A leptospirose é uma doença infecto-contagiosa que acomete os animais domésticos, silvestres e o homem, causada por bactérias do gênero Leptospira. No Brasil, a hemorragia pulmonar constitui o principal fator de risco para o óbito com taxas de letalidade para essa forma da doença superior a 50%. Desta maneira, o desenvolvimento de uma vacina preventiva e o melhor entendimento dos mecanismos de lesão envolvidos nos processos de desenvolvimento da leptospirose nos permitirá propor novas terapêuticas a fim de diminuir a alta letalidade associada à doença. Neste trabalho propusemos investigar doze genes de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni. A identificação de uma metaloprotease abre caminho para a investigação de uma possível protease envolvida nos processos hemorrágicos para essa importante zoonose. Esperamos, com os resultados apresentados neste trabalho, contribuir com a caracterização da biologia e patogenicidade da leptospirose. / Leptospirosis is an infectious disease that affects domestic animals, wildlife and humans, caused by bacteria of the genus Leptospira. In Brazil, pulmonary hemorrhage is the major risk factor to death with mortality rates for this form of the disease over than 50%. Thus, the development of a preventive vaccine and better understanding of injury mechanisms involved in leptospirosis would allow us to propose new therapies to reduce the high mortality associated with the disease. In the present study we proposed to investigate twelve genes of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. The identification of one protease opens the way for the investigation of a possible protease involved in bleeding processes in this important zoonosis. With the results presented here, we expect to contribute to the biology and pathogenicity characterization of leptospirosis.

Os mecanismos responsáveis pelas manifestações hemorrágicas durante a leptospirose severa ainda são pouco compreendidos. Este trabalho avaliou os efeitos diretos e indiretos das leptospiras sobre moléculas do sistema de coagulação. Foi verificado que leptospiras virulentas são eficientes em bloquear a atividade da enzima trombina por meio do sequestro de seu sítio de ligação ao substrato, gerando uma menor formação do coágulo de fibrina, acarretando em sangramento e consequente disseminação do patógeno para outros sítios de infecção. Foi mostrado também que a inflamação causada pela resposta imune contra as bactérias causa uma ativação da coagulação, muito provavelmente via expressão de Fator Tissular, o que ocasiona um consumo e consequente esgotamento dos fatores e inibidores de coagulação, culminando em hemorragia e formação de trombos, os quais podem levar à falência de órgãos. Estes resultados melhoram o entendimento da patogênese da leptospirose e podem favorecer o desenvolvimento de terapias para as manifestações hemorrágicas. / The mechanisms responsible for the hemorrhagic manifestations during severe leptospirosis are still poorly understood. This work evaluated the direct and indirect effects of leptospires upon molecules of the coagulation system. It has been shown that virulent leptospires are effective in blocking the activity of the enzyme thrombin by sequestration of its substrate binding site, generating less fibrin clot formation, leading to bleeding and consequent dissemination of the pathogen to other sites of infection. It has also been shown that the inflammation caused by the immune response against the bacteria causes an activation of the coagulation, most probably via expression of Tissue Factor, which causes a consumption and consequent depletion of coagulation factors and inhibitors, culminating in hemorrhage and thrombus formation, which can lead to organ failure. These results improve the understanding of the pathogenesis of leptospirosis and may favor the development of therapies for hemorrhagic manifestations.

