Introdução: A leucemia linfoide aguda (LLA) \"BCR-ABL1-like\" exibe um perfil de expressão gênica semelhante ao observado em pacientes com LLA BCR-ABL1+. Este subtipo representa até 15% de todos os casos de LLA de linhagem B na população pediátrica e é frequentemente associado à presença de deleção total ou parcial do gene IKZF1. As isoformas de domínio negativo têm sido associadas a um aumento na chance de falha de resposta ao tratamento e tem sido associada com pior prognóstico. Objetivos: Analisar a presença de deleções do gene IKZF1 e a expressão de suas isoformas em amostras de medula óssea ao diagnóstico de crianças com LLA por técnica simplificada e de baixo custo de RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) e avaliar a associação desta alteração com fatores clínicos, biológicos e sobrevida. Metodologia: Foram analisadas 137 amostras de medula óssea colhidas ao diagnóstico de crianças com LLA, sendo 100 amostras de LLA de linhagem B, 35 de linhagem T e 2 na qual não foi possível a definição do imunofenópo, todas classificadas e tratadas segundo o protocolos GBTLI-99. A presença de deleções das isoformas do gene IKZF1 foi analisada por técnica de RT-PCR e confirmadas por sequenciamento automático. Associação entre deleção do IKZF1 e as variáveis idade, número de glóbulos brancos, grupo de risco, subgrupo molecular, presença de doença residual mínima e evento (recidiva ou óbito) foi analisada pelo teste exato de Fisher. Sobrevida livre de eventos, sobrevida livre de doença e sobrevida global foram avaliadas por curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank. Análise multivariada por modelo de regressão de Cox foi utilizada para testar a independência dos fatores prognósticos. Resultados: Deleção total ou parcial no gene IKZF1 foi observada em 27/100 amostras de LLA B-derivada, sendo 15 evidenciando hiperexpressão das isoformas 6 ou 10, em 9 a expressão das isoformas foi de fraca intensidade e em 3 houve deleção total do gene. Nas amostras de LLA T-derivada foram observadas 3 alterações sendo 2 hiperexpressões da isoforma Ik6 e uma deleção total do gene. Presença de expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 de IKZF1 foi associada na LLA B-derivada com pior sobrevida livre de eventos (SG), sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida global (SG)(P<0,001)). A presença de qualquer deleção do gene teve impacto apenas na SG (P=0,003). A sobrevida livre de eventos em 5 anos foi de 78,1 ± 4,6% versus 32 ± 12,4 % (P< 0,001), para os grupos sem e com expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 forte de IKZF1 respectivamente, com risco relativo de evento desfavorável de 6.034 (95% IC: 2,105 - 17,295) para a presença da deleção. Análise multivariada por modelo de regressão de Cox nas LLA de linhagem B mostrou que expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 foi o principal fator prognóstico independente (P<0.001) quando analisada em associação com idade, imunofenótipo (ausência de CD10), status da medula óssea no D28 da terapia de indução (M2/M3) e presença de DRM no D28 da indução tanto para SLE, quanto para SLD e SG. Nossos dados sugerem que o uso de técnica simplificada e de baixo custo para análise de deleções do gene IKZF1 é capaz de detectar pacientes com maior risco de recidiva, podendo ser útil na estratificação de pacientes com LLA de linhagem B em futuros protocolos de tratamento. Estudos multicêntricos com maior número de casos são necessários para confirmação destes resultados. / Introduction: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) \"BCR-ABL1-like\" exhibits a gene expression profile similar to that observed in patients with BCR-ABL1 + ALL. This subtype accounts for up to 15% of all B lineage ALL cases in the pediatric population and is often associated with the presence of total or partial deletion of the IKZF1 gene. Negative domain isoforms have been associated with an increased chance of treatment failure and have been associated with poorer prognosis. Objectives: To analyze the presence of deletions of the IKZF1 gene and the expression of its isoforms in bone marrow samples to the diagnosis of children with ALL by simplified technique and lowcost RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) and to evaluate the association of this with clinical, biological and survival factors. Methodology: It has been analyzed 137 bone marrow samples collected at the diagnosis of children with ALL, 100 samples of ALL B lineage , 35 of T lineage and 2 in which it was not possible to define the immunophenotype, all classified and treated according to GBTLI protocols -99. The presence of deletions of the IKZF1 gene isoforms was analyzed by RT-PCR technique and confirmed by automatic sequencing. The association between IKZF1 deletion and the variables age, white blood cell count, risk group, molecular subgroup, presence of minimal residual disease and event (recurrence or death) were analyzed by the Fisher exact test. Event-free survival, disease-free survival and overall survival were assessed by Kaplan-Meier curves and log-rank test. Multivariate analysis by Cox regression model was used to test the independence of prognostic factors. Results: Total or partial deletion in the IKZF1 gene was observed in 27/100 samples of B-derived ALL, 15 of which showed hyperexpression of isoforms 6 or 10, in 9 the expression of the isoforms was of low intensity and in 3 there was total deletion of the gene . In the T- derived ALL samples, 3 alterations were observed, 2 hyperexpressions of the Ik6 isoform and a total deletion of the gene. The presence of strong Ik6/Ik10 isoform expression was associated in B-derived ALL with worse event-free survival (SLE), disease-free survival (SLD), and overall survival (OS) (P <0.001). The presence of any deletion of the gene had an impact only on the SLE (P = 0.003). The 5-year event-free survival was 78.1 ± 4.6% versus 32 ± 12.4% (P <0.001), for the groups with and without a strong deletion of IKZF1 respectively, with relative risk of unfavorable event of 6,034 (95% CI: 2,105 - 17,295) for the presence of the deletion. Multivariate analysis by Cox regression model in B lineage ALL showed that the strong expression of Ik6 / Ik10 isoforms was the main independent prognostic factor (P <0.001) when analyzed in association with age, immunophenotype (absence of CD10), marrow status bone in D28 of induction therapy (M2 / M3) and presence of DRM in induction D28 for both SLE, SLD and SG. Our data suggest that the use of simplified and low-cost IKZF1 gene deletion analysis is capable of detecting patients at higher risk of relapse and may be useful in the stratification of patients with B lineage ALL in future treatment protocols. Multicentric studies with a greater number of cases are necessary to confirm these results.

