Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T00:30:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Mestrado BP - Camila Mesquita Rodrigues.pdf: 2143075 bytes, checksum: ece36df5bf0e778217222b79d03c4bd8 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T00:30:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Mestrado BP - Camila Mesquita Rodrigues.pdf: 2143075 bytes, checksum: ece36df5bf0e778217222b79d03c4bd8 (MD5) Previous issue date: 2011-12-08 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O ferro é um elemento essencial para a sobrevivência dos microorganismos in vitro e in vivo, atuando como cofator de diversas enzimas e desempenhando um papel crítico durante a interação parasito-hospedeiro. Somente os parasitos mais virulentos são dotados de mecanismos eficazes para adquirir ferro do hospedeiro sadio, conseguindo invadir, colonizar, se multiplicar e estabelecer a infecção. L. (V.) braziliensis é um parasito distribuído por todo o continente americano sendo considerado o principal agente etiológico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). No presente estudo, o efeito do ferro sobre a proliferação, a ultraestrutura e a expressão protéica de L. (V.) braziliensis é analisado pelo uso do quelante 2,2-dipyridyl. A curva de crescimento de L. (V.) braziliensis foi afetada tanto pela concentração do quelante quanto pelo tempo de cultivo em meio depletado de ferro. Nos ensaios de citotoxicidade, a relação entre a intensidade da fluorescência e a concentração do quelante de ferro também foi dose dependente. As concentrações de 100, 140 e 180 µM de 2,2-dipyridyl afetaram significativamente a fluorescência emitida por ambos os isolados após 24 e 48 horas de incubação. Os valores da IC50 foram calculados após 24 e 48 horas e o isolado IOC-L 2483, relacionado à forma disseminada da LTA, foi escolhido para a realização de todos os ensaios subseqüentes. A análise ultraestrutural das formas promastigotas tratadas com 100 µM de 2,2-dipyridyl revelou grande dano a mitocôndria que sofreu perda da matriz e da crista e passou a apresentar estruturas membranares concêntricas em seu interior. A depleção de ferro também induziu a ruptura do complexo de Golgi e a intensa vacuolização citoplasmática. A análise de parasitos incubados com TMRE e PI por citometria de fluxo demonstrou que a depleção de ferro acarreta na dissipação do potencial de membrana mitocondrial embora não esteja associada permeabilização da membrana celular. A incubação dos parasitos com TUNEL demonstrou que a privação de ferro não acarreta em fragmentação do DNA nuclear. A análise dos extratos totais das formas promastigotas por eletroforese bidimensional e espectrometria de massas revelou que as proteínas que tiveram sua expressão aumentada ou diminuída após tratamento com o quelante estão relacionadas à manutenção da homeostase do ferro, ao metabolismo dos ácidos nucléicos e à indução de modificações pós traducionais. Nossos resultados demonstram que a depleção de ferro afeta a proliferação, a ultraestrutura e a expressão protéica de L. (V.) braziliensis, induzindo à disfunção mitocondrial e levando a morte do parasito. / Iron is an essential element for in vitro and in vivo survival of microorganisms, acting as a cofactor of several enzymes and playing a critical role in host-parasite relationship. Only the more virulent strains, endowed with effective mechanisms to acquire iron from healthy hosts can invade, colonize, multiply and establish infection. Leishmania (Viannia) braziliensis is a parasite widespread in the new world and considered to be the major etiological agent of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL). In the present study, the effect of iron on growth, ultrastructure and protein expression of L. (V.) braziliensis is analyzed by use of the chelator 2,2-dipyridyl. Growth curve of L. (V.) braziliensis was affected by both concentration of iron chelator and time of culture in depleted medium. In citotoxicity assays, the ratio between fluorescence intensity and concentration of iron chelator was also dose dependent. Concentrations of 100, 140 and 180 µM of 2,2-dipyridyl significantly affected the fluorescence emitted by both isolates after 24 and 48 hours of incubation. The IC50 values were calculated after 24 and 48 hours and IOC-L 2483, related to the disseminated clinical manifestation of the LTA, was chosen to perform all the subsequent assays. Ultrastructural analysis of treated promastigotes revealed a remarkable mitochondrial swelling with loss of cristae and matrix and presence of concentric membranar structures inside the organelle. Iron