A infecção pelo HPV é correlacionada com processos neoplásicos ginecológicos e vários estudos têm sido conduzidos sobre a influência da resposta imune interferindo na oncogênese. A epidemia do HIV e as doenças sexualmente transmissíveis, inicialmente concentradas em grupos de riscos masculinos, apresentam atualmente, uma maior prevalência em mulheres, o que tem aumentado o número de infecção concomitante HPV e HIV. O estudo da resposta imune in situ é uma ferramenta essencial para a compreensão destes processos, medindo diretamente no órgão alvo a resposta imune existente. Nas mucosas, a IgA é a principal responsável pelo controle de várias infecções. As células TCD4+ e TCD8+ têm como principal função auxiliar a resposta imune e as TCD8+ agem também como citotóxicos.Neste trabalho, estudou-se 81 biópsias de vagina de mulheres que foram distribuídas em três grupos: I - com AIDS e HPV (55); II - com infecção pelo HPV e HIV negativa (13); III - HIV e HPV negativas (13). Foram realizados: exame colposcópico, avaliação semiquantitativa dos achados histológicos, hibridização in situ, estudo imuno-histoquímico para IgA, TCD4+ e TCD8+. Observou-se que o padrão citológico suspeito de NIVA mostrou relacionar-se com a quantidade tecidual de células TCD8+ e a infecção pelo HPV, mas não com o número de células TCD4+ ou IgA. A análise colposcópica definiu quadros que tiveram relação significativa com as lesões histopatológicas encontradas e com a infecção pelo HPV, mas sem relação com a co-infecção pelo HIV/HPV, uso de terapia anti-retroviral ou número de TCD4+ circulantes. Verificou-se que a expressão in situ de IgA nas biópsias de vagina de pacientes com vaginite crônica inespecífica, infecção pelo HPV ou co-infecção HPV/HIV não é um parâmetro relevante para discriminar a resposta imune humoral protetora entre esses grupos de pacientes e que o padrão citológico inflamatório é menos expressivo nos casos de infecção pelo HPV que nos casos de vaginite crônica não especifica. Outrossim, a imunidade adquirida revelou maior expressão de células TCD8+ in situ em casos de NIVA que nas vaginites crônicas não relacionadas ao HIV ou HPV e tendência a expressão de maior número de linfócitos TCD4+ em casos de NIVA e condiloma. Por outro lado, as alterações de proliferação epitelial tais como hiperqueratose e metaplasia escamosa epidermóide tiveram relação com NIVA de alto grau e condiloma. Os achados de acantose e hiperqueratose relacionaram-se à infecção pelo HIV/HPV, assim como alterações colposcópicas mais acentuadas. / The infection by HPV (Human papillomavirus) is correlated to gynecologic neoplasic processes and several studies have been performed on the influence of the immune response with interference in the oncogenesis. The HIV (Human Immunodeficiency Virus) epidemic and the sexually-transmitted diseases, initially concentrated in risk groups of men, currently show a higher prevalence in women, which has been increasing the number of concurrent HPV and HIV infection. The study of the in situ immune response is an essential tool for the understanding of these processes, measuring the existing immune response directly in the target organ. In the mucosae, IgA (Immunoglobulin A) is the main responsible for the control of several infections. The main function of the TCD4+ and TCD8+ cells (T cells that express CD4 and CD8) is to help the immune response and TCD8+ cells also play a cytotoxic role. In this work, 81 vagina biopsies have been studied, of women distributed into three groups: I - with AIDS and HPV (55); II - with HPV infection and HIV negative (13); III - HIV and HPV negative (13). It was performed: colposcopic examination, semi-quantitative evaluation of the histological findings, in situ hybridization, immunochemical study for IgA, TCD4+ and TCD8+. It was observed that the suspect cytological pattern of VAIN (Vaginal intraepithelial neoplasia) showed to be related to the total tissue quantity of TCD8+ cells and the HPV infection, but not to the number of TCD4+ cells or IgA. The colposcopic analysis defined conditions that have been significantly related to the histopathological lesions found and to the HPV infection, but not related to the HIV/HPV co-infection, use of antiretroviral therapy or number of TCD4+ in circulation. It was observed that the in situ expression of IgA in the vagina biopsies of patients experiencing nonspecific chronic vaginitis, HPV infection or HPV/HIV co-infection is not a relevant parameter to distinguish the protective humoral immune response among those patient groups and that the inflammatory cytological pattern is less expressive in the cases of HPV infection than in the cases of nonspecific chronic vaginitis. In addition, the acquired immunity showed a higher in situ expression of TCD8+ cells in VAIN cases than in the chronic vaginitis not related to HIV or HPV and the tendency to the expression of a higher number of TCD4+ lymphocytes in VAIN and condyloma cases. On the other hand, the alterations in the epithelial proliferation, such as hyperkeratosis and epidermoid squamous metaplasia were related to high-grade VAIN and condyloma. The findings of acanthosis and hyperkeratosis were related to the HIV/HPV infection, as well as the most remarkable colposcopic alterations.

