La leptospirosis es una zoonosis bacteriana de gran impacto en la salud pública a nivel mundial. Los perros y otros animales, pueden infectarse, sufrir la enfermedad, constituyendo así, un factor importante en la diseminación de la bacteria hacia humanos. La infección es causada por cualquiera de los 250 serovares patógenos, de los 25 serogrupos de Leptospira spp. El estudio tuvo como objetivo identificar a los serogrupos de Leptospira spp. presentes en caninos domésticos. Para ello, se obtuvieron 305 muestras de suero sanguíneo, de perros con diagnóstico clínico presuntivo de Leptospirosis, mayores de 6 meses de edad, no vacunados o con un tiempo mayor a seis meses desde la última vacunación contra Leptospirosis. Las muestras fueron remitidas por Médicos Veterinarios al Laboratorio de Microbiología – Sección Bacteriología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, provenientes de 31 distritos de Lima Metropolitana. Se realizó la Prueba de Microaglutinación (MAT), estableciéndose títulos ≥1/100 de serorreactividad como seropositivos, utilizando cepas de referencia de los 25 serogrupos, incluyendo al nuevo serogrupo Iquitos serovar varillal 10, aislado y reportado en casos humanos en Perú. Se detectaron 177 seropositivos (58.03%), de los cuales 31 (10.16%) fueron coaglutinaciones. Los serogrupos de mayor frecuencia fueron: Iquitos (46/305; 15.08%), Tarassovi (37/305; 12.13%), Canicola (37/305; 12.13%), Australis (14/305; 4.59%), Icterohaemorrhagiae (13/305; 4.26%), Pomona (12/305; 3.93%), Mini (10/305; 3.28%) y Ballum (8/305; 2.62%). No se identificó serorreactores a los serugrupos Bataviae, Celledoni, Hebdomadis, Lousiana, Panama, Ranarum, Sarmin. Palabras claves: Perros, leptospirosis, leptospira, MAT, serovar, serogrupo / Leptospirosis is an important bacterial zoonosis on worldwide. Dogs and other animals can be infected and suffered the disease, they constituting an important role in the spread of the bacteria to humans. The infection is caused by any of the 250 pathogenic serovars, grouped in 25 serogroups of Leptospira spp. The aim of this study was to identify the serogroups of Leptospira spp. circulating in domestic dogs. For this, 305 serum samples were obtained from dogs, who had a presumptive clinical diagnosis of Leptospirosis, over 6 months old, unvaccinated or more than six months since the last vaccination against Leptospirosis, The samples were submitted by veterinarians to Microbiology Lab - Bacteriology, Faculty of Veterinary Medicine of Universidad Nacional Mayor de San Marcos, from 31 districts of Lima. The microagglutination test (MAT) was performed, establishing seroreactivity titles ≥ 1/100 as seropositive using reference strains of the 25 serogroups, including the new serogroup Iquitos, serovar Varillal, Var 10 strain, isolated and reported human outbreaks in Peru. 177 seropositive samples (58.03%) were detected, 31 of them (10.16%) were co-agglutinations. Seropositive reacted against 18 serogroups, the most frequent were: Iquitos (46/305; 15.08%), Tarassovi (37/305; 12.13%), Canicola (37/305; 12.13%), Australis (14/305; 4.59%), Icterohaemorrhagiae (13/305; 4.26%), Pomona (12/305; 3.93%), Mini (10/305; 3.28%) and Ballum (8/305; 2.62%). There were no seroreactors to serogroups: Bataviae, Celledoni, Hebdomadis, Lousiana, Panama, Ranarum, and Sarmin. Keywords: Dog, leptospirosis, leptospira, MAT, serovar, serogroup.

