Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-10-14T20:46:44Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jeany Camelo Santos - 2013.pdf: 1042379 bytes, checksum: 0e6b3b41192470d2c48f4809f1e9d49b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-10-16T18:23:59Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jeany Camelo Santos - 2013.pdf: 1042379 bytes, checksum: 0e6b3b41192470d2c48f4809f1e9d49b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-16T18:23:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jeany Camelo Santos - 2013.pdf: 1042379 bytes, checksum: 0e6b3b41192470d2c48f4809f1e9d49b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / The CML is a expansion clonal of cells progenitors hematopoietics and is associated to an specific genetic lesion, known as the Philadelphia chromosome, product of the reciprocal translocation t(9, 22)(q34, q11) that causes the oncogene BCR-ABL. The TP53 is a tumor suppressor gene located on the chromossome 17p13.1 coding for phosphoprotein TP53. The polymorphism arises from the exchange of G for C at codon 72, resulting the genotypes Arg/Arg, Arg/Pro and Pro/Pro. This study aims to determine the allelic and genotypic frequencies of TP53 polymorphism at codon 72 in CML patients and to correlate with the response to imatinib therapy. The work had the participation of 85 CML patients treated at the Clinic of Hematology, at Hospital das Clínicas – UFG in Goiânia city, state of Goiás for the diagnosis and control of disease. To investigate the allelic and genotypic frequencies, DNA samples were isolated from peripheral blood for analysis of PCR reactions. For genotyping, forward and reverse primers were used for each variant allelic. The study had the participation of 85 CML patients, which 69 were in chronic phase, eight in accelerated phase and only one in blast crisis. The mean age was 51 years and eight months. The frequency of genotypes Pro/Pro, Arg/Pro and Arg/Arg was 11% (4/35) 43% (15/35) 46% (16/35) for patients resistant to imatinib treatment (group case) and 16% (8/50) 62% (31/50) and 22% (11/30) for patients with response to imatinib (control group), respectively. The population in this study is in Hardy-Weinberg Equilibrium (x2 = 1, 12, P> 0, 05). Regarding age, gender, disease stage, and score Sokal not observed an association of the disease with the response or resistance to treatment (P= 0,36; P = 0.82, P = 0.47 and P = 0.72), respectively. When we evaluated the genotypes with respect to the Score Sokal (High x Intermediate/Low), it was observed that Pro/Pro genotype was significantly lower in the high Sokal Score group than Intermediate/low (P = 0.017, OR = 8, 19). For criterion, age over 40 years old at diagnosis, by analyzing the Fisher’s test, we found that patients carrying the Arg/Arg genotype are four times more susceptible to produce any resistance to imatinib therapy. When we evaluated the variables age, gender, disease phase, genotype and Sokal Score in logistic regression showed that only the variable genotype was significant (P = 0.0159). Our results are not according to the previous studies, in which suggest that the Pro/Pro genotype and the Pro allele can check risk of developing disease or resistance to imatinib treatment. Our findings suggest that patients carrying the Arg/Pro and Pro/Pro genotypes responded well to treatment and that the Pro/Pro genotype represented an indicator for a good prognosis. Genotype Arg/Arg represented a risk factor in genetic susceptibility in CML’s pathogenesis, contributing for a worse outcome. / A LMC caracteriza-se por uma expansão clonal de células progenitoras hematopoiética e está associada a uma alteração citogenética, conhecida como o cromossomo Philadelphia (Ph+), produto de uma translocação recíproca t(9q34;22q11), gerando a proteína híbrida BCR-ABL. O gene TP53 é um gene supressor tumoral está localizado no braço curto do cromossomo 17 (17p13.1) que codifica uma proteína fosfonuclear a TP53. O polimorfismo desse gene, envolve uma troca de uma única base guanina (G) por uma citosina (C) no códon 72, originando os genótipos Arg/Arg, Arg/Pro e Pro/Pro. Este trabalho tem como objetivo determinar as frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo de TP53 no códon 72 em pacientes com LMC e correlacionar com a resposta ao tratamento com imatinibe. O trabalho contou com a participação de 85 pacientes com LMC atendidos no serviço do Ambulatório de Hematologia do HC (Hospital das Clínicas) da UFG, na cidade de Goiânia, Goiás, para o diagnóstico e controle da doença. A idade, o sexo, a fase da doença, o Índice Sokal e resposta e resistência ao tratamento, foram levados em consideração. Para investigar as frequências alélicas e genotípicas, amostras de DNA foram isoladas do sangue periférico para posterior análise em reações de PCR. Para a amplificação das regiões de interesse, primers específicos forward e reverse foram utilizados. Dos 85 pacientes portadores de LMC, 69 pacientes estavam na fase crônica, oito na fase acelerada e um na crise blástica. A média de idade foi de 51 anos e oito meses. A frequência dos genótipos Pro/Pro, Arg/Pro e Arg/Arg foi 11% (4/35), 43% (15/35) e 46% (16/35) para pacientes com resistência ao tratamento com imatinibe (grupo caso) e 16% (8/50), 62% (31/50) e 22% (11/30) para pacientes com resposta ao tratamento (grupo controle), respectivamente. A população do presente estudo está em Equilíbrio de Hardy Weinberg (x2 = 1, 12; P > 0, 05). Quanto à idade, sexo, fase da doença e índice Sokal não se observou associação com a resposta e resistência ao tratamento (P= 0,36; P= 0,82; P=0,47 e P=0,72), respectivamente. Quando avaliou-se os genótipos com relação ao Índice Sokal (Alto x Intermediário/baixo), observou-se que Pro/Pro, foi significativamente menor no grupo com Índice Sokal alto (P=0,017; OR=8,19). Para o critério idade acima de 40 anos no diagnóstico da doença, através da análise do Teste de Fisher, observou-se que pacientes homozigotos para o genótipo Arg/Arg são quatro vezes mais susceptíveis a apresentar algum tipo de resistência ao tratamento com imatinibe. Quando avaliou-se as variáveis: idade, sexo, fase da doença, genótipos e Índice Sokal na regressão logística, observou-se que somente a variável genótipo foi significativa (P= 0,0159). Nossos resultados divergem dos dados apresentados pela literatura sobre a LMC, que sugerem que o genótipo Pro/Pro ou alelo Pro, pode conferir risco de desenvolver a doença ou resistência ao tratamento com imatinibe. Nossos achados sugerem que pacientes Arg/Pro e Pro/Pro, responderam bem ao tratamento e que o genótipo Pro/Pro, representou um indicador para um bom prognóstico. O genótipo Arg/Arg representou um fator de risco na susceptibilidade genética à patogênese da LMC, contribuindo para um pior prognóstico da doença.