Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-14T17:17:44Z No. of bitstreams: 1 dissertação Fernanda Alvarenga Cardoso 1.pdf: 1458584 bytes, checksum: a3070865cab7509b6900f5f36ab2b623 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-14T17:17:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertação Fernanda Alvarenga Cardoso 1.pdf: 1458584 bytes, checksum: a3070865cab7509b6900f5f36ab2b623 (MD5) Previous issue date: 2013 / Nas últimas décadas, a reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo utilizada para o diagnóstico da leishmaniose visceral (LV) com diferentes objetivos: o diagnóstico da infecção, da doença e o controle de cura. Para utilização em larga escala, a etapa de eletroforese para detecção dos produtos amplificados na PCR, torna a técnica complexa e onerosa. A PCR-ELISA representa uma alternativa de detecção do produto amplificado por PCR através de um ensaio imunoenzimático (ELISA). Esta técnica é capaz de conferir maior sensibilidade e rapidez para a análise de grandes números de amostras clínicas com o uso de equipamentos utilizados para processamento de ELISA e, portanto, permite realizar PCR para fins de diagnóstico em laboratórios de média complexidade. Assim, este estudo objetivou desenvolver e validar o método de detecção colorimétrica dos produtos de amplificação gerados pela reação de PCR para o diagnóstico da LV em amostras de sangue periférico.O método de PCR-ELISA foi desenvolvido para detecção de fragmento de DNA do cinetoplasto (kDNA), complexo Donovani-específico. Utilizando-se cepas referências de Leishmania em cultivo e de painel de amostras de sangue periférico humano de 11 indivíduos não infectados, moradores de área endêmica e 14 casos de LV, caracterizadas clínica e parasitologicamente, determinou-se o limite de detecção da reação, medidas de precisão (repetibilidade e reprodutibilidade) e limite entre positivo e negativo (cut-off). A avaliação do desempenho do ensaio foi realizada com amostras de sangue periférico de 105 pacientes portadores de LV, 25 pacientes portadores da co-infecção Leishmania/HIV e de 73 indivíduos moradores de área endêmica para a LV. Foi desenvolvido ainda um ensaio de PCR-ELISA para detecção do DNA amplificado do gene humano ACTB, para uso como controle do processo de extração de DNA e amplificação por PCR das amostras clínicas. O ensaio PCR-ELISA kDNA desenvolvido apresentou limite de detecção de 1 parasito/mL de sangue e 0,07fg/µL de DNA de L. (L.) infantum, sensibilidade de 100% (IC 95%: 97,1 a 100%) e especificidade de 95% (IC 95%: 83,5 a 98,6%). Todos os indivíduos assintomáticos de área endêmica, com positividade por outras técnicas diagnósticas, foram também positivos pela PCR-ELISA. Todas as amostras foram testadas satisfatoriamente para o ensaio de PCR-ELISA ACTB. O ensaio de PCR-ELISA kDNA, desenvolvido e validado neste estudo, apresenta simplicidade metodológica e operacional, permite interpretação objetiva da amplificação por PCR do DNA de Leishmania do complexo Donovani e desempenho adequado no diagnóstico da LV em laboratórios de referência. / In recent decades, the polymerase chain reaction (PCR) has been used for the diagnosis of visceral leishmaniasis (VL) with different goals: diagnosis of infection, disease control and cure. For large-scale use, the step of electrophoresis to detect amplified products of PCR makes this technique more complex and costly. The PCR-ELISA is an alternative for the detection of the amplified PCR product through an immunoenzymatic assay (ELISA). This technique offers higher sensitivity and speed for the analysis of large numbers of clinical specimens, using equipment widely used for processing sets of ELISA and therefore allows performing PCR for diagnostic purposes in laboratory of medium complexity. Thus, this study aimed to develop and validate the colorimetric detection method (ELISA) for amplification products generated by PCR targeting the diagnosis of VL.The method of PCR-ELISA was developed to detect a fragment of DNA of kinetoplast (kDNA) specific from Leishmania donovani complex. Using reference strains of Leishmania in cultivation and a panel of human peripheral blood samples of 11 non-infected individuals, residents of endemic area and 14 cases of VL with clinical and parasitological characterization, we determined the detection limit of the reaction, precision measurements (repeatability and reproducibility) and limit between positive and negative (cut-off). The performance of the assay was evaluated with peripheral blood samples of 105 patients with VL, 25 patients showing the co-infection Leishmania/HIV and 73 individuals living in endemic areas for VL. A PCR-ELISA assay for detection of DNA from the human ACTB gene was also developed for use as control for the process of DNA extraction and amplification by PCR of clinical samples. The PCR-ELISA kDNA assay developed showed a detection limit of 1 parasite/ml blood and 0.07 fg/µL of DNA from L. (L.) infantum. The assay showed a sensitivity of 100% (IC 95%: 97.1 to 100%) and specificity of 95% (IC 95%: 83.5 to 98.6%). All asymptomatic individuals from an endemic area, who were diagnosed for LV by other techniques, were also positive by PCR-ELISA kDNA. All samples were tested satisfactorily by PCR-ELISA ACTB assay. The PCR-ELISA kDNA assay was developed and validated in this study. It presents methodological and operational simplicity; enables objective interpretation of PCR amplification of DNA from Leishmania donovani complex and have sufficient performance for diagnosis of VL in reference laboratories.