Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004Bitstream added on 2014-06-13T19:51:03Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_me_me_botfmvz.pdf: 982475 bytes, checksum: cc23ec2107c58b4368971366d301352a (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / The identification of Leishmania spp. in the skin is an important tool for the canine visceral leishmaniasis (CVL) control. The aim of this study was to investigate which would be a better clinically normal skin region to perform skin biopsies for the diagnosis of the naturally Leishmania-infected dogs and to associate this finds to clinical signs. Thirty dogs from an endemic visceral leishmaniasis area and positive diagnose for CVL were selected for the study. Five asymptomatics dogs, negative for Leishmania were included as a fourth group. Clinically normal skin samples were collected from the six different sites by punch biopsy: upper part of the muzzle, ear, thorax, abdomen, forelimb and mucocutaneous junction. Immunohistochemistry detection of Leishmania was performed in all skin biopsy specimens and polymerase chain reaction (PCR) was performed in samples that were Leishmania-negative by immunohistochemistry. Weight loss (95%), lymphadenomegaly (55%) and pale mucous membrane (30%) were the main clinical signs observed. The most frequent skin abnormalities were alopecia and desquamation (90%), ulcerative dermatitis (60%), onychogryphosis (50%) and hyperpigmentation (40%). The immunohistochemistry demonstrated 100% of positivity in all skin samples of symptomatics dogs with skin lesions, independing on the region. Symptomatics dogs without skin lesions showed a lower positivity percentage, 40% and 30% depending on the region and asymptomatics dogs showed 30% and 20%. All regions from group 4 showed negative results. PCR showed positivity rates higher when compared to immunohistochemistry (P< 0,05) for the forelimb region from symptomatics dogs without skin lesions. These findings demonstrated that clinically normal skin of dogs from endemic area have parasites independently of clinical signs.

Orientador: Sonia R. V. da Silva Franco / Resumo:A identificação do agente etiológico da leishmaniose visceral canina (LVC) em tecido cutâneo é importante ferramenta para o controle desta enfermidade. Foram colhidas amostras da cútis, clinicamente sem lesão, de 30 cães pertencentes à área endêmica e com diagnóstico positivo para leishmaniose visceral, com o objetivo de determinar se há uma região preferencial para a realização da biópsia cutânea para o diagnóstico da doença, relacionando esses achados aos aspectos clínicos. Fragmentos cutâneos foram colhidos de seis regiões distintas: plano nasal, pavilhão auricular, toráx, abdome, membro anterior e transição mucocutânea. Foi realizada a técnica de imunoistoquímica em todas as amostras cutâneas e posteriormente, empregou-se a técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR) somente nas amostras que apresentaram resultados negativos à primeira técnica. Os sinais clínicos mais freqüentemente observados nos cães foram emagrecimento (95%), seguido de linfoadenomegalia (55%) e mucosas pálidas (30%). As alterações dermatológicas mais freqüentes foram alopecia e descamação cutânea (90%), seguidas de dermatite ulcerativa (60%), onicogrifose (50%) e hiperpigmentação (40%). A imunoistoquímica revelou resultado positivo em 100% das amostras cutâneas, independente da região dos cães sintomáticos que apresentaram quadro dermatológico. Já nos cães que não apresentaram manifestações dermatológicas, a porcentagem de positividade foi menor, 40% e 30%, dependendo da região e nos animais assintomáticos a positividade foi de 30% e 20%. Todas as regiões avaliadas nos cães com diagnóstico negativo apresentaram resultado negativo a imunoistoquímica. A PCR apresentou maior positividade quando comparada com a imunoistoquímica (P< 0,05) para a região de membro anterior dos cães sintomáticos sem alterações cutâneas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: The identification of Leishmania spp. in the skin is an important tool for the canine visceral leishmaniasis (CVL) control. The aim of this study was to investigate which would be a better clinically normal skin region to perform skin biopsies for the diagnosis of the naturally Leishmania-infected dogs and to associate this finds to clinical signs. Thirty dogs from an endemic visceral leishmaniasis area and positive diagnose for CVL were selected for the study. Five asymptomatics dogs, negative for Leishmania were included as a fourth group. Clinically normal skin samples were collected from the six different sites by punch biopsy: upper part of the muzzle, ear, thorax, abdomen, forelimb and mucocutaneous junction. Immunohistochemistry detection of Leishmania was performed in all skin biopsy specimens and polymerase chain reaction (PCR) was performed in samples that were Leishmania-negative by immunohistochemistry. Weight loss (95%), lymphadenomegaly (55%) and pale mucous membrane (30%) were the main clinical signs observed. The most frequent skin abnormalities were alopecia and desquamation (90%), ulcerative dermatitis (60%), onychogryphosis (50%) and hyperpigmentation (40%). The immunohistochemistry demonstrated 100% of positivity in all skin samples of symptomatics dogs with skin lesions, independing on the region. Symptomatics dogs without skin lesions showed a lower positivity percentage, 40% and 30% depending on the region and asymptomatics dogs showed 30% and 20%. All regions from group 4 showed negative results. PCR showed positivity rates higher when compared to immunohistochemistry (P< 0,05) for the forelimb region from symptomatics dogs without skin lesions. These findings demonstrated that clinically normal skin of dogs from endemic area have parasites independently of clinical signs. / Mestre