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa, resultante da expansão clonal da célula-tronco hematopoética pluripotente. A fisiopatologia da LMC está associada a uma translocação entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22, o que promove o aparecimento do neogene bcr-abl, cujo gene codifica uma proteína denominada Bcr-Abl. A oncoproteína Bcr-Abl possui atividade tirosina-quinase constitutiva que é a responsável pelo fenótipo maligno da célula, incluindo resistência à apoptose. O tratamento da LMC pode ser realizado com hidroxiuréia, IFN- associado à citarabina, inibidores de TK (mesilato de imatinibe e dasatinibe) e transplante de medula óssea. O tratamento de escolha para pacientes com LMC na fase crônica é o inibidor de tirosina-quinase mesilato de imatinibe e para os refratários utiliza-se o dasatinibe. Apesar do conhecimento acerca do mecanismo de ação dos inibidores de TK, pouco se sabe sobre seu efeito na maquinaria apoptótica. Sendo assim, no presente trabalho foi detectada a expressão dos genes e proteínas anti- (A1, Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-W, C-Flip, Ciap-1, Ciap-2 e Mcl-1) e pró-apoptóticos (Bad, Bak, Bax, Bcl-Xs, Bid, Bik, Bimel, Bmf, Bok, Fas, Fasl, Noxa e Puma) em células mononucleares de 32 indivíduos saudáveis e 26 pacientes com LMC antes e após 12 meses da terapia com mesilato de imatinibe e dasatinibe. Dentre os 26 pacientes avaliados, 13 eram do sexo feminino e 13 do sexo masculino, três eram negros, um amarelo e 22 brancos, com idade média de 48 anos (faixa etária de 25 a 77 anos). O grupo controle foi composto por 32 indivíduos, 16 do sexo feminino e 16 do sexo masculino, 26 eram brancos, quatro negros e dois amarelos, com idade média de 45 anos (idade de 23 a 77 anos). O isolamento das células mononucleares foi realizado pelo método de Ficoll-Hypaque, a determinação da expressão gênica por PCR em tempo real e a protéica por western-blot. Os resultados foram expressos em unidade relativa de expressão (U.R.E.), comparados entre os diferentes grupos (controle e pacientes pré- e pós-tratamento), associados à resposta aos medicamentos e correlacionados ao índice de prognóstico de SOKAL. Na comparação dos dados de expressão gênica entre pacientes e controles, verificou-se que os pacientes apresentaram maior expressão dos genes bcl-xL, c-flip, mcl-1 e fas e níveis reduzidos de bik. O mesilato de imatinibe modulou significativamente a transcrição dos genes bcl-xL, bok, mcl-1 e noxa, enquanto que o dasatinibe agiu sobre a expressão dos genes a1, bmf, c-flip, ciap-1, ciap-2 e mcl-1. Os pacientes refratários ao mesilato de imatinibe apresentaram níveis elevados de expressão de a1 e c-flip e reduzida expressão de bcl-2, ciap-2, bak, bax, bid e fasl em relação aos pacientes em remissão. A expressão protéica refletiu os dados da quantificação do RNAm dos genes. Os dados da presente investigação indicam que as células mononucleares dos pacientes com LMC apresentam desregulação do processo de apoptose celular. Essa alteração pode ser parcialmente associada ao fenótipo de resistência das células leucêmicas Bcr-Abl+ à apoptose e ausência de resposta aos inibidores de TK. Os dados revelam ainda que os inibidores de tirosina-quinase interferem na transcrição e tradução das moléculas envolvidas na regulação do processo de apoptose. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disease resultant of a clonal expansion of pluripotent hematopoietic stem cells. The CML physiopathology is associated with a translocation between chromosomes 9 and 22 long arms, promoting the formation of a bcr-abl neogene, which codifies the Bcr-Abl protein. The Bcr-Abl oncoprotein presents tyrosine-kinase activity that is responsible for the malign phenotype which includes apoptosis resistance. CML treatment may be performed with hydroxyurea, IFN- plus cytarabine, tyrosine-kinase inhibitors (imatinib mesylate and dasatinib) and bone marrow transplantation. The standard treatment for CML patients in chronic phase is the tyrosine-kinase inhibitor imatinib mesylate (IM) and for IM-refractory patients dasatinibe is employed. Despite of the knowledge related to the mechanism of action of tyrosine-kinase inhibitors, little is known about its effects on the apoptosis machinery. In this work we characterized both the mRNA and protein patterns of expression of the anti- (A1, Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-W, C-Flip, Ciap-1, Ciap-2 e Mcl-1) and pro-apoptotic (Bad, Bak, Bax, Bcl-Xs, Bid, Bik, Bimel, Bmf, Bok, Fas, Fasl, Noxa e Puma) regulators in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 32 healthy individual and 26 CML patients before and after 12 months of imatinib mesylate and dasatinibe therapy. Thirteen patients were female and thirteen were male, three were black, one was japanese and 22 were white, the mean age was 48 years (varying from 25 to 77 years). The control group was composed of 32 individuals, 16 were female and 16 were male, 26 were white, four black and two japanese, the mean age was 45 years (varying from 23 to 77 years). PBMC isolation was performed by Ficoll-Hypaque, gene expression was assessed by real time PCR and protein expression was carried out by western-blot methodology. Results were given by the relative expression, after comparison between the different groups (control and patients before and after treatment), associated with drug response and related to Sokal index. The comparison of gene expression profiles between patients and controls showed that CML patients present increased levels of bcl-xL, c-flip, mcl-1 and fas expression and reduced levels of bik gene expression. The imatinib mesylate significantly modulated the transcription of bcl-xL, bok, mcl-1 and noxa, whereas dasatinib affected the expression of a1, bmf, c-flip, ciap-1, ciap-2 and mcl-1. MI-refractory patients present higher levels of a1 and c-flip and lower levels of bcl-2, ciap-2, bak, bax, bid and fasl when compared to patients who achieved complete cytogenetic response. Overall, the patterns of protein expression agree with the profiles of mRNA expression. Taken together, the results described in this investigation indicate that PBMC from CML patients present deregulation in cell death pathways. These alterations could partly account for the apoptosis resistance phenotype observed in Bcr-Abl+ leukemic cells and for lack of response to tyrosine kinase inhibitors. Furthermore, our data also reveal that tyrosine kinase inhibitors interfere in the transcription and translation of molecules that regulate the apoptosis process.