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-27Bitstream added on 2014-06-13T18:52:01Z : No. of bitstreams: 1 000749210.pdf: 1108771 bytes, checksum: 009239602ae64bc0bdbeaf4fb91f27f9 (MD5) / A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma zoonose que acomete canídeos, constituindo-se um grave problema de saúde pública, tendo em vista que é o cão a principal fonte de infecção da doença para humanos no ciclo doméstico. A proximidade do cão tem sido referenciada como um importante fator de risco para a doença. É endêmica em diversas regiões do Brasil, incluindo o Estado da Paraíba. Em Campina Grande-PB, no período de dezembro de 2011 a fevereiro de 2012 foi realizado inquérito soroepidemiológico para Leishmania spp. em cães por meio de sorologia e pesquisa do DNA do parasita pela biologia molecular, enfocando a sua distribuição geográfica e correlacionando os fatores de riscos e socioeconômicos. Dos 391 cães estudados, 33% apresentaram resultado positivo para a pesquisa de anticorpos para leishmania spp. na RIFI e 4,34% ao ELISA, e 2% para a pesquisa de DNA do parasita no sangue pela PCR. Houve diferença estatística significante para contactantes (P=0,02) e (OR=4,1). A RIFI com antígeno de L. major, mostrou-se como um bom teste confirmatório, podendo ser utilizado como contra prova do ELISA, que apresentou sensibilidade de 39,4%. A associação entre os dois testes e a co-positividade foi de apenas 52%, necessitando de outra prova confirmatória. Já para a confirmação de negatividade na RIFI, o ELISA foi considerado seguro, apresentando um índice de 96,7%. O uso da PCR de sangue total apresentou baixa sensibilidade e baixa concordância com a RIFI, não sendo indicado como teste primário e mostrou-se eficiente na contra prova. Os estudos mostram que a LVC tem-se adaptado à zona urbana, portanto de forma endêmica, concluindo-se que a diversidade de provas diagnósticas, melhora a detecção de animais positivos, aspecto excelente para o controle da LVC em determinadas áreas, além de evitar a eutanásia de cães falsos positivos / The Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is a canidae zoonosis, which infects dogs and other mammals, as humans, becoming a serious public health problem, owing the fact that dogs are the main source infection disease for human on domestic cycle. The closeness to dogs has been referenced as an important disease risk factor. This illness is endemic in several regions from Brazil, including the Paraiba state. In the period of December 2011 to February 2012, in Campina Grande, Paraiba, was conducted a seroepidemiological survey to Leishmania spp. in dogs, through serology study and research from the DNA of the parasite by the molecular biology. This study had a focus on the geographical distribution, correlating the socioeconomic and risk factors. From the 391 studied dogs, 33% showed a positive result to antibodies of Leishmania spp. by IFAT test, 4.34% by ELISA and 2% by PCR with detection of the parasite DNA in the animal blood. There was significant statistical difference to contactants (P = 0.02) and (OR = 4.1). The IFAT with L. major antigen, proved to be a proper confirm test that could be used as counterproof to ELISA test, which presented 39.4% of sensitivity. The combination of these two tests and its co-positivity was only 52%, which required another confirmatory test. However, for the negativity confirmation of IFAT, the ELISA test was considered reliable, with a 96.7% index. The use of PCR with total blood, showed low agreement and sensitivity with IFAT test, therefore not indicated as primary test, however efficient as counterproof. This research shown that CVL has adapted to urban areas, thus as endemic form and it concludes that a variety of diagnostic tests improves the detection of positive animals, becoming an excellent aspect to CVL control in certain areas, besides preventing euthanasia of false positives dogs

