view of physical-chemical and biological and structural, where a well-studied group of these proteins involves lectin obtained from members of the subtribe Diocleinae. Lectins Diocleinae have a high degree of structural similarity, but the same was not true regarding biological activities. This variability, as a rule, is in the detail that can be analyzed in structures based studies. In this context, multiple cardiovascular disease and inflammatory processes, particularly chronic and recurrent nature, arouse the interest of the scientific community because they require a wider range of drugs for therapeutic alternatives. In this sense, they become important research seeking new compounds with vasorelaxant and anti-inflammatory action. The present paper describes the partial structural and biological characterization of two lectins present in Canavalia virosa and Canavalia oxyphylla seeds, belonging to the family Leguminosae, subfamily Papilionoideae, Phaseoleae tribe, subtribe Diocleinae. The lectin from Canavalia virosa seeds (ConV) was purified in a single step by affinity chromatography on mannose-Sepharose 4B column. ConV strongly agglutinated rabbit erythrocytes and was inhibited by monosaccharide (D-mannose, D-glucose and α-methyl-D-manosídeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). SDS-PAGE revealed three bands, corresponding to three chains (α, β, γ and) confirmed by ESI mass spectrometry with masses of 25.480 ± 2 Da, 12.864 ± 1 Da and 12,633 ± 1 Da, respectively. The hemagglutination activity of ConV is great in pH 7.0 to 9.0, stable at a temperature of 80° C, and is not affected by EDTA. ConV showed no toxicity against Artemia sp. and relaxed the endothelized rat aorta, with the participation of the lectin domain. In our tests, the lectin immobilized on CNBr-Sepharose was able to bind 0.8 mg of ovalbumin by chromatography, allowing the use of ConV as a tool to capture and purification of glycoproteins. Moreover, the lectin from Canavalia oxyphylla (CoxyL) was purified in a single step by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. SDS-PAGE showed that pure lectin consists of a major band of 30 kDa (α chain) and two minor components (β and γ chains) of 16 and 13 kDa, respectively. These data were further confirmed by mass spectrometry via electrospray ionization. Compared to the average molecular weight of the α chains, the partial amino acid sequence obtained corresponds to about 45% of the total sequence CoxyL. CoxyL showed hemagglutinating activity was specifically inhibited by monosaccharide (D-glucose, D-mannose and methyl-α-D-manosídeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). Furthermore, CoxyL proved to be heat stable at 60° C, and its activity is optimal at pH 7.0. CoxyL caused toxicity in Artemia sp. and induced paw edema in rats. / Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos de forma específica e reversível. As lectinas de leguminosas representam o grupo mais bem estudado e estabelecido, tanto do ponto de vista de caracterização físico-química e biológica como estrutural, onde um grupo bem estudado destas proteínas envolve lectinas obtidas de membros da subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porém o mesmo não se observa quanto às atividades biológicas. Esta variabilidade, via de regra, está em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. Neste contexto, múltiplos processos patológicos cardiovasculares e inflamatórios, principalmente de natureza crônica e recorrente, despertam o interesse da comunidade científica por requererem uma maior variedade de fármacos para alternativas terapêuticas. Neste sentido, tornam-se importantes pesquisas que busquem novos compostos, com ação vasorrelaxante e anti-inflamatória. Assim, o presente trabalho descreve a caracterização estrutural parcial e biológica de duas lectinas presentes em sementes de Canavalia virosa e Canavalia oxyphylla, pertencentes à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae. A lectina de sementes de Canavalia virosa (ConV) foi purificada em uma única etapa através de cromatografia de afinidade em coluna Sepharose-mannose 4B. ConV aglutinou fortemente eritrócitos de coelho e foi inibida por monossacarídeos (D-manose, D-glicose e α-metil-D-manosídeo) e glicoproteínas (ovalbumina e fetuína). SDS-PAGE revelou três bandas, correspondentes a três cadeias (α, β, e γ) confirmadas por espectrometria de massas ESI com massas de 25,480±2 Da, 12,864±1 Da e 12,633±1 Da, respectivamente. A atividade hemaglutinante da ConV é ótima nos pH 7.0 a 9.0, estável a uma temperatura de 80 ºC, e não é afetada pelo EDTA. ConV não demonstrou toxicidade contra náuplios de Artemia sp. e relaxou a aorta endotelizada de ratos, com a participação do domínio da lectina. Em nossos testes, a lectina imobilizada em CNBr-Sepharose foi capaz de se ligar a 0,8 mg de ovalbumina por cromatografia, permitindo o uso de ConV como uma ferramenta para a captura e purificação de glicoproteínas. Por outro lado, a lectina de Canavalia oxyphylla (CoxyL) foi purificada em um único passo através de cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50.SDS-PAGE mostrou que a lectina pura consiste de uma principal banda de 30 kDa (cadeia α) e dois componentes menores (cadeias β e γ) de 16 e 13 kDa, respectivamente. Estes dados foram adicionalmente confirmados por espectrometria de massas por ionização por eletropulverização. Em comparação com a massa molecular média das cadeias α, a sequência parcial de aminoácidos obtida corresponde a aproximadamente 45% da sequência total de CoxyL. CoxyL apresentou atividade hemaglutinante que foi especificamente inibida por monossacarídeos (D-glicose, D-manose, e α-metil-D-manosídeo) e glicoproteínas (ovalbumina e fetuína). Além disso, CoxyL mostrou ser termoestável a 60° C, e sua atividade é ótima no pH 7,0. CoxyL causou toxicidade em náuplios de Artemia sp. e induziu edema de pata em ratos.

SILVA, Luana Maria Castelo Melo. Atividades antinociceptiva e antiinflamatória da lectina da alga marinha vermelha Pterocladiella capilacea (S.G. Gmelin) Santelices & Hommersand. 2008. 102 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2008. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-01T13:02:01Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_lmcmsilva.pdf: 2224713 bytes, checksum: 67e77fcc04fc1e415446bc0b1a28cdb9 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-12T23:40:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_lmcmsilva.pdf: 2224713 bytes, checksum: 67e77fcc04fc1e415446bc0b1a28cdb9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-12T23:40:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_lmcmsilva.pdf: 2224713 bytes, checksum: 67e77fcc04fc1e415446bc0b1a28cdb9 (MD5) Previous issue date: 2008 / Marine algae lectins had been showing important biotechnical tools. Our objectives were to study the antinociceptive and anti-inflammatory activities of the lectin from the marine red alga Pterocladiella capillacea (Pc). The Pc, presenting haemagglutinating activity against trypsin-treated erytrocytes from rabbit, was purified by application of crude extract (0.025 M Tris-HCl buffer, pH 7.5) on ion exchange chromatography on DEAE-cellulose followed by affinity chromatography on guar-gum column. To proceed, it was used in the nocicepção and inflammation assays, using male Swiss mice and male Wistar rats, respectively. Pc (0.9; 8.1 or 72.9 mg/kg; i.v) it was administered 30 min before each challenge, that is, before the injection i.p of acetic acid 0.8% (10 μl/mL), of the intraplantar injection of 1% formalin (20 μL/paw) or of the Hot Plate test (52±1 ºC), and compared to non treated animals or to pre-treated by Indomethacin or Morphine, both at 5 mg/kg; s.c. It was observed that the Pc (0.9; 8.1 or 72.9 mg/kg) reduced significantly the number of writhes induced by acetic acid (29.2%; 39.3%, and 51.9%, respectively). Pc (72.9 mg/kg) also reduced (p<0.05) the 1st phase (neurogenic) and the 2nd phase (inflammatory) observed after administration of the formalin (58% and 87%, respectively). However, the Pc (72.9 mg/kg) was not capable to reduce the nociception evaluated by Hot Plate test, compared to morphine. These antinociceptive effects were abolished when the Pc was pre-incubated with mucin (1.25 mg/mL), inhibitory glycoprotein of its haemagglutinating activity. Therefore, it is suggested that the antinociceptive activity of the Pc can be predominant by inhibition of peripheric mechanisms. After this, was realized the assays of neutrophil migration for peritoneal cavity or of the paw edema of mice by Carragenan (Cg-type l; 500 g/cavity or paw), where was observed that the administration of the Pc (8,1 mg/kg) 30 min before Cg reduced the neutrophil counts significantly by 84%. However, Pc was not capable to prevent the paw edema induced by Cg. This way, it is suggested that this protein was capable to reduce neutrophil migration by previous mechanism to migration, possibly linking to cellular specific molecules as, for example, selectins. Then, to confirm its safety, the Pc (8.1 mg/kg) was administered daily in mice and observed their behaviors, and at the 7th day, sanguine samples were collected for urea and transaminases (TGO and TGP) dosages, and heavy kidneys and liver. It was observed that Pc did not cause significant alterations, suggesting be safety for the administration period. Considering the data together, it is ended that the Pc possesses antinociceptive and anti-inflammatory properties with peripheral action. / Lectinas de algas marinhas têm-se mostrado importantes ferramentas biotecnológicas. Objetivou-se estudar as atividades antinociceptivas e antiinflamatórias da lectina da alga marinha vermelha Pterocladiella capillacea (Pc). A Pc, apresentando atividade hemaglutinante contra eritrócitos tripsinizados de coelho, foi obtida a partir da aplicação do extrato protéico total em cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-celulose seguida da cromatografia de afinidade em coluna de goma de guar. A seguir, foi utilizada nos ensaios de nocicepção e inflamação, utilizando camundongos machos Swiss e ratos machos Wistar, respectivamente. Pc (0,9; 8,1 ou 72,9 mg/kg; i.v) foi administrada 30 min antes de cada estímulo nocigênico, ou seja, antes da injeção i.p de ácido acético a 0,8% (10 μL/mL), da injeção intraplantar de formalina a 1% (20 μL/pata) ou do teste da Placa quente (51±1 ºC), e comparada a animais não tratados ou pré-tratados com Indometacina ou Morfina, ambas a 5 mg/kg; s.c. Observou-se que a Pc (0,9; 8,1 ou 72,9 mg/kg) reduziu significantemente o número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em 29,2%; 39,3%, e 51,9%, respectivamente. Pc (72,9 mg/kg) também reduziu (p<0,05) a fase 1 (neurogênica) e a fase 2 (inflamatória) observadas após administração da formalina, em 58% e 87%, respectivamente. Entretanto, a Pc (72,9 mg/kg) não foi capaz de reduzir a nocicepção observada no teste da Placa Quente, quando comparada à morfina. Os efeitos antinociceptivos da Pc foram abolidos quando a Pc foi pré-incubada com a glicoproteína mucina (1,25 mg/mL), inibidora de sua atividade hemaglutinante. Sugere-se, portanto, que a atividade antinociceptiva da Pc possa ser predominante via inibição de mecanismos periféricos. Assim, seguiram-se os ensaios de indução da migração neutrofílica para cavidade peritoneal ou do edema de pata de ratos por Carragenana (Cg-tipo l; 500 g/cavidade ou pata), onde observou-se que a administração da Pc (8,1 mg/kg; i.v) 30 min antes da Cg reduziu significativamente a contagem do número de neutrófilos em 84%. No entanto, a Pc não foi capaz de prevenir o edema de pata induzido pela Cg. Desta forma, sugere-se que esta proteína foi capaz de reduzir o mecanismo de migração de neutrófilos, possivelmente ligando-se à moléculas específicas celulares, como por exemplo, selectinas. Para confirmar sua segurança, a PC (8,1 mg/kg) foi administrada em camundongos diariamente e no 7º dia foram coletadas amostras sanguíneas para dosagens de uréia e transaminases (TGO e TGP), e pesados rins e fígado. Observou-se que a Pc não causou alterações significativas, sugerindo portanto, ser segura no período de administração avaliado. Dessa forma, considerando os dados em conjunto, conclui-se que a Pc possui propriedades antinociceptiva e antiinflamatória com ação periférica.

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Zatkovskis Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2015. / A jacalina é uma lectina extraída da semente da jaca (Artocarpus heterophyllus), capaz de reconhecer resíduos de galactose, aglutinando de forma específica alguns tipos celulares, tendo sua aplicação bem estabelecida no isolamento da imunoglobulina A (IgA). Nosso grupo de pesquisa tem interesse no desenvolvimento de métodos e dispositivos econômicos e de fácil uso para separação e purificação de proteínas. Nesse sentido, o presente estudo teve como objetivo avaliar e otimizar a purificação da jacalina através de cromatografia de afinidade, empregando duas fases estacionárias diferentes. A montagem de colunas cromatográficas utilizando esferas baseadas na formação de hidrogéis de alginato de cálcio com goma guar mostrou-se inviável devido à perda da reticulação sofrida pelas esferas durante a etapa de lavagem da coluna. No entanto, a utilização de fibras de nylon grafitadas com goma guar a 0,5% como fase estacionária mostrou ser eficiente na purificação da jacalina. De acordo com a literatura, a quantidade de jacalina no extrato proteico bruto da semente de jaca é de aproximadamente 56%. Considerando esses valores, a técnica cromatográfica utilizando o nylon foi capaz de reter cerca de 75% do total de jacalina presente no extrato bruto. Também foram otimizadas as condições para análise da jacalina através de eletroforese capilar. A técnica se mostrou mais rápida e eficiente no intuito de caracterizar a jacalina quando comparada a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Portanto, a cromatografia de afinidade utilizando fibras de nylon grafitadas com goma guar como suporte mostrou ser uma técnica simples, rápida e eficiente na purificação da lectina jacalina. / Jacalin is a lectin, extracted from jackfruit seeds (Artocarpus heterophyllus), which is able to recognize galactose residues, specifically agglutinating some cell types, and useful for isolation of immunoglobulin A (IgA). Our research group is interested in developing inexpensive and uncomplicated methods and devices for separation and purification of proteins. In this sense, the present study aimed to evaluate and optimize the purification of jacalin by affinity chromatography, employing two different stationary phases. Stationary phase based on calcium alginate hydrogels with guar gum showed impracticable columns due to reticulation losses. On the other hand, the use of nylon fibers graphited with guar gum 0.5% as stationary phase proved to be efficient to purify jacalin. As described in the literature, the amount of jacalin in the crude extract of jackfruit seeds is approximately 56%. Considering these values, the chromatographic technique using nylon was able to retain approximately 75% of jacalina from crude extract. Finally, experimental conditions were optimized for analysis of jacalin by means of capillary electrophoresis. This technique proved to be faster and more efficiently in order to characterize the jacalin if compared to electrophoresis on polyacrylamide gel system (SDS-PAGE). Therefore, affinity chromatography using nylon fibers graphited with guar gum as support proved to be a simple, fast and efficient technique for the purification of jacalin lectin.