Na leucemia mielóide crônica (LMC) a proteína Bcr-Abl possui atividade tirosina-quinase constitutivamente ativada, induzindo a mieloproliferação e a resistência das células à apoptose. A maioria dos pacientes na fase crônica da LMC tratados com inibidores de tirosina-quinase (TKIs), como o mesilato de imatinibe, apresenta remissão citogenética completa da doença, mas uma parcela desses pacientes tem se mostrado resistente à terapia. A fisiopatologia da LMC e os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na resistência à terapia com TKIs são diversos e precisam ser melhor estudados. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi quantificar os níveis de expressão do gene DIDO, incluindo suas diferentes isoformas (DIDO 1, 2 e 3) e promotores (DIDO PP e PD) em controles e em pacientes com LMC nas diferentes fases da doença, tratados ou não com TKIs, bem como em linhagens celulares BCR-ABL1+ sensíveis (S) e resistentes (R) ao mesilato de imatinibe (MI). A literatura relata que DIDO 1 participa do processo de apoptose e que alterações na expressão de DIDO 2 e DIDO 3 podem estar associadas com o desenvolvimento de neoplasias mielóides. Dessa forma, foram estudados 60 pacientes com LMC e 57 controles, assim como as linhagens celulares HL-60, HL-60.Bcr-Abl+, LAMA 84 S, LAMA 84 R, KCL 22 S e KCL 22 R. Foram separadas as células mononucleares de sangue periférico dos pacientes e controles, com posterior extração de RNA e síntese de cDNA, que foi então empregado nas reações de PCR em tempo real (qPCR) para quantificação das expressões gênicas de DIDO 1, 2, 3, PP, PD e ORF. As linhagens celulares foram tratadas por 4h com TKIs e então a expressão das diferentes isoformas de DIDO foi também quantificada por qPCR. A avaliação da expressão proteica de Bcr-Abl, c-Abl e proteínas fosforiladas nas linhagens foi realizada por Western-blotting. A expressão de DIDO 1 e 2 foi maior nos pacientes nas fases avançadas da LMC e nos pacientes na fase crônica da doença tratados com TKIs (mesilato de imatinibe ou dasatinibe) do que nos controles. Os pacientes na fase crônica da LMC tratados com MI expressaram mais DIDO 1 e 3 do que os pacientes na fase crônica sem tratamento. Houve uma correlação positiva entre expressão de BCR-ABL1 e de DIDO 2 e entre índice de Sokal dos pacientes e expressão de DIDO 2. Na linhagem HL60.Bcr-Abl+, a expressão de proteínas fosforiladas reduziu após tratamento de 4h com TKIs, mas não houve alteração na expressão gênica de DIDO. Nas linhagens celulares S e R, houve aumento da expressão de DIDO 1 após o tratamento de 4h com MI. Conclui-se, portanto, que as diferentes isoformas de DIDO parecem exercer funções distintas na leucemia mielóide crônica; que o tratamento de pacientes e linhagens BCR-ABL1 positivas com inibidores de tirosina-quinase aumenta expressão de DIDO 1; e que a expressão de DIDO 2 correlaciona-se positivamente à expressão de BCR-ABL1 e ao índice de Sokal dos pacientes. / In chronic myeloid leukemia (CML) the Bcr-Abl protein has constitutively activated tyrosine kinase activity, that induces to myeloproliferation and apoptosis resistance of the cells. Most patients in chronic phase of CML treated with the tyrosine kinase inhibitor (TKI) imatinib mesylate have a complete cytogenetic remission, but a portion of these patients have been shown to be resistant to therapy. The pathophysiology of CML and the cellular and molecular mechanisms involved in resistance to TKIs therapy are diverse and require further study. In this sense, the aim of this study was to quantify the expression levels of the DIDO gene, including its isoforms (DIDO 1, 2 and 3) and promoters (DIDO PP and PD) in controls and in patients with CML in different phases of the disease treated or not treated with TKIs, as well as in cell lines BCR-ABL1+ sensitive (S) and resistant (R) to imatinib mesylate (IM). The literature reports that DIDO 1 is involved in apoptosis process and that alterations of DIDO 2 and DIDO 3 expression may be associated with the development of myeloid neoplasms. Thus, 60 CML patients, 57 control individuals and the cell lines HL-60, HL-60.Bcr-Abl+, LAMA 84 S, LAMA 84 R, KCL 22 S and KCL 22 R were studied. Peripheral blood mononuclear cells of patients and controls were isolated and RNA extraction and cDNA synthesis were performed. The cDNA samples were used in Real-Time PCR reactions (qPCR) to