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-14T18:03:14Z No. of bitstreams: 1 Tese_GlauciaFernandesCota.pdf: 3493712 bytes, checksum: fa62c9cc82d462b8b7270f8bcf4123dc (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-14T18:03:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_GlauciaFernandesCota.pdf: 3493712 bytes, checksum: fa62c9cc82d462b8b7270f8bcf4123dc (MD5) Previous issue date: 2013 / Leishmaniose visceral (LV) entre infectados pelo HIV tem incidência crescente em regiões onde as duas infecções são endêmicas. Reconhece-se hoje que a doença está associada a maior mortalidade, menor taxa de resposta clínica e parasitológica e maior toxicidade ao tratamento que as observadas em pacientes não infectados pelo HIV. Várias são as incertezas e dificuldades a cerca do diagnóstico, tratamento e seguimento dos pacientes coinfectados com Leishmania-HIV. Esta tese é composta por três revisões sistemáticas e um estudo clínico e busca contribuir para a redução de algumas lacunas do conhecimento à cerca da coinfecção Leishmania-HIV. Por meio de revisões sistemáticas da literatura e de um estudo transversal, que comparou a acurácia de métodos invasivos e não invasivos para o diagnóstico de LV entre infectados pelo HIV, confirmamos baixa sensibilidade dos testes sorológicos, à exceção do teste de aglutinação direta, que deve ser preferido em rotinas de investigação. Incluindo nossos próprios resultados, foram identificados apenas três estudos que avaliaram o desempenho de testes imunocromatográficos rápidos, baseados na pesquisa do anticorpo contra o antígeno recombinante K39, entre infectados pelo HIV. Por sua vez, testes baseados na reação em cadeia da polimerase, incluindo a técnica que utiliza como alvo a subunidade ribossomal do RNA e testada em nosso meio, apresentam alto desempenho global e despontam como alternativa menos invasiva ao exame parasitológico. De acordo com a evidência disponível, a terapia antirretroviral altamente potente não constitui intervenção suficiente para evitar a recidiva. Por outro lado, o uso de profilaxia secundária reduz significativamente a ocorrência de episódios subsequentes de LV. A revisão da literatura nos permitiu ainda identificar algumas condições marcadoras do risco de recidiva que, se presentes, reforçam a indicação de profilaxia secundária: ausência de elevação da contagem de linfócitos T CD4+ no seguimento; história prévia e recidiva de LV; contagem de linfócitos T CD4+ abaixo de 100 células/mL na ocasião do primeiro diagnóstico de LV. Os trabalhos publicados revelam maior taxa de resposta clínica com o uso de anfotericina B em relação ao tratamento com derivados de antimônio, o que parece estar relacionado à menor toxicidade que à maior eficácia. Os derivados de antimônio são drogas mal toleradas pelos pacientes coinfectados com HIV, associando-se a alta taxa de descontinuidade do tratamento e mortalidade três vezes maior que a observada com o tratamento com anfotericina B. Os dados disponíveis até o momento são insuficientes para se comparar a eficácia entre as várias formulações de anfotericina ou se definir a dose e o tempo de tratamento ideais para LV entre infectados pelo HIV. / Concurrent visceral leishmaniasis (VL) and HIV infection have been reported in most areas of the world where the geographical distribution of the two infections overlap. The disease is characterized by significantly lower cure rates, higher drug toxicity, relapse and mortality rates than those for VL in non-HIV-infected individuals. There are many uncertainties and difficulties about the diagnosis, treatment and monitoring of Leishmania-HIV coinfected patients. This dissertation is composed of three systematic reviews and a clinical study and aims to contribute to the reduction of some of the knowledge gaps in Leishmania-HIV coinfection field. Through a systematic literature review and a cross-sectional study, designed to evaluate the accuracy of invasive and noninvasive tests for VL diagnosis in HIV-infected patients, it was confirmed the low sensitivity of serological tests, except for direct agglutination test. Including our own results, there are only three studies evaluating the performance of anti-rK39 based dipsticks tests among HIV-infected patients. Tests based on DNA detection are highly sensitive and may contribute to a VL diagnostic workup. A good performance was also obtained (in our cross-sectional study) with a real time PCR (polymerase chain reaction) using as target the small subunit of ribosomal RNA. PCR tests are emerging as a less invasive and a useful alternative to parasitological examination. According to the available evidence, highly active antiretroviral therapy is not sufficient to prevent VL recurrence. In contrast, secondary prophylaxis was shown to be protective against relapse. Some predictors of VL relapse could be identified: a) the absence of an increase in CD4+ cells at follow-up; b) lack of secondary prophylaxis; and c) previous history of VL relapse. CD4+ counts below 100 cells/mL at the time of primary VL diagnosis may also be a predictive factor for VL relapse. Based on these observations, a high-risk population might be identified and such patients might then be eligible for secondary prophylaxis. Available evidence suggests higher clinical response rate with amphotericin B than with antimony treatment, which appears to be related to less toxicity than with higher effectiveness. Antimonial therapy carries a higher rate of drug discontinuation and a significantly higher mortality indirectly compared to treatment with amphotericin B. The optimal dose of amphotericin and the difference in efficacy between its various formulations remain to be established.