O objetivo do presente trabalho foi determinar a soroprevalência da leptospirose bovina no Estado da Bahia, bem como identificar fatores de risco associados à infecção. A amostragem foi delineada para a determinação da prevalência de propriedades positivas (focos) e de animais soropositivos para a leptospirose. O Estado foi dividido em quatro circuitos produtores, nos quais foram amostradas 10.823 fêmeas bovinas com idade ≥24 meses distribuídas em 1.414 propriedades. Na ocasião da colheita de sangue, foi aplicado um questionário epidemiológico por propriedade e as coordenadas geográficas foram obtidas com um aparelho de GPS. A reação de Soroaglutinação Microscópica (SAM), empregando 24 sorovares de Leptospira spp. como antígenos, foi utilizada como teste diagnóstico. O rebanho foi considerado foco quando apresentou pelo menos um animal soropositivo. As prevalências de foco e de animais soropositivos no Estado foram de 77,93% [75,73% 79.99%] e 45,42% [42,00% 48,88%], respectivamente. O sorovar mais freqüente foi o Hardjoprajitno, com 34,49% [31,93% 37,14%] de propriedades positivas e 14,95% [12,59% - 17,67%] de animais soropositivos. Nos circuitos produtores 1, 2, 3 e 4, as prevalências de focos foram de 62,40% [57,43% 67,13%], 88,10% [84,16% 91,15%], 77,47% [72,88% 81,49%] e 78,25% [73,47% 82,37%], e as prevalências de animais soropositivos foram de 42,52% [35,82% 49,51%], 48,60% [43,68% 53,56%], 47,72% [40,36% 55,18%] e 44,18% [38,13% 50,41%], respectivamente. A compra de reprodutores, presença de animais silvestres, utilização de pasto compartilhado, presença de eqüinos, cães e suínos, presença de cervídeos, abate de reprodutores nas fazendas, existência de áreas alagadiças, exploração de corte, aluguel de pasto e predominância de raças especializadas foram os principais fatores de risco identificados. A presença de gatos foi um fator de proteção contra a leptospirose. / The aim of this work was to determine the seroprevalence of bovine leptospirosis in Bahia State, Northeastern Brazil, as well as to identify risk factors associated to infection. The sampling was delineated for the determination of the prevalence of positive herds and seropositive animals for bovine leptospiroses. The State was divided into four productive circuits in which 10,823 bovine females aged ≥24 months allocated in 1,414 herds were sampled. On the occasion of the blood collection, an epidemiological questionnaire was applied in each herd and the geographical coordinates were obtained with a GPS. The Microscopic Agglutination Teste (MAT), using 24 Leptospira spp. serovars as antigens, was employed as diagnostic test. The herd was considered positive if at least one animal was seropositive. The prevalences of positive herds and seropositive animals in State were 77. 93% [75.73% 79.99%] and 45.42% [42.00% 48.88%], respectively. Serovar Hardjoprajitno was the most frequent, with 34.49% [31.93% 37.14%] of positive herds and 14.95% [12.59% - 17.67%] of seropositive animals. In the productive circuits 1, 2, 3 and 4, the prevalences of positive herds were 62.40% [57.43% 67.13%], 88.10% [84.16% 91.15%], 77.47% [72.88% 81.49%] and 78.25% [73.47% 82.37%], and the revalences of seropositive animals were 42.52% [35.82% 49.51%], 48.60% [43.68% 53.56%], 47.72% [40.36% 55.18%] and 44.18% [38.13% 50.41%], respectively. Purchase of reproducers, presence of wild animals, utilization of shared pasturage, presence of equine, dogs and swine, presence of cervides, slaughter of reproducers in the farms, existence of flooded areas, meat farm enterprise, rent of pasturage and predominance of specialized breeds were the main identified risk factors. Presence of cats was a protective factor against leptospirosis.

A leptospirose é uma zoonose de importância mundial, causada por leptospiras patogênicas. Aproximadamente 5 a 10% das infecções humanas cursam com a forma grave. A Doença de Weil é a forma mais comum de doença grave e pode apresentarse com duas formas de evolução, aguda progressiva monofásica ou de curso prolongado. A doença grave se caracteriza por uma combinação de hemorragia, mais comumente pulmonar, icterícia e insuficiência renal, com letalidade de 5 a 15%. O rim é um órgão muito acometido na Leptospirose. Clinicamente o envolvimento renal ocorre de 16 a 40%, com manifestações peculiares como poliúria, hipocalemia, e perda de sódio. A disfunção tubular renal, é característica da leptospirose forma grave, com envolvimento dos transportadores renais de sódio ao longo do néfron, levando às manifestações observadas. A terapêutica antimicrobiana é recomendada na Leptospirose, porém com controvérsias à sua indicação após o quarto dia de doença. Quando da instalação da lesão não haveria benefícios com a utilização de antibióticos. O tratamento pode diminuir a morbidade e letalidade, assim como interferir no envolvimento renal e na expressão dos transportadores renais de sódio. A patogênese pode estar relacionada a efeitos diretos da leptospira ou a resposta inflamatória assim como o estresse oxidativo. A utilização de antioxidantes, pode ser considerada como terapia adjuvante. Nós avaliamos a expressão no túbulo proximal do trocador Na+-H+ (NHE3) e na porção espessa da medula ascendente o cotransportador Na+-K+-2Cl- (NKCC2), no modelo de hamster com as duas formas de evolução de doença grave, mimetizando a doença de humanos realizados em dois experimentos. Os experimentos envolveram animais infectados não tratados e tratados com ampicilina associado ou não ao antioxidante, N-acetilcisteína. A presença de antígenos de Leptospira e a expressão dos transportadores foram avaliadas por imunohistoquímica, e o ácido tiobarbitúrico, marcador de estresse oxidativo, (TBARS) foi quantificado.Hamsters infectados, apresentaram altas quantidades de antígenos nos tecidos-alvo, enquanto que a expressão de ambos os transportadores apresentou-se diminuída. O tratamento com ampicilina esteve associado com mínima detecção ou ausência de antígenos, restabelecimento da expressão dos transportadores nos respectivos locais e redução dos níveis de TBARS. O tratamento precoce e tardio com ampicilina restabeleceu os defeitos tubulares na leptospirose forma grave em ambos experimentos, sem benefícios com a utilização da N-acetilcisteína. / Leptospirosis is a zoonosis of worldwide distribution. About 5-10% of all human infections presents with severe forms. Weil\'s syndrome, the most common presentation of severe forms of leptospirosis, may courses either as a single monophasic disease or as a disease with prolonged course, characterized by a combination of hemorrhage, particularly in the lung, renal failure, and jaundice, with fatality rates ranging from 5 to 15%. The kidney is an important target organ in leptospiral infection. Clinically, renal involvement in leptospirosis occurs in 16% to 40% of cases and is unique because of the atypical presentation of polyuria, hypokalemia, and sodium wasting, suggestive of a special form of tubular dysfunction related to the major renal sodium transporters expressed along the nephron. A wide range of antimicrobial therapy for leptospirosis was described and benefits have been disputed for cases with more than four days of clinical disease, because after a threshold of leptospiremia, the delayed use of antibiotics is unlikely to reduce fatality. Antimicrobial therapy is thought to interfere on fatality, renal involvement, and renal sodium transporters expression during severe disease. The pathogenesis may be related to direct effects of leptospiral compounds or inflammatory response due to oxidative stress. Antioxidant could be considered for adjunctive therapy.We evaluated the expression of proximal tubule type 3 Na+/H+ exchanger (NHE3) and thick ascending limb Na+-K+-2Cl- cotransporter (NKCC2) in infected non treated and treated hamsters reproducing the two forms of clinical human presentations of Weil\'s syndrome divided in two experiments. Animals were treated or not with ampicillin and/or N-acetyl-cysteine (NAC). Leptospiral antigen/s and expression of renal transporters were evaluated by immunohistochemistry, and serum thiobarbituric acid (TBARS) was quantified. Infected hamsters had high amounts of detectable leptospiral antigen/s in target tissues while renal expression of NHE3 and NKCC2 decreased. Ampicillin treatment was associated with minimal or no detection of leptospiral antigens, normal expression of NHE3 and NKCC2 transporters, and reduced levels of TBARS. Early and late ampicillin treatment rescued tubular defects in leptospirosis severe disease in both experiments, and there was no evidence of benefit from antioxidant therapy.

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Resumo: A leptospirose é uma zoonose de grande impacto mundial na saúde animal e saúde pública. Esta doença tem como agente infeccioso as espiroquetas do gênero Leptospira spp., com espécies patogênicas e não patogênicas. Em animais de produção como os bovinos o quadro clínico manifesta-se geralmente com falhas reprodutivas, como abortos e infertilidade, ocasionando prejuízo econômico nas fazendas, além de representar risco à saúde dos trabalhadores que lidam direta ou indiretamente com os animais. Com o intuito de avaliar o estado sanitário da leptospirose nos bovinos reprodutores de centrais de receptoras de embrião e fazendas de cria da região de Bauru, foram analisadas 400 amostras de sangue e soro destes animais mediante os seguintes testes diagnósticos: cultura em meio de Fletcher, técnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM) e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR). Os resultados indicaram todas as culturas negativas à visualização de formas espiroquetideas. Porém, a análise sorológica mediante SAM, indicou soroprevalência de 83% (331/400); sendo que o sorovares mais frequentes pertencem ao sorogrupo Sejroe (Hardjoprajitno (71,6%), HardjoCTG (62,8%), Wolffi (60,1%) e Hardjo (45,6%). Á PCR de sangue, encontraram-se três (0,7%, 3/400) animais positivos, os quais foram negativos à SAM, indicando estarem na fase aguda da doença. À PCR do sêmen, encontraram-se três (8,1%, 3/37) animais positivos, indicando a probabilidade de transmissão sexual de leptospirose nas fazendas de cria.... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leptospirosis is a worlwide zoonosis of great impact in animal and public health. The etiological agent of this disease are spirochetes of genus Leptospira spp., classified in pathogenic and nonpathogenic species. In farm animals, such as cattle, the clinical presentation involves reproductive failure, like abortion and infertility, causing economical loses in farms, furthermore represents a health risk for workers who keep direct or indirect contact with these animals. Aiming to evaluate the sanitary state of leptospirosis in reproductive cattle of enbryo receptors centers and meet cattle farms of Bauru, 400 blood samples were analysed with three diagnostic tests: Cultured in Fletcher medium, Microagglutination test (MAT) and Polymerase Chain Reaction (PCR). Results shown all cultures negative to visualization of spirochetes forms. However, serological analysis indicated a prevalence of 83% (331/400), with greater frequency of serovars from serogroup Sejroe (Hardjoprajitno (71.6%), HardjoCTG (62.8%) and Hardjo (45. 6%)). Blood PCR showed three (0.7%, 3/400) positive animals, who were also negative to MAT, concluding they were in the acute phase of the disease. PCR of semen showed three (8.1%, 3/37) positive animals, suggesting the chance of leptospirosis´ sexual transmission in the meet farms evaluated. High percentage of positive animals to serogroup Sejroe in MAT, as to the high titles observed, showed concordance to several other studies performed in cattle from Brazil a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A proteção induzida por uma vacina comercial anti-leptospirose importada, bivalente produzida com estirpes de referência dos sorovares Icterohaemorrhagiae e Canicola, foi comparada a promovida por uma bacterina experimental, bivalente produzida com as estirpes autóctones M64/06 e LO-4, respectivamente dos sorovares Copenhageni e Canicola, isoladas no Brasil e tipificadas com anticorpos monoclonais produzidos pelo Royal Tropical Institut, Laboratório de Referência da Organização Mundial de Saúde. O ensaio foi conduzido pelo teste de potência com desafio em hamsters. A vacina experimental, bivalente foi inativada com fenol a 37%, ajustada para concentração de 108 leptospiras por mL, por sorovar e produzida nas versões com e sem adjuvante hidróxido de alumínio a 0,15%. Os hamsters foram imunizados com 0,25 mL de vacina, via subcutânea em duas aplicações com 15 dias de intervalo. Os desafios foram efetuados com as estirpes LO4 (Canicola) ou L1-130 (Copenhageni) isoladas no Brasil, respectivamente nas diluições de 10-3 e 10-1 no volume de 0,5 mL via intraperitoneal por animal, 15 dias após a última dose da vacina. A estirpe de desafio do sorovar Copenhageni foi caracterizada, por anticorpos monoclonais, como idêntica a M64/06 e foi escolhida devido a apresentar melhor regularidade em termos de patogenicidade para os hamsters. Decorridos 20 dias do desafio os hamsters sobreviventes foram eutanasiados em câmara de CO2, necropsiados e nos seus rins foi efetuada a pesquisa do estado de portador de leptospiras por cultivo em meio de Fletcher. Nos desafios efetuados com a estirpe autóctone, L1-130 do sorovar Copenhageni foi obtida a proteção contra a doença clínica em oito de dez animais, para as duas vacinas experimentais, no entanto, entre os sobreviventes, houve portadores renais de leptospiras, em maior número para a vacina sem adjuvante (n=5), quando comparado a vacina acrescida de Al(OH)3, (n=3); para a vacina comercial a proteção foi total, tanto contra a doença como quanto a infecção não havendo qualquer morte por leptospirose e todos os cultivos renais dos sobreviventes foram negativos para leptospiras. Nos desafios efetuados com a estirpe autóctone, LO4 do sorovar Canicola, a proteção conferida pelas três vacinas ensaiadas foi total, não havendo mortes por leptospirose e todos os sobreviventes apresentaram resultados negativos para leptospiras nos cultivos de tecido renal. Os números de DL50 empregadas nos inóculos de desafio foram superiores a 10.000, para os dois sorovares ensaiados, pois na titulação dos inóculos morreram mais do que 50% dos animais até a última diluição testada. Foi, portanto, demonstrado a existência de proteção cruzada entre os sorovares Copenhageni e Icterohaemorrhagiae e que a bacterina importada foi capaz de induzir proteção contra a doença e contra a infecção para estirpes de leptospiras autóctones dos sorovares Canicola e Copenhageni isoladas no Brasil. Nos desafios efetuados com o sorovar Canicola a vacina experimental induziu proteção contra a doença e contra a infecção, mas nos que empregaram o sorovar Copenhageni houve proteção apenas contra a doença, constatando-se menor número de portadores renais de leptospiras entre os animais imunizados com a bacterina experimental acrescida do adjuvante de hidróxido de alumínio. / The protection induced by an imported commercial bivalent anti-leptospirosis vaccine produced with the reference strain of the serovars Icterohaemorrhagiae and Canicola was compared to one promoted by an experimental, bivalent bacterial vaccine produced with the indigenous strains M64/06 and LO-4, respectively of the serovars Copenhageni and Canicola isolated in Brazil and typified with monoclonal antibodies