depletion also induced Golgi disruption and intense cytoplasmic vacuolization. Fluorescence- activated cell sorting analysis of tetramethylrhodamine stained parasites showed that 100 µM of 2,2-dipyridyl collapsed the mitochondrial membrane potential. Incubation of parasites with propidium iodide demonstrated that disruption of mitochondrial membrane potential was not associated with plasma membrane permeabilization. TUNEL labelling for DNA fragments was negative. Two dimensional electrophoresis and mass spectrometry analysis of whole extracts from promastigotes showed that proteins involved in homeostasis of iron, metabolism of nucleic acids and coordination of post-translational modifications suffered up- or down- regulation after treatment with the iron chelator. Our results show that iron depletion affects growth, ultrastructure and protein expression of L. (V.) braziliensis leading to mitochondrial dysfunction and cell death.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6315_1.pdf: 1356784 bytes, checksum: ed82e0e5c10b92208b91c8e8a95cb0f7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / A investigação da possibilidade de diagnóstico para a Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), a partir de sangue venoso e através da Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction = PCR), foi realizada em duas amostras de populações de área endêmica do Estado de Pernambuco, Brasil. Foi coletado um total de 119 amostras de sangue venoso, sendo 63 do município do Cabo de Santo Agostinho e 56 do município de Triunfo. Inicialmente, realizaram-se alguns experimentos para padronização da técnica de PCR, e os primers escolhidos amplificaram o fragmento de 750 pares de bases pertencente ao minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA) da Leishmania Viannia braziliensis, espécie identificada com esta patologia em Pernambuco. Os resultados revelaram 48,7% de indivíduos positivos para a PCR, dos quais 31% tinham sido tratados e considerados clinicamente curados por apresentarem a lesão cicatrizada. Esses achados demonstram que: a) o sangue venoso pode ser utilizado como ferramenta para diagnóstico; b) a ausência de lesão nem sempre corresponde a uma PCR negativa; c) a existência de DNA circulante de parasita em indivíduos tratados, chama atenção para a possível presença do mesmo e conseqüente risco de recidiva; d) o tratamento preconizado não parece ser capaz de eliminar completamente os parasitas

Leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e se apresentam sob forma tegumentar ou visceral. No Brasil, a leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada, na sua maioria, por Leishmania (Viannia) braziliensis e conhecem-se principalmente as formas cutânea (LC), mucosa (LM) e disseminada (LD) da doença. Na LTA as formas clínicas tem sido atribuídas a diferenças na resposta imune do hospedeiro, mas recentemente vinculam-se também à variabilidade intraespecífica da L. (V.) braziliensis. Neste estudo avaliamos se haveria variabilidade biológica nos isolados de L. (V.) braziliensis, provenientes de pacientes com LC, LM e LD, principalmente em resposta a fator de crescimento insulina-símile-I (IGF-I). Os fatores de crescimento do hospedeiro tem sido alvo de estudos no desenvolvimento das leishmanioses, sendo IGF-I um deles. Havíamos demonstrado em estudos anteriores, utilizando Leishmania (Leishmania) amazonensis, que IGF-I induz proliferação, aumentando a atividade da arginase, com geração de poliaminas e diminuindo a síntese de óxido nítrico. No presente estudo analisamos o efeito de IGF-I em L.(V.) braziliensis, espécie prevalente no Brasil. Avaliamos inicialmente as características dos diferentes isolados enquanto promastigota e no prosseguimento enquanto amastigota em células de linhagem monocítica humana THP-1, com e sem estímulo de IGF-I. Nossos dados sugerem que há diferenças na atividade da arginase basal entre os isolados de L. (V.) braziliensis, sendo maior naqueles provenientes de pacientes com LM. IGF-I aumentou a atividade da arginase nos isolados de LC e LD, mas não de LM. Nos isolados em forma amastigota nas células de linhagem monocítica humana THP-1, o efeito de IGF-I foi de aumento do parasitismo nos isolados de LC e LM e de diminuição com os de LD. Nos isolados de LD a atividade da arginase basal foi menor que nos de LC. Por outro lado, a produção de óxido nítrico tendeu a ser maior em isolados de LD quando sob estímulo de IGF-I. Os dados sugerem que diferenças nas características biológicas dos parasitos podem contribuir na apresentação clínica dos casos da LTA. / Leishmaniasis are diseases caused by