O controle da infecção por Trypanosoma cruzi dependente da resposta de linfócitos T CD8+. Porém, o parasito faz a indução subótima destes linfócitos, que pode ser corrigida pela vacinação genética. Não se sabe como T. cruzi induz uma resposta ruim dos linfócitos T CD8+, nem como a vacinação reverte esta resposta. Estas questões foram objeto de estudo da presente tese. O envolvimento do imunoproteassomo foi investigado na indução de imunidade in vivo em animais triplamente deficientes das subunidades 1i, 2i e 5i (TKO), indicando que o imunoproteassomo é essencial para o processamento dos epítopos de T. cruzi relacionados à imunidade protetora de linfócitos T CD8+ gerados durante a infecção e na vacinação. Também foi observado que T. cruzi, mas não adenovírus, é capaz de tornar uma resposta ótima de linfócitos transgênicos induzidos in vivo em subótima. A interferência do parasito envolveu a supressão ativa do priming dos linfócitos T CD8+ mediada por linfócitos T CD4+ CD25- Foxp3+ de modo independente de IL-10, mas parcialmente dependente de TGF- e CTLA-4. / The control of infection by Trypanosoma cruzi relies on the response of CD8+ T cells. However, the parasite suboptimally induces these lymphocytes, which can be corrected by genetic vaccination. It is unknown how T. cruzi induces a poor response of CD8+ T cells and how vaccination reverts this. These questions were subject of study in this thesis. The involvement of the immunoproteasome was investigated in the in vivo induction of immunity in mice triply deficient of the subunits β1i, β2i e β5i (TKO), indicating that the immunoproteasome is essential for the processing of T. cruzi epitopes related to the protective immunity of CD8+ T cells generated upon infection and vaccination. Also, it was observed that T. cruzi, and not adenovirus, is capable of turning an optimal response of in vivo-induced transgenic CD8+ T cells into suboptimal. The parasite interference involved the active suppression of CD8+ T cell priming mediated by CD4+ CD25- Foxp3+ lymphocytes, in an IL-10-independent, but TGF-β and CTLA-4 partially dependent manner.