quantify the DIDO 1, 2, 3, PP, PD and ORF gene expression. The cell lines were treated during 4h with TKIs and then the expression of DIDO different isoforms was also quantified by qPCR. The assessment of protein expression of Bcr-Abl, c-Abl and phosphorylated proteins in this cell lines was performed by Western blotting. The DIDO 1 and 2 expression was higher in advanced phases patients and in chronic phase patients CML treated with TKIs (imatinib mesylate and dasatinib) than in controls. Chronic phase CML Patients treated with IM expressed more DIDO 1 and 3 than chronic phase untreated patients. There was a positive correlation between BCR-ABL1 expression and DIDO 2 expression and between Sokal score prognostic and DIDO 2 expression. In HL60.Bcr-Abl+ cells the expression of phosphorylated proteins was lower after treatment during 4h with TKIs, but there was no change in DIDO gene expression. There were an increase of DIDO 1 expression in all S and R cell lines after treatment during 4h with IM. Therefore we conclude that the DIDO different isoforms may have different functions in chronic myeloid leukemia; the treatment of patients and BCR-ABL1+ cell lines with TKIs increases DIDO 1 expression; and that the DIDO 2 expression is positively correlated to the BCR-ABL1 expression and Sokal score prognostic of CML patients.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006Bitstream added on 2014-06-13T18:54:35Z : No. of bitstreams: 1 kanegae_mpp_me_arafcf.pdf: 328350 bytes, checksum: ee1587bd6ab853b184cea70a4d71dac0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Em hematologia, a principal aplicação da determinação da atividade da fosfatase alcalina (FA) neutrofílica é no auxílio ao diagnóstico diferencial entre leucemia mielóide crônica (LMC) e reações leucemóides neutrofílicas (RL) decorrentes de doenças mieloproliferativas, como a mielofibrose, policitemia vera ou de inflamações/ infecções. Tradicionalmente esta determinação é realizada por um ensaio citoquímico subjetivo, no qual se atribui uma pontuação (SCORE) para o nível de FA. Neste trabalho apresentamos um método quimiluminescente, objetivo, quantitativo, sensível e barato para a determinação de FA neutrofílica baseado no reagente comercial Immulite®. Leucócitos íntegros obtidos de amostras de sangue periférico de trinta e dois indivíduos saudáveis, nove portadores de LMC e nove portadores de RL foram submetidos ao protocolo otimizado. Através da determinação da emissão de luz por quatro concentrações de neutrófilos, foi possível detectar a atividade de FA por célula (inclinação - SLOPE - da curva obtida por regressão linear). Uma alta correlação foi obtida quando o método quimiluminescente (SLOPE), aqui desenvolvido, foi comparado ao citoquímico (SCORE). Obtivemos uma variação do SLOPE entre 0,61-8,49 (10-5 mV.s/célula) para amostras do grupo controle (indivíduos saudáveis), sendo que o valor da mediana foi 2,04 (10-5 mV.s/célula). Estes resultados foram estatisticamente diferentes das amostras do grupo LMC (variação: 0,07 - 1,75; mediana: 0,79) e do grupo RL (variação: 3,84 - 47,24; mediana: 9,58) (p<0,05). / In haematology the main application of the leukocyte alkaline phosphatase (LAP) assay is in distinguishing chronic myeloid leukaemia (CML) from other myeloproliferative diseases, particularly from myelofibrosis, polycythaemia or other inflammatory/infectious diseases (LR). Traditionally, this is performed by subjective cytochemical assays where a SCORE is attributed to the level of LAP. Here we present a non-subjective, quantitative, sensitive and inexpensive chemiluminescent technique for LAP determination, based on the commercial reagent Immulite®. Intact leukocytes obtained from thirty-two healthy subjects, nine CML and nine LR patients were submitted to the optimized protocol. By measuring the light emission elicited by four concentrations of neutrophils, it was possible to estimate the activity of LAP per cell (the SLOPE of the curve obtained by linear regression). A high linear correlation was found between the chemiluminescent result (SLOPE) and the cytochemical SCORE. The SLOPE for healthy individuals ranged between 0.61 and 8.49 (10-5 mV.s/cell), with a median of 2.04 (10-5 mV.s/cell). These results were statistically different from CML patients (range 0.07 - 1.75, median 0.79) and LR patients (range 3.84 - 47.24, median 9.58) (p<0.05).

Submitted by Valquíria Barbieri (kikibarbi@hotmail.com) on 2017-08-30T21:44:32Z No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Beluci Bianca Nunes de Siqueira.pdf: 720939 bytes, checksum: f785c41d77a555cc4b6a978ad9366ed8 (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-09-01T14:03:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Beluci Bianca Nunes de Siqueira.pdf: 720939 bytes, checksum: f785c41d77a555cc4b6a978ad9366ed8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T14:03:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Beluci Bianca Nunes de Siqueira.pdf: 720939 bytes, checksum: f785c41d77a555cc4b6a978ad9366ed8 (MD5) Previous issue date: 2014-07-11 / CAPES / Esta pesquisa tem como proposta compreender a experiência de adoecimento de adultos jovens por uma condição crônica: a Leucemia Mielóide Aguda. Ressaltamos nesse estudo a dimensão social, pois essa nova condição é tratada com prognóstico ruim, mutilante, fatal; sendo comparada/associada a desordens físicas, mentais e sociais, além disso, a sociedade deprecia as pessoas adoecidas pelo câncerestigmatizando- as. Trata-se de uma pesquisa qualitativa baseado em pressupostos da fenomenologia de Alfred Schutz. As informações foram obtidas mediante entrevistas semiestruturadas realizada com quatro jovens, na faixa etária de 20 a 28 anos, em fase de manutenção no tratamento em uma unidade de referência oncológica no período de novembro de 2013 até janeiro de 2014, no estado de Mato Groso. Após as entrevistas foi realizada a descrição dos sujeitos entrevistados, e em seguida o agrupamento dos temas principais nas experiências dos adoecidos. Os resultados abrangem: o processo de descoberta do adoecimento por leucemia, em que destacase o diagnóstico realizado com rapidez sendo esse o diferencial entre a vida e a morte; o conceito, sendo a leucemia atribuída a uma doença fatal, contagiosa, silenciosa e invisível; noções causais relacionado a uma doença com causas pluralísticas de acordo com o seu contexto, como hereditariedade, agentes externos e momento marcante negativamente em sua vida; os impactos e as estratégias cotidianas de enfrentamento relatados com maior importância estavam ligados com a aparência corporal, morte vivenciada de amigos e prenúncios da própria morte e o apoio social recebidos tanto pelo apoio informal quanto formal para a realização do tratamento;e as motivações dos sujeitos para as suas ações. A pesquisa demonstrou a complexidade do adoecimento crônico, como o adoecimento marca a vida cotidiana dos sujeitos e como são realizadas as estratégias de enfrentamento na tentativa de integrar a condição crônica ao novo ritmo da vida, resignificando sua experiência com a leucemia. Além disso, possibilita a refletir sobre as práticas de atenção e de gestão oncológica. / This research aims at understanding the experience of illness in young adults with a chronic condition: the Acute Myeloid Leukemia. This study emphasize the social dimension, because this new condition is treated bad, mutilating, fatal prognosis; being compared / associated with physical, mental, and social disorders, moreover, detracts society people with cancer have fallen ill-branding them. This is a qualitative research based on assumptions of phenomenology of Alfred Schutz. Data were obtained through semi-structured interviews conducted with four youths, aged 20-28 years in the maintenance phase of treatment in an oncology referral from November 2013 until January 2014, the state of Mato Groso. After the interviews were performed description of the interviewees, and then grouping the main themes in the experiences of the diseased. The results include: the process of discovery of illness from leukemia, where the highlight is the diagnosis made quickly that being the difference between life and death; the concept, and the leukemia attributed to a fatal, contagious, silent and invisible disease; causal notions related to a disease with pluralistic causes according to its context, such as heredity, external agents and negatively striking moment in your life; impacts and everyday coping strategies reported most importance were linked with body appearance, experienced death of friends and harbingers of death itself and the social support received by both the informal and formal support for the completion of the treatment, and the motivations of the subjects for their actions. Research has demonstrated the complexity of chronic illness, such as illness marks the daily lives of the subjects and how the coping strategies in an attempt to integrate the new chronic condition pace of life are held, redefining his experience with leukemia. Furthermore, it allows to reflect on care practices and oncological management.

As leucemias são desordens proliferativa nas células tronco hematopoiéticas pluripotentes caracterizada por mutações que comprometem seus precursores mielóides ou linfóides levando ao desenvolvimento de leucemias similares quanto ao fenótipo (Mielóide ou Linfóide) e forma (Crônica ou Aguda). Descrito em 1960, o cromossomo philadelphia (Ph) foi a primeira anomalia cromossômica associada a uma neoplasia, a Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Em 1973, foi demonstrado que o cromossomo Ph resulta da translocação recíproca entre os braços longos do cromossomo 9 e 22 [t(9;22)(q34;q11)], produzindo um gene quimérico BCR-ABL, encontrado em 95% dos casos de LMC. A proteína quimérica codificada, BCR-ABL, com atividade tirosina quinase descontrolada, é o fator causal da LMC. Durante os anos 1990, uma série de moléculas sintéticas foram desenvolvidas e testadas para inibir especificamente a atividade tirosina quinase da proteína BCR-ABL, o Imatinib (STI-571 ou Gleevec) foi a primeira dessas drogas aprovadas e usadas como agente terapêutico contra a LMC, demonstrando redução do número de células leucêmicas em quase todos pacientes. No entanto muitos pacientes com resistências primárias ou secundárias foram frequentemente relatados. Os mecanismos de resistência são provavelmente heterogêneos, e no mínimo dois mecanismos envolvendo o gene BCR-ABL foram descritos em estudos realizados in vivo: amplificação do gene e ocorrência de mutações que resultam em substituições de aminoácidos associadas com o fenótipo de resistência. Diferentes níveis de resistência são frequentemente associadas a mutações pontuais recorrentes encontradas no domínio quinase da proteína c-ABL em regiões como: sítio catalítico, alça de ativação (A-loop) e alça de fosforilação (P-loop). Os primeiros estudos computacionais foram realizados com o mutante Thr334Ile e mutações na região do P-loop, e ajudaram a entender num nível molecular, os mecanismos de resistência ao Imatinib. Neste trabalho, realizamos um estudo estrutural e termodinâmico das interações entre os ligantes Imatinib e Nilotinib no sítio ativo da proteína c-ABL selvagem e em 12 proteínas com mutações específicas, além de determinar a importância do solvente (com particular interesse na molécula de água denominada Cw - que medeia a interação fármaco-proteína) no processo de resistência aos fármacos. No presente trabalho, utilizamos o método semi-empírico de energia de interação linear (LIE) de maneira alternativa: analisando as interações entre diferentes mutantes da proteína c-ABL e um inibidor (Imatinib ou Nilotinib). Os coeficientes de LIE obtidos foram os seguintes: com Cw fixa (restrição de Cw na posição inicial) = 0,2169; = 0,0654; = 1,4159; e Cw livre (sem restrição de Cw na posição inicial) = 0,0394; = 0,0077; = -2,0503. O melhor ajuste dos coeficientes de LIE foram obtidos nas simulações sem restrição da posição inicial de uma molécula de água conservada (Cw), essa escolha foi baseada no valor de energia livre absoluta da proteína c-ABL selvagem ( ) ser sempre um número mais negativo quando comparado com o valor da energia livre absoluta de cada proteína c-ABL mutada. O uso do método LIE (Linear Interaction Energy) com essa estratégia foi eficiente para analisar o efeito da interação entre diferentes proteínas c-ABL mutantes e um ligante (Imatinib ou Nilotinib). Até o momento não existem simulações de dinâmica molecular na presença de outros domínios da proteína BCR-ABL: SH2 e SH3.