protozoa of the genus Leishmania that may manifest as cutaneous or visceral disease. In Brazil, American tegumentary leishmaniasis (ATL) is caused mostly by Leishmania (Viannia) braziliensis and cutaneous (CL), mucosal (ML) and disseminated (DL) forms of the disease are known.The diversity of clinical manifestations has been attributed to differences in the host immune response, but recently it has also been related to intraspecific variability of L. (V.) braziliensis. In the present study we evaluated whether there were biological variability in different isolates of L. (V.) braziliensis from patients with CL, ML, and DL, mainly in response to insulin-like growth factor-I (IGF-I). Growth factors of the host have been investigated in the development of leishmaniasis including IGF-I. In previous studies using Leishmania (Leishmania) amazonensis IGF-I was shown to induce proliferation, to increase the activity of arginase, generating polyamines and to decrease the synthesis of nitric oxide. In this study we analyzed the effect of IGF-I in L. (V.) braziliensis, a species prevalent in Brazil. Initially we evaluated the characteristics of individual isolates as promastigote and further as amastigote within human macrophage cell line THP-1 with and without IGF-I stimulation. Our data suggest that there are differences in the basal arginase activity amongst isolates of L. (V.) braziliensis, being higher in those from patients with ML. IGF-I increased the activity of arginase in the isolates of CL and DL, but not of ML. In isolates in the form of amastigotes within THP-1 cells, IGF-I induced the increase of parasitism of isolates from CL and ML, and decrease of those from DL. In isolates of DL the basal arginase activity was lower than in those of CL. Moreover, the production of nitric oxide tended to be higher with isolates of DL upon IGF-I stimulation. The data suggest that differences in the biological characteristics of parasites may contribute to the diversity of clinical presentation of ATL.

No ciclo natural de transmissão da leishmaniose, as fêmeas infectadas de flebotomíneos regurgitam promastigotas na pele de hospedeiro junto com a saliva. Tem sido descrito que componentes da saliva do vetor possuem propriedades imunomodulatórias que facilitam o estabelecimento da infecção no hospedeiro, contudo a maior parte dos estudos emprega lisado de glândula salivar (LGS) de vetores colonizados em laboratório. Dessa forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a especificidade do LSG dos flebotomíneos Lutzomyia flaviscutellata e Lutzomyia (Psychodopygus) complexus capturados no campo na infectividade de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis. Camundongos BALB/c foram inoculados no coxim plantar traseiro com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis na ausência ou presença do LGS de L. flaviscutelata, e L. (P.) complexus. A evolução da infecção foi acompanhada semanalmente e biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para análise histopatológica e determinação de carga parasitária na 4ª e 8ª semana pós-infecção (PI); e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram também cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-10, IL- 12 e IL-4) no sobrenadante. A infecção por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis não se mostrou exacerbada nos grupos co-inoculados com o LGS de ambas as espécies em relação ao grupo controle, inoculado somente com o parasito. O tamanho de lesão e carga parasitária do grupo controle foi maior ou igual aos grupos com saliva. Na infecção por L. (L.) amazonensis houve diminuição dos linfócitos CD4+ e aumento na população de linfócitos CD8+ enquanto na infecção por L. (V.) braziliensis houve manutenção da população de linfócitos CD4+ e aumento de linfócitos CD8+ em todos os grupos quando comparados ao grupo saudável. A produção de IL-10 e IL-12, não diferiram entre os grupos, assim como a produção de IL-4 no grupo infectado por L. (V.) braziliensis. No entanto, nos grupos infectados apenas com L. (L.) amazonensis e com saliva de L. flaviscutellata, foi observada uma maior produção de IL-4 em relação ao grupo saudável. De forma geral, os resultados mostraram que a saliva de L. flaviscutellata e de Lutzomyia (P.) complexus, no seu binômio natural vetor/parasito ou não, não favoreceram o estabelecimento da infecção causada por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis em camundongos BALB/c. / During the natural transmission of leishmaniasis, the infected female phlebotomine regurgitates promastigotes into the host\'s skin together with the saliva. It has been reported that components of vector saliva contain immunomodulatory properties that facilitate the establishment of infection in the host, however the most studies employed salivary gland lysate (SGL) of laboratory colonized vectors. Thus, the main objective of this study was to evaluate the specificity of SGL of the phlebotomines Lutzomyia flaviscutellata and Lutzomyia (Psychodopygus) complexus caught in the field in the infectivity of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis. BALB/c mice were inoculated in the hind footpad with promastigotes of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in the absence or presence of L. flaviscutelata, and L. (P.) complexus SGL. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and biopsies from the site of infection were collected for histopathological analysis and determination of parasite load in the 4th and 8th week post infection (PI), and the draining lymph node to characterize subsets of T cells by flow cytometry. The draining lymph nodes cells were also cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-10, IL-12 and IL-4) in the supernatant. L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis infection was not exacerbated in the groups co-inoculated with the SGL of both species in the control group, only inoculated with the parasite. The lesion size and parasite burden of the control group was higher or equal to the groups with saliva. In L. (L.) amazonensis infection there was a decrease of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells while in L. (V.) braziliensis infection there was a maintenance of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells in all groups compared with the health group. The production of IL-10 and IL-12, did not differ between groups, as well as the production of IL-4 in the group infected by L. (V.) braziliensis. However, in the groups infected only with L. (L.) amazonensis in the presence of L. flaviscutellata saliva, it was observed a higher production of IL-4 in relation with the health group. As a whole, the results show that the saliva of L. flaviscutellata and L. (P.) complexus, in the natural vector/parasite binomium or not, did not favor the establishment of the infection caused by L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in BALB/c mice

No ciclo natural de transmissão da leishmaniose, as fêmeas infectadas de flebotomíneos regurgitam promastigotas na pele de hospedeiro junto com a saliva. Tem sido descrito que componentes da saliva do vetor possuem propriedades imunomodulatórias que facilitam o estabelecimento da infecção no hospedeiro, contudo a maior parte dos estudos emprega lisado de glândula salivar (LGS) de vetores colonizados em laboratório. Dessa forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a especificidade do LSG dos flebotomíneos Lutzomyia flaviscutellata e Lutzomyia (Psychodopygus) complexus capturados no campo na infectividade de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis. Camundongos BALB/c foram inoculados no coxim plantar traseiro com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis na ausência ou presença do LGS de L. flaviscutelata, e L. (P.) complexus. A evolução da infecção foi acompanhada semanalmente e biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para análise histopatológica e determinação de carga parasitária na 4ª e 8ª semana pós-infecção (PI); e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram também cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-10, IL- 12 e IL-4) no sobrenadante. A infecção por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis não se mostrou exacerbada nos grupos co-inoculados com o LGS de ambas as espécies em relação ao grupo controle, inoculado somente com o parasito. O tamanho de lesão e carga parasitária do grupo controle foi maior ou igual aos grupos com saliva. Na infecção por L. (L.) amazonensis houve diminuição dos linfócitos CD4+ e aumento na população de linfócitos CD8+ enquanto na infecção por L. (V.) braziliensis houve manutenção da população de linfócitos CD4+ e aumento de linfócitos CD8+ em todos os grupos quando comparados ao grupo saudável. A produção de IL-10 e IL-12, não diferiram entre os grupos, assim como a produção de IL-4 no grupo infectado por L. (V.) braziliensis. No entanto, nos grupos infectados apenas com L. (L.) amazonensis e com saliva de L. flaviscutellata, foi observada uma maior produção de IL-4 em relação ao grupo saudável. De forma geral, os resultados mostraram que a saliva de L. flaviscutellata e de Lutzomyia (P.) complexus, no seu binômio natural vetor/parasito ou não, não favoreceram