Orientador: Flávio Quaresma Moutinho / Banca: Maria Cecília Rui Luvizotto / Banca: Noeme Sousa Rocha / Banca: Denise Saretta Schwartz / Banca: Mara Regina Stipp Balarin / Resumo: Constituiu objetivo desta pesquisa avaliar experimentalmente os efeitos decorrentes do tratamento de cães naturalmente infectados por Leishmania spp., com anfotericina b em associação ao alopurinol e prednisona, avaliando as lesões hepática e renal, e principalmente a eficácia deste protocolo para o controle da doença por meio da sorologia, pesquisa de parasitos, e manifestações clínicas. Para tanto, foram utilizados 20 cães adultos, machos e fêmeas, soropositivos pelo teste ELISA. Todos os cães foram tratados com anfotericina b na dose de 0,5 mg/kg a cada 3 dias durante 16 aplicações, associado ao alopurinol na dose de 10 mg/kg/12horas durante 18 meses e prednisona 0,5 mg/kg/24 horas durante 8 semanas. O experimento foi realizado durante 18 meses, sendo que as variáveis foram analisadas em momentos diferentes. Os animais foram monitorados quanto à lesão renal e hepática por meio da concentração sérica de uréia, creatinina, aspartato aminotransferase (AST), e alanina aminotransferase (ALT) em 7 momentos: M0 - antes do tratamento, M1 - 14 dias, M2 - 28 dias, M3 - 42 dias, M4 - 56 dias, M5 - 12 meses e M6 - 18 meses. Os cães foram submetidos a exame físico rotineiro a cada 3 meses, e classificados em assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos. Da mesma forma, nos momentos supramencionados, procedeu-se à análise do proteinograma, ou seja, da concentração sérica de proteína total, albumina, globulina e relação albumina/globulina. A pesquisa de anticorpos anti-leishmania e a análise imunoistoquímica, foram realizadas - antes do início da terapia e decorridos 18 meses. A pesquisa de formas parasitárias através da avaliação citopatológica do aspirado de linfonodo, foi efetuada a cada 6 meses. O protocolo terapêutico promoveu remissão total dos sinais clínicos em quinze animais, entretanto dois cães... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The goal of this research was to experimentally assess the effects of the treatment of dogs infected by Leishmania spp., with amphotericin B associated to allopurinol and prednisone , evaluating renal and liver lesion and, mainly, the effectiveness of such protocol in controlling the disease by means of sorology, parasite detection and clinical manifestation. Twenty adult, male and female, ELISA-seropositive dogs were therefore used. All dogs were treated with 16 administrations of amphotericin B, each dosed at 0.5 mg/kg and given in 3-day intervals, associated to allopurinol dosed at 10 mg/kg/12 hours for 18 months and prednisone dosed at 0,5 mg/kg/24 hours for 8 weeks. The experiment was carried out for 18 months and the variables analysed at distinct times. All animals were monitored in respect of renal and liver lesion through their serum concentrations of urea, creatinine, aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase in 7 moments: M0 - before treatment, M1 - 14 days, M2 - 28 days, M3 - 42 days, M4 - 56 days, M5 - 12 months and M6 - 18 months. All dogs were submitted to routine physical examination every 3 months and classified as asymptomatic, oligosymptomatic and symptomatic. Likewise, at the same moments proteinogram analysis was also carried out using serum concentration of total protein, albumin, globulin and albumin/globulin ratio. Antileishmania antibody detection and immunohistochemical analysis were carried out at 2 times - before the therapy and 18 months after its start. Every 6 months a cytopathological evaluation of the lymphoid aspirate was carried out in search of parasitic bodies. The therapeutic protocol promoted complete remission of clinical signals in fifteen animals, however two dogs showed relapse and three came to die. Amphotericin B immunomodulatory effect was demonstrated through seroconversion and proteinogram... (Complete abstract, click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-07Bitstream added on 2014-06-13T19:01:38Z : No. of bitstreams: 1 nogueira_fs_dr_botfmvz.pdf: 613808 bytes, checksum: 53835c4f383e76a5d3d5fb8ba35f88b5 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Constituiu objetivo desta pesquisa avaliar experimentalmente os efeitos decorrentes do tratamento de cães naturalmente infectados por Leishmania spp., com anfotericina b em associação ao alopurinol e prednisona, avaliando as lesões hepática e renal, e principalmente a eficácia deste protocolo para o controle da doença por meio da sorologia, pesquisa de parasitos, e manifestações clínicas. Para tanto, foram utilizados 20 cães adultos, machos e fêmeas, soropositivos pelo teste ELISA. Todos os cães foram tratados com anfotericina b na dose de 0,5 mg/kg a cada 3 dias durante 16 aplicações, associado ao alopurinol na dose de 10 mg/kg/12horas durante 18 meses e prednisona 0,5 mg/kg/24 horas durante 8 semanas. O experimento foi realizado durante 18 meses, sendo que as variáveis foram analisadas em momentos diferentes. Os animais foram monitorados quanto à lesão renal e hepática por meio da concentração sérica de uréia, creatinina, aspartato aminotransferase (AST), e alanina aminotransferase (ALT) em 7 momentos: M0 - antes do tratamento, M1 - 14 dias, M2 - 28 dias, M3 - 42 dias, M4 - 56 dias, M5 - 12 meses e M6 - 18 meses. Os cães foram submetidos a exame físico rotineiro a cada 3 meses, e classificados em assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos. Da mesma forma, nos momentos supramencionados, procedeu-se à análise do proteinograma, ou seja, da concentração sérica de proteína total, albumina, globulina e relação albumina/globulina. A pesquisa de anticorpos anti-leishmania e a análise imunoistoquímica, foram realizadas - antes do início da terapia e decorridos 18 meses. A pesquisa de formas parasitárias através da avaliação citopatológica do aspirado de linfonodo, foi efetuada a cada 6 meses. O protocolo terapêutico promoveu remissão total dos sinais clínicos em quinze animais, entretanto dois cães... / The goal of this research was to experimentally assess the effects of the treatment of dogs infected by Leishmania spp., with amphotericin B associated to allopurinol and prednisone , evaluating renal and liver lesion and, mainly, the effectiveness of such protocol in controlling the disease by means of sorology, parasite detection and clinical manifestation. Twenty adult, male and female, ELISA-seropositive dogs were therefore used. All dogs were treated with 16 administrations of amphotericin B, each dosed at 0.5 mg/kg and given in 3-day intervals, associated to allopurinol dosed at 10 mg/kg/12 hours for 18 months and prednisone dosed at 0,5 mg/kg/24 hours for 8 weeks. The experiment was carried out for 18 months and the variables analysed at distinct times. All animals were monitored in respect of renal and liver lesion through their serum concentrations of urea, creatinine, aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase in 7 moments: M0 - before treatment, M1 - 14 days, M2 - 28 days, M3 - 42 days, M4 - 56 days, M5 - 12 months and M6 - 18 months. All dogs were submitted to routine physical examination every 3 months and classified as asymptomatic, oligosymptomatic and symptomatic. Likewise, at the same moments proteinogram analysis was also carried out using serum concentration of total protein, albumin, globulin and albumin/globulin ratio. Antileishmania antibody detection and immunohistochemical analysis were carried out at 2 times - before the therapy and 18 months after its start. Every 6 months a cytopathological evaluation of the lymphoid aspirate was carried out in search of parasitic bodies. The therapeutic protocol promoted complete remission of clinical signals in fifteen animals, however two dogs showed relapse and three came to die. Amphotericin B immunomodulatory effect was demonstrated through seroconversion and proteinogram... (Complete abstract, click electronic access below)

Submitted by Milena Dias (milena.dias@ufpe.br) on 2015-03-12T17:45:21Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Rafael Medeiros.pdf: 841724 bytes, checksum: 770fac09975639de3352fde1d0ea2ec3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T17:45:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Rafael Medeiros.pdf: 841724 bytes, checksum: 770fac09975639de3352fde1d0ea2ec3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CAPES / As Leishmanioses são uma antropozoonose com ampla distribuição geográfica e ocorrência em torno de 88 países. Na Leishmaniose visceral americana (LVA), os cães domésticos são considerados os principais reservatórios da L. infantum no ambiente domiciliar. Diferentes perfis epidemiológicos da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) têm sido caracterizados pela presença de casos humanos em áreas de colonizações antigas, sugerindo uma antropozoonose entre os animais domésticos por demonstrarem lesões tegumentares causadas pela Leishmania (Vianna) braziliensis. O diagnóstico das leishmanioses pode ser realizado através de métodos clínicos, epidemiológicos, parasitológicos, imunológicos e moleculares. Em áreas endêmicas o diagnóstico clínico e epidemiológico dessas zoonoses é dificultado pela similaridade clínica com outras doenças, tornando a utilização de exames laboratoriais de suma importância para confirmação diagnóstica. Em virtude da necessidade de diagnóstico especifico das leishmanioses na espécie canina, este trabalho tem como objetivo a utilização da PCR-RFLP, tendo como alvo o espaçador interno transcrito (ITS-1), para diferenciação das espécies de Leishmania em cães provenientes da Região Metropolitana do Recife. Foram coletadas 40 amostras de soro e medula de cães, 30 machos e 10 fêmeas, com idades entre 2 e 7 anos , que apresentaram suspeita clinica de leishmaniose quando atendidos no Hospital Veterinário da UFRPE. Foram realizados os testes diagnósticos de exame direto em medula e Reação indireta de imunoflorescência tanto para LTA quanto LVA. Além disso foi realizado a PCR-RFLP nas amostras de soro e urina para a pesquisa de L. infantum e L. (viannia) braziliensis. Dos 40 cães pesquisados 23 foram positivos para L.infantum e 17 foram negativos para as duas espécies pesquisadas. Quando comparado com os testes diagnósticos convencionais , 3 dos 23 cães foram positivos apenas na técnica molecular. Portanto, a ITS1-PCR RFLP pode ser uma importante ferramenta para o diagnostico e caracterização da leishmaniose canina em uma determinada região.