A L- asparaginase é uma enzima aplicada no tratamento de Leucemia Linfoide Aguda, que atua na hidrólise da L- asparagina, privando a célula tumoral de um aminoácido essencial para o seu crescimento. A L- asparaginase, como outros biofármacos, deve ser estável, manter sua atividade específica e formar poucos agregados. A fim de manter a integridade do biofármaco, são utilizados adjuvantes nas formulações farmacêuticas, e dentre os mais importantes estão os osmólitos. Essas moléculas protegem a estrutura nativa da proteína, sendo capazes de interferir na formação de agregados e garantir a estabilidade proteica. O presente trabalho teve o objetivo de estudar o efeito dos osmólitos sacarose, sorbitol, arginina e glicina na atividade específica, estabilidade, cinética e caracterização de agregados na solução de L- asparaginase II de Erwinia chrysanthemi. Os resultados mostraram que a maioria dos osmólitos testados aumentou a atividade específica e a estabilidade da enzima, o que pode estar relacionado com o aumento da velocidade máxima e do kcat observados no ensaio cinético realizado com sacarose e sorbitol. Um perfil diferente de agregados foi encontrado para cada tipo de osmólito. A presença de sacarose ou sorbitol resultou na menor quantidade de agregados na faixa de, respectivamente, 100 a 200 e 200 a 300 nm em relação a enzima sem osmólito. Por outro lado, aumento no número total de agregados e presença de moléculas de alto peso molecular (300 a 500 nm) foram observados nas soluções enzimáticas contendo, respectivamente, glicina e arginina. Dessa forma, os resultados obtidos neste trabalho poderão auxiliar na produção e escolha da formulação de biofármacos, e, consequentemente, melhorar o tratamento medicamentoso de pacientes. / L L-Asparaginase is an enzyme applied in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia, which acts on the hydrolysis of L- asparagine, depriving the tumor cell of an essential amino acid for its growth. L-asparaginase, as other biopharmaceuticals, must be stable, maintain its specific activity and form few aggregates. In order to maintain the integrity of the biopharmaceutical, adjuvants are used in the pharmaceutical formulations, and among the most importants adjuvants are the osmolytes. These molecules protect the native structure of the protein, being able of interfering in the formation of aggregates and guarantee protein stability. The present work had the objective of studying the effect of the osmolytes sucrose, sorbitol, arginine and glycine in the specific activity, stability, kinetic and aggregates characterization, in L- asparaginase II solution of Erwinia chrysanthemi. The results showed that the majority of the tested osmolytes increased the specific activity of the enzyme and its stability, which may be related to the augment of maximum velocity and kcat observed in the kinetic assay performed with sucrose and sorbitol. A different profile of aggregates was found for each type of osmolyte. The presence of sucrose or sorbitol resulted in the least amount of aggregates in the range of, respectively, 100-200 and 200-300nm in relation to the enzyme without osmolyte. On the other hand, increase in the total number of aggregates and the presence of high molecular weight molecules (300 to 500 nm) were observed in the enzymatic solutions containing, respectively, glycine and arginine. Thus, the results obtained in this work may help in the production and choice of the formulation of biopharmaceuticals and, consequently, improve the drug treatment of patients.

A leucemia linfoide aguda (LLA) compreende um grupo heterogêneo de neoplasias caracterizadas por proliferação anormal e acúmulo de células imaturas na medula óssea, o que prejudica a produção de eritrócitos, leucócitos e plaquetas. O fator de crescimento semelhante à insulina 1 (insulin-like growth factor 1; IGF1) e seu receptor (IGF1R) regulam o crescimento celular normal e contribuem para a transformação e crescimento de células malignas através da ativação de vias de sinalização intracelular. A via de sinalização do IGF1 é iniciada através da ativação de seu receptor seguido da ativação de seus substratos, incluindo o substrato 1 do receptor de insulina (insulin receptor substrate 1; IRS1). IRS1 é uma proteína predominantemente citosólica envolvida na transdução de sinal, e também desempenha um papel na transformação maligna, sendo altamente expresso em muitos tipos de câncer. Em fibroblastos de camundongos, Irs1, através da sinalização do Igf1, foi descoberto como uma proteína chave para a translocação nuclear da ?-catenina e ativação da transcrição de seus genes alvos, como o Myc e a ciclina D1. MYC e ciclina D1 podem atuar como oncogenes, contribuindo para o desenvolvimento de diversas neoplasias, inclusive as hematopoéticas. Deste modo, o objetivo deste projeto de pesquisa foi investigar a participação do IRS1 nuclear na via da ?-catenina em LLA. Foram utilizadas no estudo linhagens celulares de LLA (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa) e células hematopoéticas primárias de doadores normais (n=13) e de pacientes adultos com LLA (n=45) atendidos em nossa Instituição. Estudos de expressão gênica (PCRq), expressão, associação proteica (western blotting, imunoprecipitação) e localização celular (fracionamento subcelular e microscopia confocal) foram utilizados. Células da linhagem Jurkat foram submetidas à estimulação com IGF1 e/ou inibição farmacológica de IGF1R (OSI-906). Observamos elevada expressão gênica relativa de IRS1, ?-catenina e MYC nos pacientes com LLA quando comparada aos controles normais (p<0,05), mas não houve diferença na expressão gênica de ciclina D1 e IGF1R entre os dois grupos. Observamos uma correlação positiva entre a expressão gênica de ?-catenina e MYC (p=0.0004; r=0.50), e entre a expressão de IRS1 e MYC (p=0.001; r=0.45) na coorte de pacientes com LLA. Na análise univariada, idade e expressão de MYC correlacionaram-se negativamente com a sobrevida global de pacientes com LLA; idade foi fator independente de prognóstico para a sobrevida. Em linhagens celulares de LLA (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa), observamos co-localização de IRS1 e ?-catenina no núcleo e no citoplasma. Em células primárias de doador normal, IRS1 e ?