o estabelecimento da infecção causada por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis em camundongos BALB/c. / During the natural transmission of leishmaniasis, the infected female phlebotomine regurgitates promastigotes into the host\'s skin together with the saliva. It has been reported that components of vector saliva contain immunomodulatory properties that facilitate the establishment of infection in the host, however the most studies employed salivary gland lysate (SGL) of laboratory colonized vectors. Thus, the main objective of this study was to evaluate the specificity of SGL of the phlebotomines Lutzomyia flaviscutellata and Lutzomyia (Psychodopygus) complexus caught in the field in the infectivity of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis. BALB/c mice were inoculated in the hind footpad with promastigotes of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in the absence or presence of L. flaviscutelata, and L. (P.) complexus SGL. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and biopsies from the site of infection were collected for histopathological analysis and determination of parasite load in the 4th and 8th week post infection (PI), and the draining lymph node to characterize subsets of T cells by flow cytometry. The draining lymph nodes cells were also cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-10, IL-12 and IL-4) in the supernatant. L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis infection was not exacerbated in the groups co-inoculated with the SGL of both species in the control group, only inoculated with the parasite. The lesion size and parasite burden of the control group was higher or equal to the groups with saliva. In L. (L.) amazonensis infection there was a decrease of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells while in L. (V.) braziliensis infection there was a maintenance of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells in all groups compared with the health group. The production of IL-10 and IL-12, did not differ between groups, as well as the production of IL-4 in the group infected by L. (V.) braziliensis. However, in the groups infected only with L. (L.) amazonensis in the presence of L. flaviscutellata saliva, it was observed a higher production of IL-4 in relation with the health group. As a whole, the results show that the saliva of L. flaviscutellata and L. (P.) complexus, in the natural vector/parasite binomium or not, did not favor the establishment of the infection caused by L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in BALB/c mice

Leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e se apresentam sob forma tegumentar ou visceral. No Brasil, a leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada, na sua maioria, por Leishmania (Viannia) braziliensis e conhecem-se principalmente as formas cutânea (LC), mucosa (LM) e disseminada (LD) da doença. Na LTA as formas clínicas tem sido atribuídas a diferenças na resposta imune do hospedeiro, mas recentemente vinculam-se também à variabilidade intraespecífica da L. (V.) braziliensis. Neste estudo avaliamos se haveria variabilidade biológica nos isolados de L. (V.) braziliensis, provenientes de pacientes com LC, LM e LD, principalmente em resposta a fator de crescimento insulina-símile-I (IGF-I). Os fatores de crescimento do hospedeiro tem sido alvo de estudos no desenvolvimento das leishmanioses, sendo IGF-I um deles. Havíamos demonstrado em estudos anteriores, utilizando Leishmania (Leishmania) amazonensis, que IGF-I induz proliferação, aumentando a atividade da arginase, com geração de poliaminas e diminuindo a síntese de óxido nítrico. No presente estudo analisamos o efeito de IGF-I em L.(V.) braziliensis, espécie prevalente no Brasil. Avaliamos inicialmente as características dos diferentes isolados enquanto promastigota e no prosseguimento enquanto amastigota em células de linhagem monocítica humana THP-1, com e sem estímulo de IGF-I. Nossos dados sugerem que há diferenças na atividade da arginase basal entre os isolados de L. (V.) braziliensis, sendo maior naqueles provenientes de pacientes com LM. IGF-I aumentou a atividade da arginase nos isolados de LC e LD, mas não de LM. Nos isolados em forma amastigota nas células de linhagem monocítica humana THP-1, o efeito de IGF-I foi de aumento do parasitismo nos isolados de LC e LM e de diminuição com os de LD. Nos isolados de LD a atividade da arginase basal foi menor que nos de LC. Por outro lado, a produção de óxido nítrico tendeu a ser maior em isolados de LD quando sob estímulo de IGF-I. Os dados sugerem que diferenças