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-28T11:31:47Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 787388 bytes, checksum: e4427091e3439191bcebe29096b6b773 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-28T11:31:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 787388 bytes, checksum: e4427091e3439191bcebe29096b6b773 (MD5) Previous issue date: 2001-12-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As leishmanioses representam, na atualidade, uma das mais importantes zoonoses do mundo. O estudo epidemiológico destas doenças torna-se importante, pois nosso país apresenta quadros graves de epidemias e endemias. Adicionalmente, em algumas áreas, estas doenças apresentam caráter emergente. O presente trabalho pretendeu avaliar a existência de condições propícias para a manutenção e transmissão da leishmaniose tegumentar na área urbana do município de Viçosa-MG, assim como, realizar a identificação e a descrição do perfil de ocorrência da doença no município. Foi realizada análise de banco de dados, constituído a partir do inquérito sorológico canino e da aplicação de questionário individualizado, contendo informações demográficas e sobre hábitos do animal, permitindo assim, caracterizar a distribuição da infecção canina no município. Foi encontrada taxa de prevalência da infecção canina de 9,9%, a qual variou segundo os distritos e bairros analisados. Não foram encontradas associações entre infecção canina e as variáveis sexo, idade, raça e tipo de pelagem do animal. Entretanto, cães com o hábito de “irem à rua sozinho” apresentaram maior chance de infecção, o que pode significar fator de risco para dispersão da doença pelo município e regiões circunvizinhas. Foi encontrado um alto percentual de cães assintomáticos reforçando a importância de animais aparentemente sadios, porém infectados, que servem como fonte de infecção para vetores e destes para o ser humano. Adicionalmente, foram analisadas as fichas de notificação de leishmaniose tegumentar humana existentes na Secretaria Municipal de Saúde de Viçosa, tendo sido observada a existência de casos autóctones humanos nas áreas urbana e rural. Estes achados associados à descrição prévia dos vetores Lutzomia whitmani e L. intermedia corroboram a hipótese de transmissão da leishmaniose tegumentar humana e canina no município de Viçosa. O fato de terem sido identificados casos autóctones humanos e caninos na área urbana sugere a existência de um processo de urbanização da leishmaniose tegumentar nesta área. Os dados obtidos denotam a importância desta zoonose no município de Viçosa, indicando que medidas de prevenção e controle da infecção canina devem ser implementadas, para que os níveis de prevalência humana e animal não aumentem. / Leishmaniasis represents, in the present time, one of the most important zoonose of the world. The epidemiological study of these illnesses becomes important because Brazil presents serious pictures of epidemics and endemic diseases. Additionally, in some areas, these illnesses present emergent character. The present work intended to evaluate the existence of propitious conditions for the maintenance and transmission of cutaneous leishmaniose in the urban area of Viçosa city, Minas Gerais state, as well as, to carry through the identification and the description of the ilness occurrence profile in the city. A data base was constituted from a canine serological inquiry and the application of a questionnaire contend demographic information and on habits of the animal. The prevalence of the canine infection was 9.9%. Associations between canine infection and the variables sex, age, race and type of coat of the animal had not been found. However, dogs with the habit “go to street alone” had presented greater infection probability, what it can mean a risk factor for ilness dispersion in the city and surrounding regions. A high percentage of dogs without signs of the disease was found, strengthening the importance of aparently healthy animals that can be source of infection for vectors and from these to human being. Additionally, the cases of human cutaneous leishmaniasis notificated to the Municipal Secretariat of Health of Viçosa had been analyzed, having been observed the existence of human autochthonous cases in the urban and rural areas. These findings, associates to the previous description of the vectors Lutzomia intermedia and L. whitmani, corroborate the hypothesis of human and canine cutaneous leishmaniasis transmission in Viçosa city. The human and canine autochthonous cases, in the urban area, suggest a urbanization process of the disease in this area. These datas denote the importance of this zoonose in the Viçosa city and actions to prevent and control the disease must be implemented, so that the human and animal prevalence levels do not magnify.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nas Américas, a leishmaniose visceral (LV) experimenta um processo de urbanização e o cão doméstico é considerado o principal reservatório da doença neste cenário, embora seu papel no ciclo de transmissão não esteja totalmente explicado. Este estudo teve como objetivo investigar, por meio da análise de dados espaciais e imagens de sensoriamento remoto, a relação de fatores ambientais com a ocorrência de infecção canina por Leishmania chagasi e sua correlação espacial com a doença humana na cidade de Teresina (Piauí - Brasil), onde foi relatada a primeira epidemia urbana de LV no Brasil. Os resultados são apresentados na forma de dois manuscritos, nos quais são utilizados dados georreferenciados obtidos por meio de um inquérito sorológico canino realizado durante o ano de 2011, em diferentes bairros com transmissão moderada ou intensa. No primeiro, a regressão logística multinível