-catenina localizaram-se predominantemente no citoplasma. Em células da linhagem celular Jurkat, observamos interação entre IRS1 e ?- catenina e o estímulo com IGF1 provocou o aumento da fosforilação em tirosina de IRS1. O tratamento com OSI-906 diminuiu a fosforilação em tirosina de IGF1R, a translocação nuclear de ?-catenina e a expressão proteica de MYC em células Jurkat. Em conclusão, nossos dados suportam uma relação entre a via de sinalização IGF1R/IRS1 e a ativação da ?- catenina em leucemia linfoide aguda, o que pode representar um importante eixo de sinalização envolvido na fisiopatologia da doença. / The acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a heterogeneous group of malignancies characterized by abnormal proliferation and accumulation of immature cells in the bone marrow, which impairs the production of erythrocytes, leukocytes and platelets. Insulin-like growth factor 1 (IGF1) and its receptor (IGF1R) regulate normal cell growth and contribute to transformation and growth of malignant cells through activation of downstream signaling pathways. The IGF1 signaling pathway is initiated through activation of its receptor followed by activation of its substrates, including insulin receptor substrate 1 (IRS1). IRS1 is well known as a cytosolic protein involved in signal transduction, but also plays a role in malignant transformation, being highly expressed in many cancers. In mouse fibroblasts, Irs1, through Igf1 signaling, was found to be the key protein for nuclear translocation of ?-catenin and transcription activation of its target genes, such as Myc and cyclin D1. MYC and cyclin D1 may act as oncogenes, contributing to the development of cancers, including hematopoietic neoplasm. Thus, the aims of this study were to investigate the role of nuclear IRS1 in the ?-catenin pathway in LLA. We used in the study ALL cell lines (Jurkat, MOLT-4, Namalwa and Raji) and primary hematopoietic cells from healthy donors (n=13) and from adult patients with ALL (n=45) treated at our Institution. Studies of gene expression (qPCR), protein expression, association (Western blotting and immunoprecipitation) and cell location (subcellular fractionation and confocal microscopy) were used. Jurkat cells were submitted to IGF1 stimulation and/or IGF1R pharmacological inhibition (OSI-906). IRS1, ?-catenin and MYC relative gene expression were significantly elevated in ALL patients compared to normal controls (p<0.05), but there was no difference in gene expression of cyclin D1 and IGF1R between the two groups. A positive correlation between ?-catenin and MYC relative expression (p=0.0004; r=0.50) and between IRS1 and MYC expression (p=0.001; r=0.45) was found. Univariate analysis revealed that increasing age and elevated expression of MYC are factors that adversely affect the overall survival; age was an independent prognostic factor for survival. IRS1 and ?-catenin co-localized in the nucleus and cytoplasm of ALL cell lines (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa). In primary cell of normal donor, IRS1 and ?-catenin were found predominantly in the cytoplasm. In Jurkat cells, a constitutive IRS1 and ?-catenin protein interaction was observed and IGF1 stimulation increased IRS1 tyrosine phosphorylation. OSI-906 treatment decreased IGF1R tyrosine phosphorylation, nuclear translocation of ?-catenin and MYC protein expression in Jurkat cells. In conclusion, our data support a link between the signaling pathway IGF1R/IRS1 and activation of ?-catenin in acute lymphoblastic leukemia, which may represent an important axis involved in the pathophysiology of the disease.

Orientador: Jose Andres Yunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T02:57:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ganazza_MonicaAparecida_M.pdf: 2462267 bytes, checksum: 471302ae0756c283d944a7545a0ff930 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A leucemia linfóide aguda (LLA) é o câncer mais comum da infância. Os atuais protocolos de tratamento da LLA levam à cura em 70% dos casos e parte do sucesso se deve à aplicação de diferentes tratamentos para os pacientes estratificados em diferentes grupos de risco, segundo fatores prognóstico pré-tratamento (contagem leucocitária e idade ao diagnóstico). Contudo, pacientes considerados em remissão podem apresentar conteúdo substancial de células neoplásicas, chamada doença residual mínima (DRM), cuja proliferação está associada com a recaída da doença e que podem estar em níveis indetectáveis pelas técnicas convencionais de análise morfológica. Vários trabalhos têm mostrado que é possível prever a evolução clínica dos pacientes com base na DRM, porém, no protocolo do Grupo Brasileiro de Tratamento da Leucemia Infantil (GBTLI), a DRM não é utilizada como critério de realocação dos pacientes nos grupos de risco. Desta forma, o presente estudo objetivou (1) obter dados prospectivos de DRM com o uso de reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção de rearranjos de genes de imunoglobulina (Ig) e receptores de células T (TCR); (2) comparar resultados de DRM com fatores prognósticos ao diagnóstico e de resposta utilizados nos protocolos do GBTLI e (3) avaliar o valor preditivo da DRM em pacientes tratados pelo protocolo GBTLI-99. No total, foram estudadas 91 amostras de LLA pediátrica classificadas e tratadas pelo protocolo GBTLI-99. Duas metodologias foram empregadas, metodologia do grupo brasileiro (91 casos) e metodologia Biomed-1 (78 casos), as quais são baseadas em PCR com primers consenso para as regiões VDJ das imunoglobulinas e TCR seguido por análise de formação de homo/heteroduplex. Ambos métodos mostraram-se tecnicamente factíveis, reprodutíveis e capazes de detectar marcadores moleculares para a análise da DRM na maioria dos casos, a saber, 2 ou mais marcadores de DRM em 85,7 e 76,9% do total das amostras analisadas, respectivamente. As mesmas metodologias foram aplicadas para a análise da DRM nos dias 14 e 28 da terapia de indução e demonstraram concordância de 96% na detecção da DRM. Gênero masculino, idade <1 e _ 9 anos, imunofenótipo LLA-T, classificação em alto risco, ausência de CD10, presença de blastos no dia 14, presença de mais de 5% de blastos leucêmicos na medula óssea (MO) do D14 e resposta ao tratamento associaram-se com DRM positiva no D14. Já DRM positiva no D28 mostrou estar associada com