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Resumo: A leptospirose é uma zoonose de grande importância em saúde pública, considerada antropozoonótica com alta incidência e prevalência, negligenciada e de caráter ocupacional. Funcionários da linha de produção e manipuladores de sangue e vísceras em frigoríficos, podem infectar-se pelo contato direto com estes produtos, assim como os trabalhadores rurais nas propriedades, pelo contato e exposição direta a fômites e secreções destes animais. Esta enfermidade representa perdas econômicas importantes nos rebanhos, pois pode ocasionar abortos e fetos natimortos e, na sua forma subclínica, é comumente assintomática em bovinos. Amostras biológicas de sangue, fígado e rins de 144 bovinos abatidos em frigorífico localizado no centro-oeste paulista foram utilizadas para o diagnóstico da leptospirose com as técnicas de Soroaglutinação Microscópica (SAM) e Reação em Cadeia da Polimerase convencional (cPCR) para Leptospira spp. Os resultados sorológicos demostraram 71/144 (49,3%) animais reagentes à SAM para os seguintes sorovares: Djasiman (56,3%), Hardjoprajtino (40,8%), HardjoCTG (12,7%), Hardjo (11,3%), Hardjobovis (11,3%), Pyrogenes (9,8%), Wollfi (8,4%), Castellonis (7,0%), Pomona (4,2%), Grippotyphosa (1,4%), Hardjomini (1,4%), Icterohaemorrhagiae (1,4%) e Bratislava (1,4%). Os resultados moleculares evidenciaram a presença de DNA de Leptospira spp. em 25 animais (17,4%), sendo em rins de 21 animais, em fígado de cinco animais, em fígado e rins de dois animais e em sangue, de um (01)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leptospirosis is a zoonosis of great importance in public health, considered anthropozoonotic with high incidence and prevalence, neglected and of occupational character. Production line workers and handlers of blood and viscera in slaughterhouses can be infected by direct contact with these products, as well as rural workers on the farms, by contact and direct exposure to fomites and secretions of these animals. This disease represents important economic losses in the herds, since it can cause abortions and stillborn fetuses and, in its subclinical form, is commonly asymptomatic in cattle. Biological blood, liver and kidneys samples from 144 cattle slaughtered in a slaughterhouse located in central-western São Paulo were used for the diagnosis of leptospirosis using the Microscopic Agglutination Test (MAT) and Conventional Polymerase Chain Reaction (cPCR) techniques for Leptospira spp. The serological results showed 71/144 (49.3%) animals reactive to MAT for the following serovars: Djasiman (56.3%), Hardjoprajtin (40.8%), HardjoCTG (12.7%), Hardjo 3%), Hardjobovis (11.3%), Pyrogenes (9.8%), Wollfi (8.4%), Castellonis (7.0%), Pomona (4.2%), Grippotyphosa, Hardjomini (1.4%), Ichterohaemorrhagiae (1.4%) and Bratislava (1.4%). Molecular results evidenced the presence of Leptospira spp. in 25 animals (17.4%): the kidneys of 21 animals, in the liver of five animals, in the liver and kidneys of two animals and in blood of one (01) animal. These results indicate an alert to the sani... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A leptospirose é uma zoonose de distribuição global causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. A doença possui um quadro de manifestações clínicas muito variadas em humanos, que pode apresentar febre, dores de cabeça e muscular, até um quadro clínico mais severo, conhecido como síndrome de Weil, caracterizado por hemorragias, icterícia, falência renal e hepática. Até o presente momento, os mecanismos de patogenicidade da leptospira não são totalmente claros e não existe uma vacina eficaz contra a doença. O sequenciamento de genomas de leptospiras patogênicas possibilitou a identificação de proteínas da membrana externa conservadas entre cepas patogênicas, que são os principais alvos de pesquisa para elucidar os mecanismos de patogenicidade e possivelmente o desenvolvimento de uma vacina. Nesse sentido, foram selecionados por bioinformática os genes LIC11711 e LIC12587 a partir do genoma sequenciado de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, os quais codificam para duas preditas lipoproteínas hipotéticas de funções desconhecidas. Os genes foram amplificados por PCR a partir do DNA genômico da bactéria e clonados no vetor de expressão pAE. As proteínas recombinantes foram expressas em E. coli BL21 DE3 Star pLysS e purificadas por cromatografia de afinidade a metal. As proteínas recombinantes foram inoculadas em camundongos para avaliação da sua atividade imunogênica e obtenção de soros imunes. Ambas as proteínas recombinantes se mostraram reativas com anticorpos em soros de pacientes diagnosticados com a doença, apresentando uma sensibilidade maior em relação ao teste de aglutinação microscópica (MAT), e alta especificidade, diferenciando anticorpos presentes em soros de pacientes diagnosticados com outras doenças não relacionadas. Os resultados de ELISA de bactéria intacta, proteólise por proteinase K e imunofluorescência sugerem que ambas as proteínas estão localizadas na membrana externa bactéria. Com base no ensaio de conservação por western blotting, as proteínas nativas estão presentes em diferentes cepas patogênicas de Leptospira, e ausentes na espécie saprófita L. biflexa. Em ensaios de adesão in vitro, as proteínas recombinantes interagiram com os componentes humanos laminina, e-caderina, plasminogênio, fibrinogênio, fibronectina plasmática, vitronectina, C7, C8 e C9 de forma dose-dependentes, porém com valores de afinidade baixos. Estes resultados sugerem que as proteínas codificadas pelos genes LIC11711 e LIC12587 são expressas durante a patogênese e podem desempenhar múltiplas funções a partir da interação com diferentes componentes, e deste modo auxiliam nas etapas de invasão, disseminação e evasão do sistema imune, auxiliando as leptospiras no processo de infecção. / Leptospirosis is a zoonosis of global distribution caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira. The disease has a wide range of clinical manifestations in humans, which can present with fever, headaches and muscular pain, to a more severe clinical condition, known as Weil\'s syndrome, characterized by hemorrhages, jaundice, renal and hepatic failure. So far, the pathogenicity mechanisms of leptospira are not entirely clear and there is no effective vaccine against a disease. Sequencing of pathogenic leptospires genomes has enabled the identification of conserved outer membrane proteins among pathogenic strains, which are the main research focus to understand the mechanism of pathogenicity and possibly identify a vaccine candidate. In this sense, the genes LIC11711 and LIC12587 were selected from the genome sequence of Leptospira interrogans serovar Copenhageni by bioinformatics, which encode two hypothetical predicted lipoproteins of unknown functions. The genes were amplified by PCR from the genomic DNA of the bacteria and cloned into pAE expression vector. The recombinant proteins were expressed in E. coli BL21 DE3 Star pLysS and purified by metal affinity chromatography. Recombinant proteins were inoculated in mice to evaluate their immunogenic activity and to obtain immune sera. Both recombinant proteins are reactive with antibodies in sera from patients diagnosed with a disease, presenting higher sensitivity than the microscopic agglutination test (MAT), high specificity, differentiating antibodies present in sera from patients diagnosed with other non-specific diseases related. The results of intact bacterial ELISA, proteinase K proteolysis and Immunofluorescence suggest that both proteins are located in the surface of the bacteria. Based on western blotting conservation assay, the coding sequences are present in different pathogenic strains of Leptospira, and absent in the nom-pathogenic L. biflexa. In in vitro adhesion assays, recombinant proteins showed interaction with the human components laminina, e-cadherin, plasminogen, fibrinogen, plasma fibronectina, vitronectin, C7, C8 and C9, in dose-dependent manner, but with low affinity values. These results suggest that the proteins encoded by the genes LIC11711 and LIC12587 are expressed during the infection and may perform multiple tasks and thus assist in the steps of invasion, dissemination and evasion of the immune system, helping leptospires during the establishment of the disease.

A leptospirose é uma zoonose amplamente disseminada, causada pelo gênero patogênico de Leptospira. Essa doença apresenta grande interesse humano e veterinário, devido aos danos econômicos gerados. Em áreas urbanas, os roedores desempenham o papel de principais reservatórios da doença, pois albergam as leptospiras nos túbulos renais proximais e as excretam vivas na urina. Os humanos podem ser infectados de forma direta ou indireta, através de solo ou água contaminados. Após infecção pode-se apresentar sintomas leves ou mais severos como icterícia e hemorragia. O diagnóstico clínico da leptospirose é dificultoso devido aos sintomas iniciais serem comuns à de outras doenças. As vacinas existentes são baseadas em bactérias inativadas, não conferem proteção duradoura, além de serem específicas para os sorovares presentes na preparação. Atualmente, já foram identificados mais de 250 sorovares diferentes da bactéria, sendo assim, a identificação de proteínas da membrana externa conservadas entre diferentes espécies e sorovares de Leptospira e que podem interagir com o hospedeiro são os principais alvos de pesquisa para o desenvolvimento de vacinas. Estas proteínas podem induzir uma resposta imune no hospedeiro e são importantes para elucidar os mecanismos de patogenicidade. Deste modo, diversos estudos têm buscado caracterizar e identificar as proteínas de superfície que sejam antigênicas e presentes nos diversos sorovares de Leptospira interrogans. O primeiro passo deste trabalho foi avaliar por programas de bioinformática a localização celular, a presença de sinal de exportação e/ou lipidação, presença de domínios conservados e similaridade com outras sequências. Inicialmente, os genes LIC10562 e LIC13259 foram amplificados por PCR utilizando o DNA da L. interrogans. sorovar Copenhageni e os fragmentos de DNA gerados foram clonados no vetor pGEM T-Easy e subclonados no vetor de expressão pAE e expressas em cepas de Escherichia coli . As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade ao metal. A proteína recombinante codificada pelo gene LIC10562 apresentou dificuldades durante a purificação. Por esse motivo, os estudos com esse gene foram interrompidos. Por outro lado, a purificação da LIC13259 foi obtida com sucesso. Desse modo, a presença de estrutura secundária da rLIC13259 foi avaliada por dicroísmo circular e sua atividade imunogênica foi analisada após imunização em Camundongos Balb/c. Ensaios de localização celular demonstraram a exposição da proteína na superfície das bactérias, o que corrobora com as análises de bioinformática. Além disso, rLIC13259 foi reconhecida por soro de indivíduos infectados, sugerindo sua expressão durante a infecção. Ensaios de interação com componentes do hospedeiro mostraram que a proteína rLIC13259 foi capaz de se ligar a laminina, plasminogênio, vitronectina, C7, C8 e C9 de maneira dosedependente. Além disso, rLIC13259 foi capaz de recrutar estes componentes direto do soro humano, revelando a importância desta interação. A ligação de rLIC13259 com PLG foi capaz de gerar plasmina, sugerindo que esta proteína pode contribuir nos processos de invasão da bactéria no hospedeiro. A interação da rLIC13259 com os componentes do sistema complemento parece ocorrer via os domínios de heparina. Além disso, o envolvimento da proteína recombinante com C9 foi capaz de inibir a polimerização de C9, consequentemente, inibindo a formação do complexo de ataque à membrana (MAC). Em conjunto, nossos dados sugerem a participação da proteína LIC13259 nos mecanismos de invasão e evasão do sistema imune do hospedeiro. / Leptospirosis is a widely disseminated zoonosis, caused by the pathogenic genus Leptospira. This disease presents great human and veterinary interest due to economic. In urban areas, rodents are the major reservoir of the disease. The leptospires colonize the proximal renal tubules and shedding them live in urine. Humans can be infected directly or indirectly through contaminated soil or water. After the infection, mild or more severe symptoms such as jaundice and bleeding may occur. The clinical diagnosis of leptospirosis is difficult because the initial symptoms are common in other diseases. Existing vaccines are based on inactivated bacteria, do not confer lasting protection, and are serovar specific. Currently, more than 250 different serovars of the bacterium have been identified, therefore, the identification of outer membrane proteins conserved between different species and serovars of Leptospiraand that may interact with the host are the main research targets for the vaccine development. These proteins can serve as targets for the immune system of the host. Thus, several studies have sought to characterize and identify as surface proteins that are antigenic and present in the various serovars of Leptospira interrogans. The first step of this work was to evaluate the cellular localization, presence of export signal and / or lipidation, presence of conserved domains and similarity with other sequences through the bioinformatics programs. Initially, LIC10562 and LIC13259 genes were amplified by PCR using the L. interrogans serovar Copenhageni DNA. The generated DNA fragments were cloned into the pGEM T-Easy vector and subcloned into the pAE expression vector and expressed in strains of Escherichia coli. Recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography. The recombinant protein encoded by the LIC10562 gene presented difficulties during purification. For this reason, study with this gene has been discontinued. On the other hand, the purification of LIC13259 was successfully achieved. The presence of secondary structure of rLIC13259 was assessed by circular dichroism and its immunogenic activity was analyzed after immunization in Balb / c mice. Cell localization assays have demonstrated the exposure of the protein to the surface of the bacteria, which corroborates with bioinformatics analyzes. In addition, rLIC13259 was recognized by sera from infected individuals, suggesting its expression during infection. Interaction with host components showed that the rLIC13259 protein was able to bind laminin, plasminogen, vitronectin, C7, C8 and C9 in a dose-dependent manner. In addition, rLIC13259 was able to recruit these components directly from human serum, revealing the importance of this interaction. The binding of rLIC13259 to PLG was able to generate plasmin, suggesting that this protein may contribute to the invasion processes of the bacterium in the host. The interaction of rLIC13259 with components of the complement system appears to occur via the heparin domains. In addition, the involvement of the recombinant protein with C9 was able to inhibit the polymerization of C9, consequently,inhibiting a formation of the membrane attack complex. Taken together, our data suggest the participation of the LIC13259 protein in the mechanisms of invasion and evasion of the host immune system.

A leptospirose é uma doença sistêmica, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. O desenvolvimento de novas estratégias para prevenir a doença é necessário. As pesquisas atuais têm interesse em identificar antígenos conservados que estão envolvidos nas interações patógeno-hospedeiro. Dois genes de L. interrogans foram selecionados, clonados, expressos e suas respectivas proteínas caracterizadas. Os genes foram amplificados por PCR e clonados no vetor de expressão PAE. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade ao metal. A proteína rLIC10821 foi capaz de se ligar a laminina, plasminogênio e fibrinogênio. Ambas as proteínas foram localizadas na membrana externa de acordo com as três metodologias utilizadas: imunofluorescência, proteinase K, leptospira intacta. A proteína rLIC10821 que interagiu com o PLG foi capaz de gerar plasmina. Após a interação da proteína rLIC10821 com o fibrinogênio, foi possível identificar uma diminuição de 60% no coágulo de fibrina. / Leptospirosis is a systemic disease caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. The development of new strategies to prevent the disease is needed. Currently research has focused to identify conserved antigens related to the host-pathogen interaction. Two genes of L. interrogans were selected, cloned, expressed and its proteins characterized. The genes were amplified by PCR and cloned into expression vetor pAE. The recombinant proteins were purified by chromatography of metal affinity. The protein rLIC10821 were able to bind to laminin, plasminogen and fibrinogen. Both proteins were localized in the outer membrane according three methodologies: immunofluorescence, proteinase K, intact leptospira. The protein rLIC10821 interacted with PLG was able to generate plasmin. After the interaction of the protein rLIC10821 with fibrinogen, we could identify a decrease of 60% in the fibrin clot.

A leptospirose é uma zoonose, amplamente difundida pelo mundo, causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais silvestres e domésticos. A transmissão ocorre, principalmente, pelo contato direto com água e solo contaminados com a urina de animais infectados que podem ser clinicamente assintomáticos. As leptospiras patogênicas invadem os tecidos do hospedeiro através da penetração da pele lesada ou mucosas da boca, narina e olhos. Logo após ultrapassar as superfícies de contato, as bactérias chegam rapidamente à corrente sanguínea e espalham-se para todos os órgãos causando lesões, principalmente, no fígado e rins onde produzem hemorragia e necrose tecidual. Após a entrada no hospedeiro, a progressão da infecção envolve a adesão das bactérias às células eucarióticas e às proteínas de matriz extracelular seguida pela invasão aos tecidos. Estudos recentes demonstraram que as leptospiras são capazes de se translocarem através das monocamadas celulares, o que poderia ser um mecanismo de evasão do sistema imune e também facilitaria a entrada e saída da corrente sanguínea para infectar órgãos-alvo. O mecanismo envolvido na invasão do patógeno através das barreiras extracelulares não está bem elucidado. Enzimas capazes de degradar proteínas da matriz extracelular poderiam contribuir com a motilidade e quimiotaxia das bactérias durante a invasão. Bactérias patogênicas sintetizam e secretam diferentes tipos de proteases, que atuam degradando colágeno e glicoproteínas entre outras proteínas do hospedeiro. Recentemente, um estudo, utilizando gelatina e caseína como substratos e lisado bacteriano, mostrou haver uma variedade de proteases em Leptospira spp. Análises do genoma indicam a presença de vários genes que codificam prováveis proteases. A comprovação experimental da existência e a caracterização funcional destas proteínas poderão contribuir no entendimento da patogenia da leptospirose. Neste sentido, este trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e caracterização funcional de uma provável colagenase (ColA) de L.interrogans sorovar Copenhageni. As sequências codificantes do domínio de colagenase 1 (D1), do domínio de colagenase 2 (D2) e de ambos os domínios (Full) da ColA foram amplificadas por PCR a partir de DNA genômico de Leptospira e clonadas no vetor de expressão pAE. Os fragmentos D1, D2 e Full da ColA foram expressos em E. coli BL21 - SI e purificados a partir das frações insolúveis por cromatografia de afinidade a níquel. Os fragmentos recombinantes purificados foram utilizados na obtenção dos antissoros policlonais, e as atividades enzimáticas de cada um foram avaliadas. Os antissoros policlonais produzidos em coelho apresentaram elevados níveis de anticorpos detectados por ELISA. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína ColA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. As proteínas Full e D2 apresentaram atividade catalítica sobre o colágeno desnaturado e sobre peptídeo sintético e atividade hemorrágica em camundongos. Estes resultados indicam que ColA é provavelmente uma proteína de leptospira envolvidas na invasão de tecidos do hospedeiro. / Leptospirosis is a zoonosis widespread throughout the world, caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira, which colonize the renal tubules of wild and domestic animals. Transmission occurs mainly through direct contact with water and soil contaminated with urine of infected animals that may be clinically asymptomatic. Pathogenic leptospires invade host tissues by penetrating damaged skin or the mucous membranes of the mouth, nostrils and eyes. Soon after passing the contact surfaces, leptospires come quickly into the bloodstream and spread to all organs causing damage mainly in the liver and kidneys where they produce hemorrhage and tissue necrosis after entering the host, the progression of the infection involves the adhesion of bacteria to eukaryotic cells and extracellular matrix proteins followed by invasion of tissues. Recent studies have shown that leptospires are able to translocate across cell monolayers, which could be a mechanism for evasion of the immune system and also facilitate the entry and exit from the bloodstream to infect target organs. The mechanism involved in pathogen invasion through extracellular barriers is not well elucidated. Enzymes capable of degrading extracellular matrix proteins could contribute to motility and chemotaxis of bacteria during the invasion. Pathogenic bacteria synthesize and secrete different types of proteases that degrade collagen and glycoproteins among other host proteins. Recently, a study using gelatin and casein as substrates and bacterial lysate showed a variety of proteases in Leptospira spp. Analysis of the genome indicate the presence of several genes encoding probable protease. The experimental proof of the existence and functional characterization of these proteins may contribute to the understanding of the pathogenesis of leptospirosis. In this sense, this work aimed the cloning, expression and functional characterization of a probable collagenase (ColA) from L.interrogans serovar Copenhageni. Coding sequences of the collagenase domain 1 (D1), collagenase domain 2 (D2), and both domains (Full) of the ColA gene were amplified by PCR from genomic Leptospira DNA and cloned into the pAE expression vector. The D1, D2 and Full fragments of ColA protein were expressed in E. coli BL21-SI and purified from the insoluble fractions by nickel affinity chromatography. The purified fragments were used to obtain the polyclonal antiserum, and their enzymatic activities were evaluated by zymography. Rabbit polyclonal antiserum against the recombinant protein fragments were produced with a high antibody level detected by ELISA. Western-blotting experiments demonstrated the presence of ColA protein in different pathogenic serovars of Leptospira. The Full and D2 proteins showed catalytic activity on denatured collagen and synthetic peptide and hemorrhagic activity in mice. These results indicated that ColA is probably a leptospiral protein involved in invasion of host tissues.

A leptospirose é considerada a zoonose mais difundida do mundo, assim como uma doença reemergente. Esta enfermidade, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, possui altas taxas de infecção em países em desenvolvimento, ocasionando graves prejuízos econômicos e de saúde pública. Até o momento, não existem vacinas humanas licenciadas contra leptospirose. Após o seqüenciamento do genoma de três espécies de Leptospiras vários genes foram apontados como candidatos vacinais promissores. Uma categoria importante de genes candidatos são aqueles com possível atividade hemolítica. Neste trabalho, clonamos e expressamos diversas proteínas com possível atuação hemolítica. As proteínas recombinantes obtidas, no entanto, não exibiram atividade hemolítica. Uma destas proteínas, TlyC, foi investigada quanto à sua capacidade de interagir com os componentes da matriz extracelular (MEC). Os resultados obtidos indicam que TlyC liga-se com alta afinidade a diversos componentes da MEC, e que esta proteína é capaz de inibir competitivamente a adesão de Leptospiras à um material biológico que se assemelha à MEC. A transcrição e expressão destas proteínas foi detectada em cultura de Leptospira. Algumas das proteínas recombinantes foram utilizadas em um desafio animal contra leptospirose, mas nenhum delas foi protetora. Concluímos que estas proteínas não parecem ser bons candidatos vacinais e que TlyC é uma proteína que interage com componentes da MEC. / Leptospirosis is considered the most disseminated zoonosis of the world, and also a reemerging disease. This disease, caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira, has high rates of infection in developing countries, leading to severe economic and medical costs. There is not a licensed vaccine against leptospirosis for human use. After the genome sequencing of three species of leptospires, several genes were pointed to be promising vaccinal candidates. An important category of these candidates are those with putative hemolytic activity. In this work, we cloned and expressed some proteins with putative hemolytic activity. The recombinant proteins obtained, however, did not show hemolytic activity. One of these proteins, TlyC, was investigated with regard to its possible ability to interact to extracellular matrix (ECM) components. The results obtained indicate that TlyC binds with high affinity to several ECM components and that this protein can inhibit the Leptospira bind to a biological material that ressambles the ECM. The transcription and expression of these proteins were detected in leptospires cultures. Some of the recombinant proteins were used in an animal challenge against leptospirosis, but none of them were protective. We conclude that these proteins do not seem to be good vaccine candidates and that TlyC is a protein that interacts with the ECM and its components.

O sequenciamento da L. interrogans sorovar Copenhageni e as análises bioinformáticas permitiram a identificação de candidatos vacinais e fatores de virulência. Foram selecionados dois genes, LIC11834 e LIC12253, que foram submetidos a ensaios de presença do DNA genômico e RNA mensageiro em diferentes sorovares de Leptospira. Observamos que o gene LIC12253 foi o mais presente entre os sorovares testados. Os genes foram clonados em vetor de expressão pAE e expressos em E. coli BL21 SI. As proteínas recombinantes foram purificadas e submetidas a ensaio de dicroísmo circular, o qual confirmou que ambas as proteínas estavam estruturadas. Por meio de testes de imunogenicidade em camundongos, ambas as proteínas mostraram-se imunogênicas, apresentando altos títulos de anticorpos, porém não foram capazes de promover resposta imune celular. Em ensaios de localização das proteínas nativas podemos observar a presença destas proteínas na membrana externa de Leptospira. Ensaios de reatividade com soros de pacientes diagnosticados com leptospirose mostraram que há reconhecimento das proteínas por anticorpos presentes nesses soros, sugerindo que as proteínas são expressas durante a infecção. Em ensaios de adesão a componentes de matriz extracelular e componentes do soro e plasma humano, rLIC11834 apresentou ligação à laminina, sendo nomeada de Lsa33, além de ligação ao plasminogênio, ao C4bp e ao fibrinogênio de forma dose-dependente; rLIC12253 apresentou ligação à laminina, sendo chamada de Lsa25, e ao C4bp de forma dose-dependente. Ensaios de desafio demonstraram que as proteínas não apresentam proteção contra infecção letal em hamsters. Assim, acreditamos que estas proteínas multifuncionais possam interagir com proteínas do hospedeiro e ter participação na patogênese da doença. / The genomic sequencing and the advances of bioinformatics analysis allowed the identification of new vaccine candidates and new virulence factors. Therefore, two genes from L. interrogans serovar Copenhageni, LIC11834 and LIC12253 were selected and subjected to assays for the presence of genomic DNA and mRNA in different serovars of Leptospira. These assays found that the gene LIC12253 was the most present among the tested serovars. The genes were then cloned in the expression vector pAE and expressed in E. coli BL21 SI. The recombinant proteins were purified and subjected to circular dichroism, which confirmed that both proteins presented secondary structures. Immunogenicity tests in mice showed that both proteins are immunogenic, with high antibodies titers, but don\'t induce cellular immune response. Localization assays of the native proteins on the leptospiras demonstrated the presence of the proteins on the surface of Leptospira. Reactivity assays with sera of patients diagnosed with leptospirosis showed that the recombinant proteins could be recognized by their antibodies, suggesting that they are expressed during infection. Adhesion assays to the extracellular matrix components, human serum and plasma components, showed that the protein rLIC11834 binds to laminin and was called Lsa33. In addition, Lsa33 interacts to plasminogen, to C4bp and to fibrinogen in a dose-dependent manner. The protein rLIC12253 showed binding to laminina, named Lsa25, and to C4bp in a dose-dependent manner. Challenge assays showed that both recombinant proteins don\'t afford protection against lethal infection in hamsters. Thus, we believe that these multifunctional proteins may interact with host proteins and may play a role in leptospiral pathogenesis.