foi utilizada para correlacionar a prevalência da infecção canina com variáveis ambientais de quadrículas de 900m2 (30mx30m) onde os domicílios estavam localizados, ajustando para as características individuais dos cães (sexo, idade e raça) e da residência. Participaram desta análise 717 cães distribuídos em 494 domicílios e 396 quadrículas. Um percentual >16,5% da área da quadrícula coberta por pavimentação clara (ruas de terra ou asfalto antigo) foi a única variável ambiental associada com a infecção canina por L. chagasi (Odds ratio [OR] = 2,00, intervalo de 95% de confiança [IC95%]: 1,22 - 3,26). Estas áreas provavelmente correspondem àquelas mais pobres e com pior infraestrutura urbana, sugerindo a ocorrência de um padrão de transmissão intra-urbano similar aos padrões rurais e peri-urbanos da LV. No segundo manuscrito, a partir da análise hierárquica do vizinho mais próximo foi verificada a presença de sete clusters de maior concentração de cães soropositivos em relação aos soro negativos em áreas menos urbanizadas e com vegetação pouco densa. Participaram desta análise 322 cães distribuídos em cinco bairros. A relação espacial entre os caninos soropositivos e os casos humanos foi investigada através do método da distância média entre os pontos e analisada por meio do teste t. Foi encontrada uma maior proximidade de casos humanos em relação a cães soropositivos quando comparada à distância em relação aos soro negativos, sugerindo a existência de uma relação espacial entre a LV humana e a soropositividade canina. Os resultados contribuem para uma maior compreensão sobre a dinâmica da doença em meio urbano além de fornecer informações úteis para a prevenção e controle da LV em seres humanos. / In the Americas, visceral leishmaniasis (VL) undergoes an active process of urbanization and the domestic dog is considered to be the main reservoir of the disease in this scenario, although its role in the transmission cycle is not fully explained. This study aimed to investigate, by spatial data analysis and remote sensing images, the association between environmental factors with the occurrence of canine infection by Leishmania chagasi and their spatial correlation with the human disease in the city of Teresina (Piauí-Brazil), where first urban epidemic of LV in Brazil was reported. The results are presented in the form of two manuscripts, which used georeferenced data obtained through a serological canine survey carried out during 2011 canine, in localities with moderate or severe transmission. In the first manuscript, the multilevel logistic regression approach was used to correlate the prevalence of canine infection with the environmental variables of grids with 900m2 (30mx30m) where the residence was located, adjusting to the dogs' individual characteristics (gender, age and race) and characteristics of the residences. The environmental analysis was performed with 717 dogs distributed in 494 households and 396 grids. The percentage of the area of grid covered by clear pavement (bare soil or old asphalted streets) >16.5% was the only environmental variable associated with canine infection by L. chagasi (Odds ratio [OR] = 2.00, 95% confidence interval [95% CI]: 1.22 - 3.26). These probably correspond to impoverished areas with inadequate infrastructure suggesting the occurrence of an urban cycle similar to those observed in rural and periurban areas. In the second manuscript, by the hierarchical analysis of nearest neighbor, were checked seven clusters of highest concentration of seropositve dogs in relation to seronegative in less urbanized areas with sparse vegetation. This analysis was performed with 322 dogs distributed in five boroughs. The spatial relationship between seropositive dogs and human cases was investigated by the method of average distance between points and was analyzed by t-test. The human cases were closer to the seropositive dogs when compared to the distance from the seronegative ones, suggesting the existence of a spatial relationship between the human LV and canine infection. The results contribute to a greater understanding of the dynamics of urban disease and also provide useful information for the prevention and control of visceral leishmaniasis in humans.

Este estudo avaliou a imunidade humoral e celular em cães naturalmente infectados com L. (L.) chagasi correlacionando com a transmissibilidade para o vetor. Soros e biópsias de baço, linfonodo e pele foram coletados de 120 cães provenientes do Centro de Controle de Zoonoses do município de Araçatuba, São Paulo, Brasil. Os soros foram processados por ELISA para detecção de IgG, IgG1, IgG2 e IgE; e as biópsias foram processadas por técnicas histológicas usuais coradas pelo HE e imunoistoquímica para a detecção de parasito, macrófago e células T CD3. De acordo com os sinais clínicos, 65/120 (54%) cães foram classificados como sintomáticos e 55/120 (46%) como assintomáticos. O diagnóstico parasitológico foi confirmado em 71% dos sintomáticos e em 40% dos assintomáticos. A correlação dos sinais clínicos com parasitismo mostrou que a carga parasitária estava diretamente associada com cães sintomáticos (p<0.05). Em relação aos anticorpos específicos anti-L.