imunofenótipo LLA-T, ausência de calla (CD10), presença de mais de 5% de blastos leucêmicos na MO no D28 e resposta ao tratamento. O valor preditivo da DRM, nas condições testadas, mostrou-se pouco útil para casos classificados como sendo de risco baixo pelo GBTLI/99. Para casos de alto risco, entretanto, a ausência de DRM no D14 caracteriza um grupo de pacientes com sobrevida similar a pacientes de risco básico. Novos protocolos para análise da DRM foram propostos baseados nas metodologias aplicadas no presente estudo visando otimizar o tempo e minimizar os custos / Abstract: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common pediatric cancer. The recent ALL treatment protocols can achieve the complete remission in 70% of cases and this success is due to different treatments for patients stratified into different risk groups , according to pre-treatment prognostic factors (white count cells and diagnosis age). Therefore, patients considered in remission may have substantial contents of neoplasic cells, the minimal residual disease (MRD). The proliferation of such neoplasic cells is associated with disease relapse and they can be undeteced by conventional methods. It has been demonstrated that the clinical evolution of patients based on MRD can be forecasted. Therefore, in the Brazilian Group for Childhood Leukemia Treatment (GBTLI), MRD is not used as a reallocation criterion of patients in risk groups. The present study aimed to (1) obtain MRD data through the use of polymerase chain reaction (PCR) for the detection of immunoglobulin (Ig) and T cell receptor genes rearrangements (TCR); (2) compare the results of MRD with prognostic factors at diagnosis and response factors used in the GBTLI protocols and (3) estimate the predictive value of MRD in patients treated by the GBTLI-99 protocol. In total, 91 samples of pediatric ALL classified and treated with the GBTLI-99 protocol were studied using two methodologies: Brazilian group methodology (91 cases) and Biomed-1 methodology (78 cases), both using the consensus PCR primers for the immunoglobulin and TCR VDJ regions followed by homo/heteroduplex formation. These methods were feasible, reproducible and able to detect molecular markers for MRD analysis in most cases, since they provided the detection of two or more markers in 85,7% and 76,9% of the samples analyzed, respectively. The same methodologies were applied in the MRD analysis on days 14 and 28 of induction therapy and the results are in agreement in 96% of the MRD detection. Male, age (<1 e _ 9 years), immunophenotyping (T-ALL), high risk classification, calla (CD10) absence, presence of blasts in peripheral blood on day 14, presence of more than 5% of leukemic blasts in the bone marrow (BM) on day 14 of treatment response were associated with positive MRD on D14. Already, positive MRD on day 28 of treatment were associated with immunophenotyping (T-ALL), CD10 absence, presence of more than 5% of leukemic blasts in the BM on D28 and treatment response. MRD predictive value on the conditions tested proved to be useful for the patients classified by GBTLI/99 as basic risk. However, for high risk cases, the absence of MRD on D14 defines a new group of patients with similar survival to basic risk patients. New protocols to the MRD analysis were proposed based on methodologies applied in this study to optimize the time and minimize the costs / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientadores: José Andrés Yunes, Ana Carolina de Mattos Zeri / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T13:46:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Canevarolo_RafaelRenatino_M.pdf: 3376497 bytes, checksum: f3e8edf217e0d57089ffcffbe4a8097a (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O uso intensivo e combinado de diferentes quimioterápicos tem permitido a cura de 70-80% das leucemias linfóides agudas (LLA) da infância, sendo que a recaída da doença decorre em grande parte da resistência intrínseca das células leucêmicas à quimioterapia. Alguns dos quimioterápicos utilizados na LLA são inibidores metabólicos, como o metotrexato (MTX), antagonista do ácido fólico, que impede a divisão celular ao inibir a síntese de nucleotídeos. Em uma abordagem metabolômica, foi investigada a associação entre linhagens leucêmicas resistentes ou sensíveis ao MTX e metabólitos biondicadores de cada um destes fenótipos. Seis linhagens celulares B-derivadas e oito T-derivadas foram classificadas como sendo resistentes ou sensíveis ao MTX pelo método do 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT) após 48h de co-cultura com diferentes concentrações da droga. Cinco linhagens foram classificadas como resistentes e nove como sensíveis ao MTX. Após 24h de cultura na presença ou ausência de MTX (ambos em triplicata), os metabólitos intracelulares das linhagens foram acessados por ressonância magnética nuclear (RMN) numa abordagem metabolômica. Ao total, oitenta e quatro metabólitos foram quantificados, dos quais 72 foram também identificados. A análise de componentes principais (PCA) não conseguiu segregar as amostras de acordo com sua resistência, ao passo que a análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) foi efetiva nesta separação. Os metabólitos mais relevantes para a construção dos modelos de classificação quanto à resistência ao MTX, tanto para amostras tratadas quanto controles foram: ATP, dimetilglicina, fosfocolina e sarcosina (associados à resistência); carnitina, CB-09 (composto não identificado), colato, fumarato, glicocolato, lactato, malato e succinato (associados à sensibilidade ao MTX). A capacidade de classificar corretamente as amostras em sensíveis ou resistentes foi obtida com a construção de curvas da característica operativa do receptor (ROC) para os metabólitos individualmente. Os metabólitos com desempenho bom ou excelente na análise ROC (AUC>0,8) foram selecionados para comporem "testes diagnósticos" de classificação de amostras. De todas as combinações possíveis dentre os metabólitos selecionados, o teste que considerou a combinação de carnitina, sarcosina e succinato em amostras não tratadas com MTX apresentou sensibilidade de 100% (identificou todas as 15 amostras resistentes) e especificidade de 92,3% ao classificar corretamente 24 de 26 amostras sensíveis. O melhor teste diagnóstico