As septinas fazem parte de uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina. As septinas têm mostrado ter um papel importante na citocinese e outros processos celulares, incluindo a determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. Todos os membros da família de septinas são compostos por três domínios: um N-terminal variável, um domínio central GTPase e uma região C-terminal que inclui sequências de coiled-coil. Septinas possuem uma característica de polimerizarem para formar complexos hetero-oligoméricos altamente organizados, in vivo e in vitro. Estruturas homo-oligoméricas também foram observadas, embora sua função ainda não esteja bem estabelecida. A Septina 2 humana (SEPT2) se acumula no sulco de clivagem de células em divisão, desde a anáfase até a telófase, além de interagir com a actina, e também está envolvida em doenças neurodegenerativas, como mal de Azheimer. Nesse estudo, a ORF que codifica SEPT2, bem como os fragmentos que codificam seus domínios, foram clonados, expressos em E.coli e purificados por cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular. Os produtos foram analisados por espectroscopia de dicroísmo circular, espalhamento de luz a ângulo fixo e espectroscopia de fluorescência extrínseca, usando Tioflavina-T, que é um marcador clássico para fibras amilóides. Em todos os casos, os produtos formaram homodímeros in vitro, e também agregaram em temperaturas fisiológicas. O desenovelamento térmico das proteínas recombinantes revelou a presença de uma população intermediária de desenovelamento, rica em folhas-β, e que ligam Tioflavina-T, sugerindo uma estrutura amiloidogênica para essa proteína, confirmada pelos programas de predição TANGO e WALTZ. Imagens dessas fibras foram obtidas usando Microscopia eletrônica de Transmissão, evidenciando uma agregação organizada das proteínas. Além disso, usando monocamadas de Langmuir, foi possível confirmar a ligação específica de SEPT2 ao fosfolipídeo fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PtdIns(4,5)P2). Essa ligação específica mantém a estrutura secundária de SEPT2, observada pela técnica PM-IRRAS, algo que não ocorre caso o lipídio seja inespecífico, sugerindo uma associação de SEPT2 com a membrana plasmática e podendo ter um papel na regulação das septinas. Por meio da técnica de duplo híbrido em levedura, identificamos proteínas que interagem com a SEPT2, como a MPBI e a DCTN2, auxiliando na elucidação de processos em que a SEPT2 possa participar. O conjunto dos resultados sobre a estabilidade, os processos de agregação de SEPT2 e a identificação de novos parceiros protéicos de interação, obtidos nesse trabalho, contribuíram para o melhor entendimento da função da SEPT2 e de seu envolvimento em desordens neurodegerenativas. / Septins are members of a conserved group of GTP-binding and filament-forming proteins. They are involved in a variety of cellular processes, such as microtubule regulation, vesicle trafficking, the formation of scaffolding platforms and actin dynamics. Human Septin 2 (SEPT2) has an N-terminal polybasic region responsible for lipid binding, a GTPase domain, and a C-terminal domain. SEPT2 is essential for cytokinesis and it is found in many tissues, mainly in the brain. Together with SEPT1 and SEPT4, it is accumulated in deposits known as neurofibrillary tangles in Alzheimers disease, which is evidence that SEPT2 may be involved in this process. In this study, the human SEPT2, and its domains, were cloned, expressed in E.coli and purified by affinity and size-exclusion chromatographies. The proteins form homodimers in vitro, suggesting that the GTPase domain is enough to promote the oligomerization. Thermal unfolding revealed the formation of aggregates under physiological conditions, which have the ability to bind a specific amyloid dye, Thioflavin-T, suggesting them to be an amyloidal fiber. Besides, in silico prediction programs, TANGO and WALTZ, corroborate that SEPT2 contain regions with high probability of aggregation and amyloidogenic formation, respectively. Moreover, we observed 20-50 nm thick filamentous structures by electron microscopy of negatively stained. Using Langmuir monolayers at the cell membrane lipid packing, SEPT2 and SEPT2NG bound to the phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). Results from in situ PM-IRRAS experiments indicated that the secondary structure of SEPT2 is preserved upon interacting with PtdIns(4,5)P2, but not when interacting with DPPC - which is not specific for SEPT2 - at the air/water interface suggesting an association with the plasma membrane and a role in septin regulation. Furthermore, we also identified protein partners of SEPT2, from both human leukocyte and brain fetal cDNA libraries, using the yeast two-hybrid system. SEPT2 was shown to interact with: septins 6 and 4; a serine-protease and a MAP inhibitory protein; an ubiquitin-conjugating enzyme; and proteins related to cellular division. Thus, taken together this study contributed for the knowledgment of the stability and the aggregation kinetic of the SEPT2, leading to a better understanding of this protein and their role in neurodegenerative disorders.

As septinas fazem parte de uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina. As septinas têm mostrado ter um papel importante na citocinese e outros processos celulares, incluindo a determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. Todos os membros da família de septinas são compostos por três domínios: um N-terminal variável, um domínio central GTPase e uma região C-terminal que inclui sequências de coiled-coil. Septinas possuem uma característica de polimerizarem para formar complexos hetero-oligoméricos altamente organizados, in vivo e in vitro. Estruturas homo-oligoméricas também foram observadas, embora sua função ainda não esteja bem estabelecida. A Septina 2 humana (SEPT2) se acumula no sulco de clivagem de células em divisão, desde a anáfase até a telófase, além de interagir com a actina, e também está envolvida em doenças neurodegenerativas, como mal de Azheimer. Nesse estudo, a ORF que codifica SEPT2, bem como os fragmentos que codificam seus domínios, foram clonados, expressos em E.coli e purificados por cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular. Os produtos foram analisados por espectroscopia de dicroísmo circular, espalhamento de luz a ângulo fixo e espectroscopia de fluorescência extrínseca, usando Tioflavina-T, que é um marcador clássico para fibras amilóides. Em todos os casos, os produtos formaram homodímeros in vitro, e também agregaram em temperaturas fisiológicas. O desenovelamento térmico das proteínas recombinantes revelou a presença de uma população intermediária de desenovelamento, rica em folhas-β, e que ligam Tioflavina-T, sugerindo uma estrutura amiloidogênica para essa proteína, confirmada pelos programas de predição TANGO e WALTZ. Imagens dessas fibras foram obtidas usando Microscopia eletrônica de Transmissão, evidenciando uma agregação organizada das proteínas. Além disso, usando monocamadas de Langmuir, foi possível confirmar a ligação específica de SEPT2 ao fosfolipídeo fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PtdIns(4,5)P2). Essa ligação específica mantém a estrutura secundária de SEPT2, observada pela técnica PM-IRRAS, algo que não ocorre caso o lipídio seja inespecífico, sugerindo uma associação de SEPT2 com a membrana plasmática e podendo ter um papel na regulação das septinas. Por meio da técnica de duplo híbrido em levedura, identificamos proteínas que interagem com a SEPT2, como a MPBI e a DCTN2, auxiliando na elucidação de processos em que a SEPT2 possa participar. O conjunto dos resultados sobre a estabilidade, os processos de agregação de SEPT2 e a identificação de novos parceiros protéicos de interação, obtidos nesse trabalho, contribuíram para o melhor entendimento da função da SEPT2 e de seu envolvimento em desordens neurodegerenativas. / Septins are members of a conserved group of GTP-binding and filament-forming proteins. They are involved in a variety of cellular processes, such as microtubule regulation, vesicle trafficking, the formation of scaffolding platforms and actin dynamics. Human Septin 2 (SEPT2) has an N-terminal polybasic region responsible for lipid binding, a GTPase domain, and a C-terminal domain. SEPT2 is essential for cytokinesis and it is found in many tissues, mainly in the brain. Together with SEPT1 and SEPT4, it is accumulated in deposits known as neurofibrillary tangles in Alzheimers disease, which is evidence that SEPT2 may be involved in this process. In this study, the human SEPT2, and its domains, were cloned, expressed in E.coli and purified by affinity and size-exclusion chromatographies. The proteins form homodimers in vitro, suggesting that the GTPase domain is enough to promote the oligomerization. Thermal unfolding revealed the formation of aggregates under physiological conditions, which have the ability to bind a specific amyloid dye, Thioflavin-T, suggesting them to be an amyloidal fiber. Besides, in silico prediction programs, TANGO and WALTZ, corroborate that SEPT2 contain regions with high probability of aggregation and amyloidogenic formation, respectively. Moreover, we observed 20-50 nm thick filamentous structures by electron microscopy of negatively stained. Using Langmuir monolayers at the cell membrane lipid packing, SEPT2 and SEPT2NG bound to the phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). Results from in situ PM-IRRAS experiments indicated that the secondary structure of SEPT2 is preserved upon interacting with PtdIns(4,5)P2, but not when interacting with DPPC - which is not specific for SEPT2 - at the air/water interface suggesting an association with the plasma membrane and a role in septin regulation. Furthermore, we also identified protein partners of SEPT2, from both human leukocyte and brain fetal cDNA libraries, using the yeast two-hybrid system. SEPT2 was shown to interact with: septins 6 and 4; a serine-protease and a MAP inhibitory protein; an ubiquitin-conjugating enzyme; and proteins related to cellular division. Thus, taken together this study contributed for the knowledgment of the stability and the aggregation kinetic of the SEPT2, leading to a better understanding of this protein and their role in neurodegenerative disorders.

A migração de células musculares lisas (VSMC) da camada média do vaso para a íntima é essencial para vasculogênese e contribui para o processo de aterosclerose e estenose após lesão por cateter-balão, caracterizando-se como um importante alvo terapêutico. Diversos trabalhos já demonstraram que fatores de crescimento (como PDGF e FGF) estimulam a migração de VSMC, inclusive, muitos desses fatores de crescimento induzem sinalização redox associadas à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) (ex. Nox1 NADPH oxidase). Nosso grupo já descreveu interações físicas e regulação funcional da NADPH oxidase por uma chaperona redox do retículo endoplasmático, a Dissulfeto Isomerase Protéica (PDI). Contudo, tanto a relevância fisiológica como os mecanismos desta interação ainda não estão claros. O objetivo geral do presente trabalho é investigar por meio de experimentos de perda e ganho de função da PDI, a importância da PDI na migração celular associada à ativação do complexo NADPH oxidase, bem como possíveis mecanismos envolvidos na interação entre a PDI e esse complexo enzimático durante a migração celular. Os objetivos específicos são: i) avaliar o efeito do silenciamento da PDI, bem como da expressão forçada de PDI wild type na migração de VSMC in vitro; ii) analisar o efeito da transfecção de siRNA da PDI atividade e expressão de distintas isoformas da NADPH oxidase vascular e produção de ROS induzida por PDGF; iii) investigar o envolvimento de RhoGTPases na regulação do complexo NADPH oxidase pela PDI. No presente trabalho, mostramos que o PDGF induz redistribuição da PDI e aumento da produção de ROS. O silenciamento da PDI inibe a produção de ROS e a expressão do mRNA da Nox1, sem alterar a expressão do mRNA da Nox4. Mais ainda, o silenciamento da PDI reduz a migração celular induzida por PDGF, em diferentes modelos de migração, enquanto a super-expressão da PDI induz aumento espontâneo da migração na condição basal. Análise utilizando métodos de Biologia de Sistemas de redes de interação física proteína-proteína em bancos de dados e técnicas de análise de centralidade, topologia e ontologia gênica indicou forte convergência entre PDI e proteínas da família das pequenas RhoGTPases e seus reguladores. Em VSMC com silenciamento da PDI, a presença do PDGF induziu uma redução na atividade de Rac1 e RhoA, sem alterar a expressão total destas proteínas. Estudos mostraram que a PDI colocaliza com Rac1 na região perinuclear e co-imunoprecipita com Rac1 e RhoA, tanto na presença como na ausência de PDGF. Além disso, ocorreu a interação entre PDI e o regulador de GTPases RhoGDI (inibidor da dissociação da guanina) na condição basal (por microscopia confocal e co-imunoprecipitação), diminuída após estimulo com PDGF. O silenciamento da PDI induziu ainda alterações em estrutura de citoesqueleto: desorganização das fibras de estresse, e redução no número e tamanho de adesões focais e vesículas de adesão marcadas por RhoGDI e Rac1. Assim, os dados apresentados no presente trabalho sugerem que a PDI sustenta a migração de VSMC dependente de sinalização redox e RhoGTPases. Além disso, RhoGTPases podem ser um alvo proximal importante mediando a convergência entre PDI e o complexo NADPH oxidase / Vascular Smooth Muscle Cell (VSMC) migration into vessel neointima is a therapeutic target for atherosclerosis and post-injury restenosis. NADPH oxidase-derived oxidants synergize with growth factors to support VSMC migration. We described interaction between NADPH oxidases and the endoplasmic reticulum redox chaperone Protein Disulfide Isomerase (PDI) in many cell types. However, physiological implications as well as mechanisms of such association are yet unclear. The aim of the present work was to investigate, througth experiments of gain or loss of PDI function, the importance of PDI in VSMC migration associated to NADPH oxidase. The specific aims were: i) to evaluate effects of PDI silencing or PDI overexpression in VSMC migration in vitro; ii) to evaluate effects of PDI silencing on PDGF-induced NADPH oxidase isoform expression and ROS production; iii) to evaluate the involvement of RhoGTPases on NADPH oxidase regulation by PDI. We show here that PDGF promoted subcellular redistribution of PDI concomitant to ROS production and that siRNA-mediated PDI silencing inhibited such ROS production, while near-totally suppressing the increase in Nox1 expression, with no change in Nox4. Furthermore, PDI silencing inhibited PDGF-induced VSMC migration assessed by distinct methods, while PDI overexpression increased spontaneous basal VSMC migration. To address possible mechanisms of PDI effects, we searched for PDI interactome by PPPI networks, which indicated convergence with small GTPases and their regulator RhoGDI. PDI silencing decreased PDGF-induced Rac1 and RhoA activities, without change in their expression. PDI displayed small detectable points of perinuclear co-localization with Rac1 and co-immunoprecipitated with Rac1 and RhoA in a PDGF-independent way. Moreover, there was PDI association with RhoGDI at baseline (confocal and co-immunoprecipitation), decreased after PDGF. Of note, PDI silencing promoted strong cytoskeletal changes: branched stress fiber disorganization, markedly decreased number of focal adhesions and reduced number of RhoGDI-containing vesicular recycling adhesion structures. Overall, these data suggest that PDI is required to support redox and GTPase-dependent VSMC migration. Moreover, RhoGTPases are a potential upstream target mediating the convergence between PDI and NADPH oxidase

A inibição do transporte axonal é um evento que ocorre prematuramente no curso das doenças neurodegenerativas, inclusive antes da formação dos agregados proteicos, os quais estariam envolvidos no processo fisiopatológico das doenças neurodegenerativas. No presente estudo avaliou-se a hipótese de que alterações no transporte de mitocôndrias ocorrem antes da formação dos agregados proteicos envolvidos em neurodegeneração, devido a desregulação dos níveis citoplasmáticos de Ca2+ e o envolvimento da modulação do transporte mitocondrial provido pela proteína Miro neste cenário. Utilizaram-se dois modelos experimentais: o primeiro utilizando a exposição à rotenona em culturas primárias de neurônios do locus coeruleus, hipocampo e substância negra de ratos, e o segundo utilizando neurônios derivados de células tronco de pluripotência induzida (iPSC), isogênicas humanas contendo mutações que levam à deleção do exon 9 da (deltaE9) no gene da presenilina 1 (PS1), o qual apresenta aumento da síntese do peptídeo beta-amiloide com 42 aminoácidos (Abeta42), sem a formação de agregados proteicos. Os resultados mostram disfunções nos níveis citoplasmáticos de Ca2+ em ambos modelos. A mobilidade mitocondrial alterou-se no hipocampo, locus coeruleus e substância negra após exposição à rotenona. No entanto, a direção das alterações observadas não se correlacionaram com os níveis de Ca2+, de acordo com o já descrito na literatura. Não houve alteração da mobilidade mitocondrial, nem nos níveis de Miro1, nos neurônios derivados de iPSC. Em conclusão, o presente estudo demonstrou que alterações nos níveis citoplasmáticos de Ca2+ ocorrem antes e durante a formação de agregados proteicos, o que pode ser importante para a etiologia de doenças neurodegenerativas. Foi também demonstrado que mudanças na mobilidade mitocondrial, acompanhadas por alterações nas concentrações intracelulares de Ca2+, em níveis fisiológicos, ocorrem de forma independente dos níveis da proteína Miro1 em culturas de células. Porém são necessários novos estudos a fim de relacionar alterações na mobilidade mitocondrial e a indução da neurodegeneração / The axonal transport impairment occurs early in neurodegenerative diseases, even before the formation of protein aggregates, which are related with the neuropathophysiology mechanism in neurodegenerative diseases. In this study, we evaluate the hypothesis that disruptions in mitochondria transport occurs before the formation of protein aggregate related with neurodegeneration, triggered by dysregulations in cytosolic Ca2+ levels and the involvement of Miro Ca2+ dependent mechanism of mitochondria trafficking modulation. We employed two experimental models, first using rotenone exposure in primary neuronal cell cultures from locus coeruleus, substantia nigra and hippocampus of newborn rats. Second, using isogenic human neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), harboring mutations, those induce exon 9 deletion (deltaE9) in Presenilin 1 (PS1) gene, and showing increased synthesis of amyloid beta peptide with 42 amino acids (betaA42) without the formation of protein aggregates. We found abnormalities in cytosolic Ca2+ levels in both experimental models, mitochondria trafficking were altered in hippocampus, substantia nigra and locus coeruleus. However, the pattern of mitochondria trafficking alterations did not correlate with cytosolic Ca2+ levels, accordingly with the data that was already published. We did not find alterations in mitochondria trafficking or Miro1 levels in neurons derived from iPSC. In conclusion, our finds demonstrated aberrant cytosolic Ca2+ levels before and during protein aggregation, which may be important for the etiology of neurodegenerative diseases. In addition, this dysfunction in mitochondria trafficking happens after changes in cytosolic Ca2+ levels, in physiological range, independent of Miro1 levels in primary neurons cell cultures. Therefore, new studies need to be done, aiming to elucidate the relation between mitochondria trafficking dysfunctions and the induction of neurodegeneration process.

A inibição do transporte axonal é um evento que ocorre prematuramente no curso das doenças neurodegenerativas, inclusive antes da formação dos agregados proteicos, os quais estariam envolvidos no processo fisiopatológico das doenças neurodegenerativas. No presente estudo avaliou-se a hipótese de que alterações no transporte de mitocôndrias ocorrem antes da formação dos agregados proteicos envolvidos em neurodegeneração, devido a desregulação dos níveis citoplasmáticos de Ca2+ e o envolvimento da modulação do transporte mitocondrial provido pela proteína Miro neste cenário. Utilizaram-se dois modelos experimentais: o primeiro utilizando a exposição à rotenona em culturas primárias de neurônios do locus coeruleus, hipocampo e substância negra de ratos, e o segundo utilizando neurônios derivados de células tronco de pluripotência induzida (iPSC), isogênicas humanas contendo mutações que levam à deleção do exon 9 da (deltaE9) no gene da presenilina 1 (PS1), o qual apresenta aumento da síntese do peptídeo beta-amiloide com 42 aminoácidos (Abeta42), sem a formação de agregados proteicos. Os resultados mostram disfunções nos níveis citoplasmáticos de Ca2+ em ambos modelos. A mobilidade mitocondrial alterou-se no hipocampo, locus coeruleus e substância negra após exposição à rotenona. No entanto, a direção das alterações observadas não se correlacionaram com os níveis de Ca2+, de acordo com o já descrito na literatura. Não houve alteração da mobilidade mitocondrial, nem nos níveis de Miro1, nos neurônios derivados de iPSC. Em conclusão, o presente estudo demonstrou que alterações nos níveis citoplasmáticos de Ca2+ ocorrem antes e durante a formação de agregados proteicos, o que pode ser importante para a etiologia de doenças neurodegenerativas. Foi também demonstrado que mudanças na mobilidade mitocondrial, acompanhadas por alterações nas concentrações intracelulares de Ca2+, em níveis fisiológicos, ocorrem de forma independente dos níveis da proteína Miro1 em culturas de células. Porém são necessários novos estudos a fim de relacionar alterações na mobilidade mitocondrial e a indução da neurodegeneração / The axonal transport impairment occurs early in neurodegenerative diseases, even before the formation of protein aggregates, which are related with the neuropathophysiology mechanism in neurodegenerative diseases. In this study, we evaluate the hypothesis that disruptions in mitochondria transport occurs before the formation of protein aggregate related with neurodegeneration, triggered by dysregulations in cytosolic Ca2+ levels and the involvement of Miro Ca2+ dependent mechanism of mitochondria trafficking modulation. We employed two experimental models, first using rotenone exposure in primary neuronal cell cultures from locus coeruleus, substantia nigra and hippocampus of newborn rats. Second, using isogenic human neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), harboring mutations, those induce exon 9 deletion (deltaE9) in Presenilin 1 (PS1) gene, and showing increased synthesis of amyloid beta peptide with 42 amino acids (betaA42) without the formation of protein aggregates. We found abnormalities in cytosolic Ca2+ levels in both experimental models, mitochondria trafficking were altered in hippocampus, substantia nigra and locus coeruleus. However, the pattern of mitochondria trafficking alterations did not correlate with cytosolic Ca2+ levels, accordingly with the data that was already published. We did not find alterations in mitochondria trafficking or Miro1 levels in neurons derived from iPSC. In conclusion, our finds demonstrated aberrant cytosolic Ca2+ levels before and during protein aggregation, which may be important for the etiology of neurodegenerative diseases. In addition, this dysfunction in mitochondria trafficking happens after changes in cytosolic Ca2+ levels, in physiological range, independent of Miro1 levels in primary neurons cell cultures. Therefore, new studies need to be done, aiming to elucidate the relation between mitochondria trafficking dysfunctions and the induction of neurodegeneration process.

A migração de células musculares lisas (VSMC) da camada média do vaso para a íntima é essencial para vasculogênese e contribui para o processo de aterosclerose e estenose após lesão por cateter-balão, caracterizando-se como um importante alvo terapêutico. Diversos trabalhos já demonstraram que fatores de crescimento (como PDGF e FGF) estimulam a migração de VSMC, inclusive, muitos desses fatores de crescimento induzem sinalização redox associadas à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) (ex. Nox1 NADPH oxidase). Nosso grupo já descreveu interações físicas e regulação funcional da NADPH oxidase por uma chaperona redox do retículo endoplasmático, a Dissulfeto Isomerase Protéica (PDI). Contudo, tanto a relevância fisiológica como os mecanismos desta interação ainda não estão claros. O objetivo geral do presente trabalho é investigar por meio de experimentos de perda e ganho de função da PDI, a importância da PDI na migração celular associada à ativação do complexo NADPH oxidase, bem como possíveis mecanismos envolvidos na interação entre a PDI e esse complexo enzimático durante a migração celular. Os objetivos específicos são: i) avaliar o efeito do silenciamento da PDI, bem como da expressão forçada de PDI wild type na migração de VSMC in vitro; ii) analisar o efeito da transfecção de siRNA da PDI atividade e expressão de distintas isoformas da NADPH oxidase vascular e produção de ROS induzida por PDGF; iii) investigar o envolvimento de RhoGTPases na regulação do complexo NADPH oxidase pela PDI. No presente trabalho, mostramos que o PDGF induz redistribuição da PDI e aumento da produção de ROS. O silenciamento da PDI inibe a produção de ROS e a expressão do mRNA da Nox1, sem alterar a expressão do mRNA da Nox4. Mais ainda, o silenciamento da PDI reduz a migração celular induzida por PDGF, em diferentes modelos de migração, enquanto a super-expressão da PDI induz aumento espontâneo da migração na condição basal. Análise utilizando métodos de Biologia de Sistemas de redes de interação física proteína-proteína em bancos de dados e técnicas de análise de centralidade, topologia e ontologia gênica indicou forte convergência entre PDI e proteínas da família das pequenas RhoGTPases e seus reguladores. Em VSMC com silenciamento da PDI, a presença do PDGF induziu uma redução na atividade de Rac1 e RhoA, sem alterar a expressão total destas proteínas. Estudos mostraram que a PDI colocaliza com Rac1 na região perinuclear e co-imunoprecipita com Rac1 e RhoA, tanto na presença como na ausência de PDGF. Além disso, ocorreu a interação entre PDI e o regulador de GTPases RhoGDI (inibidor da dissociação da guanina) na condição basal (por microscopia confocal e co-imunoprecipitação), diminuída após estimulo com PDGF. O silenciamento da PDI induziu ainda alterações em estrutura de citoesqueleto: desorganização das fibras de estresse, e redução no número e tamanho de adesões focais e vesículas de adesão marcadas por RhoGDI e Rac1. Assim, os dados apresentados no presente trabalho sugerem que a PDI sustenta a migração de VSMC dependente de sinalização redox e RhoGTPases. Além disso, RhoGTPases podem ser um alvo proximal importante mediando a convergência entre PDI e o complexo NADPH oxidase / Vascular Smooth Muscle Cell (VSMC) migration into vessel neointima is a therapeutic target for atherosclerosis and post-injury restenosis. NADPH oxidase-derived oxidants synergize with growth factors to support VSMC migration. We described interaction between NADPH oxidases and the endoplasmic reticulum redox chaperone Protein Disulfide Isomerase (PDI) in many cell types. However, physiological implications as well as mechanisms of such association are yet unclear. The aim of the present work was to investigate, througth experiments of gain or loss of PDI function, the importance of PDI in VSMC migration associated to NADPH oxidase. The specific aims were: i) to evaluate effects of PDI silencing or PDI overexpression in VSMC migration in vitro; ii) to evaluate effects of PDI silencing on PDGF-induced NADPH oxidase isoform expression and ROS production; iii) to evaluate the involvement of RhoGTPases on NADPH oxidase regulation by PDI. We show here that PDGF promoted subcellular redistribution of PDI concomitant to ROS production and that siRNA-mediated PDI silencing inhibited such ROS production, while near-totally suppressing the increase in Nox1 expression, with no change in Nox4. Furthermore, PDI silencing inhibited PDGF-induced VSMC migration assessed by distinct methods, while PDI overexpression increased spontaneous basal VSMC migration. To address possible mechanisms of PDI effects, we searched for PDI interactome by PPPI networks, which indicated convergence with small GTPases and their regulator RhoGDI. PDI silencing decreased PDGF-induced Rac1 and RhoA activities, without change in their expression. PDI displayed small detectable points of perinuclear co-localization with Rac1 and co-immunoprecipitated with Rac1 and RhoA in a PDGF-independent way. Moreover, there was PDI association with RhoGDI at baseline (confocal and co-immunoprecipitation), decreased after PDGF. Of note, PDI silencing promoted strong cytoskeletal changes: branched stress fiber disorganization, markedly decreased number of focal adhesions and reduced number of RhoGDI-containing vesicular recycling adhesion structures. Overall, these data suggest that PDI is required to support redox and GTPase-dependent VSMC migration. Moreover, RhoGTPases are a potential upstream target mediating the convergence between PDI and NADPH oxidase

O desenvolvimento das doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, está associado à presença de agregados proteicos contendo Tau hiperfosforilada (p-Tau). Esta disfunção da Tau leva a prejuízos na homeostase celular. Um mecanismo chave para diminuir e/ou prevenir os danos promovidos pelos agregados contendo Tau seria o estímulo de sua degradação. Neste sentido, a proposta do presente estudo foi analisar a degradação da proteína Tau após aumento da expressão exógena da cochaperona Bag-2, a qual influencia o sistema proteassomal de degradação; bem como avaliar a ativação dos sistemas de degradação, a fim de correlacionar estes sistemas em cultura de células primárias e organotípica do hipocampo de ratos. Os resultados mostraram que a rotenona foi capaz de aumentar os níveis de p-Tau e que a superexpressão de Bag-2, foi eficiente em prevenir e degradar a p-Tau. O mecanismo envolvido neste processo envolve a coordenação dos sistemas proteassomal e lisossomal, já que a Rab7 e a Rab24 (envolvidas na via lisossomal) mostraram-se diminuídas na fase que antecede a agregação proteica, enquanto houve aumento da Rab24 na presença dos agregados proteicos. Com relação ao peptídeo beta amiloide, foi demonstrado tendência de aumento de p-Tau acompanhado de diminuição da atividade proteassomal e lisossomal. O tratamento com PADK (ativador lisossomal) foi capaz de reverter este efeito nestas diferentes condições. A análise da interrelação entre os sistemas mostrou que uma inibição do proteassoma favorece a via lisossomal e que o inverso não se repete. Os resultados sugerem que a modulação das vias de degradação pode ser interessante para o estudo, prevenção e tratamento das doenças neurodegenerativas associadas à agregação de proteínas / Neurodegenerative diseases, such as Alzheimer\'s, are associated to protein inclusions containing hyperphosphorylated Tau (p-Tau). It is well established that Tau dysfunction impairs cell homeostasis. A key mechanism to prevent and/or reduce the damage promoted by aggregates of Tau might be its degradation. In view of this, the aims of the present study are to evaluate p- Tau clearance following exogenous expression of Bag-2, which stimulates proteasome; as well as to analyze the activation of both lysosome and proteasome pathways in order to understand the crosstalk between these two systems in primary and organotypic cultures of rat hippocampus. Results showed that rotenone was able of increasing p-Tau that was prevented and degraded by Bag-2 