(L.)chagasi, cães de área endêmica com diagnóstico parasitológico positivo mostraram maiores níveis de IgG total comparado com ambos os controles (p<0.05), sem diferença entre cães sintomáticos e assintomáticos. IgG1 esteve presente em baixos níveis e foi mais intensa no grupo sintomático parasito-positivo (p<0.05). Níveis mais elevados foram observados para IgG2 em cães de área endêmica (p<0.05), mas sem correlação com o parasitismo e sinais clínicos. IgE também esteve presente em baixos níveis, mas mostrou diferenças entre cães de área endêmica e cães de área não endêmica; e cães com diagnóstico parasitológico positivo mostrou níveis mais elevados que cães com diagnóstico parasitológico negativo (p<0.05). Histopatologicamente, linfonodos mostraram hiperplasia e hipertrofia de macrófagos na área medular e em muitos casos linfadenite granulomatosa. Na polpa branca do baço, hiperplasia folicular foi observada; e a polpa vermelha mostrou granulomas. As lesões de pele foram caracterizadas por infiltrado inflamatório crônico na derme formado por macrófagos, linfócitos e plasmócitos; variando de discreto a intenso, assim como de focal a difuso. Foi evidente a presença de granulomas epitelióides na pele de alguns animais. Imunoistoquímica mostrou presença de células marcadas pelo anticorpo anti-macrófago e anti-CD3 em 100% dos baços e linfonodos variando de intensidade entre discreto e intenso. Na pele, macrófagos foram positivos em 90% e células CD3 em 39% dos casos. Houve associação direta entre baixa expressão de células CD3 e alto parasitismo na pele. Animais assintomáticos mostraram baixa expressão de macrófagos junto com baixo parasitismo na pele. Em relação ao xenodiagnóstico, no 4o dia depois da alimentação, as fêmeas dos vetores foram dissecadas e examinadas para observação de parasitos no intestino. Formas promastigotas foram observadas em 27% das fêmeas que se alimentaram em cães sintomáticos e em 42% das fêmeas que se alimentaram em cães assintomáticos. A técnica da PCR foi também utilizada para avaliar as fêmeas positivas depois do xenodiagnóstico. DNA de Leishmania foi detectado em 24% das fêmeas que se alimentaram em cães sintomáticos e em 34% das fêmeas que se alimentaram em cães assintomáticos. Os dados mostraram que a imunidade humoral e celular não teve correlação direta com as formas clínicas de leishmaniose canina. A alta porcentagem de vetores infectados na alimentação em cães assintomáticos mostra a importância destes animais na transmissibilidade para o vetor. / These studies evaluate humoral and cellular immunity in dogs naturally infected with L. (L.) chagasi correlating to the transmissibility to the vector. Serum and biopsy from spleen, lymph node and skin were collected from 120 dogs referred to the Center of Zoonosis Control of Araçatuba city, São Paulo, Brazil. The sera were processed by ELISA for IgG, IgG1, IgG2 and IgE detection; and the biopsies were processed usual histological techniques stained by HE and immunohistochemistry for parasite, macrophage and T CD3 cells detection. According to the clinical signs, 65/120 (54%) dogs were classified as symptomatic and 55/120 (46%) as asymptomatic. Parasitological diagnosis was confirmed in 71% of symptomatic and in 40% of asymptomatic dogs. The correlation of clinical signs and parasitism showed that parasite burden was directly associated with symptomatic dogs (p<0.05). Concerning to L.(L.)chagasi-specific antibodies, dogs from the endemic area with positive parasitological diagnosis showed high levels of total IgG compared to both controls (p<0.05), without difference between symptomatic and asymptomatic dogs. IgG1 was present at low levels and was more intense in the parasite-positive symptomatic group (p<0.05). More elevated levels were observed for IgG2 in dogs from endemic area (p<0.05), but with no correlation to parasitism and clinical signs. IgE was also present at low levels, but showed differences between dogs from non-endemic and endemic areas; and dogs with positive parasitological diagnosis showed higher levels than dogs with negative parasitological diagnosis (p<0.05). Histopathologically, lymph nodes showed macrophage hyperplasia and hypertrophy in the medullary area and in many cases granulomatous lymphadenitis. In the white pulp of the spleen, follicular hyperplasia was observed; and the red pulp showed granulomas. The skin lesions were characterized by dermal chronic inflammatory infiltrate formed by macrophages, lymphocytes and plasma cells; it varied between descreet to intense, as well as focal to diffuse. The epithelioid granulomas were evident in the skin of some animals. Immunohistochemistry showed presence of labeled cells by anti-macrophage and anti-CD3+ antibodies in 100% of spleen and lymph nodes varying the intensity between mild to intense. Macrophage was positive in 90% of the skin and CD3 cells in 39%. There was a direct association between lower CD3 cells expression and higher parasite burden in the skin. Asymptomatic animals showed lower macrophage expression together with lower parasitism in the skin. Concerning to the xenodiagnosis, on the 4th day after the blood meal, female flies were dissected and examined for visible parasites in the gut. Promastigotes forms were observed in 27% of female which fed in symptomatic dogs and in 42% of female which fed in asymptomatic dogs. PCR technique was also used to evaluate the positive females after the xenodiagnosis. Leishmania DNA was detected in 24% of female which fed in symptomatic dogs and in 34% of female which fed in asymptomatic dogs. The data showed that the humoral and cellular immune response not has direct correlation to the clinical form of canine leishmaniasis. The high percentage of sand flies female infected by feeding in the asymptomatic dogs show the importance these animals on the parasite transmissibility to the vector.

Este estudo avaliou a imunidade humoral e celular em cães naturalmente infectados com L. (L.) chagasi correlacionando com a transmissibilidade para o vetor. Soros e biópsias de baço, linfonodo e pele foram coletados de 120 cães provenientes do Centro de Controle de Zoonoses do município de Araçatuba, São Paulo, Brasil. Os soros foram processados por ELISA para detecção de IgG, IgG1, IgG2 e IgE; e as biópsias foram processadas por técnicas histológicas usuais coradas pelo HE e imunoistoquímica para a detecção de parasito, macrófago e células T CD3. De acordo com os sinais clínicos, 65/120 (54%) cães foram classificados como sintomáticos e 55/120 (46%) como assintomáticos. O diagnóstico parasitológico foi confirmado em 71% dos sintomáticos e em 40% dos assintomáticos. A correlação dos sinais clínicos com parasitismo mostrou que a carga parasitária estava diretamente associada com cães sintomáticos (p<0.05). Em relação aos anticorpos específicos anti-L.(L.)chagasi, cães de área endêmica com diagnóstico parasitológico positivo mostraram maiores níveis de IgG total comparado com ambos os controles (p<0.05), sem diferença entre cães sintomáticos e assintomáticos. IgG1 esteve presente em baixos níveis e foi mais intensa no grupo sintomático parasito-positivo (p<0.05). Níveis mais elevados foram observados para IgG2 em cães de área endêmica (p<0.05), mas sem correlação com o parasitismo e sinais clínicos. IgE também esteve presente em baixos níveis, mas mostrou diferenças entre cães de área endêmica e cães de área não endêmica; e cães com diagnóstico parasitológico positivo mostrou níveis mais elevados que cães com diagnóstico parasitológico negativo (p<0.05). Histopatologicamente, linfonodos mostraram hiperplasia e hipertrofia de macrófagos na área medular e em muitos casos linfadenite granulomatosa. Na polpa branca do baço, hiperplasia folicular foi observada; e a polpa vermelha mostrou granulomas. As lesões de pele foram caracterizadas por infiltrado inflamatório crônico na derme formado por macrófagos, linfócitos e plasmócitos; variando de discreto a intenso, assim como de focal a difuso. Foi evidente a presença de granulomas epitelióides na pele de alguns animais. Imunoistoquímica mostrou presença de células marcadas pelo anticorpo anti-macrófago e anti-CD3 em 100% dos baços e linfonodos variando de intensidade entre discreto e intenso. Na pele, macrófagos foram positivos em 90% e células CD3 em 39% dos casos. Houve associação direta entre baixa expressão de células CD3 e alto parasitismo na pele. Animais assintomáticos mostraram baixa expressão de macrófagos junto com baixo parasitismo na pele. Em relação ao xenodiagnóstico, no 4o dia depois da alimentação, as fêmeas dos vetores foram dissecadas e examinadas para observação de parasitos no intestino. Formas promastigotas foram observadas em 27% das fêmeas que se alimentaram em cães sintomáticos e em 42% das fêmeas que se alimentaram em cães assintomáticos. A técnica da PCR foi também utilizada para avaliar as fêmeas positivas depois do xenodiagnóstico. DNA de Leishmania foi detectado em 24% das fêmeas que se alimentaram em cães sintomáticos e em 34% das fêmeas que se alimentaram em cães assintomáticos. Os dados mostraram que a imunidade humoral e celular não teve correlação direta com as formas clínicas de leishmaniose canina. A alta porcentagem de vetores infectados na alimentação em cães assintomáticos mostra a importância destes animais na transmissibilidade para o vetor. / These studies evaluate humoral and cellular immunity in dogs naturally infected with L. (L.) chagasi correlating to the transmissibility to the vector. Serum and biopsy from spleen, lymph node and skin were collected from 120 dogs referred to the Center of Zoonosis Control of Araçatuba city, São Paulo, Brazil. The sera were processed by ELISA for IgG, IgG1, IgG2 and IgE detection; and the biopsies were processed usual histological techniques stained by HE and immunohistochemistry for parasite, macrophage and T CD3 cells detection. According to the clinical signs, 65/120 (54%) dogs were classified as symptomatic and 55/120 (46%) as asymptomatic. Parasitological diagnosis was confirmed in 71% of symptomatic and in 40% of asymptomatic dogs. The correlation of clinical signs and parasitism showed that parasite burden was directly associated with symptomatic dogs (p<0.05). Concerning to L.(L.)chagasi-specific antibodies, dogs from the endemic area with positive parasitological diagnosis showed high levels of total IgG compared to both controls (p<0.05), without difference between symptomatic and asymptomatic dogs. IgG1 was present at low levels and was more intense in the parasite-positive symptomatic group (p<0.05). More elevated levels were observed for IgG2 in dogs from endemic area (p<0.05), but with no correlation to parasitism and clinical signs. IgE was also present at low levels, but showed differences between dogs from non-endemic and endemic areas; and dogs with positive parasitological diagnosis showed higher levels than dogs with negative parasitological diagnosis (p<0.05). Histopathologically, lymph nodes showed macrophage hyperplasia and hypertrophy in the medullary area and in many cases granulomatous lymphadenitis. In the white pulp of the spleen, follicular hyperplasia was observed; and the red pulp showed granulomas. The skin lesions were characterized by dermal chronic inflammatory infiltrate formed by macrophages, lymphocytes and plasma cells; it varied between descreet to intense, as well as focal to diffuse. The epithelioid granulomas were evident in the skin of some animals. Immunohistochemistry showed presence of labeled cells by anti-macrophage and anti-CD3+ antibodies in 100% of spleen and lymph nodes varying the intensity between mild to intense. Macrophage was positive in 90% of the skin and CD3 cells in 39%. There was a direct association between lower CD3 cells expression and higher parasite burden in the skin. Asymptomatic animals showed lower macrophage expression together with lower parasitism in the skin. Concerning to the xenodiagnosis, on the 4th day after the blood meal, female flies were dissected and examined for visible parasites in the gut. Promastigotes forms were observed in 27% of female which fed in symptomatic dogs and in 42% of female which fed in asymptomatic dogs. PCR technique was also used to evaluate the positive females after the xenodiagnosis. Leishmania DNA was detected in 24% of female which fed in symptomatic dogs and in 34% of female which fed in asymptomatic dogs. The data showed that the humoral and cellular immune response not has direct correlation to the clinical form of canine leishmaniasis. The high percentage of sand flies female infected by feeding in the asymptomatic dogs show the importance these animals on the parasite transmissibility to the vector.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-22T11:44:35Z No. of bitstreams: 1 cristiane-marques-de-souza.pdf: 1147113 bytes, checksum: 60995fd9938a018115dd7df1eec2d052 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-22T11:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cristiane-marques-de-souza.pdf: 1147113 bytes, checksum: 60995fd9938a018115dd7df1eec2d052 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A leishmaniose visceral (LV) causada pelo parasito Leishmania chagasié uma doença severa que ocorre em seres humanos sendo prevalenteem vários países, inclusive no Brasil. Trata-se da forma com maior potencial de letalidade. Os cães são importantes reservatórios do parasito, portanto o diagnóstico canino é essencialpara os programas de vigilância da LV. Neste trabalho é relatado a expressão, o isolamento e a purificação de dois antígenos recombinantes protéicos de Leishmania chagasi, Lc9 e Lc13, produzidos em Escherichia coli visando um imuno-ensaio para o diagnóstico desta enfermidade. Inicialmente, os plasmídeos de E.coli contendo os gens inseridos e relacionados a ambas as proteínas foram analisados por eletroforese de agarose. A proteína Lc9, por conter um marcador de seis histidinas, foi purificada por cromatografia de metal imobilizado (Ni) seguido porcromatografia de exclusão e peneiração molecular em Superdex 200. A Lc13 foi purificada, somente, por cromatografia de perfusão de troca aniônica em Poros HQ. As preparações protéicas purificadas tiveram suas homogeneidades verificadas por eletroforese desnaturante (SDS-PAGE), focalização isoelétrica e western blot. Um pI estimado de 6,43 e de 6,42 foi observado paraLc9 e Lc13, respectivamente. A determinação de peso molecular (PM) feita por SDS-PAGE-10% indicou valores de 44000 (Lc9) e 88000 (Lc13), enquanto por cromatografia de exclusão e filtração molecular em Superdex 200, os valores estimados foram de 550.000 (Lc9) e 282.000 (Lc13). Estes valores estimados de PM sugerem que ambas macromoléculas apresentam-se em seu estado nativo na forma multimérica, sendo ambas constituídas por cadeias polipeptídicasidênticas. As diferentes detecções protéicas depois do SDS-PAGE de Lc9 e Lc13 purificadas mostraram que a principal banda imuno-revelada corresponde a principal banda revelada como coomassie brilliant blueR-350 por igual metodologia. Concluindo-se então que ambas correspondem ao principal antígeno presente em cada uma das duas preparações protéicas (Lc9 e Lc13) purificadas. Para o desenvolvimento de um ELISA indireto, relacionado ao diagnóstico da leismaniose visceral canina, os antígenos, Lc9 e Lc13 e o conjugado IgG – peroxidase tiveram as faixas de concentrações selecionadas para uso no referido ensaio sorológico. Segundo a mesma metodologia, o antígeno Lc9 apresentou melhores resultados que o antígeno Lc13 (Lc9: sensibilidade 100%; especificidade 95% e Lc13: sensibilidade 96%; especificidade 92%). Os resultados obtidos propõem o uso das proteínas recombinantes Lc9 e Lc13, principalmente a primeira, num imuno-ensaio baseado em ELISA para o aperfeiçoamento do diagnóstico da leishmaniose. / The visceral leishmaniasis (VL) caused by Leishmania chagasiis a relevant human disease prevalent in many countries, including Brazil. This form has the greatest potential for lethality. Dogs are important reservoir of the parasite, thus diagnosis of canine infections is essential for VL surveillance programs. This work is related to the expression, isolation and purification of two recombinant protein antigens of Leishmania chagasi, Lc9 and Lc13, produced in Escherichia coliaiming a diagnostic illness immune assay. Initially, the E. coliplasmids containing the inserted genes related to both proteins were analyzed in agarose gel electrophoresis. The protein Lc9 containing a hexapeptide histidine tag was purified by immobilized metal (Ni) affinity chromatography followed by sieving exclusion chromatography in Superdex 200. The Lc13 was only purified by anion exchange perfusion column chromatography onto Poros HQ. The purified protein preparations had their homogeneities ascertained by denaturing gel electrophoresis (SDS-PAGE), isoelectric focusing and western blot. Estimated pI of 6.43 and 6.42 were observed for Lc9and Lc13, respectively. Molecular weights (MW) determined by SDS-PAGE-10% showed values of 44000 (Lc9) and 88000 (Lc13), while values of 550000 (Lc9) and 282000 (Lc13), were obtained by Superdex- 200 gel filtration. These estimated MW values suggested that both macromolecules in native state are multimeric proteins being formed by identical polypeptide chains. Different protein detections after SDS-PAGE of purified Lc9 and Lc13 showed that the majorimmune-revealed band correspond to the major coomassie brilliant blue R-350 revealed bands. So it concluded that both correspond to the main antigen present in each purified protein preparation (Lc9 and Lc13). For the development of an indirect ELISA for canine visceral leismaniosis diagnosis the antigens Lc9 and Lc13 as well IgG-peroxidase conjugate suitable concentrations were selected for the use in the related serologic assay. According to mentioned serologicalassay the antigen Lc9 gave better results than the antigen Lc13 (Lc9: sensitivity 100%; specificity 95% and Lc13: sensitivity 96%; specificity 92%). These results suggest the use of Lc9 and Lc13 antigens, preferably the former, in immune assays based on ELISA for the improvementof the leismaniasis diagnostic.