A dengue é uma doença infecciosa aguda causada pelo vírus DEN do gênero Flavivirus e é transmitida pela picada de um mosquito vetor, principalmente o Aedes aegypti. Existem quatro sorotipos do vírus da dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4) e sua incidência tem aumentado dramaticamente nos últimos 50 anos, inclusive no Brasil. O objetivo deste trabalho é caracterizar subpopulações de linfócitos T, principalmente linfócitos T CD8+, provenientes de pacientes infectados quanto a sua capacidade proliferativa, seu estado de ativação e memória celular. Os pacientes foram recrutados no Hospital Ana Costa de Santos, SP, no ano de 2010, após assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. O diagnóstico de dengue foi realizado utilizando o teste rápido Dengue Duo e os parâmetros imunológicos foram analisados no citômetro de fluxo. Foi coletado sangue periférico para criopreservação de células mononucleares e separação de soro para detecção da carga viral. Pacientes com dengue apresentaram maior proliferação de linfócitos T CD8+ quando comparados com indivíduos saudáveis. Foi ainda observado que tal proliferação celular foi evidente nos dias cinco e seis de sintomas. Quando marcadores de ativação celular foram analisados por citometria de fluxo, observou-se um aumento de linfócitos T CD8+ expressando CD38 e HLA-DR nos pacientes, quando comparados com indivíduos saudáveis. Da mesma forma, a ativação celular também aumentou com o passar dos dias de sintomas com destaque para o quinto e sexto dia. Este aumento na ativação das células juntamente com os dias de sintomas, foi igualmente observado em várias subpopulações de células T de memória Além disso, foi observada uma correlação negativa entre o número absoluto de linfócitos T CD8+ e a carga viral. Juntos, os resultados desse estudo sugerem que a infecção por DEN leva a um aumento da ativação de células T CD8+ / Dengue is an acute disease caused by DEN, a Flavivirus transmitted by a mosquito vector, primarily Aedes aegypti. There are four serotypes of dengue viruses (DEN-1, DEN-2, DEN-3 and DEN-4) and their incidences have increased dramatically over the past 50 years, including in Brazil. The goal of this study is to characterize subpopulations of T lymphocytes, mainly CD8+ T cells, from infected patients. Status of cell activation, and memory cell profiles were assessed. Patients were recruited at Hospital Ana Costa, Santos-SP, Brazil, in 2010, after having signed an informed consent form. The serologic diagnosis of dengue was carryied out using a rapid test and immunological parameters were analyzed in flow cytometer. Peripheral blood was collected for cryopreservation of mononuclear cells and separation of serum for viral load testing. Dengue patients showed higher proliferation of CD8+ T cells compared to healthy subjects. Cell proliferation was more evident in the fifth and sixth days of symptoms. We observed increased frequency of CD8+ T cells expressing activation markers CD38 and HLA-DR in patients, when compared to healthy subjects. Similarly, T cell activation also increased along with the passing days of symptoms hitting on the fifth and the sixth days. Such augment in cellular activation along with the days of symptoms was equally observed in the several memory T cell compartments. Furthermore, we observed a negative correlation between the absolute number of CD8+ T lymphocytes and viral load. Together, the results of this study suggest that dengue virus infection leads to an increased activation of CD8+ T cells

Utilizando modelo de coinflamação tuberculose e alergia (TB/OVA), nosso grupo mostrou que camundongos BALB/c coinflamados apresentaram diminuição significativa no número de bacilos, associada com diminuição no infiltrado granulomatoso no pulmão, aumento na produção de leucotrieno B4 e no número de células CD8+, quando comparados ao grupo infectado com Mycobacterium tuberculosis (TB). No presente estudo, nosso objetivo foi avaliar os mecanismos envolvidos na restrição ao crescimento dos bacilos nos animais do grupo TB/OVA. Quatro estratégias foram usadas: I) Para avaliar o papel dos linfócitos CD8+ no modelo TB/OVA, foram utilizados camundongos deficientes para a molécula CD8 (CD8KO). Foi observado que não houve diferenças significativas no crescimento do bacilo no pulmão dos animais CD8KO-TB/OVA e WT-TB/OVA. No entanto, nos pulmões dos animais WT-TB/OVA houve maior crescimento de bacilos em relação aos animais WT-TB, diferente do previamente observado com os animais TB/OVA da linhagem BALB/c. Para avaliar o papel dos leucotrienos foram usadas as seguintes estratégias: II). Camundongos da linhagem 129Sv tratados com MK886, inibidor da enzima 5-lipoxigenase (5LO), envolvida na síntese de mediadores lipídicos; III) animais 129Sv, deficientes para a expressão da 5LO (5LOKO). Foi observado que o tratamento com MK886 não afetou o número de bacilos no pulmão do grupo coinflamado TB/OVA quando comparado ao grupo TB/OVA. Além disso, diferente do que foi previamente observado em animais BALB/c, os animais 129Sv coinflamados foram mais susceptíveis que os animais 129Sv infectados. Do contrário, animais 5LOKO-TB/OVA foram mais resistentes que os camundongos WT-TB/OVA. Para avaliar se alterações no infiltrado granulomatoso estavam relacionadas com o infiltrado de macrófagos no pulmão, usamos a quarta estratégia: IV) quantificação das populações de macrófagos M1 e M2. Foi observado que os animais TB/OVA apresentaram aumento da população de macrófagos M2 no pulmão, enquanto a população de macrófagos M1 manteve-se inalterada comparado-se ao grupo apenas infectado. A diminuição no crescimento de bacilos nos animais TB/OVA foi dependente dos macrófagos M2, pois animais deficientes para a expressão do receptor de IL-33 submetidos ao protocolo de coinflamação tiveram diminuição da população de macrófagos M2, e foram susceptíveis à infecção. Esses resultados mostram que a diminuição no crescimento de bacilos nos animais coinflamados TB/OVA é dependente do aumento da população de macrófagos M2. / Using model of coinfection allergy and tuberculosis (TB / OVA), our group showed that coinfected BALB/c showed a significant decrease in the number of bacilli, associated with a decrease in granulomatous infiltrate the lung, increased production of leukotriene B4 and the number of cells CD8+, compared to the group infected with Mycobacterium tuberculosis (TB). To evaluate the mechanisms involved in reducing the growth of bacilli in group TB/OVA, were used four strategies: I) To assess the role of CD8+ lymphocytes in model TB/OVA, we used mice deficient for the molecule CD8 (CD8KO).We was observed that the number of bacilli in the lungs of animals in the group CD8KO-TB/OVA and WT-TB/OVA was similar. However, the lungs of animals WT-TB/OVA growth of bacillus was higher compared to WT animals, TB, unlike what was previously observed with background genetic BALB/c. To evaluate the role of leukotrienes, we use the following strategies: II) strain 129Sv mice treated with MK886, an inhibitor of the enzyme 5-lipoxygenase (5LO), involved in the synthesis of lipid mediators, III) 129Sv animals deficient for the expression of 5LO (5LOKO). We observed that treatment with MK886 did not affect the number of bacilli in the lung of the coinfected group TB/OVA. Moreover, unlike what was previously observed in animals BALB/c mice, coinfected 129Sv were more susceptible than the animals infected 129Sv. On the contrary, 5LOKO-TB/OVA animals were more resistant than mice WT-TB/OVA. To assess whether changes in granulomatous infiltrates were related to macrophages, we use the fourth strategy: IV) quantification of macrophage populations M1 and M2. We observed that M2 population in animals TB/OVA showed increased lung. The decrease in bacilli growth of animals TB/OVA was dependent on macrophage M2, since animals deficient for the expression of IL-33 protocol submitted to coinfected protocol had decreased macrophage population M2, and were susceptible to infection. These results show that the reduction in growth of bacilli in coinfected animals TB/OVA is dependent increase in macrophage population M2.

A eliminação de células-alvo por linfócitos T citotóxicos (CTLs) exerce um papel importante na imunidade protetora contra patógenos e células tumorais, o que pode ser desencadeada pela ação de perforina e granzima, ou pelas interações Fas-FasL. A interação Fas-FasL promove a apoptose pela formação de DISC, que é composto pela cauda citoplasmática de Fas, a proteína adaptadora FADD e a pro-caspase-8. Nesse complexo, a caspase-8 é ativada e induz a clivagem das caspases efetoras -3, -6 e -7, e/ou BID - membro da família Bcl-2, desencadeando o sinal apoptótico. Devido à sua relevância na sinalização apoptótica, a caspase-8 é alvo de inúmeros estudos. Uma correlação entre mutações no gene CASP8 de células tumorais e alta atividade citolítica foi demonstrada, sugerindo que a deficiência em caspase-8 pode representar um mecanismo de evasão imune. Nesse projeto, nosso objetivo foi avaliar o efeito da deficiência em caspase-8 na eliminação de células-alvo por linfócitos T CD8&#43. Para isso, nós estabelecemos uma técnica de citotoxicidade in vitro utilizando blastos de camundongos OTI como células efetoras e células RMA como alvo. Nesse ensaio, as células-alvo foram marcadas e pulsadas com diferentes concentrações de peptídeo OVA e colocadas em co-cultura a diferentes razões efetora: alvo (E:A) com linfócitos OTI, estimulados por 7 dias com ConA e rIL-2. A eliminação específica foi avaliada após 16 horas de co-cultura. Como controle para avaliar a especificidade ao MHC de classe I, utilizamos as células RMA-S, uma vez que expressam níveis reduzidos desta molécula na superfície. Os resultados demonstraram que o ensaio estabelecido é eficiente e antígeno-específico. Foi também observado que a eliminação das células RMA-S é menor em comparação com as células RMA, sendo essa diferença melhor discriminada em condições com números limitados de células efetoras. Para avaliar o efeito da caspase-8, células RMA caspase-8-suficientes e -deficientes, obtidas pela técnica CRISPR-Cas9, foram utilizadas como alvo nesse ensaio. Os resultados demonstram que, em condições com menor número de células efetoras, as células caspase-8-deficientes são significativamente mais resistentes à eliminação por linfócitos T CD8&#43, em comparação com as células caspase-8-suficientes. Portanto, nossos dados corroboram com a ideia de que a deficiência em caspase-8 poderia representar um mecanismo de evasão imune, principalmente na eliminação por linfócitos T CD8&#43. / The killing of target cells by cytotoxic T lymphocytes (CTLs) plays a major role in protective immunity to pathogens and tumor cells, which can be triggered by either the action of perforin and granzymes or FAS-FASL interactions. The Fas-FasL interaction leads to apoptosis through the formation of DISC, which is composed by the cytoplasmic tail of Fas, the adaptor protein FADD and the pro-caspase-8. At the complex, caspase-8 become activated and transduce the apoptotic signal by cleaving the effector caspases-3, -6 and -7 and/or the Bcl-2 family member Bid. Due to its role on apoptotic signaling, caspase-8 is the target of several studies. Recently, it has been demonstrated a correlation between mutations in CASP8 in tumors from patients with high cytolytic activity, suggesting that deficiency in caspase-8 may represent an immune evasion mechanism. Our project aimed to evaluate the effect of caspase-8 deficiency on the elimination of target cells by CD8&#43 T lymphocytes. In order to assess this elimination, we have established an in vitro cytotoxic assay using as effector, blasts from OTI mice, and as target, RMA cells. In this assay, the target cells were labeled, pulsed with OVA peptide at different concentrations and then co-cultured with OTI lymphocytes, which were stimulated with ConA and rIL-2, at different effector: target (E: T) ratios. The specific elimination was evaluated after 16 hours of co-culture. As a control to assess the specificity to MHCI of our assay, RMA-S cells were used because they have reduced levels of MHCI at surface. The results have shown that OTI blasts have effector capacity and that our established assay is antigen-specific. In addition, we observed that RMA-S elimination is reduced in comparison to RMA cells. The difference between RMA and RMA-S is better detected in conditions with limited number of effector cells. In order to assess the effect of caspase-8 in the resistance to elimination by CD8&#43 T cells, caspase-8-sufficient and deficient RMA cells (obtained by CRISPR-Cas9 technique) were used as targets in this assay. Our results demonstrate that caspase-8-deficient cells are more resistant to elimination than wild-type counterparts. This difference is better detected at conditions with reduced number of effector cells. Thus, our data suggests the deficiency in caspase-8 results in lower elimination by CD8&#43 T lymphocytes, suggesting this might represent an immune evasion mechanism.