Para relacionar possíveis variáveis para infecção pelos agentes N. caninum, B. abortus e Leptospira spp em rebanhos bovinos do Estado do Pará utilizando a frequência de anticorpos foram colhidas amostras de sangue de 3466 vacas provenientes de 176 propriedades, nas quais um questionário foi aplicado. A prova de RIFI foi utilizada para pesquisa de anticorpos anti-N.caninum; a prova de triagem do AAT seguida pela SAL e 2-ME como confirmatórias para pesquisa de anticorpos anti-B. abortus; e o método de SAM para pesquisar anticorpos contra Leptospira spp., utilizando uma bateria de 22 antígenos. As análises estatísticas foram realizadas pelas provas do Qui-quadrado (X2) e Mann-Whitney, com intervalo de confiança de 95%. A ocorrência de anticorpos anti-N. caninum, B. abortus e Leptospira spp. em bovinos foi de 14,7%, 3,7% e 65,5% em 87,4%, 41,3% e 98,8% das propriedades analisadas, respectivamente. O sorovar Hardjo foi o mais freqüente, seguido por Wolffi, Grippotyphosa e Hebdomadis, e o mais provável causador da infecção nos animais, seguido de Grippotyphosa, a associação Hardjo+Wolffi e a sorovariedade Wolffi. A presença de abortamentos foi associada à ocorrência de N.caninum (p<0,05), assim como a realização de inseminação artificial e o destino inadequado dos produtos de abortamento foram associados à ocorrência de anticorpos anti-B. abortus e a presença de cães, destino inadequado de vacas que abortaram e a inseminação artificial foram variáveis associadas à ocorrência das sorovariedades Hardjo, Grippotyphosa e Hebdomadis. Demonstrou-se a necessidade de um controle sanitário efetivo para neosporose e leptospirose e de mais estudos para determinar a causa da alta ocorrência do sorovar Grippotyphosa, que pode estar relacionada com a degradação ambiental / Aiming for association of possible infection variables with antibodies frequency of the agents N. caninum, B. abortus and Leptospira spp., 3466 female cattle from 176 herds were examined and a inquiry was applied. IFAT was used for research of antibodies against N. caninum; serum samples were examined for B. abortus antibodies using TAA trial test and SAA plus 2-ME for confirmation; and antibodies against Leptospira spp. were searched using MAT, with a 22 antigens battery. Statistical analysis were performed using Chi-Square (X2) and Mann-Whitney tests, with 95% confidence interval. Occurrence of antibodies against N. caninum, B. abortus and Leptospira spp. in cattle was 14,7%, 3,7% and 65,5% in 87,4%, 41,3% and 98,8% of analysed herds, respectively. Serovar Hardjo was the most frequent, followed by Wolffi, Grippotyphosa and Hebdomadis, and also most probable responsible for infection in animals, followed by Grippotyphosa, Hardjo+Wolffi association and serovar Wolffi. Occurrence of anti-N. caninum antibodies was associated with abortion presence (p<0,05), as artificial insemination and inappropriate destination of abortion products were linked with frequency of antibodies against B. abortus and occurrence of antibodies anti-Hardjo, Grippotyphosa and Hebdomadis was associated with dog presence, inappropriate destination of aborting cows and artificial insemination. It was demonstrated lack of sanitary control for neosporosis and leptospirosis and also necessity for more studies to determine causes for serovar Grippotyphosa high occurrence, condition that may be related with environmental destruction

A leptospirose é uma zoonose mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais domésticos e silvestres e são liberadas ao ambiente externo pela urina. Neste estudo avaliou-se a interação de seis prováveis lipoproteínas de membrana externa de leptospira com as proteínas do hospedeiro: colágeno I, colágeno IV, elastina, fibrinogênio, fibronectina celular e plasmática, laminina e plasminogênio. Os experimentos de adesão demonstraram que as proteínas recombinantes Lp21, Lp22 e Lsa30 apresentaram interação com os componentes do hospedeiro de maneira dose-dependente. Estas aderiram à fibronectina plasmática e laminina, além destes, a Lp21 e a Lp22 interagiram com plasminogênio, a Lp22 e a Lsa30 interagiram com colágeno IV. A Lp22 aderiu à elastina e ao fibrinogênio. No estudo de conservação gênica, os genes que codificam estas proteínas foram observados somente nas Leptospiras patogênicas. Portanto estas proteínas devem contribuir na adesão aos tecidos do hospedeiro na patogênese da Leptospira. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira that colonize the renal tubules of wild and domestic animals and are excreted in the environment by their urine. The aim of this work was to study the interaction of six leptospiral probable outer-membrane lipoproteins with host proteins: collagen I, collagen IV, elastin, fibrinogen, cellular fibronectin, plasma fibronectin, laminin, and plasminogen. The binding experiments demonstrated that the recombinant proteins showed interaction with host components in a dose-dependent manner were Lp21, Lsa30 and Lp22. These proteins adhered to plasma fibronectin and laminin, in addition to these components, Lp21 and Lp22 interacted with plasminogen, Lp22 and Lsa30 interacted with collagen IV. The Lp22 adhered to elastin and fibrinogen. The genes encoding the probable lipoproteins were found only in pathogenic Leptospira. These results demonstrated that these proteins may contribute in the adhesion to host tissues, in the pathogenesis of Leptospira.