para amostras tratadas com MTX considerou as concentrações de CB-MTX, glicocolato, sarcosina e succinato; apresentou sensibilidade de 100% (identificou as 15 amostras resistentes) e especificidade de 85,2%, equivocando-se na classificação de 4 dentre 27 amostras sensíveis. As concentrações metabólicas diferenciais apontaram para uma superativação dos metabolismos energético e de lipídeos em linhagens sensíveis ao MTX, ao passo que linhagens resistentes teriam superativado o metabolismo da glicina. As análises metabolômicas e de integração bioquímica dos metabólitos revelaram interações gênicas, enzimáticas e metabólicas que podem estar alteradas em linhagens sensíveis ou resistentes ao MTX, bem como permitiram a especulação sobre possíveis alvos moleculares que poderiam tornar sensíveis células resistentes ao quimioterápico / Abstract: The intensive use of different and combined chemotherapics has allowed curing 70-80% of pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL), and the relapse of the disease stems largely from the intrinsic resistance of leukemic cells to chemotherapy. Some of the chemotherapics used in ALL are metabolic inhibitors such as methotrexate (MTX), a folic acid antagonist, which prevents cell division by inhibiting the synthesis of nucleotides. The association between leukemic strains resistant or sensitive to MTX and the metabolites associated with each of these phenotypes were investigated. Six B- and eight T-derived cell lines were classified as resistant or sensitive to MTX by the 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, after 48h in co-culture with different concentrations of the drug. Five lineages were classified as resistant, and nine as sensitive to MTX. After 24 hours of culture in the presence or absence of MTX (both in triplicates), the intracellular metabolites of the lineages were assessed by nuclear magnetic resonance (NMR), in a metabolomic approach. In total, 84 metabolites were quantified, 72 of which were also identified. The principal component analysis (PCA) did not segregate the samples according to their resistance, whereas the supervised partial least square discriminate analysis (PLS-DA) was effective in this separation. ATP, dimethylglycine, sarcosine and phosphocholine were associated with MTX resistance in both models constructed for treated and untreated samples, whereas carnitine, CB-MTX (unidentified compound), cholate, fumarate, glycocholate, lactate, malate and succinate were associated with sensitivity to MTX. The ability to correctly classify the samples into sensitive or resistant groups was checked with the construction of the receiver operating characteristic (ROC) curves for metabolites individually. Metabolites with good or excellent performance in ROC analysis (AUC> 0.8) were selected to compose "diagnostic tests" for classifying samples. Of all the possible combinations among the selected metabolites, the test composed by the comination of carnitine, sarcosine and succinate in untreated samples exhibited sensitivity of 100% (identified all 15 resistant samples) and specificity of 92.3% in classifying correctly 24 of 26 sensitive samples. The best diagnostic test for samples treated with MTX took into consideration concentrations of CB-MTX, glycocholate, sarcosina, succinato. It had a sensitivity of 100% (identified 15 resistant samples) and specificity of 85.2%, classifying incorrectly 4 out of 27 sensitive samples. Differential metabolic concentrations pointed to an over activation of energy and lipids metabolism in MTX-sensitive strains, whereas resistant strains seemed to have overactive the glycine metabolism. Metabolomic and biochemical integration analysis revealed genetic, enzymatic and metabolic interactions that might be altered in strains sensitive or resistant to MTX, as well as allowed speculations about possible molecular targets on which intervention could make resistant cells susceptible to chemotherapy / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientadores: José Andrés Yunes, Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T20:56:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zenatti_PriscilaPini_D.pdf: 14781518 bytes, checksum: 2324b48b89768b42bcd5bf002d30a510 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A IL-7 é uma citocina essencial para o desenvolvimento, sobrevivência, e proliferação dos timócitos prematuros normais no timo e linfócitos T maduros nos órgãos linfoides periféricos. O receptor da IL-7 é um heterodímero constituído pela IL-7Ra (codificado pelo gene IL7R) e IL-2Ry. A IL-2Ry participa também dos receptores da IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 e IL-21, sendo por isso conhecida como cadeia comum gama ou yc. A sinalização via IL-7 é imprescindível para o processo de rearranjo V(D)J dos receptores de células T (TCR), pois leva à modificação da cromatina que permite o acesso da recombinase aos loci TCR no DNA Camundongos defeituosos para a cadeia alfa do receptor da IL-7 (IL-7Ra) desenvolvem imunodeficiências devido à falta de células T. A via IL-7/IL-7Ra é também importante para proliferação e sobrevivência da leucemia linfóide aguda de células T (LLA-T). Suspeitando da existência de mutações em IL7R resultando em ganho de função e hiperativação da via IL-7/IL-7Ra, procurou-se por mutações no gene do IL-7Ra em mais de 50 casos de LLA-T pediátrica. Procurou-se também mutações no domínio de autoinibição das JAK1 e JAK3, moléculas associadas ao IL-7Ra e IL-2Ry, respectivamente. Aproximadamente 9% das LLA-T pediátricas apresentaram mutações no IL-7Ra, resritas a uma região estreita do éxon 6, que resultaram, na maioria dos casos, em inserções de uma cisteína no domínio transmembrana/justamembrana da proteína. A presença dessa cisteína leva à homodimerização das cadeias IL-7Ra mediante a formação de pontes de dissulfeto e à ativação constitutiva do IL-7Ra independente de seu ligante, conforme verificado pela fosforilação de JAK1, STAT5, AKT e BAD e análise de mutantes artificiais do IL-7Ra com subtração ou adição de resíduo de cisteína. Verificou-se também que o local de inserção da cisteína é crítico para que a homodimerização das cadeias IL-7Ra mutantes resulte em ativação da via JAK/STAT. Receptores imitados tiveram um efeito transformante nas linhagens celulares Dl e