nas características biológicas dos parasitos podem contribuir na apresentação clínica dos casos da LTA. / Leishmaniasis are diseases caused by protozoa of the genus Leishmania that may manifest as cutaneous or visceral disease. In Brazil, American tegumentary leishmaniasis (ATL) is caused mostly by Leishmania (Viannia) braziliensis and cutaneous (CL), mucosal (ML) and disseminated (DL) forms of the disease are known.The diversity of clinical manifestations has been attributed to differences in the host immune response, but recently it has also been related to intraspecific variability of L. (V.) braziliensis. In the present study we evaluated whether there were biological variability in different isolates of L. (V.) braziliensis from patients with CL, ML, and DL, mainly in response to insulin-like growth factor-I (IGF-I). Growth factors of the host have been investigated in the development of leishmaniasis including IGF-I. In previous studies using Leishmania (Leishmania) amazonensis IGF-I was shown to induce proliferation, to increase the activity of arginase, generating polyamines and to decrease the synthesis of nitric oxide. In this study we analyzed the effect of IGF-I in L. (V.) braziliensis, a species prevalent in Brazil. Initially we evaluated the characteristics of individual isolates as promastigote and further as amastigote within human macrophage cell line THP-1 with and without IGF-I stimulation. Our data suggest that there are differences in the basal arginase activity amongst isolates of L. (V.) braziliensis, being higher in those from patients with ML. IGF-I increased the activity of arginase in the isolates of CL and DL, but not of ML. In isolates in the form of amastigotes within THP-1 cells, IGF-I induced the increase of parasitism of isolates from CL and ML, and decrease of those from DL. In isolates of DL the basal arginase activity was lower than in those of CL. Moreover, the production of nitric oxide tended to be higher with isolates of DL upon IGF-I stimulation. The data suggest that differences in the biological characteristics of parasites may contribute to the diversity of clinical presentation of ATL.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-22T11:12:34Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucilla Ribeiro Àvila - 2012.pdf: 1507401 bytes, checksum: bf2c2e095da09a43d8131413a5b45a44 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-22T11:14:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucilla Ribeiro Àvila - 2012.pdf: 1507401 bytes, checksum: bf2c2e095da09a43d8131413a5b45a44 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-22T11:14:19Z (GMT). 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The mechanisms for the development of mucosal leishmaniasis are poorly known, but it is possible that proteins associated with virulence of the parasite, such as META2 LRR17 and/or related with the induction of a strong immune response, such as STI and TSA, participate in the pathogenesis disease, causing the appearance of metastases in the mucosa. Objective: To evaluate the expression of proteins META2, LRR17, STI1 and TSA in promastigotes and amastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis derived from cutaneous or mucosal lesions. Methods: It was used three isolates from cutaneous lesions of patients (JCJ8c, and RPL5c SMB7c) and three isolates from mucosal lesions (ASL9m, and JBC8m PPS6m). Amastigotes of the isolates were obtained after inoculation of biopsies in mice knockout in interferon gamma and promastigotes in logarithmic or stationary phase obtained in culture in Grace's medium. The kinetics of growth in culture of isolates was performed by counting daily over ten days in the flow cytometer. The expression of proteins of each isolate was assessed by immunoblotting technique and by flow cytometry, the latter being used only to evaluate the expression of proteins whose expression was significant difference between isolates from cutaneous or mucosal lesions. Results: Promastigotes in stationary phase of the isolates SMB7c and JBC8m were the most expressed the protein META2. The greatest expression of this protein in parasites coincided with more severe lesions, since despite of isolated SMB7c being of cutaneous origin, the patient also presented mucosal lesion, and in the isolated JBC8m the patient presented return of lesions. Proteins LRR17 and STI1 were not expressed in significant amount in both promastigotes and amastigotes of different isolates. TSA protein was expressed at higher levels in promastigotes stationary phase and amastigotes of the xi isolates from patients with mucosal lesions, and this difference was also observed in flow cytometric analysis. Conclusion: The results suggest an association of META2 protein, which is related to the virulence of the parasite, with the generation of more severe lesions in the mucosal, since the highest expression of the protein was isolate from patients with mucocutaneous lesions and patients whose treatment was not effective. TSA, which is associated with antigenicity and virulence of the parasite was also expressed in greater amount in isolates from patients with mucosal lesions. The hypothesis is that, despite TSA protein to induce a protective immune response could be conferring protection in the Leishmania after entering the phagolysosomes by being an antioxidant protein. This protection favored the persistence of parasites and later generation of mucosal lesions. / Introdução: A Leishmania (Viannia) braziliensis é o agente etiológico mais frequente da leishmaniose tegumentar no Brasil. Cerca de 1 a 10% dos pacientes infectados com essa espécie de parasito desenvolvem a leishmaniose mucosa, cujas lesões são progressivas, destrutivas e caracteriza-se por uma forte resposta imune específica. Os mecanismos para o desenvolvimento da leishmaniose mucosa são pouco conhecidos, porém é possível que proteínas associadas à virulência do parasito, como a META2 e o LRR17 e /ou relacionadas com a indução de uma forte resposta imune, como a STI e a TSA, participem da patogênese da doença, ocasionando o aparecimento de metástase na mucosa. Objetivo: Avaliar a expressão das proteínas META2, LRR17, STI1 e TSA em formas promastigotas e amastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis oriundas de lesões cutâneas ou mucosas. Métodos: Foram utilizados três isolados oriundos de lesões cutâneas de pacientes (JCJ8c, RPL5c e SMB7c) e três isolados oriundos de lesões mucosas (ASL9m, JBC8m e PPS6m). Formas amastigotas dos isolados foram obtidas após o inóculo das biópsias em camundongos deficientes em interferon gama e as formas promastigotas em fase estacionária ou logarítmicas obtidas em cultura em meio de Grace. A cinética do crescimento dos isolados em cultura foi realizada através de contagem diária durante dez dias em citômetro de fluxo. A expressão das proteínas de cada isolado foi avaliada através da técnica de immunoblotting e por citometria de fluxo, sendo esta última utilizada somente para avaliar a expressão de proteínas cuja diferença na expressão foi significante entre os isolados de lesões cutâneas ou mucosas. Resultados: Promastigotas em fase estacionária dos isolados SMB7c e JBC8m foram as que mais expressaram a proteína META2. A maior expressão desta proteína nos parasitos coincidiu com lesões mais graves, visto que o isolado SMB7c apesar de ser de origem cutânea, o paciente apresentou também lesão na mucosa e no isolado JBC8m o paciente teve o retorno das lesões. As proteínas LRR17 e STI1 não foram expressas em quantidades significativamente diferentes tanto em promastigotas quanto em amastigotas dos diferentes isolados. A proteína TSA foi expressa em maior quantidade nas formas promastigotas em fase estacionária e em amastigotas dos isolados oriundos de pacientes com lesão mucosa, sendo que essa diferença também foi observada na análise citométrica. Conclusão: Os resultados sugerem uma associação da proteína META2, que está relacionada com a virulência do parasito, com a geração de lesões mais graves nas mucosas, visto que a maior expressão da proteína foi em isolados de pacientes com lesão mucocutânea e de pacientes que o tratamento não foi eficaz. A TSA, que está associada à antigenicidade e também virulência do parasito foi mais expressa em isolados oriundos de pacientes com lesão mucosa. A hipótese é que, a proteína TSA apesar de induzir uma resposta imune protetora, estaria conferindo proteção da leishmânia após a entrada no fagolisossomo por ser uma proteína antioxidante. Esta proteção favorecia a persistência dos parasitos e mais tarde a geração de lesões na mucosa.