Submitted by Michel Batista (mbatista@fiocruz.br) on 2014-11-28T11:47:15Z No. of bitstreams: 1 Tese Guilherme Ferreira Silveira.pdf: 9523097 bytes, checksum: 1944bdd5853c5e3e3e1fe8bda7c59f5b (MD5) / Approved for entry into archive by Michel Batista (mbatista@fiocruz.br) on 2014-11-28T11:50:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Guilherme Ferreira Silveira.pdf: 9523097 bytes, checksum: 1944bdd5853c5e3e3e1fe8bda7c59f5b (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-28T11:50:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Guilherme Ferreira Silveira.pdf: 9523097 bytes, checksum: 1944bdd5853c5e3e3e1fe8bda7c59f5b (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas, Fiocruz-PR. Curitiba, PR, Brasil. / A dengue representa na atualidade a mais prevalente arbovirose, caracterizando-se como um grave problema de saúde pública, tanto no Brasil como em todo o mundo. No entanto, o paciente que desenvolve a febre da dengue e/ou dengue com complicações recebe apenas tratamento de suporte, uma vez que não existem medicamentos ou vacinas específicas contra o vírus. Adicionalmente, pouco se sabe sobre os mecanismos imunopatológicos que desencadeiam os sintomas graves. Um dos aspectos que parece ser chave na patogenia é a resposta funcional dos linfócitos ao vírus da dengue (DV). Embora, a susceptibilidade destas células à infecção pelo DV ainda não fora bem caracterizada. Deste modo, os alvos principais deste trabalho foram à determinação da susceptibilidade e a caracterização da resposta funcional de linfócitos humanos de doadores saudáveis, analisadas na infecção por cepas dos quatro sorotipos do DV. Foi demonstrado que três diferentes populações de linfócitos (LT CD4+, LT CD8+ e LB CD19+) são susceptíveis ao DV, especialmente o LT CD8+, sendo o heparam sulfato um receptor de entrada para a infecção destas células pelo DV. Esta infecção foi produtiva, com replicação ativa e liberação de partículas virais viáveis no sobrenadante das culturas, além da produção da proteína não-estrutural 1 (NS1). Contudo, foram observados apenas níveis discretos de ativação celular e produção de citocinas. Adicionalmente, não foram observadas respostas funcionais como: apoptose de linfócitos, degranulação de LT CD8+, infecção diferencial de LT CD8+ “naïve” ou LT CD8+ de memória, resposta de polarização Th1/Th17 de LT CD4+ ou produção de IgM anti-DENV por LB CD19+. Ademais, a infecção dos linfócitos não foi capaz de reduzir a proliferação celular observada em ensaios de Ensaio Misto de Leucócitos e Ensaio de “Prime” de Linfócitos, sendo observada uma discreta elevação na proliferação quando as células foram infectadas com o DV4 360. Do mesmo modo, as infecções de culturas de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) pelas cepas DV3 98 e DV4 360 foram capazes de induzir uma polarização de perfil Th2. Portanto, estes achados demonstram que, apesar das infecções produtivas, os linfócitos são pouco responsivos aos DV, sendo que importantes funções destas células não foram reguladas pela infecção. Desta forma, é possível sugerir que os linfócitos seriam uma fonte importante para a manutenção da viremia observada nos casos de dengue. / Dengue fever is the most prevalent arboviral disease, characterized as a serious public health problem, both in Brazil and worldwide. The patient who develops dengue fever, which could culminate in severe complications, receives only live-support therapy, since there are no specific drugs or vaccines against the virus. Furthermore, little is known about the immunopathogenic mechanisms that trigger the severe symptoms in dengue. One aspect that seems to be key in the pathogenesis is the functional response of lymphocytes to the dengue (DV) infection. The susceptibility of these cells to DV infection is not well characterized. Therefore, the main targets of this study were the determination of ex vivo susceptibility by DV infection and the characterization of functional response of human lymphocytes. Cells from healthy donors were analyzed against four DV serotypes. It has been shown that three populations of lymphocytes (LT CD4+, LT CD8+ and LB CD19+) are susceptible to DV, especially LT CD8+, infection by DV which occurs through the participation of heparan sulfate as the receptor. Infection was productive, with active replication and release of viable viral particles and NS1 protein in the culture supernatants. Only discrete levels of cellular activation and cytokine production were observed. In addition, lymphocyte apoptosis, LT CD8+ degranulation, differential infection of naïve or memory LT CD8+, LT CD4+ polarization (Th1/Th17) or production of IgM anti-DENV by LB CD19+ were not modulated. Furthermore, the infection of the lymphocytes was not able to reduce cell proliferation induced in Mixed Leukocyte Reaction and Lymphocytes Prime Assay, showing a slight increase in proliferation when the cells were infected with DV4 360. PBMC infection with DV3 98 and DV4 360 strains was able to induce a Th2 polarized response. These findings suggest that, despite the productive infection, lymphocytes are poor responders to DV, and important functions of these cells were not modulated by DV infection. However, it is possible that lymphocytes would be an important source for maintenance of viremia observed in dengue fever.