produced by the Royal Tropical Institut, Reference Laboratory of the World Health Organization. The assay was conducted by using the potency test with challenge in hamsters. The experimental bivalent vaccine was inactivated with 37% phenol and adjusted at a concentration of 108 leptospires/mL, for each serovar and produced in the versions with and without adjuvant (0.15% aluminium hydroxide). The hamsters were immunized by 0.25 mL of vaccine, by subcutaneous route in two applications with 15 days of interval. Fifteen days after receiving the last dose of the vaccine, the challenges were performed by employing the strains LO4 (Canicola) or L1-130 (Copenhageni), which were isolated in Brazil, respectively at the dilution of 10-3 and 10-1, in the volume of 0.5 mL/each animal by the intraperitoneal route. The challenge strain serovar Copenhageni has been characterized as identical to M64/06 strain by means of monoclonal antibodies and it was chosen due to its better regularity in terms of pathogenicity determined in hamsters. After 20 days of the challenge, the surviving hamsters were sacrificed in CO2 chamber, submitted to necropsy and the kidneys were examined to test the carrier state of leptospires by cultivation in Fletcher\'s medium. In the challenges effectuated with the indigenous strain, L1-130 of the serovar Copenhageni the protection was obtained against the clinical disease in eight of ten animals, for two experimental vaccines, however, among the survivors, there were renal carriers of leptospires, in higher number for the vaccine without containing the adjuvant (n=5), when compared to the one added with Al (OH) (n=3). For the commercial vaccine, the protection was total both against the disease and as for infection, when no death was found in consequence of leptospirosis and all the renal cultures of the survivors were negative for leptospires. In the challenges performed with the indigenous strain LO4 of the serovar Canicola, the protection conferred by the three vaccines tested was total, without observing any deaths due to leptospirosis and all the survivors presented negative culturing results for leptospires in the renal tissue. The challenge doses of the inocula were superior to 10,000 LD50, for the two serovars tested, since in the titration of the inocula have died more than 50 % of the animals up to the last tested dilution. So, the crossed protection existing between the serovars Copenhageni and Icterohaemorrhagiae was demonstrated and that the imported bacterial vaccine was able to induce protection against the disease and against the infection for the native strains of leptospires serovars Canicola and Copenhageni isolated in Brazil. In the challenges effectuated with the serovar Canicola, the experimental vaccine induced protection against the disease and against the infection, but in vaccine employing the serovar Copenhageni, protection was found only against the disease, when less number of renal carriers of leptospires was observed among the animals immunized with the experimental vaccine added with the aluminium hydroxide adjuvant.

A leptospirose é a zoonose mais disseminada no mundo e uma das principais causas de perda econômica no agronegócio. O estudo de novos antígenos de superfície de Leptospira interrogans, é intrigante e pode fornecer conhecimento na interação inicial patógeno-hospedeiro. Os genes LIC13059 e LIC10879, escolhidos por bioinformática, com predição de localização na superfície celular, foram clonados e as proteínas recombinantes expressas em E. coli, para avaliar a interação com componentes do hospedeiro. Após purificação, as proteínas encontravam-se estruturadas e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas recombinantes interagem com plasminogênio, fibrinogênio e laminina. rLIC13059, nomeada Lsa25.6, quando ligada ao fibrinogênio é capaz de inibir a formação de coágulo de fibrina e rLIC10879, nomeada Lsa16, interage com e-caderina, sugerido envolvimento na cascata de coagulação e ligação com o hospedeiro, respectivamente. O plasminogênio ligado às proteínas é convertido em plasmina, o que poderia ajudar a penetração bacteriana no hospedeiro. / Leptospirosis is the most widespread zoonosis and also a major cause of economic loss in animal production worldwide. The study of new surface antigens of Leptospira interrogans is intriguing and may shed light into the initial pathogen-host interactions. We set out to study two novel coding sequences LIC13059 and LIC10879 predicted to be located at the cell surface. The genes were cloned and the recombinant proteins were expressed in E. coli. The purified recombinant proteins presented secondary structures, and interacted with plasminogen, fibrinogen and laminin human components. rLIC13059, named Lsa25.6, when bound to fibrinogen was capable of inhibiting the formation of fibrin clot, while rLIC10879, named Lsa16, interacted with e-cadherin, a mammalian cell receptor, suggesting participation in coagulation pathway and host-cell binding, respectively. The plasminogen captured by both recombinant proteins could be converted into plasmin, a mechanism that could help bacterial penetration in the host.