Ba/F3, que sobreviveram na ausência dos fator de crescimento IL-7 e IL-3, respectivamente. Além disso, células Dl transduzidas com IL7R mutante, quando injetadas em camundongos knockout (KO) para IL7, causaram esplenomegalia, metástase e tumor no local da injeção. Resultados semelhantes foram obtidos com a expressão ectópica do IL7R mutante em células progenitoras hematopoiéticas de camundongos knockout para IL7R, JAK3 e/ou IL2RG, demonstrando que o homodímero IL-7Ra mutante atua independentemente dessas moléculas. Em conclusão, mutações no IL7R contribuem para a leucemogenese em 9% das crianças com LLA-T. Espera-se que a melhor caracterização do mecanismo responsável pela ativação constitutiva do IL-7Ra mutante abra caminho para o desenho de novas drogas e anticorpos monoclonais, o que permitirá avaliar o valor terapêutico do bloqueio/inibição do IL-7Ra mutante nas LLA-T / .Abstract: The IL-7, a product of stromal cells, is normally required for T cells development and for survival of mature peripheral T cells. The IL-7R consists of two components, the IL-7Ra (encoded by IL7R) and the common gamma chain (yc), or IL-2Ry, that is shared by receptors for IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 and IL-21. The IL-7 signaling has a role in V(D)J recombination in developing T and B cells by controlling access of the V(D)J recombinase to the locus. IL-7Ra deficiency mice showed a diminished T cell number and impaired lymphocyte development. Further, the IL-7/IL-7Ra pathway is important for T-acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) proliferation and survival. Hypothesizing that IL7R gain-of-function mutation could be occurring in T-ALL, 50 T-ALL samples were analyzed for mutations. The kinases JAK1 and JAK3, mat are associated with IL-7Ra and yc, respectively, were also studied for mutations. About 9% of childhood T-ALL presented mutations at the transmembrane domain encoded by éxon 6, and all of mem were in-frame insertions and deletions. In all but three cases there was an insertion of cysteine mat is essential for disulfide bond formation and constitutive activation of the receptor independent of IL-7. The constitutive signaling was confirmed by phosphorylation of JAK1, STAT5, AKT and BAD, and analysis of IL-7Ra artificial mutants with or without cysteine. The position of cysteine insertion is very important to disulfide bond formation, to activate the JAK/STAT pathway and to support the proliferation of Ba/F3 and Dl cell lines in the absence of cytokine. Moreover, IL7R mutant transduced Dl cells injected into ILT1' mice caused splenomegaly, metastasis and tumor at the injection site. Similar results were obtained with the ectopic expression of the IL7R mutant in hematopoietic progenitor cells of IL7K1', JAK3'1' and/or IL2RG'1' mice, demonstrating that the mutant homodimer IL-7Ra operates independently of these molecules. In conclusion, mutations in ÚÍQIL7R contribute to leukemo genes is in 9% of children with ALL-T. We hope mat a better comprehension of the mechanism responsible for the constitutive activation of IL-7Ra mutant opens new perspectives into the design of new drugs and monoclonal antibodies, which may turn into valuable therapeutic treatment / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Acute Lymphocitic Leukemia (ALL) is the most common cause of childhood cancer and occurs in adults in 20%. Lymphoblasts accumulation is a characteristic of the disease since the leukemic cells retain some multiplication ability without differentiation. The chemotherapy treatment for ALL has been proven effectiveness leading 95% cases to remission however, some patients may have recurrence disease. An accurate diagnosis is critical for the correct treatment and therefore longer survival. Molecular biology techniques have contributed to the early detection of recurrence, mainly by PCR method. Considering the high frequency of clonal rearrangements in leukemia (about 90 to 95%) the analysis of clonal immunoglobulin (Ig) or T-cell receptor (TCR) rearrangements by PCR has been shown to be useful for treatment monitoring the minimal residual disease. This study aimed to standardize the PCR for Ig and TCR rearrangements technique and characterize the pacients at the University Hospital of Santa Maria, through these analysis. After adjustments the technique was considered a reliable procedure and relatively easy to perform. The higher frequency of rearrangements were detected in IgH gene (82.76%) by the DH7 sequences (14 samples), Vg1 (10 samples), VH3 and V2D3 (9 cases). IgK rearrangements occurred in frequency of 31.03, TCRG and TCRD rearrangements to 41.37%, and Sil-Tal to 3.45%. / A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é a causa mais comum de câncer infantil e ocorre em 20% dos adultos. Tem como característica o acúmulo de linfoblastos, células leucêmicas que mantêm capacidade de multiplicação, porém, sem diferenciação. O tratamento quimioterápico para LLA tem se mostrado eficaz e levado à remissão em 95% dos casos, no entanto, alguns pacientes podem apresentar recidiva da doença. O diagnóstico preciso é fundamental para o tratamento correto do paciente e, consequentemente, elevar a sobrevida. Metodologias de biologia molecular têm contribuído para a detecção precoce de recidivas, principalmente por técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR). Tendo em vista que nas LLA os rearranjos clonais de imunoglobulinas (Ig) ou de receptores de células T (TCR) ocorrem em 90 a 95% dos casos, as análises destes por PCR tem-se mostrado método útil para o acompanhamento do tratamento, detecção de doença residual mínima. O presente estudo teve como objetivo padronizar a técnica de pesquisa de rearranjos de Ig e TCR, e caracterizar a sua frequência na população de pacientes com LLA do Hospital Universitário de Santa Maria. A técnica para pesquisa da prevalência de rearranjos gênicos mostrou-se, depois de ajustadas os devidos detalhes, um procedimento de reprodutibilidade confiável e relativamente fácil execução. A maior frequência de rearranjos foi detectada no gene IgH (82,76%), sendo representada por amplificações nas sequências DH7 (14 amostras), Vg1 (10 amostras), VH3 e V2D3 (9 amostras). Rearranjos de IgK ocorreram em frequência de 31,03%, rearranjos TCRG e TCRD com 41,37% e Sil-Tal em 3,45%.

Orientador: José Andrés Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T07:51:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ganazza_MonicaAparecida_D.pdf: 9547403 bytes, checksum: 7d821874cefad54cd4ae846262dbb09a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A leucemia linfóide aguda (LLA) é o câncer mais comum da infância. Os atuais protocolos de tratamento da LLA levam à cura em até 80% dos casos e parte do sucesso se deve à aplicação de diferentes tratamentos para os pacientes estratificados em diferentes grupos de risco. Contudo, pacientes considerados em remissão podem apresentar conteúdo substancial de células neoplásicas, a chamada doença residual mínima (DRM), cuja proliferação está associada com a recaída da doença e que podem estar em níveis indetectáveis pelas técnicas convencionais de análise morfológica. O atual protocolo do Grupo Brasileiro de Tratamento da Leucemia Infantil (GBTLI-LLA-2009) utiliza as análises da DRM para estratificar os pacientes em grupos de risco e assim determinar seu tratamento. Desta maneira o presente estudo objetivou (1) estudar a DRM por método qualitativo e quantitativo (RQ-PCR) em amostras D35 de 120 pacientes prospectivos admitidos para tratamento com o protocolo GBTLI-LLA-2009 no Centro Boldrini entre dezembro de 2009 e julho de 2013 (2) determinar a freqüência e sensibilidade dos rearranjos gênicos de imunoglobulinas e receptores de células T (3) analisar a realocação dos pacientes em grupos de risco em três pontos do tratamento (D8, D15 e D35) (4) buscar associações entre resultados de DRM no D35 e variáveis clínico-biológicas dos pacientes (5) analisar a sobrevida global nos pacientes (6) analisar o grau de concordância entre os resultados obtidos por PCR qualitativo e RQ-PCR no D35. Para a DRM no D15 as análises foram realizadas por citometria de fluxo pela equipe multidisciplinar do Centro Boldrini, já para DRM no D35 as análises foram feitas por PCR qualitativo e RQ-PCR com o uso de primers para a região VDJ das imunoglobulinas e receptores de células T. Observou-se que pelo menos 1 rearranjo gênico foi detectado ao diagnóstico para 98% dos casos estudados através de PCR qualitativo. Os rearranjos mais frequentes ao diagnóstico foram IGH , IGK, TCRG e TCRD para os casos de LLA-B derivada e TCRG, TCRD e Sil-Tal e IGH para os casos de LLA-T. Os primers paciente específicos para RQ-PCR mais sensíveis (sensibilidade 1x10-4) foram aqueles envolvendo rearranjos IGH, TCRD, TCRG e IGK. Associação entre presença de DRM no D35 detectada por RQ-PCR e idade dos pacientes (grupo <1 e ?9 anos) foi observada. Presença de DRM ?10-3 no D35 se mostrou relacionada com sobrevida global em pacientes com LLA-B derivada classificados como BR após análises de DRM no D15. Casos de LLA-B derivada classificados como BR após o D15 em sua maioria não apresentaram DRM nos pontos analisados (D15 e D35) sugerindo que a análise da DRM nesses casos seja dispensável. Já para os casos LLA-B derivada classificados como AR após o D15, 7 pacientes considerados bons respondedores no D15 mostraram-se respondedores lentos no D35 ressaltando a importância da análise da DRM nesse ponto do tratamento. Para casos com LLA-T o número reduzido de pacientes impediu qualquer conclusão a respeito. As duas metodologias aplicadas para as análises da DRM no D35 obtiveram concordância de 80% e 100% para LLA-B derivada e LLA-T, respectivamente / Abstract: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common pediatric cancer. The recent ALL treatment protocols can achieve the complete remission in 80% of cases and this success is due to different treatments for patients stratified into different risk groups. Therefore, patients considered in remission may have substantial contents of neoplasic cells, the minimal residual disease (MRD). The proliferation of such neoplasic cells is associated with disease relapse and they can be undected by conventional methods. The current protocol of the Brazilian Childhood Leukemia Treatment (GBTLI-LLA-2009) uses the analysis of MRD to stratify patients into risk groups and thus determine their treatment. Thus this study aimed to (1) study the MRD for qualitative and quantitative method (RQ-PCR) at D35 from 120 prospective patients admitted for treatment with protocol GBTLI-LLA-2009 at Centro Boldrini between December 2009 and July 2013 (2) determine the frequency and sensitivity of immunoglobulin and T cell receptor gene rearrangements (3) analysis of the relocation of patients into risk groups in three points of treatment (D8, D15 and D35) (4) find associations between results of MRD at D35 and D15 and clinical-biological characteristics of patients (5) analyze the overall survival in patients (6) to analyze the degree of agreement between the results obtained by qualitative PCR and RQ-PCR in D35. MRD analyzes at D15 were performed by flow cytometry by the multidisciplinary team of the Centro Boldrini, MRD at D35 analyzes were performed by qualitative PCR and RQ-PCR using primers for the VDJ region of the immunoglobulin and T cell receptors. At least one gene rearrangement was detected at diagnosis to 98% of the cases studied by qualitative PCR. The most frequent rearrangements at diagnosis were IGH, IGK, TCRG and TCRD for cases of B-ALL derived and TCRG, TCRD and Sil-Tal and IGH in cases of T-ALL. The most sensitive RQ-PCR patient specific primers (sensitivity 1x10-4) were those involving IGH, TCRD, TCRD and IGK rearrangements. Association between presence of MRD in D35 detected by RQ-PCR and age group (<1 and ? 9 years) was observed. Presence of MRD ? 10-3 in D35 showed to be related with overall survival in patients with B-ALL derived classified as BR after analysis of MRD in D15. Cases of B-ALL derived classified as low risk after the D15 mostly showed no MRD in the analyzed points (D15 and D35) suggesting that the analysis of these cases is dispensable. As for the B-ALL derived cases classified as AR after D15, 7 patients considered good responders in D15 proved to be slow responders in D35 emphasizing the importance of analyzing MRD at this point of treatment. For T-ALL cases the small number of patients did not allow any conclusion. Both methodologies for the analysis of DRM in D35 obtained 80% and 100% of agreement for B-ALL derived and T-ALL respectively / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

Objetivo: avaliar as habilidades cognitivo-linguísticas de crianças diagnosticadas com leucemia linfoide aguda durante o tratamento quimioterápico. Método: estudo clínico transversal observacional. Formaram o grupo pesquisa (GLL) 18 crianças com idades entre 7 anos e 10 anos e 11 meses, com diagnóstico de leucemia linfoide aguda e em tratamento quimioterápico, que não apresentavam síndromes genéticas, alterações neurológicas e/ou auditivas, não haviam realizado radioterapia e/ou transplante de medula óssea. Foi coletado grupo controle (GC), formado por 18 crianças hígidas, pareadas ao grupo pesquisa por idade, gênero e escolaridade materna. Foram aplicadas provas de avaliação da inteligência não-verbal, fonologia, vocabulário expressivo, fluência verbal, memória verbal de curto prazo e memória verbal operacional. Os dados coletados foram submetidos à análise estatística. Resultados: não houve diferenças estatísticas entre os grupos nas provas de inteligência e vocabulário expressivo. O grupo GLL apresentou desempenho inferior nas demais provas, com diferença significante apenas em memória operacional e na categoria \"partes do corpo\" da prova de fluência verbal. Conclusão: Esse estudo possibilitou uma primeira análise dos efeitos do tratamento quimioterápico em crianças com leucemia nas habilidades cognitivo-linguísticas. Não houve diferença no vocabulário expressivo, mas as habilidades de fluência verbal e memória parecem ser prejudicadas nessas crianças, quando comparadas ao grupo controle, apesar de não haver significância estatística em todas as variáveis / Objective: to evaluate the cognitive-linguistic abilities of children diagnosed with acute lymphoid leukemia during chemotherapy treatment. Methods: observational cross-sectional clinical study. The research group (GLL) was composed by 18 children aged between 7 years and 10 years and 11 months, with diagnosis of acute lymphoid leukemia receiving chemotherapeutic treatment, who did not present genetic syndromes, neurological and/or auditory alterations, had not undergone radiotherapy and/or bone marrow transplantation. A control group (GC) was collected, comprising eighteen healthy children, matched to the research group by age, gender and maternal schooling. Non-verbal intelligence, phonology, expressive vocabulary, verbal fluency, short-term verbal memory, and operational verbal memory were evaluated. The collected data were submitted to statistical analysis. Results: There were no statistical differences between groups in the intelligence and expressive vocabulary tests. The GLL group presented a worse performance in the other tests, but with significant difference only in operational memory and in the \"body parts\" category of the verbal fluency test. Conclusion: This study enabled a first analysis of the effects of chemotherapy treatment in children with leukemia on cognitive-linguistic abilities. There was no difference in expressive vocabulary, but verbal fluency and memory skills appear to be impaired in these children, when compared to the control group, although there was no statistical significance in all variables

Orientador: José Andrés Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:04:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Laranjeira_AngeloBrunelliAlbertoni_D.pdf: 13248620 bytes, checksum: 729ec8e23331934ddd1e5803361b6fe6 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é o tipo de câncer mais comum que acomete crianças. Sabe-se que a interação do tumor com o contexto celular do hospedeiro (microambiente tumoral) é recíproca, ou seja, na medida em que o tumor estimula o seu microambiente, este potencializa a sobrevivência, proliferação e invasividade tumoral. A interação da LLA com as células estromais da medula óssea tem um impacto positivo na resistência das células leucêmicas à quimioterapia. No presente estudo foi investigado a modulação de uma série genes de sensibilidade e resistência à asparaginase em células de LLA-B precursoras após co-cultura com as células estromais. Mostramos o aumento da expressão e secreção da IGFBP7 pelas células leucêmicas após co-cultivo com células do estroma da medula óssea. Em ensaios com o silenciamento do IGFBP7 em células leucêmicas e células estromais, mostramos que a IGFBP7 atua regulando positivamente o crescimento celular e aumenta a resistência a asparaginase. A IGFBP7 'leucêmica' junto com IGF/insulina atua sobre as células estromais, induzindo nestas células o aumento da produção de asparagina, e diminuindo a ação da asparaginase. Além deste mecanismo de resistência dependente das células estromais, mostramos que a IGFBP7 em conjunto com IGF/insulina promove a resistência das células leucêmicas à ação de outros compostos quimioterápicos (dexametasona e metotrexato) de forma independente da interação leucemia-estroma. Ainda pode ser observado que o plasma de crianças com LLA ao diagnóstico, apresenta maiores níveis de IGFBP7 do que em amostras controles. É importante ressaltar que níveis mais altos de mRNA IGFBP7 foram associados com menor sobrevida livre de leucemia (Modelo de regressão de Cox, P = 0,003), em células de LLAB Ph(-) presursoras / Abstract: Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common type of cancer that affects children. It is known that the interaction between tumor and the cellular context of the host (tumor microenvironment) is reciprocal, ie, to the extent that the tumor stimulates their microenvironment, this enhances the survival, proliferation and tumor invasiveness. The interaction of ALL with bone marrow stromal cells has a positive impact on leukemia resistance to chemotherapy. In the present study, we investigated the modulation of a series of putative asparaginase-resistance/sensitivity genes in B-precursor ALL upon co-culture with stromal cells. We showed an increase expression and secretion of IGFBP7 in leukemic cells after co-culture with BMSCs. Assays with IGFBP7 knockdown in leukemic cells and stromal cells, showed that IGFBP7 acts as a positive regulator of cell growth and increases resistance to asparaginase. 'Leukemic' IGFBP7 together with IGF/insulin acts on stromal cells, increasing asparagine production, thus reducing the asparaginase effect. Besides this mechanism of resistance dependent of stromal cells, we showed that IGFBP7 in conjunction with IGF/insulin promotes the resistance of leukemia cells to the action of other chemotherapeutic compounds (dexamethasone and methotrexate) independently of the interaction leukemia-stroma. We still observed that diagnostic BM plasma from children with ALL at diagnosis, have higher levels of IGFBP7 than control samples. Importantly, higher levels of IGFBP7 mRNA were associated with lower leukemia-free survival (Cox regression model, P = 0.003) in precursor B-ALL Ph (-) patients / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular