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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23807号 / 医博第4853号 / 新制||医||1058(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 湊谷 謙司, 教授 YOUSSEFIAN Shohab, 教授 石見 拓 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

In dieser Arbeit wurde geprüft, ob eine sequenzspezifische Hybridisierung von zwei Peptid-PNA-Konjugaten an einem komplementären DNA-Templat die Bildung eines neuen Peptids auslösen kann, welches proapoptotische Eigenschaften besitzt. Dazu binden zwei kurze PNA-Oligomere an einem komplementären DNA-Templat und ermöglichen dadurch den Transfer einer Aminoacylgruppe. In den vorgestellten Untersuchungen trug ein Oligomer einen Alaninrest, welcher C-terminal als Thioester gebunden war. An das zweite PNA-Oligomer war ein Peptid mit N-terminalem Cysteinrest geknüpft. Mittels einer Cystein-vermittelten Transferreaktion wurde die Aminoacyleinheit auf das Akzeptor-Konjugat übertragen und es entstand das freie PNA-Oligomer sowie ein neues Peptid. Die so generierten Peptid-PNA-Konjugate waren so konstruiert, dass sie an BIR3 binden und damit dessen Interaktion mit Caspase-9, einem Schlüsselenzym der Apoptose, entgegenwirken konnten. Es wurde ein Assay entwickelt, bei dem die DNA-gesteuerte Transferreaktion mit der Aktivierung der Caspase-9 aus dem inhibitorischen Komplex mit BIR3 in HEK293-Zelllysat kombiniert wurde. Als Vorbereitung für eine intrazelluläre Anwendung der Nukleinsäuretemplat-katalysierten Peptidsynthese wurde zunächst die Stabilität der Konjugate in Zelllysat untersucht und weiterhin eine Synthesestrategie zur PEGylierung der verwendeten Peptid-PNA-Konjugate entwickelt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass mit dem DNA-gesteuerten Aminoacyltransfer zum ersten Mal eine Methode aufgezeigt wurde, welche die in Nukleinsäuren kodierte Information für die Generierung eines Wirkstoffes nutzt, der die Aktivität eines Proteins kontrollieren kann. Die Synthese des aktiven Peptidwirkstoffes gelang in der komplexen Umgebung von Zelllysat, erfolgte sequenzspezifisch und in Gegenwart substöchiometrischer Konzentrationen des Templats. / In this thesis it was investigated, whether the sequence specific hybridisation of two peptide-PNA conjugates could trigger the formation of a new peptide with proapoptotic properties. The method draws upon a nucleic acid-templated reaction, in which two short PNA oligomers bind adjacently on a complementary DNA template enabling the transfer of an amino acyl group. In the presented study one oligomer carried an alanine residue that was C-terminally attached to the PNA sequence via a thioester linkage. The second PNA oligomer conferred a peptide with an N-terminal cysteine residue and served as acceptor. In a cysteine mediated transfer reaction an amino acyl moiety was transferred to the acceptor conjugate yielding a free PNA oligomer and a new peptide. The generated peptide-PNA conjugates were designed to bind BIR3 protein and therefore interrupt its interaction with caspase-9 a key enzyme of apoptosis. In a cell free functional assay, which included recombinant BIR3 protein and HEK293 cell lysate, the peptide-PNA conjugates formed upon the DNA-triggered peptide synthesis acted as BIR3 antagonists and allowed reactivation of inhibited initiator caspase-9 as well as of the executioner caspase-3. Preliminary studies for future intracellular applications of this method included the investigation of the stability of the peptide-PNA conjugates in cell lysate and the development of a synthetic strategy for the PEGylation of the conjugates. With the DNA-triggered peptide synthesis via aminoacyl transfer we introduced a method, which allows for the translation of nucleic acid information into the output of molecules that interfere with disease-related protein-protein interactions. The synthesis of the active peptide drug proceeds sequence specifically and shows turnover in template even in a complex biomolecular environment such as cell lysate.

Protein-Arrays sind das Mittel der Wahl, um eine Vielzahl von Proteinen parallel zu untersuchen. Ziele dieser Untersuchungen sind meistens Proteininteraktionsnetzwerke zu entdecken oder besser verstehen zu können. Bisher wurden die benötigten Proteine fast ausschließlich mit biologischen Methoden gewonnen. Diese bieten allerdings keinen generellen Zugang zu posttranslational-modi-fizierten (PTM)-Proteinen. Somit war es bisher nicht möglich den Einfluss von PTMs auf Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) im Arrayformat zu untersuchen. Die chemische Synthese kann dagegen Proteine mit ortsspezifischen PTMs liefern. Daher ist es verwunderlich, dass bislang noch keine Berichte über chemisch hergestellte PTM-Protein-Arrays existieren, besonders da PTMs meist entscheidend für proteomische Interaktionsnetzwerke sind. In der vorliegenden Arbeit wird eine Methodik beschrieben, die es ermöglicht PTM-modifizierte Protein-Domänen-Arrays auf der Oberfläche zu synthetisieren und zu analysieren. Mit der Methodik wurden 20 SH3-Domänen synthetisiert und 64 PPIs gemessen. Neben vier Hefe-SH3-Domänen wurden je acht humane (Phospho)SH3-Domänen der Abl- und Arg(Abl2)-Tyrosinkinase synthetisiert und funktionell untersucht. Es wurde gefunden, dass die Ligandenspezifität von Abl-SH3-Domänen durch Phosphorylierung feinreguliert wird. Je nach Phosphorylierungsmustern wurde die Affinität für spezifische Liganden erhöht oder erniedrigt. Der Ursprung dieser Phosphoregulierung wurde für die Abl-SH3-Domäne mit Hilfe der NMR-Spektroskopie und durch Zellexperimente versucht zu entschlüsseln und weiter validiert. / Protein-arrays are the method of choice to investigate a variety of proteins in a parallel fashion. Objectives of these studies are mostly to discover or to investigate protein interaction networks. So far, the necessary proteins were almost exclusively gained by biological methods. Unfortunately, generic access to proteins bearing post-translational modifications (PTM) is not provided by these techniques. Therefore, it was not possible to investigate the impact of PTMs on protein-protein-interactions (PPIs) on arrays so far. Chemical synthesis in contrast offers proteins with site-specific PTM incorporation. In this context, it is surprising, that chemical methods of PTM-protein array synthesis remained virtually unexplored, especially since these modifications are usually crucial for proteomic interaction networks. In this thesis, a methodology is described, that allows to synthesize and functional analyse post-translationally modified protein domain arrays on the surface. By using this methodology, 20 SH3 domains were synthesized and 64 protein-pep-tide interactions were measured. In addition to 4 yeast SH3 domains, 8 human (phospho) SH3 domains of the Abl and Arg(Abl2) tyrosine kinase were synthesized and functionally investigated. The experiments revealed that phosphorylation might serve as a means to fine tune the ligand recognition. Depending on the phosphorylation pattern the affinity to specific interaction partners were enhanced or reduced. The origin of this phosphoregulation was further investigated for the Abl SH3 domain by means of NMR spectroscopy and cellular experiments.

Native chemische Ligation ist heutzutage die Methode der Wahl für die chemische Synthese von Proteinen. Die Voraussetzung der Methode: ein Cystein Rest am N-Terminus, gilt als größter Nachteil der Methode. N-alpha-Auxiliare werden seit mehreren Jahren als Cystein-Surrogat verwendet, um diese Einschränkungen zu überwinden. Aufgrund zahlreicher Einschränkungen haben sich die Auxiliare als Standard Methode nicht durchgesetzt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neue Klase N-alpah-Auxiliare entwickelt. Die Auxiliare sind einfach zu synthesieren, können direkt auf den Festphasen in das Peptid eingeführt und unter milden basischen Bedingungen wieder abgespalten werden. Modelversuche wurden durchgeführt um ihr Eigenschaften hinsichtlich der native chemische Ligation und Abspaltung zu evaluieren. Daraufhin wurden die Auxiliare für die Synthese der antimikrobiellen Domäne des Dermicidin Proteins verwendet. Die chemische Ligation an der festen Phase hat in den letzten Jahren erheblich an Popularität gewonnen. Die Methode profitiert von der einfachen Reinigungseigenschaften der Festphasensynthese und erlaubt die sequenzielle Verknüpfung von mehreren Peptidfragmenten zu den gewünschten Zielproteinen mit hohen Reinheiten. Im zweiten Teil der Dissertation wurde das Konzept der chemische Festphasen Ligation mit der Hilfe eines „Second Generation“ Auxiliar über die Cysteinchemie hinaus erweitert. Durch Auxiliar-unterstüzte Festphase Ligation“ wurde die variable tandem repeats Domäne des MUC1 Proteins hergestellt. / Native chemical ligation continues to lead as the method of choice for the total chemical synthesis of proteins. Despite the methods broad use the method requirement for a terminal cysteine residue remains its biggest disadvantage. N-alpah-auxiliaries have long been used to overcome this inherent hindrance by acting as cysteine mimics. The method however has still not achieved broad use due to several key issues. In the first part of the thesis a new class of N-alpha-auxiliaries is presented. The auxiliaries are straightforwardly synthesized, readily introduced onto the peptide building blocks and cleaved under mild basic conditions. Model tests were carried out to evaluate the auxiliaries’ characteristics and their removal chemistry was developed. Finally, the auxiliary was utilized for the synthesis of the antimicrobial C-terminal domain of Dermicidine. Solid phase chemical ligation has grown in popularity in the recent years. Benefitting from the solid-phase inherent purification characteristic it allows for multiple peptide fragments to be ligated in a sequential fashion to yield the full length protein target in high purity. In the second part of the dissertation the concept of solid phase chemical ligation is expanded beyond the cysteine junction using a “second generation” auxiliary. MUC1 protein variable tandem repeats domain was synthesized using auxiliary-assisted solid phase chemical ligation.

La ligation chimique implique la liaison des molécules de manière covalente pour former un nouveau complexe ayant les propriétés combinées de ses composants individuels. Ainsi, les composés naturels ou synthétiques avec leurs activités individuelles peuvent être conjuguer pour créer des substances possédant des caractéristiques uniques. Un domaine d' intérêt particulier à ces procédures est le marquage de protéines. Afin de simplifier et d'accélérer la découverte de nouvelles réactions de ligation bioselectives, nous avons conçu un système de screening rapide pour attribuer de la sélectivité et de la réactivité d'un groupement fonctionnel vers une série de dérivés d'acides aminés traçable. Une fonction chimique à propriétés prometteuse – 3-arylpropiolonitrile (APN) – a été identifiée. Les études comparatives ont démontré que cette technique offrait une meilleure sélectivité et stabilité par rapport à la technologie classique basée sur l’utilisation du groupement maléimide. L’utilisation de l’APN permet d’obtenir des bioconjugués propres et résistants à la décomposition, ce qui est d’une importance cruciale pour les applications médicales. Étude structure-réactivité nous a permis d'optimiser ses propriétés et de préparer une série de sondes fonctionnelles, dont un a été utilisé pour tester la sélectivité d'APN sur les mélanges modèles de peptides. De plus, les APN ont été trouvés à posséder une sélectivité élevée vers sélénocystéine: un acide aminé rare mais très important présent dans de nombreux enzymes actives. Une série des APN a été testée pour son activité inhibitrice envers une enzyme contenant sélénocystéine – thiorédoxine réductase – et s'est révélé posséder des activités élevées Enfin, une approche combinatoire de type split and mix a été développée visant à identifier des séquences peptidiques possédant la réactivité élevée avec les réactifs biosélectifs déjà connus. / Chemical ligation involves the linking of molecules in covalent manner to form a novel complex having the combined properties of its individual components. Thus, natural or synthetic compounds with their individual activities can be chemically combined to create unique substances possessing carefully engineered characteristics. A field of especial interest in such ligation procedures is protein labeling.To accelerate the discovery of new bioselective ligation reactions, we designed a screening system for fast assigning of the selectivity and reactivity of a given functional group owards series of UVGtraceable amino acid derivatives. As a result of our screening a promising cysteineGselective scaffold–3Garylpropiolonitrile (APN)–was identified. Its remarkable selectivity, high reactivity and of both starting and addition products in aqueous and organic media represents an important advantage compared to methodologies classically used for cysteine tagging. StructureGreactivity study allowed us to optimise its properties and toprepare a series of funcional probes, one of which was used for!an accurate test of APN selectivity on model mixtures of peptides. Furthermore, APN were found to possess an elevated selectivity towards selenocysteine:ararebut very important amino!acid found in many active enzymes.A series of APN was tested for their inhibitory activity towards one of such selenocysteineGcontaining enzyme–thioredoxine reductase–and was found to possess promising activities, which however still must be!optimised.Lastly, a screening system devoted to the discovery of reagents reactivity towards a sequence of amino acid residue was elaborated and allowed us to determine presumable discrepancy in reactivity of APN depending on the amino acid residue neighbouring the cysteine moiety. Such difference in reactivity may represent an important advantage for bioconjugation, and is currently under further investigation.

In den letzten Jahren gab es rasche Weiterentwicklungen auf dem Gebiet der Nukleinsäure-Erkennung. Von microRNA-Quantifizierung zur Untersuchung von Zelltods, --Teilung und -Regulation bis zur Bewertung genetischer Variabilität in Hinblick auf Krankheitsentstehung und -Behandlung: Die Analyse von Nukleinsäuren wird in der zukünftigen Medizin eine zentrale Rolle zukommen. Vor allem die Erkennung von SNPs als Hauptquelle der genetischen Vielfalt, aber aus Analysesicht auch eine der herausforderndsten Mutationen, stellt in dieser Hinsicht einen wesentlichen Aspekt dar. Methoden zur SNP-Erkennung müssen nicht nur sensibel, selektiv und stabil, sondern auch vielfältig sein und eine der wachsenden Analyseanzahl gerecht werdende hohe Verarbeitungsmenge bieten. Im Rahmendieser Arbeit wurde ein chemisches Prüfverfahren zur Erkennung von Nukleinsäuren und Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) entwickelt. Das Reaktionssystem zur Nukleinsäuren- Erkennung beruht hierbeiauf der Interaktion zweier modifizierter Peptid-Nukleinsäure (PNS) Oligonukleotiden. Das Erste beinhaltet einen C-terminalen Thioester (Donor-Sonde), die zweite einen N-terminalen Cysteinyl-Rest (Akzeptor-Sonde). Zusätzlich ist die Donor-Sonde durch einenmakrocyclischen Metall Chelatkomplex aus 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure(DOTA) mit einem gebundenen lanthanoid-tag funktionalisiert. In die Akzeptor-Sonde wurde, zurReinigung mit magnetischen Streptavidin Partikeln, Biotin integriert. Der Ziel-DNA-Strang bringt beideSonden in räumliche Nähe zueinander und ermöglicht so eine chemische Reaktion. Das so gewonneneLigationsprodukt beinhaltet den Lanthanoid-Tag und Biotin, über welches das Produkt gereinigt wird,bevor die Detektion mittels ICP-MS erfolgt. Die Lanthanoid Konzentration dient als Indikator desLigationsprodukts welches wiederum den Reporter des Ziel-DNS-Strangs darstellt. Die, mithilfe diesesSystems erreichte, methodische Nachweisgrenze lag bei 29 pM mit einem RSD von 6,8% bei 50 pM(n=5). Zur Erkennung von SNPs wurde das Experiment mit einer Kombination zweier-Sets PNS Sonden mit unterschiedlichen Lanthanoid Tags durchgeführt. Das erste Set zielte auf die SNP beinhaltende Sequenz (Reportersystem) ab, während das zweite an eine benachbarte Sequenz (Kontrollsystem) binden sollte. Zur Erkennung der SNP wurden die Signale bei der Lanthanoide wurden ins Verhältnis gesetzt. Mithilfe dieses Verfahrens konnte durch Messung von sechs Lanthaniden bei einer Konzentration von 5 nM erfolgreich simultan zwischen den Allelen dreier SNPs unterschieden werden. / The field of nucleic acid detection has evolved swiftly in recent years. From quantification of micro RNA for the study of cell death, proliferation, and regulation, to the assessment of the influence of genetic variability towards disease development and treatment, the analysis of nucleic acids will play a central role in future medicine. In that regard, the detection of SNPs, as the primary source of genetic variability and the most challenging mutation from the analytical point of view, will be at the forefront of the discussion. Methods for the detection of SNPs not only require sensitivity, selectivity and robustness, but they should also allow multiplexing and offer high throughput in order to face the growing analysis demand In this work an assay for the detection of nucleic acids and single nucleotide polymorphisms (SNPs) was developed. The reaction system for the detection of nucleic acids is based on the interaction between two modified peptide nucleic acid (PNA) oligonucleotides. The first incorporated a C-terminal thioester (donor probe), and the second one a N-terminal cysteinyl residue (acceptor probe). In addition, the donor probe is functionalized with a metal-tag, which consist of a macrocyclic metal chelate complex of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) with a chelated lanthanoide. A biotin tag for purification by streptavidin magnetic particles was incorporated in the acceptor probe. The target DNA strand brings together the reporter probes allowing the chemical reaction. The resulting ligation product contains the metal-tag and the biotin, which is used to purify the product before measurement in the ICP-MS system. The lanthanoid concentration is used as an indicator of the ligation product, which at the same time serves as reporter of the target template. The methodological limit of detection achieved with this system was 29 pM with RSD of 6.8% at 50 pM (n=5). Detection of SNPs was performed using a combination of two sets of PNA probes labeled with different lanthanoid metal tags. The first probe set targeted the sequence where the SNP was present (reporter probe system), while the second set of probes was designed to bind to a neighboring sequence (control probe system). The signals of both lanthanides were used to establish a ratio that allowed the detection of the SNP. This assay was successfully used to simultaneously differentiate between alleles of 3 SNPs by measuring six lanthanoids at 5 nM concentration.

Contexte: L'encéphalopathie hépatique (EH) est une complication majeure de la maladie hépatique chronique (MHC) caractérisée par des symptômes débilitants, notamment des troubles cognitifs, psychiatriques et moteurs. Il est cru que l’EH, définie comme étant un syndrome métabolique, disparaît après une transplantation hépatique (TH). Cependant, des complications neurologiques persistantes ont été signalées chez jusqu'à 47 % des receveurs de TH. Plusieurs études rétrospectives ont démontré une association entre des antécédents d'épisodes d'EH pré-TH et une mauvaise condition neurologique après la TH. D’autre part, l’alcool est un facteur étiologique fréquent à l’origine de la MHC. Cependant, une consommation excessive d’alcool a également un impact sur le cerveau. À ce jour, l’impact des épisodes d’EH ainsi que de l’alcool sur le développement de l’EH et l’intégrité cérébrale reste indéfini. Par conséquent, nos objectifs étaient 1) d’évaluer l'impact de plusieurs épisodes d’EH (induits par l'ammoniac) et 2) d'évaluer l'effet d'une consommation constante d'alcool sur le déclin neurologique, l'intégrité et les lésions cérébrales chez les rats atteints de MHC induite par la ligature des voies biliaires (LVB). Méthodes: Pour le premier objectif, des rats LVB ont reçu une injection (s.c.) d'acétate d'ammonium (LVB-Ammoniac), précipitant un épisode sévère d'EH réversible (perte du réflexe de redressement) tous les 4 jours à partir de la semaine 3 post-chirurgie LVB ( total ; 4 épisodes). Des rats SHAM ont également reçu une injection d'ammoniaque et des rats témoins BDL/SHAM ont reçu une injection de solution saline. La coordination motrice (rotarod) et la mémoire à court et à long-terme (test de reconnaissance d'objets nouveaux) ont été évaluées une semaine après la dernière injection. Pour évaluer l'intégrité neuronale, une analyse d’immunobuvardage de type Western et d’immunofluorescence a été réalisée dans le cortex frontal, le cervelet et l'hippocampe. Pour le deuxième objectif, des rats LVB ont reçu de l'alcool (LVB-Alcool) deux fois par jour (51 % v/v, dose de 3 g/kg, par gavage) pendant 4 semaines. Les rats SHAM ont également reçu de l'alcool et les rats LVB/SHAM servant de contrôles ont reçu une solution saline. La coordination motrice (rotarod) et le comportement anxieux (champ ouvert et labyrinthe surélevé) ont été évalués une semaine après la dernière administration d'alcool. Des analyses d’immunobuvardage de type Western et d’immunofluorescence ont été effectuées pour étudier l'intégrité neuronale du cortex frontal et du cervelet. Résultats: Chez les LVB-Ammoniac, des niveaux protéiques plus élevés d’un marqueur astrocytaire (GFAP) et apoptotique (caspase-3 et Bax/Bcl2) ont été trouvés dans l'hippocampe, alors que les niveaux de marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311) ont été réduits par rapport à tous les autres groupes expérimentaux. Les rats LVB-Ammoniac ont présenté des niveaux accrus de stress oxydatif plasmatique par rapport aux rats SHAM/BDL respectifs. Une diminution des niveaux de capacité antioxydante totale (CAT) et une augmentation des protéines modifiées par le 4-HNE ont été observées dans l'hippocampe (et non dans le cortex frontal ou le cervelet) du groupe LVB-Ammoniac par rapport aux rats SHAM/BDL respectifs. Les résultats d'immunofluorescence ont révélé la colocalisation du marqueur apoptotique (caspase-3 clivée) avec un marqueur neuronal (NeuN) dans la région CA1 de l'hippocampe des rats LVB-Ammoniac. Chez les rats LVB-alcool, il a été démontré une altération de la coordination motrice aux semaines 2, 3, 4 et 5 ainsi qu'une augmentation du comportement anxieux par rapport aux rats SHAM respectifs. Chez les rats BDL-alcool, il a été démontré une diminution des marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311), une augmentation de l'activité enzymatique apoptotique (caspase-3 clivée), une augmentation des marqueurs de nécroptose (pRIP3 et pMLKL), une diminution de la CAT et une augmentation des protéines modifiées par 4-HNE dans le cervelet par rapport à tous les groupes. Les résultats d'immunofluorescence ont révélé la colocalisation du marqueur apoptotique (caspase-3 clivée) et du marqueur de nécroptose (pMLKL) dans les neurones de la couche granulaire du cervelet de rats LVB-alcool. Conclusion: De multiples épisodes d'EH sévère ont entraîné une perte de cellules neuronales dans l'hippocampe des rats LVB et qui est associée à une augmentation du stress oxydatif, à l'apoptose et à une diminution des cellules neuronales. Des niveaux élevés du marqueur astrocytaire (GFAP) dans l'hippocampe insinuent une gliose, pouvant être le résultat d'une perte neuronale. De plus, l'administration d'alcool aggrave les troubles de la coordination chez les rats LVB et qui ont été associés à une augmentation du stress oxydatif, à une diminution des marqueurs neuronaux (NeuN et SMI311) avec l’apoptose et la nécroptose dans le cervelet des rats LVB-alcool. Globalement, de multiples épisodes d’EH sévère ainsi qu'une consommation constante d'alcool, via le stress oxydatif, déclenchent une perte/lésion neuronale qui entraînera par conséquent une mauvaise condition neurologique après la TH. / Background: Hepatic encephalopathy (HE) is a major complication of chronic liver disease (CLD) characterized by debilitating symptoms, including cognitive, psychiatric, and motor disturbances. HE, defined as a metabolic syndrome, is believed to resolve following liver transplantation (LT). However, persisting neurological complications have been reported in up to 47% of LT recipients. Several retrospective studies have demonstrated an association between a history of HE episodes pre-LT and poor neurological outcome following LT. Furthermore, alcohol is a common etiological factor which causes CLD. However, excessive alcohol consumption also impacts the brain. To date, the impact of HE episodes as well as of alcohol on the development of HE and brain integrity remains undefined. Therefore, our aims were to 1) evaluate the impact of multiple episodes (induced by ammonia) and 2) evaluate the effect of constant alcohol consumption on neurological decline, brain integrity and injury in rats with CLD induced via bile-duct ligation (BDL). Methods: In the first aim, BDL rats were injected (s.c.) with ammonium acetate (BDLAmmonia), precipitating a reversible overt episode of HE (loss of righting reflex) every 4 days from week 3 post-BDL surgery (total; 4 episodes). SHAM rats were also injected with ammonia and BDL/SHAM rats were injected with saline as controls. To assess the neuronal integrity, western blot and immunofluorescence analysis were performed for frontal cortex, cerebellum, and hippocampus. Motor coordination (rotarod) and short- and long-memory (novel object recognition test) were assessed one week following last injection. In the second aim, BDL rats were administered alcohol (BDL-Alcohol) twice a day (51% v/v, dose of 3g/kg, via gavage) for 4 weeks. SHAM rats also received alcohol and BDL/SHAM rats received saline as controls. Motor coordination (rotarod) and anxiety-like behavior (open field and elevated plus maze) were assessed one week following last alcohol administration. Western blot and immunofluorescence analyses were performed to investigate neuronal integrity in frontal cortex and cerebellum. Results: In BDL-Ammonia, higher protein levels of astrocytic marker (GFAP) and apoptotic markers (caspase-3 and Bax/Bcl2) were found in the hippocampus, whereas neuronal markers (NeuN and SMI311) levels were reduced compared to all other experimental groups. BDLAmmonia rats showed increased levels of plasma oxidative stress compared to respective SHAM/BDL rats. Decreased levels of total antioxidant capacity (TAC) and increased 4-HNE modified proteins were found in the hippocampus (not in frontal cortex or cerebellum) of the BDL-Ammonia group compared to respective SHAM/BDL rats. Immunofluorescence results revealed the colocalization of apoptotic marker (cleaved caspase-3) with neuronal marker (NeuN) in the CA1 region of the hippocampus of BDL-Ammonia rats. BDL-Alcohol rats demonstrated impaired motor coordination at weeks 2, 3, 4, and 5 as well as an increase in anxiety-like behavior compared to respective SHAM rats. BDL-Alcohol rats showed a decrease in neuronal markers (NeuN and SMI311), an increase in apoptotic enzyme activity (cleaved caspase-3), an increase in necroptosis markers (pRIP3 and pMLKL), a decrease in TAC and an increase in 4-HNE modified proteins in the cerebellum compared to all groups. Immunofluorescence results revealed the colocalization of apoptotic marker (cleaved caspase3) and necroptosis marker (pMLKL) in granular layer neurons of the cerebellum of BDLAlcohol rats. Conclusion: Multiple episodes of overt HE led to neuronal cell loss in the hippocampus of BDL rats which was associated with increased oxidative stress, apoptosis and decreased neuronal count. Elevated levels of astrocytic marker (GFAP) in the hippocampus insinuate gliosis, possibly a result of neuronal loss. Moreover, alcohol administration worsens coordination impairments in BDL rats which were associated with increased oxidative stress, decreased neuronal markers (NeuN and SMI311) with apoptosis and necroptosis in the cerebellum of BDL-Alcohol rats. Overall, both multiple episodes of overt HE as well as continuous alcohol consumption, via oxidative stress, triggers neuronal loss/injury which consequently will lead to poor neurological outcome post-LT.

Posttranslationale Modifikationen sind chemische Veränderungen, die ein Protein nach der Translation durchläuft. Sie sind wichtig für die Regulierung der Funktion, Struktur und Interaktion von Proteinen. Die Einführung von Modifikationen in Biomoleküle ist zudem ein Hilfsmittel in der Chemischen Biologie, um neue Informationen über ihr Verhalten zu erlangen und ihre Aktivität zu verändern. Die Fehlregulierung von posttranslationalen Modifikationen steht häufig in direkter Verbindung zum Ausbruch von Krankheiten. Ein Beispiel ist das Tau Protein welches eine Schlüsselrolle in der Alzheimer Erkrankung hat. Im Laufe der Krankheit wird Tau hyperphosphoryliert, was zu einem Funktionsverlust des Proteins und zur Bildung von nicht-löslichen Aggregaten führt. Die Mechanismen hinter dieser Fehlregulierung zu eluieren gehört zu einer der großen Herausforderungen der Alzheimerforschung. Diese Doktorarbeit hat sich mit der Entwicklung einer neuen semi-synthetischen Ligationsstrategie beschäftigt, die es ermöglichen soll die Rolle einzelner Phosphorylierungen in der Prolin-reichen Region des Tau Proteins zu untersuchen. Hierfür wurden geeignete Ligationsstellen identifiziert, Ligationsmöglichkeiten geprüft und die Synthese der einzelnen Fragmente optimiert. Desweiteren wurde in dieser Dissertation eine neuartige Anwendung der Staudinger-Phosphonit Ligation entwickelt, die es ermöglicht mit Boran-geschützten P(III) Verbindungen azidhaltige Moleküle zu lichtspaltbaren Phosphonamidaten zu modifizieren. Die P(III) Bausteine beinhalteten dabei nicht nur zwei lichtspaltbare 2-Nitrobenzyl-Substituenten, sondern erlauben zudem über eine Alkingruppe eine vielfältige Funktionalisierung. Die Bestrahlung durch UV Licht induziert die Spaltung der P-N Bindung der Phosphonamidate und setzte das Ursprungsmolekül mit einer zusätzlichen Aminfunktion frei. Dahingehend wurden erste Schritte unternommen, damit die Lichtspaltung keine Modifikation mehr am Ursprungsmolekül hinterlässt. / Post-translational modifications are essential in the regulation of the function, folding and interaction of proteins. Similarly, the modification of biomolecules is a main tool in chemical biology to gain new insights into their molecular mechanisms and to alter and fine-tune their activity. The dysregulation of post-translational modifications is often associated with disease. An example are the abnormally hyperphosphorylated tau proteins that are the main component of neurofibrillary tangles, one of the pathological hallmarks of the neurodegenerative disease Alzheimer‘s disease. The origin of these hyperphosphorylations, which render a soluble and mostly unstructured protein into insoluble aggregates, is a key question in Alzheimer research. First steps towards a tau semi-synthesis that allow for the site-specific introduction of phosphorylations in the proline-rich domain were taken by identifying suitable ligation sites, finding the ideal sequential ligation strategy, providing reliable protein expression protocols and optimizing the synthesis of the synthetic peptides equipped with phosphorylated residues. Furthermore, this thesis explored the use of the Staudinger-phosphonite reaction in the synthesis of photo-cleavable phosphonamidates to modify biomolecules in a reversible manner. This conjugation method allowed for the chemoselective modification of an azido-containing target molecule with a borane-protected P(III) reagent that was equipped with photo-cleavable 2-nitrobenzyl substituents and one alkyne for functionalization. UV irradiation induced the phosphonamidate P-N bond cleavage and resulted in the release of the target molecule with an additional amine functionality. In this regard, first steps were undertaken to develop a traceless variant of this cleavage. The application of the photo-cleavable phosphonamidates was demonstrated in streptavidin-mediated immobilization assays, which is just one example for the use of this valuable methodology.