La leptospirosis es una enfermedad zoonótica de importancia mundial en salud pública. La enfermedad en humanos está asociada a la presencia de la bacteria Leptospira spp. en los animales, en las zonas urbanas los animales domésticos como el perro juegan un rol importante en la transmisión de la enfermedad. Los caninos domésticos pueden desarrollar la enfermedad o ser portadores asintomáticos que eliminan la bacteria en grandes cantidades en la orina. El presente estudio tuvo como objetivo estandarizar e implementar una técnica de PCR en tiempo real con sondas TaqMan para detectar la presencia de leptospiras patógenas en muestras de orina de caninos domésticos infectadas experimentalmente con cepas patrón de Leptospira spp. Las muestras de orina fueron obtenidas de un perro clínicamente sano y negativo a la prueba de microaglutinación (MAT). Se utilizaron los cebadores Lepto R y Lepto F, específicos para Leptospira spp., y una sonda TaqMan Lepto probe, que amplifican e hibridan respectivamente una porción del gen rrs, capaces de diferenciar entre especies patógenas y no patógenas de leptospira. Se estandarizó el protocolo de PCR en 35 ciclos, con un proceso de desnaturalización inicial a 95°C por 5 minutos, seguida por una desnaturalización a 95°C por 15 segundos y finalmente el alineamiento y extensión en un solo paso a 60°C por 1 minuto. Los valores de Ct determinados durante la estandarización de la PCR, estuvieron en un rango de 12.53 a 18.21 para las 25 cepas patógenas de Leptospira spp., las cepas saprófitas y otros géneros bacterianos no dieron productos específicos. El estándar fue detectado hasta una dilución de 10² con un Ct de 29.98 a una eficiencia de 1.13 y con un coeficiente de correlación (R²) de 0.993. Se detectó ADN en las muestras de orina infectada desde la dilución de 10⁷ leptospiras/ml con un valor de Ct de 17.54 hasta una mínima dilución de 10² leptospiras/ml con un valor de Ct de 29.87. Palabras claves: caninos domésticos, PCR en tiempo real, sondas TaqMan, Leptospira spp., Leptospirosis, orina / Leptospirosis is a zoonotic disease of global importance in public health. The disease in humans is associated with the presence of the bacteria Leptospira spp. in animals; in urban areas domestic animals such as dogs play an important role in the transmission of the disease. Domestic canines infected with the bacteria can develop the disease or be asymptomatic carriers, eliminating bacteria in large quantities in their urine. This study aimed to standardize and implement a TaqMan Real-Time PCR assay to detect the presence of pathogenic leptospires in urine samples of domestic canines experimentally infected with standard strains of Leptospira spp. Urine samples were obtained from a clinically healthy dog, negative to the Microagglutination Test (MAT). The primers Lepto R and Lepto F specific for Leptospira spp. and a Lepto TaqMan probe were used, which amplified and hybridized respectively a portion of the rrs gene, differentiating between pathogenic and nonpathogenic species of Leptospira. Thermocycling program was standardized with 35 cycles of 95° C for 15 seconds and 60° C for 1 minute with an initial cycle of 95° C for 5 minutes. Ct values determined during the standardization of PCR were from 12.53 to 18.21 for the 25 pathogenic strains of Leptospira spp. In contrast saprophytic leptospira and other species of bacteria did not produce any specific Ct value. The standard strain was detected up to a dilution of 10² with a Ct value of 29.98 at an efficiency of 1.13 and a correlation coefficient (R²) of 0.993. DNA was detected in infected urine samples from the dilution of 10⁷ leptospires/ml with a Ct value of 17.54 to a minimum dilution of 10² leptospires/ml with a Ct value of 29.87. Keywords: domestic canines, real time PCR, TaqMan probe, Leptospira spp., Leptospirosis, urine / Tesis

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-11-11Bitstream added on 2014-06-13T18:44:25Z : No. of bitstreams: 1 arduino_ggc_dr_jabo.pdf: 1086799 bytes, checksum: 087abbf6d5907c0059a4db75a0b3028d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No presente estudo, 100 fêmeas bovinas foram divididas em cinco tratamentos de 20 animais cada. Os grupos experimentais receberam quatro diferentes vacinas comerciais (B, C, D e E), e um grupo permaneceu como controle. Amostras foram colhidas no dia da aplicação da primeira dose e nos dias 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 120, 150 e 180 pós-vacinação (pv). A triagem dos animais foi feita pela análise sorológica com 24 antígenos de leptospiras, escolhendo-se os animais não reagentes. Os títulos de anticorpos foram monitorados pela soroaglutinação microscópica (SAM) com os sorovares Canicola, Grippotyphosa, Hardjo, Icterohaemorrhagiae, Pomona e Wolffi. Todas as vacinas induziram, aos 3 dias pv, títulos de anticorpos aglutinantes para os sorovares Hardjo e Wolffi, que persistiram até o 150o dia pv. Os sorovares Hardjo e Wolffi induziram os maiores títulos de anticorpos aglutinantes. A vacina D, apesar de não possuir o sorovar Wolffi em sua composição, foi capaz de induzir anticorpos aglutinantes contra este sorovar. Somente foram detectados anticorpos contra o sorovar Canicola nos animais vacinados com a bacterina D. A vacina que induziu os maiores títulos médios de anticorpos, considerando todos os sorovares testados, foi a D. Há a necessidade de melhoria no poder imunogênico e na concentração dos sorovares utilizados como antígenos nas vacinas comerciais. / In this research 100 heifers were used, divided in 5 groups of 20 animals each. The four experimental groups were vaccinated using distinct commercial polyvalent bacterines: A, B, C and D, and a group was the control. Samples were collected at the days 0, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 42, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 120, 150 and 180 from the first injection of the vaccine. The selection of the animals for the experimental groups was done based on a serological screening with 24 antigens of Leptospira sp., constituted by non-reagent animals. The vaccine titres were monitored using the microscopic agglutination test (MAT) for Canicola, Grippotyphosa, Hardjo, Icterohaemorrhagiae, Pomona and Wolffi serovars. All vaccines used were capable to product agglutinins for the Hardjo and Wolffi serovars observed at 3 days after vaccination, remaining until the 150th day; these serovars induced the highest titres of agglutinins. The vaccine D, in spite of not containing the Wolffi serovar, was able to induce the production of agglutinins to this serovar. Agglutinins to the Canicola serovar were only observed in the animals vaccinated with the D bacterine. The vaccine D induced the highest average titres of antibodies to all serovars tested. The improvement of the immunogenic power and serovars concentration utilized as antigens of the commercial vaccines are necessary.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-18T16:50:09Z No. of bitstreams: 1 Igor Paploski Historia natural...2013.pdf: 1824673 bytes, checksum: 82176aba4d2b6446b2fb171b23ca4e2a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-18T16:50:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Igor Paploski Historia natural...2013.pdf: 1824673 bytes, checksum: 82176aba4d2b6446b2fb171b23ca4e2a (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Leptospirose é causada por bactérias do gênero Leptospira e é transmitida aos humanos pela urina de animais contaminados. Apenas uma parcela dos indivíduos infectados desenvolvem manifestações clínicas graves que requerem hospitalização e são potencialmente fatais. Os fatores que determinam que uma infecção por Leptospira evolua de forma autolimitada e outra progrida para uma doença grave e fatal ainda são pouco claros. Nós hipotetizamos que características demográficas como o sexo e a idade influenciem o risco de progressão clínica de indivíduos infectados pela Leptospira. OBJETIVO Investigar a influência do sexo e da idade no risco de progressão clínica da leptospirose após a infecção e estimar a razão entre o número de infecções subclínicas para cada caso grave e cada óbito por leptospirose em comunidades com alta transmissão da doença. MÉTODO Um estudo de coorte foi conduzido entre 2003 e 2006 para determinar a incidência de infecções subclínicas por Leptospira no bairro de Pau da Lima, uma comunidade carente de Salvador - BA . Paralelamente, pacientes com leptospirose grave e óbitos por leptospirose foram identificados através de vigilância populacional ativa no Hospital Couto Maia, em Salvador. Foi calculada a incidência de leptospirose grave e a mortalidade por leptospirose para áreas da cidade com características socioeconômicas similares a da área do estudo de coorte. Todas as incidências foram estratificadas por faixa etária e sexo, sendo em seguida comparadas através de razões de risco. RESULTADOS Foi identificada uma incidência média anual de 23,8 (IC 95%, 19,7 – 28,8) casos de infecção subclínica/1.000 habitantes na área da coorte. Em habitantes de áreas da cidade com características socioeconômicas similares a da área do estudo de coorte