Orientador: Luiz Marcos da Fonseca / Banca: Amauri Antiquera Leite / Banca: Eduardo Magalhães Rego / Resumo: Em hematologia, a principal aplicação da determinação da atividade da fosfatase alcalina (FA) neutrofílica é no auxílio ao diagnóstico diferencial entre leucemia mielóide crônica (LMC) e reações leucemóides neutrofílicas (RL) decorrentes de doenças mieloproliferativas, como a mielofibrose, policitemia vera ou de inflamações/ infecções. Tradicionalmente esta determinação é realizada por um ensaio citoquímico subjetivo, no qual se atribui uma pontuação (SCORE) para o nível de FA. Neste trabalho apresentamos um método quimiluminescente, objetivo, quantitativo, sensível e barato para a determinação de FA neutrofílica baseado no reagente comercial Immulite®. Leucócitos íntegros obtidos de amostras de sangue periférico de trinta e dois indivíduos saudáveis, nove portadores de LMC e nove portadores de RL foram submetidos ao protocolo otimizado. Através da determinação da emissão de luz por quatro concentrações de neutrófilos, foi possível detectar a atividade de FA por célula (inclinação - SLOPE - da curva obtida por regressão linear). Uma alta correlação foi obtida quando o método quimiluminescente (SLOPE), aqui desenvolvido, foi comparado ao citoquímico (SCORE). Obtivemos uma variação do SLOPE entre 0,61-8,49 (10-5 mV.s/célula) para amostras do grupo controle (indivíduos saudáveis), sendo que o valor da mediana foi 2,04 (10-5 mV.s/célula). Estes resultados foram estatisticamente diferentes das amostras do grupo LMC (variação: 0,07 - 1,75; mediana: 0,79) e do grupo RL (variação: 3,84 - 47,24; mediana: 9,58) (p<0,05). / Abstract: In haematology the main application of the leukocyte alkaline phosphatase (LAP) assay is in distinguishing chronic myeloid leukaemia (CML) from other myeloproliferative diseases, particularly from myelofibrosis, polycythaemia or other inflammatory/infectious diseases (LR). Traditionally, this is performed by subjective cytochemical assays where a SCORE is attributed to the level of LAP. Here we present a non-subjective, quantitative, sensitive and inexpensive chemiluminescent technique for LAP determination, based on the commercial reagent Immulite®. Intact leukocytes obtained from thirty-two healthy subjects, nine CML and nine LR patients were submitted to the optimized protocol. By measuring the light emission elicited by four concentrations of neutrophils, it was possible to estimate the activity of LAP per cell (the SLOPE of the curve obtained by linear regression). A high linear correlation was found between the chemiluminescent result (SLOPE) and the cytochemical SCORE. The SLOPE for healthy individuals ranged between 0.61 and 8.49 (10-5 mV.s/cell), with a median of 2.04 (10-5 mV.s/cell). These results were statistically different from CML patients (range 0.07 - 1.75, median 0.79) and LR patients (range 3.84 - 47.24, median 9.58) (p<0.05). / Mestre

Orientador: Célia Regina Nogueira / Resumo: A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma doença malígna, clonal, da célula tronco hematopoética. A descoberta do cromossomo filadélfia e subsequente identificação do gene BCR-ABL, levaram a compreensão da biologia da doença que culminou com o desenvolvimento de drogas alvo-específicas, assim como o de métodos moleculares para o monitoramento da doença. O foco atual das pesquisas em LMC está voltado para o maior entendimento dos mecanismos moleculares e epigenéticos que levam a resistência terapêutica e progressão da doença. Estudos recentes demonstram que a expressão de micro-RNAs específicos modula oncogenes e genes supressores envolvidos no desenvolvimento de neoplasias. Ao encontro a esta tendência, propomos um estudo que procurou identificar o perfil de micro-RNAs dos pacientes bons respondedores aos tratamentos de primeira linha para LMC. Avaliamos o perfil de micro-RNAs, de 41 pacientes com LMC que atingiram resposta citogenética completa (ausência do cromossomo Filadélfia) após o tratamento com inibidor de tirosinaquinase e transplante alogênico de células progenitoras hematopoéticas, por meio do sistema de micro-RNA PCR arrays (TaqMan® Human Micro-RNA Array A e B). Identificamos uma assinatura de micro-RNA distinta entre os grupos tratados, apesar de se encontrarem no mesmo patamar de resposta clínica e citogenética. Palavras-chave: Leucemia Mielóide Crônica, micro-RNA, imatinibe, transplante, qPCR array. / Abstract: Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a malignant clonal hematopoietic stem cell disease. The discovery of the Philadelphia chromosome and subsequent identification of the gene BCR-ABL have led to understanding the biology of the disease and the development of target-specific drugs, as well as molecular methods for monitoring the disease. The current focus of research in the CML is facing the greatest understanding of the molecular and epigenetic mechanisms that lead to therapy resistance and disease progression. Recent studies show that the expression of specific micro-RNAs modulates oncogenes and tumor suppressor genes involved in cancer development.We are proposing a new study in the literature that aims to identify the profile of micro-RNAs of patients good responders to first-line treatments for CML.Evaluated the profile of micro-RNAs in 41 CML patients who achieved a complete cytogenetic response (absence of Philadelphia chromosome) after treatment with tyrosine kinase inhibitor and allogeneic bone marrow transplantation, through the micro-RNA- PCR arrays (TaqMan® Human Micro-RNA Array A e B). We identified a distinct micro-RNA signature between the treated groups, despite being on the same level of cytogenetic and clinical response.Key Words: Chronic Myeloid LeuKemia, micro-RNA, imatinib, bone marrow transplantation, qPCR array. / Mestre

Orientador: Katia Borgia Barbosa Pagnano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:22:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_RosanaAntunesda_D.pdf: 5849811 bytes, checksum: 2e4127fa41a0f3f36ca9540a1ea2cb63 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O uso de inibidores de tirosinoquinases (TKIs) tem demonstrado eficácia no tratamento da Leucemia Mieloide Crônica (LMC). Porém, o fenômeno da resistência é um importante problema na prática clínica e ainda não está completamente elucidado. Além da presença de mutações no domínio quinásico (DQ) do gene BCR-ABL, diversos mecanismos moleculares foram relacionados à resistência aos TKIs. Adicionalmente, alguns estudos têm sido realizados com o objetivo de identificar assinaturas de expressão gênica associadas à resistência citogenética primária ao imatinibe (IM). Até o momento, a expressão de transcritos sem potencial codificador, mais especificamente de RNAs não codificadores longos (lncRNAs), ainda não foi investigada neste aspecto. LncRNAs, transcritos especialmente de regiões intrônicas, têm sido apontados recentemente como possíveis reguladores da expressão gênica em células normais e cancerosas. O objetivo geral deste estudo foi avaliar possíveis mecanismos de resistência ao tratamento com TKIs em pacientes com LMC, através da pesquisa de mutações no DQ do gene BCR-ABL e da identificação de genes codificadores e lncRNAs intrônicos diferencialmente expressos entre pacientes responsivos (R) e não responsivos (NR) ao IM e dasatinibe. A pesquisa de mutações realizada pela técnica de sequenciamento direto revelou que 37% (26/71) dos pacientes avaliados apresentavam mutações, sendo as mais frequentes T315I (25%), M244V (18%) e E255K/V (14%). As taxas de Sobrevida Global (SG) (p = 0,008), Sobrevida Livre de Progressão (p = 0,03) e Sobrevida Livre de Evento (SLE) (p = 0,006) foram menores para os pacientes com mutações. SG (p = 0,04) e SLE (p = 0,03) foram significativamente menores para os pacientes com a mutação T315I. A identificação de perfis de expressão gênica por microarranjos foi realizada a partir de amostras de células mononucleares de sangue periférico de 7 e 21 pacientes, respectivamente, para os estudos envolvendo dasatinibe e IM. Duas plataformas de microarranjos (Agilent Technologies) foram utilizadas neste estudo; a primeira com sondas que mapeiam exclusivamente em genes codificadores de proteína e a segunda, customizada, com 44.000 elementos que mapeiam em regiões intrônicas e exônicas de mesmo locus. As análises estatísticas foram realizadas com as técnicas Significance Analysis of Microarrays e patient leave-one-out cross-validation. Genes codificadores de proteína e lncRNAs diferencialmente expressos foram identificados a partir de comparações de três subgrupos de amostras de R e NR, pré e pós-tratamento. Em seguida, cada conjunto de transcritos diferencialmente expressos foi analisado através do programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para a identificação de funções biológicas, redes gênicas e vias canônicas significativamente enriquecidas. Entre os transcritos encontrados como diferencialmente expressos entre R e NR estão ABCF2, PAWR, ncCD44, ncTNFAIP8 e ncFOXO3A no estudo com dasatinibe e LEF1, BCL2, FYN, ncPXN, ncNCAM1 e ncRASEF no estudo com IM. Porém, no estudo com IM, os conjuntos de transcritos diferencialmente expressos não distinguiram totalmente os casos R e NR. O presente trabalho identificou transcritos diferencialmente expressos entre amostras de pacientes R e NR tratados com dasatinibe e MI e sugere que lcnRNAs possuem um importante papel nos mecanismos moleculares de resistência. Futuras investigações serão necessárias para a confirmação destes achados / Abstract: The use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) has demonstrated efficacy in treating chronic myeloid leukemia (CML). However, resistance is an important problem in clinical practice and it has not yet been completely elucidated. Besides mutations within the BCR/ABL kinase domain (KD), diverse molecular mechanisms have been proposed to account for resistance to TKIs. Furthermore, some studies have been performed in order to identify gene expression signatures associated with primary cytogenetic resistance to imatinib (IM). So far, non-protein-coding RNAs expression, more specifically long non-coding RNAs (lncRNAs) expression, has not been investigated in this aspect. LncRNAs, especially those transcribed from intronic regions, have recently been suggested as potential regulators of gene expression in normal and cancer cells. The aim of this study was to evaluate possible mechanisms of resistance to TKI treatment in CML patients by performing BCR-ABL mutation analysis and identifying differentially expressed protein-coding genes and intronic lncRNAs in responder (R) and non-responders (NR) patients to IM and dasatinib. Mutation analysis performed by direct sequencing identified mutations in 37% (26/71) of the analyzed patients; the three most frequently detected mutations were T315I (25%), M244V (18%) and E255K/V (14%). Overall survival (OS) (p = 0.008), progression-free survival (p = 0.03) and event-free survival (EFS) (p = 0.006) rates were worse for patients harboring mutations. OS (p = 0.04) and EFS (p = 0.03) were significantly worse for T315I patients. Microarray expression profiling was performed on peripheral blood mononuclear cells from 7 and 21 patients, respectively, for the dasatinib and IM studies. Two array platforms (Agilent Technologies) were used in this study: the first one with probes exclusively mapping to protein-coding genes; the second, a custom-designed 44K oligoarray containing probes for intronic and exonic regions from the same genomic locus. Statistical analyses were performed with Significance Analysis of Microarrays and patient leave-one-out cross-validation techniques. Differentially expressed protein-coding genes and lncRNAs were identified by comparing three subgroups of pre- and post-treatment samples from R and NR. Next, each set of differentially expressed transcripts was analyzed by using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software for identifying significantly enriched biological functions, gene networks and canonical pathways. Amongst the transcripts found as differentially expressed between R and NR are ABCF2, PAWR, ncCD44, ncTNFAIP8, and ncFOXO3A in the dasatinib study and LEF1, BCL2, FYN, ncPXN, ncNCAM1, and ncRASEF in the IM study. Nevertheless, in the IM study, the sets of differentially expressed transcripts were not capable of entirely distinguishing between responder and non-responders cases. In the present study differentially expressed transcripts between responder and non-responders' samples treated with dasatinib and IM were identified, and it suggests that lncRNAs play an important role in the molecular mechanisms of resistance. Further investigations are necessary to confirm these findings / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutora em Clínica Médica

Orientadores: Karin Spat Albino Barcellos Silveira, Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T03:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bernusso_VanessaAline_M.pdf: 2366309 bytes, checksum: d89f227d922fcfaba6696c0e1af0fdae (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: VASP (Vasodilator-stimulated phosphoprotein) e Zyxin são proteínas reguladoras de actina que controlam a adesão célula-célula. Zyxin dirige a montagem da actina através da interação e recrutamento da VASP a sítios específicos da adesão. A fosforilação da VASP ou da Zyxin altera suas atividades nas junções aderentes. PKA fosforila VASP em serina 157, regulando, assim, importantes funções celulares de VASP. VASP interage com ABL e é substrato da oncoproteína BCR-ABL. A presença da proteína BCR-ABL promove a oncogênese em pacientes com leucemia mieloide crônica (LMC) devido à ativação constitutiva da atividade tirosina quinase. Apesar de já descrita alteração da expressão de VASP e Zyxin em diferentes tumores epiteliais, o papel de VASP e Zyxin na LMC, na via de sinalização BCR-ABL e a participação destas proteínas na hematopoiese são desconhecidos. Desta maneira, demonstramos aqui ausência de p-VASP ser157 em células de medula óssea de pacientes com LMC, em contraste com a presença de p-VASP ser157 em doadores saudáveis. Pacientes com LMC em remissão, responsivos a inibidores de tirosina quinase, apresentam p-VASP ser157, enquanto os pacientes resistentes não expressam p-VASP ser157. Utilizando células K562 inibidas para VASP ou Zyxin, observamos que VASP e Zyxin modulam as proteínas anti-apoptóticas BCL-2 e BCL-XL da via de sinalização do BCR-ABL. Em adição, células K562 silenciadas para a VASP apresentam diminuição na atividade de FAK y925 e demonstramos que VASP interage com FAK. A expressão de VASP e Zyxin e de suas formas ativas aumenta durante a diferenciação megacariocítica e a inibição de VASP implica em diminuição na expressão do marcador CD61. Identificamos no presente estudo a participação de VASP e Zyxin na via do BCR-ABL, regulando a expressão de proteínas efetoras anti-apoptóticas e, também, na diferenciação megacariocítica. Desta maneira, a expressão alterada da atividade de VASP nos pacientes com LMC pode contribuir para a patogênese da doença, seja afetando a diferenciação celular ou a adesão das células leucêmicas / Abstract: VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) and Zyxin are actin regulatory proteins that control cell-cell adhesion. Zyxin directs actin assembly by interacting and recruiting VASP to specific sites of adhesion. The phosphorylation of VASP and Zyxin modifies their activity in cell-cell junctions. PKA phosphorylates VASP at serine 157 regulating VASP cellular functions. VASP interacts with ABL and VASP is a substrate of BCR-ABL oncoprotein. The presence of BCR-ABL protein drives oncogenesis in patients with chronic myeloid leukemia (CML) due to a constitutive activation of tyrosine kinase activity. It has been described an altered expression of VASP and Zyxin in different types of tumor; however the function of VASP and Zyxin in CML, in BCR-ABL pathway and in hematopoiesis remains unknown. We describe here the absence of p-VASP ser157 in CML bone marrow cells, in contrast to p-VASP ser157 expression in healthy donors. Patients responsive to tyrosine kinase inhibitors present p-VASP ser157, while resistant patients do not have p-VASP ser157. In K562 cells we observed that VASP and Zyxin modulate anti-apoptotic proteins BCL-2 and BCL-XL. VASP depletion in K562 cells decreases FAK y925 activity and VASP interacts with FAK. Expression of VASP, p-VASP, Zyxin and p-Zyxin increases during megakaryocyte differentiation and VASP inhibition affects this differentiation through reduced CD61 expression in VASP depleted cells. We identify here the participation of VASP and Zyxin in BCR-ABL pathway affecting anti-apoptotic proteins and, also, in megakaryocyte differentiation. Then, the altered expression of VASP activity in CML patients may contribute to CML pathogenesis, affecting cellular differentiation or leukemic cell adhesion / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências