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Yes / Aneuploidy is usually deleterious in multicellular organisms but appears to be tolerated and potentially beneficial in unicellular organisms, including pathogens. Leishmania, a major protozoan parasite, is emerging as a new model for aneuploidy, since in vitro-cultivated strains are highly aneuploid, with interstrain diversity and intrastrain mosaicism. The alternation of two life stages in different environments (extracellular promastigotes and intracellular amastigotes) offers a unique opportunity to study the impact of environment on aneuploidy and gene expression. We sequenced the whole genomes and transcriptomes of Leishmania donovani strains throughout their adaptation to in vivo conditions mimicking natural vertebrate and invertebrate host environments. The nucleotide sequences were almost unchanged within a strain, in contrast to highly variable aneuploidy. Although high in promastigotes in vitro, aneuploidy dropped significantly in hamster amastigotes, in a progressive and strain-specific manner, accompanied by the emergence of new polysomies. After a passage through a sand fly, smaller yet consistent karyotype changes were detected. Changes in chromosome copy numbers were correlated with the corresponding transcript levels, but additional aneuploidy-independent regulation of gene expression was observed. This affected stage-specific gene expression, downregulation of the entire chromosome 31, and upregulation of gene arrays on chromosomes 5 and 8. Aneuploidy changes in Leishmania are probably adaptive and exploited to modulate the dosage and expression of specific genes; they are well tolerated, but additional mechanisms may exist to regulate the transcript levels of other genes located on aneuploid chromosomes. Our model should allow studies of the impact of aneuploidy on molecular adaptations and cellular fitness. / This study was supported by Belgian Science Policy Office (TRIT, P7/41), Flemish Fund for Scientific Research (G.0.B81.12), and Department of Economy, Science and Innovation in Flanders ITM-SOFIB (SINGLE project, to J.C.D.). G.D. and B.C. were supported by the Research Foundation—Flanders (FWO) (grants 12Q8115N and 11O1614N, respectively). V.S., J.M. and P.V. were supported by Czech Science Foundation (project no. 13-07500S) and Charles University (UNCE 204017/2012). J.R.V. was supported by research grants from the KU Leuven (SymBioSys [PFV/10/016]) and the Hercules Foundation (ZW11-14). M.S., M.B., and J.A.C. were supported by the Wellcome Trust through the core support for the Wellcome Trust Sanger Institute (grant no. 098051). G.B., P.P., and G.F.S. were supported by Institut Pasteur strategic fund for the LeiSHield project (to G.F.S.).

L'émergence de souches de Leishmania résistantes aux traitements à base d'antimoine pentavalent représente un problème particulièrement critique. Une compréhension des mécanismes impliqués dans cette résistance est alors primordiale. Le mode d'action de l'antimoine n'est pas encore bien défini mais serait multifactoriel. Dans le laboratoire, la résistance à l'antimoine chez Leishmania a été étudiée exclusivement chez la forme promastigote in vitro. Maintenant grâce à des souches amastigotes axéniques qui ont été développées dans notre laboratoire, l'étude de la résistance chez ce stade du parasite est devenue possible. Nous avons caractérisé une souche résistante amastigote axénique Sb2000.1 qui est résistante à Sblll. De plus la résistance est stable et Sb2000.1 montre une résistance croisée au pentostam à l'intérieur des macrophages. Dans le but d'identifier les gènes dont l'expression serait modifiée chez le mutant Sb2000.1, nous avons utilisé la technique des puces à ADN. Nous avons détecté la surexpression du transporteur MRPA et du gène S-adénosylehomocysteine hydrolase enzyme impliquée dans la biosynthèse du trypanothion (TSH) chez le mutant Sblll axénique amastigote. Le niveau de la cystéine mesurer par HPLC a été trouvé augmenté chez le mutant Sb2000.1. La transfection de MRPA confère la résistance au Pentostam chez les parasites intracellulaires. Cette résistance due à MRPA a été altérée par le buthionine sulfoxymine, l'inhibiteur spécifique de yglutamylcystéine synthase. Il s'agit de la première explication moléculaire d'un mécanisme de résistance à l'antimoine chez le stade amastigote via MRPA. Ces résultats nous ont incités à faire une comparaison plus détaillée de ce mutant axénique amastigote en utilisant une technique protéomique comparative de gels 2D. Notre analyse nous a révélé l'expression différentielle de plusieurs protéines et une de ces protéines qui est sousexprimée chez le mutant est kinetoplastid membrane protein 11. Le recours à la transfection ou à l'inactivation de KMP-11 chez l'isolât promastigote sensible montre que le rôle de K.MP-11 est complexe. Pour comprendre la contribution du macrophage dans le mode d'action de SbV contre Leishmania, nous avons étudié l'expression différentielle des gènes des cellules THP-1 traitées avec le Pentostam par les puces Affymetrix. L'analyse nous a suggéré l'implication de quelques gènes dans le mode d'action de SbV dont hème oxygénage.

Leishmania est un parasite intracellulaire reconnu pour sa capacité à inhiber sa cellule hôte, le macrophage, et ainsi favoriser sa survie. Il parvient principalement à altérer des fonctions impliquées dans l’action microbicide du phagocyte (dont le monoxyde d’azote (NO)) ou dans la réponse immunitaire. On a associé ce phénomène à l’altération de plusieurs voies de signalisation de la cellule telles celles dépendantes du Ca2+, de la PKC, de JAK2/STAT1α et de ERK1/2. Il a précédemment été démontré que le parasite pouvait, en outre, induire l’activité des phosphotyrosines phosphatases (PTP) et plus spécialement celle de la PTP SHP-1. On reconnaît cette dernière comme un puissant inhibiteur de la signalisation cellulaire dépendante des tyrosines kinases. De plus, l’usage d’inhibiteurs de PTP a démontré l’importance de ces dernières dans la survie du parasite in vivo et in vitro. C’est pourquoi l’objectif de la présente thèse était de vérifier le rôle de la SHP-1 dans la survie du parasite in vivo et in vitro mais également dans l’inactivation du macrophage provoquée par l’infection. Pour ce faire, des souris déficientes en SHP-1, les viable motheaten, et des macrophages dérivés de celles-ci ont été infectés par Leishmania. In vivo, l’infection et l’inflammation chez les souris déficientes en SHP-1 étaient quasi inexistantes, grâce à l’action des cellules inflammatoires, surtout les neutrophiles, et à l’augmentation de la production de NO. Ce recrutement inflammatoire accru était causé par l’élévation des taux de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines. In vitro, l’absence de la SHP-1 empêchait la survie du parasite selon des mécanismes dépendants et indépendants de la production de NO. Le rôle de la SHP-1 dans l’inhibition de cette production se situait au niveau de l’inactivation des kinases JAK2 et ERK1/2 et des facteurs de transcription NF-κB et AP-1. Par contre, l’inactivation spécifique du facteur de transcription STAT1α ne dépendait pas de l’activité de la SHP-1 mais plutôt de celle des protéasomes cellulaires. En définitive, cette thèse démontre que l’activation de la SHP-1 est essentielle à la survie de Leishmania et à sa propagation, mais qu’il parvient également à inactiver le macrophage en favorisant la dégradation de STAT1α par les protéasomes. / The intracellular protozoan parasite Leishmania has been known for its ability to evade its host immune response principally by inhibiting phagocyte functions. Indeed, infected macrophages show a loss of microbicidal (NO, oxygen intermediates) and immunological activities (IL-1, IL-12, MHC). This allows for its replication and invasion of the host. These dysfunctions are correlated by alterations in signalling cascades depending on Ca2+, PKC, JAK2/STAT1α and MAPK ERK1/2. It has also been reported that Leishmania infection could induce the macrophage phosphotyrosine phosphatase (PTP) activity and more specifically that of PTP SHP-1, a strong negative regulator of tyrosine kinase-dependent pathways. Moreover, the use of PTP inhibitors showed their essential role in parasite survival both in vivo and in vitro. These results suggested a potential role for SHP-1 in parasite survival and in the inhibition of macrophages. To address this issue, SHP-1-deficient mice, the viable motheaten mice, and their bone marrow-derived macrophages were infected with Leishmania. Results show that footpad inflammation was virtually absent in SHP-1-deficient mice and depended on inducible nitric oxide synthase increased activity as well as inflammatory cells recruitment, especially neutrophils. This recruitment seemed to be due to increases in pro-inflammatory cytokines expression and secretion and in chemokine gene expression. SHP-1-deficient mice had both more inflammatory cells numbers and a higher ratio of neutrophils, recognized for their microbicidal action against Leishmania. In vitro, SHP-1 activity seemed essential for parasite survival by allowing the attenuation of NO-dependent and -independent mechanisms. Furthermore, its alteration of NO generation in infected cells was due to the dephosphorylation of JAK2 and ERK1/2 as well as inhibition of transcription factors NF-κB and AP-1. However, SHP-1 was not responsible for the inhibition of transcription factor STAT1α seen in infected macrophages. This phenomenon seemed due to specific proteasomal degradation of the protein. Overall, the present thesis demonstrates that Leishmania is a versatile parasite able to use several strategies to alter its host responsiveness, two of them being the essential activation of SHP-1 and the targeting of STAT1α to the proteasomal degradation pathway.

Leishmania est un parasite protozoaire dimorphique causant la leishmaniose à travers le monde. Puisque aucune régulation transcriptionnelle n'a été décrite chez ce parasite, l'étude de la régulation de la traduction est devenue essentielle. Il a été décrit chez les eucaryotes supérieurs que le facteur d'initiation de la traduction, eIF2[alpha], lorsqu'il est phosphorylé en condition de stress, est capable d'inhiber la traduction. Les objectifs de ce travail étaient de 1) déterminer si le facteur eIF2[alpha] est phosphorylé chez Leishmania au cours de la différenciation ou à la suite de certains stress et 2) de caractériser une des eIF2[alpha] kinases, la PKR. Cette kinase est activée, entres autres par la présence d'ARN double brins et s'autophosphoryle. Par des expériences d'immunoprécipitation, de précipitation à l'aide d'ARNdb et d'immunobuvardage, il semble que, dans les deux cas (le facteur eIF2[alpha] et la kinase PKR), soit majoritairement phosphorylés au stade amastigote intracellulaire du parasite. Les stress de pH et de température, qui mimiqueraient l'environnement du macrophage, et de la drogue thapsigargine, qui induit un stress du RE, ne semblent pas affecter l'expression de ces facteurs mais auraient un effet sur leur phosphorylation. De plus, ces protéines sont aussi associées particulièrement aux monosomes suggérant un rôle dans l'initiation de la traduction.

La plus grande sensibilité des souris TLR9-/- a révélé le rôle de ce récepteur dans l'infection par Leishmania major. Les cellules dendritiques (DCs) sont activées de manière TLR9-dépendante par l'ADN du L. major et d'autres Trypanosomatidae et non par l'ADN de vertébré. La nature de l'ADN capable d'activer le TLR9 reste controversée quant à la séquence/charpente de l'ADN et l'implication de cofacteurs se liant avec le TLR9 ou l'ADN. Nous avons démontré l'importance de la séquence d'ADN. Contrairement aux génomes de parasites, l'ADN de vertébré présente une contre-sélection des motifs activateurs du TLR9 au profit des motifs inhibiteurs. De plus, l'activation du TLR9 par l'ADN du parasite est augmentée en présence de la protéine HMGB1, qui se fixe mieux sur l'ADN de parasite que de vertébré. La maturation du TLR9 requiert un clivage protéolytique par des protéases endosomales, dont les cathepsines (Cat) B, S, L et l'asparagine endopeptidase (AEP) qui interviennent différemment dans les macrophages et les DCs. Après infection par L. major, nous avons montré que les souris AEP-/-, CatS-/- et CatL-/- ont une pathologie identique aux souris WT, ce qui peut être dû à la redondance de leur fonction. Etonnamment, les souris CatB-/- sont plus résistantes. Leurs lésions et la charge parasitaire dans les ganglions se résolvent plus rapidement, reflétant une réponse immune plus précoce et un contrôle plus rapide de la réaction inflammatoire.En conclusion, ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes permettant au TLR9 de discriminer entre l'ADN de pathogène et de vertébré et soulèvent le rôle non protecteur de la cathepsine B dans l'infection par L. major. / As TLR9-deficient mice are more sensitive to Leishmania major infection, we have shown previously that TLR9 receptor mediates this parasite infection. Dendritic cells (DCs) are activated by L. major and other Trypanosomatidae DNA and not by vertebrate DNA. There is an ongoing controversy concerning the properties of DNA required for TLR9 activation, regarding the DNA sequence or backbone or the implication of a cofactor interacting with TLR9 or DNA. We have established the importance of DNA sequences. In contrast to parasite genome, vertebrate genome have counter-selected stimulatory sequences and over-represented inhibitory motifs for TLR9. In addition, host proteins contribute to TLR9-dependent DC activation. HMGB1 enhances TLR9 activation only in the presence of L. major DNA and, surprisingly, HMGB1 binds more abundantly L. major than vertebrate DNA. TLR9 activation requires a proteolytic cleavage by endosomal proteases, as cathepsins (Cat) B, S and L and asparagine endopeptidase (AEP) that have a differential activity in macrophages and DCs. After L. major infection, we have showed that AEP-/-, CatS-/- and CatL-/- mice have a similar pathology than WT mice, likely due to their functionnally redundant activites. In contrast, CatB-/- mice are more resistant to the infection. Their lesion sizes and the parasite burdens in lymph nodes are significantly decreased, reflecting an earlier immune response and a more rapid control of the inflammatory response. In conclusion, our results bring further insights into how TLR9 discriminates between Trypanosomatidae and vertebrate DNA and reveal a non protective role of cathepsin B in L. major infection.

As leishmanioses constituem um complexo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania. São transmitidas pela picada de fêmeas parasitadas do gênero Phlebotomus e/ou Lutzomyia. A leishmaniose é uma doença zoonótica que afeta mais de 12 milhões de pessoas no mundo, e constituem uma preocupação para a saúde pública. A arginase de Leishmania é a primeira enzima da via das poliaminas e constitui um importante alvo terapêutico devido ao seu papel ativo na sobrevivência do parasita no hospedeiro. Neste trabalho, 78 moléculas sintéticas e naturais de diferentes grupos químicos foram testadas com objetivo de determinar a sua capacidade de inibição da enzima arginase recombinante de Leishmania (L.) amazonensis (ARG-LA). Foram considerados inibidores da ARG-LA os compostos que apresentaram uma inibição ≥ 70% a 100 µM. Os resultados revelaram 28,2 % de compostos com elevado potencial de inibição da ARG-LA, exibindo valores de IC50 na faixa micromolar. A cinética de inibição foi determinada pelo método de Dixon e Cornish-Bowden e revelou diferentes mecanismos de inibição enzimática. As moléculas sintéticas com potencial inibitório da ARG-LA correspondem aos ésteres e cinamidas biosintéticos, cinamidas derivados do ácido cafeico e pirazolopirimidinas. Além disso, foram testados 4 compostos naturais estruturalmente relacionados ao ácido caféico: piceatannol e 3 ácidos salvianólicos (A, B e D). Os resultados poderão servir de ponto de partida para o planejamento e síntese de novos fármacos para tratamento da leishmaniose, baseado na inibição da ARG-LA. / Leishmaniasis is a complex of diseases caused by Leishmania protozoa. They are transmitted by the bite of parasitized females of the Phlebotomus and/or Lutzomyia genus. Leishmaniasis is essentially a zoonotic disease, affecting more than 12 million people in the world and are a public health concern. Leishmania arginase is the first enzyme in the polyamine pathway and constitutes an important therapeutic target due to its active role in the parasite\'s survival in the host. In this work 78 compounds (synthetic and natural) of different chemical groups were tested to determine their ability to inhibit the recombinant Leishmania (L.) amazonensis arginase (LA-ARG). The IC50 and Ki were determined to the compounds that showed inhibition ≥ 70% at 100 µM. The results indicated that 28.2% of the compounds have a high potential for LA-ARG inhibition, with IC50 values in the micromolar range and different enzymatic inhibition mechanisms. The main synthetic groups with the high inhibitory potential of the enzyme corresponding to the caffeic acid derivatives, pyrazolopyrimidines, and the natural compounds piceatannol and salvianolic acids. These results indicate a potential for the synthesis of new drugs for the treatment of leishmaniasis, based on parasite arginase inhibition.

Die kutane Leishmaniose ist eine Infektionskrankheit, die besonders in tropischen und Wüstenregionen endemisch ist, mit einer Inzidenz von 1,5 Millionen Fällen im Jahr und einer Prävalenz von 12 Millionen Infizierten weltweit. Die Infektion kann durch den intrazellulären Parasiten Leishmania major hervorgerufen werden. Am Mausmodell ist die Krankheit ausführlich untersucht. Wie dabei deutlich wurde, ist für die Immunität gegen den Erreger die Induktion einer Klasse von Interferon (IFN)--produzierenden CD4+ T-Helfer-Zellen (TH1-Zellen) entscheidend, welche Makrophagen dazu aktivieren, die von ihnen beherbergten Parasiten abzutöten. Die Umlenkung der Immunantwort in Richtung einer schützenden TH1-Antwort wird auch der Schlüssel zu einem effektiven Impfstoff sein. Ex vivo mit Leishmanienantigenen beladene dendritische Zellen sind vor einiger Zeit als Vakzine gegen L. major-Infektionen beschrieben worden. Ein einzelnes rekombinantes Antigen, LeIF (Leishmania homologue of eukaryotic ribosomal initiation factor 4a), ein parasitäres Protein, das die IL-12-Produktion durch dendritische Zellen stimuliert und das als mikrobiell konserviertes Strukturmolekül (pattern-associated molecular pattern; PAMP) diskutiert wird, vermittelte dabei, zum Pulsen von dendritischen Zellen verwendet, einen schützenden TH1-abhängigen Effekt. Der Einsatz rekombinanter Proteine ist jedoch mit etlichen Nachteilen verbunden, weshalb andere Methoden zur Verabreichung von Antigenen entwickelt wurden. Aus der Tumorforschung ist unlängst die RNA-Elektroporation dendritischer Zellen als eine sichere und vielseitige Methode hervorgegangen, bei der eine große Anzahl von RNA-Molekülen, die für ein bestimmtes Antigen kodieren, durch einen elektrischen Impuls in das Cytosol dendritischer Zellen gelangt. Die vorliegende Arbeit beschreibt zum ersten Mal die Transfektion dendritischer Zellen mit RNA eines molekular definierten Parasitenantigens. Zunächst erfolgte die Etablierung eines standardisierten Protokolls für die RNA-Transfektion mit dem enhanced green fluorescent protein (EGFP) als Reporterantigen. EGFP-RNA war gut translatierbar in einem In-vitro-Translationssystem, und es konnten sowohl eine Zellinie (fetal skin-derived dendritic cells; FSDC) als auch primäre, aus Knochenmarkkulturen der Maus gewonnene dendritische Zellen (bone marrow-derived dendritic cells; BMDC) mit einem Anteil von bis zu 90% bzw. 75% effizient EGFP-transfiziert werden. In beiden Zelltypen wurde die maximale Transfektionseffizienz mit 20 µg RNA erreicht, die mit größeren Mengen an RNA nicht weiter zu steigern war. Die Höhe der Antigenexpression, gemessen als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) in der Durchflußzytometrie, war direkt proportional zur verwendeten RNA-Menge. In FSDC waren die Transfektionseffizienz und die MFI generell höher als in BMDC bei gleicher RNA-Menge. Zudem konnte gezeigt werden, daß eine Behandlung mit LPS die Kinetik beeinflußt: Die maximale Expression war höher und wurde auch eher erreicht, worauf zudem ein schnellerer Abfall folgte. In den Transfektionsexperimenten mit LeIF wurden zwei Varianten von LeIF-RNA verwendet: eine für die gesamte LeIF-Sequenz kodierende LeIF(fl)-RNA, und eine nur für die aminoterminale Hälfte der LeIF-Sequenz (226 Aminosäuren), dem immunogenen Teil des LeIF-Moleküls, kodierende LeIF(226)-RNA. Im Western Blot von Ganzzellysaten dendritischer Zellen war nur LeIF(fl) nach Transfektion nachzuweisen, wohingegen LeIF(226) in LeIF(226)-transfizierten BMDC nie nachzuweisen war. Da beide Konstrukte aber gut im zellfreien System translatierbar waren, stellte der fehlgeschlagene Nachweis von LeIF(226) kein Fehlschlagen der RNA-Translation, sondern vielmehr einen raschen Antigenabbau dar. Es bestand daher die Erwartung, daß LeIF(226)-transfizierte BMDC trotzdem in der Lage sein müßten, von LeIF(226) abgeleitete antigene Peptide an T-Zellen von mit rekombinantem LeIF (rLeIF) immunisierten BALB/c-Mäusen zu präsentieren. Diese Vermutung wurde durch Messung von IFN- in Stimulationsversuchen mit BMDC und T-Zellen bestätigt, die zeigten, daß am Tag 7 der Kultur mit rLeIF gepulste, LeIF(226)- und LeIF(fl)-transfizierte BMDC in der Tat antigenspezifisch T-Zellen aus LeIF-immunisierten Mäusen aktivierten. IL-4 hingegen wurde nicht produziert, was mit der Tatsache vereinbar ist, daß in Lymphknoten LeIF-vakzinierter Mäusen hauptsächlich T-Zellen vom TH1-Typ zu finden sind. In den Überständen LeIF-transfizierter BMDC-Kulturen, im Gegensatz zu rLeIF-gepulsten BMDC, waren die proinflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6, IL-10 und IL-12 nicht nachzuweisen. Dieser Effekt lag nicht am Elektroporationsvorgang, da die Zytokinproduktion von mit rekombinantem LeIF elektroporierten BMDC nur teilweise beeinträchtigt war. Die Expression von CD86 war nach LeIF-Transfektion zudem geringer als nach Pulsen mit rLeIF. LeIF-Transfektion führte mithin nicht zur Reifung dendritischer Zellen. LeIF-transfizierte BMDC könnten im Ergebnis als antigenspezifische Toleranzinduktoren fungiert haben, mit regulatorischen T-Zellen als Respondern. Der Effekt der Transfektion mit LeIF-RNA auf die immunstimulatorische Wirkung von BMDC war nicht signifikant erhöht, wenn BMDC am Tag 8 oder 9 der Kultur verwendet wurden. BMDC, die am Tag 8, und mehr noch am Tag 9 mit rLeIF gepulst wurden, induzierten hingegen eine energische T-Zell-Antwort. BMDC vom Tag 9 waren sogar in der Lage, naive T-Zellen zu aktivieren. Bevor eine starke, gegen LeIF gerichtete T-Zell-Antwort eingeleitet werden kann, müssen dendritische Zellen also letztlich – neben Präsentation des Antigens und Expression kostimulatorischer Moleküle – eine gewisse „Empfindlichkeit“ gegenüber dem Strukturmolekül LeIF besitzen, die mit ihrem Reifungsalter in Zusammenhang steht. Dieses dritte Signal wird nicht durch intrazelluläres LeIF nach Transfektion mit LeIF-RNA übermittelt, oder es wird unterdrückt. Darüber hinaus war nach Elektroporation von rLeIF die IL-12-Produktion von BMDC gänzlich aufgehoben, die Produktion von IL-1 bei höheren Antigendosen reduziert und die Produktion von IL-10 teilweise erhöht. Die Produktion von IL-6 war unbeeinflußt. Dieses veränderte Zytokinprofil legt eine Doppelnatur von LeIF als PAMP nahe: Neben der bei extrazellulärem Vorliegen von LeIF erwiesenen Eigenschaft, die Produktion von IL-12 zu stimulieren, welches die Resistenz des Wirtes gegen L. major steigert, könnte LeIF bei intrazellulärem Vorliegen auch zu Evasionsmechanismen des Parasiten vor dem Immunsystem des Wirtes beitragen, möglicherweise durch Wechselwirkung mit MAP (mitogen-activated protein)-Kinase-Signalwegen. Die Eigenschaften von LeIF als Adjuvans hängen also sowohl von der Verabreichungsmethode (Transfektion mit RNA bzw. Pulsen mit dem rekombinanten Protein) als auch vom Zielkompartiment (extra- bzw. intrazellulär) ab. Zusammenfassend konnte also in dieser Arbeit gezeigt werden, daß BMDC mit einem Parasitenantigen transfizierbar sind. Das Antigen wird dabei prozessiert und präsentiert, aber von dendritischen Zellen nicht als PAMP erkannt. Durch Transfektion mit antigenkodierender mRNA alleine werden mithin nicht alle notwendigen Signale für die Induktion einer potenten Immunantwort übermittelt. / Cutaneous leishmaniasis is an infectious disease that is endemic especially in tropical and desert regions with an incidence of 1.5 million cases per year and a prevalence of 12 million people infected worldwide. The infection can be caused by the intracellular parasite Leishmania major. The disease has been studied extensively in the murine model. It has become apparent that the induction of a class of interferon (IFN)--producing CD4+ T helper cells (TH1 cells) that activate macrophages to kill the parasites they harbor is desicive for the establishment of immunity. The redirection of the host’s immune response towards a protective TH1 phenotype will also be the key to an effective vaccine. Dendritic cells (DC) loaded with leishmanial antigens ex vivo were lately described as vaccines against L. major infections. One single recombinant Leishmania antigen, LeIF (Leishmania homologue of eukaryotic ribosomal initiation factor 4a), which was identified as a protein that stimulates DC to secrete interleukin (IL)-12 and discussed as a pattern-associated molecular pattern (PAMP), was found to mediate a protective TH1-dependent effect when used for pulsing of DC. The application of recombinant proteins is tied to many disadvantages, which is why other methods of antigen administration have been developed. RNA electroporation of DC has recently emerged from tumor research as a safe and versatile method of antigen delivery, by which a large number of RNA molecules encoding a specific antigen gains access to the cytosol of DC by an electrical impulse. The present study describes, for the first time, transfection of DC with RNA encoding a molecularly defined parasite antigen. Initially, a standardized protocol for RNA transfection was established, using the enhanced green fluorescent protein (EGFP) as reporter antigen. EGFP-RNA was well translatable in an in vitro translation system, and both a DC cell line (fetal skin-derived DC; FSDC) and murine primary bone marrow-derived DC (BMDC) could be transfected efficiently, with a yield of up to 90% and 75%, respectively. In both cell types, maximal transfection efficiency was attained with 20 µg RNA and could not be further increased with larger amounts of RNA. The level of antigen expression, measured as the mean fluorescence intensity (MFI) by flow cytometry, was directly proportional to the amount of RNA used for transfection. In FSDC, transfection efficiency and MFI were generally higher than in BMDC when the same amounts of RNA were used. Furthermore, the kinetics was shown to be sensitive to treatment with lipopolysaccharide (LPS): the expression peak was higher and was reached sooner, followed by a more rapid decline. In transfection experiments with LeIF, two variants of LeIF-RNA were used: LeIF(fl)-RNA, encoding the complete LeIF sequence, and LeIF(226)-RNA, encoding only the aminoterminal half of the LeIF sequence (226 amino acids), the immunogenic part of LeIF. Only LeIF(fl) was detectable by Western Blot in whole cell lysates of BMDC after LeIF(fl)-RNA transfection, whereas LeIF(226) could never be detected in LeIF(226)-transfected BMDC. However, as both constructs were well translatable in a cell-free system, the failure to detect LeIF(226) in BMDC lysates did not represent a failure in RNA translation, but rather a rapid antigen degradation. It was therefore expected that LeIF(226)-transfected BMDC should nevertheless be able to present LeIF(226)-derived antigenic peptides to T cells from BALB/c mice primed with recombinant LeIF (rLeIF). This hypothesis was confirmed by measuring IFN- production in BMDC-T cell co-incubation assays, showing that rLeIF-pulsed, LeIF(226)- and LeIF(fl)-transfected day 7 BMDC did indeed activate T cells from LeIF-immunized mice in an antigen-specific manner. In contrast, IL-4 was not produced, which was consistent with the fact that T cells found in lymph nodes from LeIF-primed mice are primarily of the TH1 type. In the supernatants of LeIF-transfected BMDC cultures, in contrast to rLeIF-pulsed BMDC, the proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6, IL-10 and IL-12 were not detected. This effect was not due to the electroporation procedure, as cytokine production by BMDC electroporated with rLeIF was only partially impaired. Also, the expression levels of CD86 were lower upon LeIF transfection than after pulsing with rLeIF. Thus, LeIF transfection did not induce maturation of DC. In conclusion, LeIF-transfected BMDC may have acted as semi-mature antigen-specific tolerance inducers, with regulatory T cells as responders. The effect of LeIF transfection on the immunostimulatory capacity of BMDC was not significantly increased when day 8 or 9 BMDC were used. However, day 8, and even more day 9 BMDC pulsed with rLeIF mounted a vigorous T cell response. Day 9 BMDC were able to activate naïve T cells. In conclusion, before a strong T cell response against LeIF can be induced, DC need to – besides presenting antigen and expressing co-stimulatory molecules – exhibit a susceptibility to the innate signaling molecule LeIF which is linked to their maturation age. This third signal is provided by extracellular rLeIF, but it is not conveyed – or is suppressed – by intracellular LeIF after LeIF-RNA transfection. Furthermore, electroporation of rLeIF abrogated IL-12 production by BMDC completely, the production of IL-1 was reduced with higher antigen doses, and the production of IL-10 was partially increased. The IL-6 production was unaffected. This altered cytokine profile suggests that LeIF as a PAMP might have a bipartite nature: besides exhibiting the capacity to stimulate IL-12 production upon extracellular presence, thereby enhancing host resistance against L. major, LeIF could also contribute to parasitic host evasion mechanisms from intracellular compartments of DC, possibly by interfering with mitogen-activated protein (MAP) kinase signaling pathways. Thus, the adjuvant properties of LeIF depend both on its mode of delivery (transfection with RNA vs. pulsing with the recombinant protein) and the targeted compartment (extra- vs. intracellular). From this work, it can be summarized that BMDC are well transfectable with a parasite antigen. The antigen is processed and presented, but it is not recognized as a PAMP by DC. Hence, transfection with antigen-encoding mRNA by itself does not convey all necessary signals for the elicitation of a potent immune response.