Les gènes synthétiques des lectines des algues marines rouges Hypnea musciformis (HML) et Bryothamnion triquetrum (BTL) ont été clonés dans différents vecteurs et transformés dans plusieurs souches bactériennes d’expression. Les lectines recombinantes ont été obtenues dans la fraction soluble de cultures bactérienne dans les souches d’Escherichia coli Rosettagami 2 (DE3) pour rHML et BL21 (DE3) pour rBTL. Les tests d'hémagglutination ont montré que rHML et rBTL sont capables d’agglutiner les érythrocytes de lapin avec un bon pouvoir hémagglutinant mais seulement après traitement à la trysine et la papaine indiquant que leur ligands ne sont pas directement accessibles à la surface des hématies. Les propriétés hémagglutinantes de rHML et de rBTL confirment le repliement correct et l'état fonctionnel des protéines. La caractérisation de leur spécificité sur puces à sucres a montré une spécificité stricte de HML, BTL et rBTL pour les oligosaccharides complexes comportant la fucosylation (α1-6) du noyau, avec une préférence particulière pour les N-glycanes non bissectés, bi- et tri-antennés de chaîne courte. La présence d’acide sialique à l'extrémité non réductrice du glycane favorise la reconnaissance de ces glycanes. C'est la première caractérisation des lectines d’algues rouges par puce à sucres. Des expériences de STD-RMN menées sur BTL, ont montré son interaction avec un octasaccharide au niveau de noyau fucosylé (α1-6). L'activité toxique des lectines sauvages et recombinantes a été évaluée contre Artemia sp. et contre des cellules d'adénocarcinome du poumon (A549). Dans les essais de cytoxicité, HML, rHML, BTL et rBTL n’ont montré aucune toxicité contre Artemia sp. et seulement HML et rHML ont montré une cytotoxicité faibles contre les cellules d’adénocarcinome du poumon (A549). Le premier cristal de rBTL a été obtenu à l'aide d'un robot de cristallisation et diffractait à 15 Å. / Synthetic genes from the red marine algae Hypnea musciformis (HML) and Bryothamnion triquetrum (rBTL) were cloned into different vectors and transformed into several bacterial expression strains. The recombinant lectins were obtained from the soluble fraction of bacterial cultures using Escherichia coli Rosettagami 2 (DE3) strain for rHML and E. coli BL21 (DE3) strain for rBTL. Haemagglutination tests showed that rHML and rBTL are able to agglutinate rabbit erythrocytes with strong haemagglutination activity only after treatment with papain and trysine indicating that their ligands are not directly accessible at the cell surface. The haemagglutinating properties of rHML and rBTL confirm the correct folding and functional state of the proteins. A study of the specificity of these lectins by glycan array was conducted. HML, BTL and rBTL showed a restricted specificity for complex N-glycans with core (α1-6) fucose. A more detailed analysis of the specificity of these lectins showed a preference for non bisecting N-glycans, bi- and tri-antennary branching sugars with short chains. Addition of Sialic acid at the non-reducing end of N-glycans favors their recognition by the lectins. This is the first characterization of lectins from red algae by glycan array. An interaction between BTL and a core (α1-6) fucosylated octasaccharides was also observed by STD-NMR. The toxic activity of wild and recombinant lectins were evaluated against Artemia sp. and the human lung adenocarcinoma cell line (A549). In cytotoxicity assays, HML, rHML, BTL and rBTL showed no toxicity against Artemia sp. Only HML and rHML showed a low cytotoxic activity against cell line (A549). The first crystal of rBTL was obtained in micro-scale level using a robot and diffracted at 15 Å.