overexpression. Mechanisms involved in this process involve the coordination of cell degradation systems, depending upon aggregation status, since Rab7 and Rab24 (involved in lysosomal pathway) were decreased before protein aggregation, while Rab24 increased in the presence of protein inclusions. Amyloid-beta peptide also increased p-Tau accompanied by decreased proteasome and lysosome activity. PADK (lysosomal activator) treatment reverted the inhibition promoted by amyloidbeta peptide. Inhibition of proteasome leads to activation of lysosome, but lysosome inhibition does not affect proteasome. Overall, results suggest that targeting degradation pathways might be useful to understand, prevent and treat neurodegenerative diseases associated with protein deposits

O desenvolvimento das doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, está associado à presença de agregados proteicos contendo Tau hiperfosforilada (p-Tau). Esta disfunção da Tau leva a prejuízos na homeostase celular. Um mecanismo chave para diminuir e/ou prevenir os danos promovidos pelos agregados contendo Tau seria o estímulo de sua degradação. Neste sentido, a proposta do presente estudo foi analisar a degradação da proteína Tau após aumento da expressão exógena da cochaperona Bag-2, a qual influencia o sistema proteassomal de degradação; bem como avaliar a ativação dos sistemas de degradação, a fim de correlacionar estes sistemas em cultura de células primárias e organotípica do hipocampo de ratos. Os resultados mostraram que a rotenona foi capaz de aumentar os níveis de p-Tau e que a superexpressão de Bag-2, foi eficiente em prevenir e degradar a p-Tau. O mecanismo envolvido neste processo envolve a coordenação dos sistemas proteassomal e lisossomal, já que a Rab7 e a Rab24 (envolvidas na via lisossomal) mostraram-se diminuídas na fase que antecede a agregação proteica, enquanto houve aumento da Rab24 na presença dos agregados proteicos. Com relação ao peptídeo beta amiloide, foi demonstrado tendência de aumento de p-Tau acompanhado de diminuição da atividade proteassomal e lisossomal. O tratamento com PADK (ativador lisossomal) foi capaz de reverter este efeito nestas diferentes condições. A análise da interrelação entre os sistemas mostrou que uma inibição do proteassoma favorece a via lisossomal e que o inverso não se repete. Os resultados sugerem que a modulação das vias de degradação pode ser interessante para o estudo, prevenção e tratamento das doenças neurodegenerativas associadas à agregação de proteínas / Neurodegenerative diseases, such as Alzheimer\'s, are associated to protein inclusions containing hyperphosphorylated Tau (p-Tau). It is well established that Tau dysfunction impairs cell homeostasis. A key mechanism to prevent and/or reduce the damage promoted by aggregates of Tau might be its degradation. In view of this, the aims of the present study are to evaluate p- Tau clearance following exogenous expression of Bag-2, which stimulates proteasome; as well as to analyze the activation of both lysosome and proteasome pathways in order to understand the crosstalk between these two systems in primary and organotypic cultures of rat hippocampus. Results showed that rotenone was able of increasing p-Tau that was prevented and degraded by Bag-2 overexpression. Mechanisms involved in this process involve the coordination of cell degradation systems, depending upon aggregation status, since Rab7 and Rab24 (involved in lysosomal pathway) were decreased before protein aggregation, while Rab24 increased in the presence of protein inclusions. Amyloid-beta peptide also increased p-Tau accompanied by decreased proteasome and lysosome activity. PADK (lysosomal activator) treatment reverted the inhibition promoted by amyloidbeta peptide. Inhibition of proteasome leads to activation of lysosome, but lysosome inhibition does not affect proteasome. Overall, results suggest that targeting degradation pathways might be useful to understand, prevent and treat neurodegenerative diseases associated with protein deposits