Made available in DSpace on 2015-06-17T12:06:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 339.pdf: 1673760 bytes, checksum: b6988680884c38393a1141615afb2832 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / A leishmaniose visceral ocorre em países dos cinco continentes e quando não tratada pode levar a óbito. Para se evitar esse desfecho, são essenciais o diagnóstico precoce e tratamento adequado. Com o objetivo de contribuir na pesquisa de novos diagnósticos para leishmaniose visceral, esse trabalho propôs desenvolver sistemas baseados em Nested-PCR convencional e em único tubo para o diagnóstico de leishmaniose visceral. A partir de uma revisão na literatura em busca de alvos moleculares utilizados no diagnóstico dessa parasitose, foram selecionados os alvos subunidade menor do RNA ribossômico (ssu rRNA) e espaçador transcrito interno 1 (ITS-1), que compõem o DNA do agente etiológico Leishmania infantum, para o desenvolvimento das nested-PCR. Foi também escolhido o alvo kDNA, o mais aplicado nas abordagens de PCR, para comparações com os sistemas desenvolvidos. Após otimizar todas as PCR com DNA genômico de L. infantum, esses sistemas foram avaliados em amostras de sangue, soro e urina de indivíduos com suspeita de leishmaniose visceral dos hospitais de referência da cidade do Recife - PE. Para utilização da urina, foram avaliados quatro protocolos de extração de DNA e identificou-se que a extração por fenol-clorofórmio, com modificações, foi a de melhor desempenho. Na avaliação com amostras biológicas, as PCR simples e nested-PCR com os alvos ssu rRNA e ITS-1 não tiveram boa sensibilidade ao se usar sangue, e não foram capaz de amplificar DNA do parasito em soro e urina. Esses sistemas desenvolvidos não podem ser usados para o diagnóstico da leishmaniose visceral. No entanto, a kDNAPCR apresentou bons resultados quando avaliada com urina. Mais estudos devem ser feitos para avalia-la como um diagnóstico seguro para esse tipo de amostra biológica. Esse trabalho representa um ponto de início para posteriores estudos que objetivem o aprimoramento e validação da nested-PCR único tubo para o diagnóstico da leishmaniose visceral

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:13:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 18.pdf: 1870075 bytes, checksum: d5ea98b7af7284f04b5ff0aa3d2c7c71 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / A leishmaniose visceral canina (LVC) e uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania, principalmente por Leishmania infantum. A epidemiologia da doença varia de região para região e o entendimento dos fatores associados à infecção em cães pode ajudar na elaboração de medidas de controle mais específicas. O diagnóstico sorológico da infecção sofreu mudanças importantes nos últimos anos com a introdução do TR-DPP® e do estabelecimento de novos critérios de diagnóstico (TR-DPP® + EIE-LVC) pelo Ministério da Saúde. Dentro desse contexto, no presente estudo objetivou-se estudar a epidemiologia da LVC no município de Goiana, estado de Pernambuco, nordeste do Brasil. Para tal, realizaram-se testes sorológicos (TR-DPP® e EIE-LVC) e análise clínico-epidemiológica em 360 cães semi e domiciliados, de ambos os sexos, raças e idades variadas, nos distritos de Atapuz, Tejucupapo e Pontas de Pedra no referido município. No TR-DPP®47 (13,1 por cento) animais foram reagentes, onde se observou associação significativa dos resultados com os seguintes sinais clínicos: alopecia, lesões na pele paresia e linfonodomegalia. Já no EIE-LVC 21 (5,8 por cento) animais foram reagentes, havendo associação significativa entre a classificação clínica dos animais, condição corporal, alopecia, lesões na pele, secreção ocular, paresia e linfonodomegalia. Já de acordo com o critério do Ministério da Saúde do Brasil, apenas 15 (4,2 por cento) animais foram classificados como positivos. De fato, verificou-se uma fraca concordância (Kappa = 0,39) entre os dois testes sorológicos. Conclui-se que a LVC encontra-se estabelecida em Goiana e que o uso do TR-DPP® como teste de triagem e do EIE-LVC como teste confirmatório pode levar a perda de cães infectados, uma vez que cães positivos do TR-DPP® são negativos no EIE-LVC e vice-versa

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2015silva-rp.pdf: 5571134 bytes, checksum: 19723480d7429ee48a1698d7e2ad1a17 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. O trabalho teve como objetivo avaliar estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na LV, que compreenderam a avaliação da eficiência de diferentes métodos de extração de DNA em amostras de urina; a análise do uso da Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para a detecção do DNA de Leishmania infantum na referida amostra; e a padronização de uma reação duplex qPCR para a detecção simultânea do DNA de L. infantum e do gene G3PD (controle endógeno). Depois da escolha do protocolo de extração de DNA mais apropriado, e após a otimização e a análise de reprodutibilidade, uma qPCR em urina foi padronizada. Em paralelo, após o desenho e a síntese de sondas TaqMan® compatíveis com os sistemas LINF 1B e G3PD1, após otimização e análise de reprodutibilidade, uma duplex qPCR em sangue também foi padronizada. Para avaliação dos protocolos desenvolvidos foram utilizadas técnicas de estatística descritiva. Para análise comparativa com técnicas clássicas de diagnóstico da LV utilizou-se Teste Qui Quadrado de independência ou Teste Exato de Fisher (p<0,05 e p<0,01, respectivamente). Como resultados, após otimização, o limite de detecção alcançado pela qPCR em urina utilizando o protocolo de extração selecionado (kit comercial) foi de 5 fg/microlitros de amostra 0,034 parasitos) A duplex qPCR em sangue alcançou um limite de detecção de 2x102 fg/microlitros de amostra 1,4 (ou ~ 1,4 parasito), após a otimização. A partir dos dados estatísticos obtidos, pôde-se analisar alta concordância percentual entre a qPCR e urina e o conjunto de critérios diagnósticos (sorologia rK39 + qPCR em sangue), bem como entre a duplex qPCR em sangue e a qPCR em sangue, para os Grupos 01 (pacientes com suspeita de LV) e 02 (pacientes HIV positivos co-infectados ou não). Como um conjunto de critérios, os dois novos ensaios obtiveram excelentes concordâncias com o conjunto de técnicas clássicas: 88,89 por cento e 94,74 por cento para os Grupos 01 e 02, respectivamente. Não houve diferenças estatísticas significativas entre os testes. Pôde-se concluir que ambos os ensaios mostraram bom potencial para a incorporação, após validação, ao diagnóstico da LV; em conjunto ou individualmente (quando necessário), trazendo mais conforto, praticidade, confiabilidade e rapidez ao diagnóstico definitivo da patologia

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:55:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Giuliana Schmidt Franca Fonseca.pdf: 1055751 bytes, checksum: 050d4de10b5fae8001c2b5f264473b60 (MD5) Previous issue date: 2013-08-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O diagnóstico de rotina da leishmaniose visceral (LV) humana é usualmente baseado em parâmetros clínicos e epidemiológicos, associado a exames parasitológicos e/ou imunológicos. Tendo em vista que a doença é fatal se não tratada, a busca por métodos diagnósticos mais efetivos, que sejam de fácil execução, simples, acessíveis, menos invasivos, e rápidos, se faz necessário, diminuindo o tempo de obtenção dos resultados. Portanto, neste estudo foi avaliado o desempenho de diferentes métodos já utilizados na rotina ou propostas como ferramentas alternativas para o diagnóstico da LV, incluindo o exame direto de punção de medula óssea, a reação de imunofluorescência indireta (RIFI), o teste rápido com rK39 (Kalazar Detect®), a ELISA com antígeno solúvel de L. chagasi e a imunofluorescência baseada em citometria de fluxo (FC-AFPA). Para isso foram avaliadas 77 amostras biológicas (punção de medula óssea e soro) de pacientes com diagnóstico clínico de LV, tratados e curados. A sensibilidade dos testes avaliados foi de 48% para o exame parasitológico direto, 74% para RIFI, 79% para o teste rápido com rK39, 88% para o teste ELISA-ASL e 94% para a FC-AFPA. A análise comparativa dos testes avaliados demonstrou que há maior concordância entre os testes sorológicos entre si, do que entre os testes sorológicos e o exame direto, devido a sua baixa sensibilidade. Foi também realizada a comparação entre os resultados dos testes sorológicos em relação ao resultado do teste parasitológico direto. Entretanto, nossos resultados mostraram que o desempenho dos testes foi semelhante independente do resultado do exame direto. Além disso, nosso estudo avaliou o desempenho de dois algoritmos para diagnóstico da LV baseados apenas em testes sorológicos. O primeiro deles utilizando a RIFI como teste de inicial, uma vez que este teste é disponibilizado pelo Ministério da Saúde (MS) para os laboratórios de referência em diagnóstico de LV e um segundo utilizando o teste rápido rK39, que tem sido recentemente sugerido como teste de triagem pelo MS. A análise dos dados demonstrou que o algoritmo para o diagnóstico da LV humana que apresentou melhor desempenho, ou seja, todos os casos foram detectados, foi aquele que utilizou o teste rápido como teste inicial, seguido de FC-AFPA / The routine diagnosis of human visceral leishmaniasis (VL) is usually based on clinical and epidemiologic parameters associated to parasitological and/or immunological tests. Being a fatal disease if not treated, the search for more effective, easy to perform, simple, affordable, and fast diagnostic methods, is necessary, decreasing the time to obtain results. Therefore, in this study the performance of different methods already used in the routine or proposed as alternative tools to the diagnose of VL was evaluated, which included the direct parasite detection (DPD) on bone marrow aspirates, indirect immunofluorescent assay (IFA), rK39 rapid test (Kalazar Detect®), ELISA test using L.chagasi soluble antigen, and immunofluorescence by flow cytometry (FC-AFPA). Seventy-seven biological specimens (bone marrow and serum) from patients with clinical diagnosis of VL, treated, and cured were assessed. The sensitivity of evaluated tests was 48% for DPD, 74% for IFA, 79% for rK39 rapid test, 88% for ELISA-SLA, and 94% for FC-AFPA. The comparative analysis demonstrated higher concordance among serological tests in comparison to serological tests and DPD, due to the low sensitivity of the latter. It was also done the comparison between the results of serological tests and direct examination. However, our results showed that the performance of tests was similar regardless of DPD results. In addition, our study evaluated the performance of two algorithms for the diagnosis of VL based only on serological tests. The first of them using IFA as a initial test, since this is the test provided by the Ministry of Health (MH) for reference laboratories for diagnosis of VL, and a second algorithm using the rK39 rapid test, that has recently been suggested as a screening test by the MH. It was demonstrated that the algorithm presenting the best performance, that is, all the cases were detected, was the one using rapid test as initial test followed by FC-AFPA

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:36:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010 / Segundo o Ministério da Saúde, o diagnóstico laboratorial da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) permanece como um problema para os serviços de saúde, e está relacionado a três fatores: variedade de sinais clínicos semelhantes aos observados em outras doenças infecciosas, alterações histopatológicas inespecíficas e a inexistência de um teste de diagnóstico próximo a 100% de especificidade e sensibilidade. Esta questão, associada ao fato de haver registro de cães infectados por Leishmania sp, agente etiológico da LVC, desde o final da década de 1990 em Mato Grosso, motivou a realização deste trabalho. O objetivo geral desta dissertação foi analisar amostras de cães com suspeita clínica ou não de leishmaniose visceral, recolhidos pelo Centro de Controle de Zoonoses (CCZ), oriundos de área urbana de Cuiabá (MT), a partir da comparação de técnicas laboratoriais de RIFI, ELISA, teste rápido imunocromatográfico DPPTM e cultivo in vitro com o exame parasitológico direto (esfregaço de medula óssea), desenvolver uma metodologia de diagnóstico utilizando, como substrato, o papel de filtro FTA® Card embebido com o aspirado de tecido subcutâneo dos animais e caracterizar a espécie de Leishmania circulante. Foram analisados 45 cães, de ambos os sexos e de diferentes raças. (...) A combinação do aspirado de tecido subcutâneo dos cães, em papel de filtro FTA® Card, com a PCR não obteve resultados positivos nesta pesquisa. Portanto, esta metodologia deve ser aprimorada mediante novos testes. A priori, com abordagem diferente para a coleta do aspirado de tecido subcutâneo em cães e realização da PCR. A espécie de Leishmania, caracterizada pela enzima 6PGDH, circulante em cinco cães amostrados, provenientes de área urbana de Cuiabá, foi a Leishmania (Leishmania) infantum. / According to the Ministry of Health, the laboratory diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) remains as a problem for health services, and is linked to three factors: variety of clinical evidence similar to those observed in other infectious diseases, histopathologic-unspecific changes and the lack of a diagnostic test near 100% specificity and sensitivity. This issue associated with having infected dogs record for Leishmania sp, etiological microorganism of the CVL, since the late 1990s in Mato Grosso state, motivated this study. The main purpose of this dissertation was analyzing samples of dogs with clinical suspicion or not with leishmaniasis, collected by Zoonoses Control Center (ZCC) from Cuiabá (MT) urban area by comparing laboratory techniques IFR, ELISA, rapid test imunocromatographic DPPTM and cultivation in vitro with parasitological direct examination (smear of bone marrow), to develop a methodology for diagnosis using as substrate, the filter paper FTA ® card wet and embedded with the infiltrate of subcutaneous tissue of animals and characterize the species of Leishmania stock present in the culture. The results showed that 45 dogs were examined, of both sexes and of different races. The clinical evidences recorded in dogs sampled from Cuiabá urban area were, in descending order of frequency: desquamation (53.33%), alopecia (44.44%), injuries (40%), cachexia (26.67%), onychogryphosis (26.67%), mucosal pale (26.67%), keratoconjunctivitis, (26.67%) and apathy (13.33%). The positive results obtained by direct parasitological techniques (gold standard), cultivation in vitro IFR, ELISA and DPPTM accounted for 37.21% (16/43), 44.44% (8/18), 84.44% (38/45), 42.22% (19/45) and 46.67% (21/45), respectively. The rapid test sensitivity = imunocromatographic DPPTM (68.42%, specificity = 87.5%, accurate = 73.07%, k = 0.57) proved to be more sensitive, more specific and with greater reliability than IFR (sensitivity = 44.44%, specificity = 100%, accurate = 53.49%, k = 0.21) and ELISA (sensitivity = 58.52%, specificity = 76.92%, accurate = 69.77%, k = 0.36). The combination of subcutaneous infiltrate dogs tissues in filter paper FTA ® card with the PCR did not succeed in this poll. Therefore, this methodology must be enhanced by further testing. A priori with different approach to the collection of induction of subcutaneous in dogs tissues and the proceedings of PCR. The species of Leishmania, characterized by the enzyme 6PGDH, stock in five dogs sampled from Cuiabá, urban area was Leishmania (Leishmania) infantum.

Made available in DSpace on 2016-05-19T12:59:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) 2016barbosa-junior-wl.pdf: 2215174 bytes, checksum: ec8edd1a6fc480050cdd6db05c9631f6 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença grave que afeta a população de vários países, onde o Brasil apresenta a maior prevalência da infecção nas Américas. Com o estudo do gene codificante da proteína B de superfície (HASPB ou K26) de Leishmania infantum é possível identificar as variações polimórficas intraespecíficas e, assim, será possível consolidar a descrição de um perfil polimórfico presente no Estado de Pernambuco. O objetivo do trabalho foi analisar as regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV. O sistema K26 PCR foi otimizado utilizando concentrações variadas de DNA genômico de L. infantum. Foi realizado o screening de amostras clínicas de DNA através de dois sistemas de PCR simples, kDNA e ITS1/RFLP, para ensaios posteriores com a K26 PCR nas amostras positivas. A curva de dissociação de alta definição (qPCR-HRM) foi empregada na localização de temperaturas de melting específicas para L. infantum. Os amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados as sequencias selecionadas em base de dados. A K26 PCR apresentou limiar de detecção de 1 pg para amplicon de 700 pb. A especificidade dos primers foi avaliada experimentalmente e in silico, apresentando anelamento inespecífico com DNA humano. Em paralelo, foram selecionadas 78 amostras de DNA através dos dois sistemas screening, sendo 17 caracterizadas como L. infantum. Os ensaios com DNA das amostras clínicas para o sistema K26 PCR revelaram bandas espúrias. A análise através qPCR-HRM em DNA genômico do parasita resultou em amplificação com Tm de 88,2 °C, já o ensaio com amostra clínica revelou duas amplificações com distintas temperaturas de melting, 84,6 e 88,2 °C. Três amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados a cinco sequencias da base de dados, indicando 38,2 % de similaridade. Pode-se concluir que o sistema K26 PCR é recomendável para análise dos polimorfismos genéticos, contanto que o DNA seja extraído diretamente de espécies isoladas em meio de cultura.

Com o objetivo de avaliar o desempenho do teste rápido DPP® LVC comparando com os testes de ELISA e RIFI (Bio-Manguinhos, Br), assim como ELISA e RIFI in-house, empregando como antígeno formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi, com ênfase a reatividade cruzada com outros agentes infecciosos, soros de cães infectados por L. (L.) infantum chagasi, clinicamente sintomáticos (n=48) e assintomáticos (n=39), assim como soros de cães sadios e não infectados (n=18), e soros de cães infectados por Babesia canis (n=9), Dirofilaria immitis (n=4), Trypanosoma cruzi (n=6), Ehrlichia canis (n=17), Neospora caninum (n=6), Toxoplasma gondii (n=9), Neospora/Toxoplasma coinfecção (n=4) e Toxocara canis (n=9) foram avaliados pelas diferentes técnicas de diagnóstico. DPP e ELISA in-house mostraram alta sensitividade (90.81% e 94.25%) e especificidade (95.06% e 97.53%), respectivamente para o diagnóstico de LVC sintomática e assintomática, mas apresentaram reação cruzada com Babesia canis, 44% para DPP e 22% para ELISA in-house. Os dois testes mostraram uma excelente concordância de resultados (kappa=0.9405, p < 0.0001). ELISA Bio-Manguinhos assim como o RIFI Bio-Manguinhos e RIFI in-house mostraram boa sensitividade (90.81%, 96.47% e 89.41%), mas baixa especificidade (77.78%, 69.14% e 65.82%), respectivamente; e mostraram reação cruzada com soros de animais infectados com Babesia canis, Dirofilaria immitis, Trypanosoma cruzi, Ehrlichia canis, Neospora caninum, Toxoplasma gondii. Os resultados mostraram que o DPP® CVL apresentou um bom desempenho para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina sintomática e assintomática / In order to investigate the performance of the DPP® CVL rapid test comparing with ELISA and IFA (Bio-Manguinhos, Br), as well as ELISA and IFAT in house using L. (L.) infantum chagasi promastigotes as antigen with emphasis in the cross-reactivity with others infectious agents, sera from clinically symptomatic (n=48) and asymptomatic (n=39) L. (L.) infantum chagasi infected dogs, as well as from healthy non-infected (n=18) dogs and from Babesia canis (n=9), Dirofilaria immitis (n=4), Trypanosoma cruzi (n=6), Ehrlichia canis (n=17), Neospora caninum (n=6), Toxoplasma gondii (n=9), Neospora/Toxoplasma co-infection (n=4) and Toxocara canis (n=9) infected dogs were tested for different diagnosis techniques. DPP and ELISA in-house showed high sensitivity (90.81% and 94.25%) and specificity (95.06% and 97.53%), respectively for symptomatic and asymptomatic CVL diagnosis, but presented cross-reactivity with Babesia canis, 44% for DPP and 22% for ELISA in-house. Both test showed an excellent agreement (kappa=0.9405, p < 0.0001). ELISA Bio-Manguinhos as well as IFA Bio-Manguinhos and IFA in-house showed good sensitivity 90.81%, 96.47% and 89.41%) but low specificity (77.78%, 69.14% and 65.82%), respectively; and showed cross-reactivity with sera from animals infected with Babesia canis, Dirofilaria immitis, Trypanosoma cruzi, Ehrlichia canis, Neospora caninum, Toxoplasma gondii. The results showed that DPP® CVL had a good performance for the diagnosis of of both symptomatic and asymptomatic canine visceral leishmaniasis