a incidência média anual de formas graves foi de 8,2 (IC 95%, 7,0 – 9,4) casos/100.000, sendo que a mortalidade por leptospirose média anual nesta população foi de 1,6 (IC 95%, 1,2 – 2,0) óbitos/100.000 habitantes. Homens apresentaram um risco 2,0 (IC 95%, 1,6 – 2,6) vezes maior de desenvolverem infecções subclínicas, 6,1 (IC 95%, 5,2 – 7,2) vezes maior de desenvolverem infecções graves e 0,6 (IC 95%, 0,4 – 1,0) vezes menor de evoluir para óbito do que mulheres. Indivíduos da faixa etária de 25 a 34 anos e de 35 a 44 anos de idade apresentaram um risco de desenvolverem infecções subclínicas 2,5 (IC 95%, 1,8 – 3,6) e 1,3 (IC 95%, 0,8 – 2,3) vezes maior, respectivamente, em comparação aos com idade entre 5 a 14 anos, enquanto que os indivíduos das mesmas faixas etárias apresentaram riscos de leptospirose grave de 4,5 (IC 95%, 2,2 – 9,0) e 5,1 (IC 95%, 2,5 – 10,3) vezes, respectivamente. Estima-se que ocorreram 289 e 1.510 infecções subclínicas para cada caso grave e para cada óbito, respectivamente, identificados e analisados neste estudo. CONCLUSÕES O sexo e a idade influenciam de risco de infecção subclínica, grave e de óbito por leptospirose. Homens tem maior risco de infecção subclínica e grave, entretanto mulheres apresentam maior letalidade de leptospirose. O risco para infecções subclínicas alcança o pico em indivíduos de 25 a 34 anos, entretanto o risco para infecções graves e óbito não se comporta da mesma maneira e aumenta com a idade. / INTRODUCTION Leptospirosis is caused by a bacteria of the genus Leptospira and is transmited to humans by the urine of infected animals. Only a portion of infected individuals develop severe clinical manifestations that require hospitalization and are potentially fatal. The factors that determine if a Leptospira infection will evolve in a self-limiting while others will progress to a severe and fatal disease are still unclear. We hipothesize that demographic characteristics such as age and gender influence the risk of clinical progression of individuals infected with Leptospira. OBJECTIVE To investigate the influence of gender and age on the risk of clinical progression of leptospirosis after infection and estimate the infection to disease and infection to death ratio in communities with high disease transmission. METHODS A cohort study was performed between 2003 and 2006 to determine the incidence of subclinical infections of leptospirosis at Pau da Lima, a poor community of Salvador. In addition, patients with severe leptospirosis and deaths by leptospirosis were identified through active surveillance population at the infectious disease state reference hospital, in Salvador. We calculated the incidence of severe leptospirosis and mortality by leptospirosis in areas of the city with similar socioeconomic characteristics of the area of the cohort study. All incidences were stratified by age and sex, and then compared using risk ratios. RESULTS The mean annual incidence of subclinical infection was 23.8 (95% CI, 19.7 to 28.8) per 1,000 residents in the cohort area. The mean annual incidence of severe leptospirosis was 8.2 (95% CI, 7.0 – 9.4) cases per 100,000 inhabitants in areas with similar socioeconomic characteristics of the area of the cohort study. The mean annual mortality for individuals of the same area was 1.6 (95% CI, 1.2 – 2.0) per 100,000 inhabitants. Males have 2.0 (95% CI, 1.6 - 2.6) times the risk of developing subclinical infections, 6.1 (95% CI, 5.2 - 7.2) times the risk to develop severe infections and 0.6 (95% CI, 0.4 to 1.0) times the risk to evolve to death, compared to females. Individuals aged from 25 to 34 years and 35 to 44 years had a risk of developing subclinical leptospirosis 2.5 (95% CI , 1.8 - 3.6) and 1.3 (95% CI, 0,8 - 2.3) times greater, respectively, when compared to individuals aged 5 to 14 years, while individuals of the same age had a risk for severe leptospirosis 4.5 (95% CI, 2.2 - 9.0) and 5.1 (95% CI, 2.5 - 10.3) times greater, respectively. It is estimated that there were 1,510 and 289 subclinical infections for every death and severe leptospirosis cases, respectively, identified and analyzed in this study. CONCLUSIONS Age and gender influences the risk of subclinical and severe infection, and death from severe leptospirosis. Males have a higher risk of subclinical and severe infection, but females have higher lethality of leptospirosis. The risk for subclinical infection peaks in individuals aged 25 to 34 years, however, the risk for severe infection and death by leptospiris does not evolve in the same manner, increasing with age.