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tatiane Luiza da Costa.pdf: 1394288 bytes, checksum: cde5d3e8ab1f315e5e9ac6dd8d167bd0 (MD5) Previous issue date: 2011-09-16 / Leishmaniasis is a disease of the endothelial reticulum system and is caused by protozoans form the Leishmania genus. The promastigote forms of Leishmania sp degradate carbohydrates through the glycolityc pathway and its first reaction occurs inside the glicosome. As they use as energy source glucose, aminoacids and lipids from the culture media the excreted/secreted (E/S) products may be useful as indicative of the energetic and metabolis profile of the parasite and of its biological disturbances. The biochemical analysis of Leishmania metabolism is important to upgrade the parasitological studies with techniques which are adequate to the evaluation of the biochemical profile of the host-parasite relationship towards a better understanding of how these organisms are able to survive in such diverse environments such as the digestory tract of the insect or inside vertebrate hosts tissues. The aim of this study was to perform a study of the energetic metabolism of species and isolates of Leishmania spp. Therefore the in vitro analysis of E/S metabolic products from the parasite within the culture media during logarithmic and stationary growth phases was performed through chromatographic (HPLC) methods. The spectrophometry was used to glucose measurement and the nuclear magnetic resonance (NMR) was implanted aiming the study of the parasite‟s metabolism. Through HPLC it was possible to verify a significant difference in the E/S of organic acids from the carbohydrates metabolism (pyruvate and lactate), intermediary metabolism (citrate, α-ketoglutarate, succinate, fumarate, malate and oxaloacetate) and from the fatty acids oxidation (β-hydroxibutyrate) between differents species and isolates of Leishmania spp. Through the enzymatic spectrophotometric analysis we verified the different concentrations of glucose. The NMR through 13C and 1H detected the following metabolites in pellet and supernatant: alanine, lactate, acetate, oxalate, pyruvate, succinate, glicerol, CO2, ureia and aminoacids (glutamine, valine and arginine). Therefore, through the several methods it was possible to observe that there is difference of E/S metabolites between the isolates and strains of Leishmania spp that utilize several biochemical pathways to energy production and the identification of these pathways may be used to identify each isolate and also establish metabolic differences in the host-parasite relationship. / A leishmaniose é uma doença do sistema mononuclear fagocitáio causada por protozoários do gênero Leishmania. As formas promastigotas de Leishmania sp degradam carboidratos pela via glicolítica e a primeira reação ocorre dentro do glicossomo. Utilizando como fonte de energia a glicose, aminoácidos e lipídeos presentes no meio de cultura, os produtos excretados/secretados (E/S) podem ser indicadores do perfil metabólico energético parasitário e de distúrbios biológicos. A análise bioquímica do metabolismo de Leishmania vem atualizar os estudos parasitológicos com técnicas adequadas à avaliação do perfil bioquímico na relação parasito-hospedeiro, levando ao melhor entendimento da maneira como esses organismos conseguem sobreviver em ambientes diversos como o trato digestório do hospedeiro invertebrado ou nos tecidos do hospedeiro vertebrado. O objetivo deste trabalho foi o estudo do metabolismo energético de diferentes espécies de Leishmania. Para tanto, foi realizada a análise in vitro de metabólitos E/S pelo parasito em meio de cultura durante as fases logarítmicas e estacionárias do crescimento, e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A espectrofotometria foi utilizada para a dosagem de glicose. O método de ressonância magnética nuclear foi implantado para o estudo do metabolismo parasitário. Pela CLAE verificou-se diferença nos produtos E/S dos ácidos orgânicos do metabolismo de carboidratos (piruvato e lactato), do metabolismo intermediário (citrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato) e do metabolismo dos ácidos graxos (β-hidroxibutirato) entre diferentes espécies e isolados de Leishmania. Pela análise espectrofotométrica enzimática verificou-se diferença na concentração de glicose na cepa M2903 de L.(V.) braziliensis. Pela RMN de 13C e 1H detectaram-se os seguintes metabólitos no sedimento e sobrenante: alanina, lactato, acetato, oxalato, piruvato, succinato, glicerol, CO2, uréia e aminoácidos (glutamina, valina e arginina). Entretanto, através de vários métodos, foi possível observar que há diferenças na E/S de metabólitos entre diferentes cepas e isolados de Leishmania spp que utilizam diversas vias bioquímicas para a obtenção de energia e a identificação dessas vias poderá ser utilizada para investigar a atuação de fármacos anti-parasitários. Mudanças bioquímicas no metabolismo podem indicar possíveis adaptações do parasito às diferentes condições ambientais e fisiológicas durante o ciclo de vida e essas características bioquímicas individuais poderão ser utilizadas na identificação de cada isolado, além de estabelecer diferenças metabólicas na relação parasito-hospedeiro.