A dengue é uma doença infecciosa aguda causada pelo vírus DEN do gênero Flavivirus e é transmitida pela picada de um mosquito vetor, principalmente o Aedes aegypti. Existem quatro sorotipos do vírus da dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4) e sua incidência tem aumentado dramaticamente nos últimos 50 anos, inclusive no Brasil. O objetivo deste trabalho é caracterizar subpopulações de linfócitos T, principalmente linfócitos T CD8+, provenientes de pacientes infectados quanto a sua capacidade proliferativa, seu estado de ativação e memória celular. Os pacientes foram recrutados no Hospital Ana Costa de Santos, SP, no ano de 2010, após assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. O diagnóstico de dengue foi realizado utilizando o teste rápido Dengue Duo e os parâmetros imunológicos foram analisados no citômetro de fluxo. Foi coletado sangue periférico para criopreservação de células mononucleares e separação de soro para detecção da carga viral. Pacientes com dengue apresentaram maior proliferação de linfócitos T CD8+ quando comparados com indivíduos saudáveis. Foi ainda observado que tal proliferação celular foi evidente nos dias cinco e seis de sintomas. Quando marcadores de ativação celular foram analisados por citometria de fluxo, observou-se um aumento de linfócitos T CD8+ expressando CD38 e HLA-DR nos pacientes, quando comparados com indivíduos saudáveis. Da mesma forma, a ativação celular também aumentou com o passar dos dias de sintomas com destaque para o quinto e sexto dia. Este aumento na ativação das células juntamente com os dias de sintomas, foi igualmente observado em várias subpopulações de células T de memória Além disso, foi observada uma correlação negativa entre o número absoluto de linfócitos T CD8+ e a carga viral. Juntos, os resultados desse estudo sugerem que a infecção por DEN leva a um aumento da ativação de células T CD8+ / Dengue is an acute disease caused by DEN, a Flavivirus transmitted by a mosquito vector, primarily Aedes aegypti. There are four serotypes of dengue viruses (DEN-1, DEN-2, DEN-3 and DEN-4) and their incidences have increased dramatically over the past 50 years, including in Brazil. The goal of this study is to characterize subpopulations of T lymphocytes, mainly CD8+ T cells, from infected patients. Status of cell activation, and memory cell profiles were assessed. Patients were recruited at Hospital Ana Costa, Santos-SP, Brazil, in 2010, after having signed an informed consent form. The serologic diagnosis of dengue was carryied out using a rapid test and immunological parameters were analyzed in flow cytometer. Peripheral blood was collected for cryopreservation of mononuclear cells and separation of serum for viral load testing. Dengue patients showed higher proliferation of CD8+ T cells compared to healthy subjects. Cell proliferation was more evident in the fifth and sixth days of symptoms. We observed increased frequency of CD8+ T cells expressing activation markers CD38 and HLA-DR in patients, when compared to healthy subjects. Similarly, T cell activation also increased along with the passing days of symptoms hitting on the fifth and the sixth days. Such augment in cellular activation along with the days of symptoms was equally observed in the several memory T cell compartments. Furthermore, we observed a negative correlation between the absolute number of CD8+ T lymphocytes and viral load. Together, the results of this study suggest that dengue virus infection leads to an increased activation of CD8+ T cells

O controle da infecção por Trypanosoma cruzi dependente da resposta de linfócitos T CD8+. Porém, o parasito faz a indução subótima destes linfócitos, que pode ser corrigida pela vacinação genética. Não se sabe como T. cruzi induz uma resposta ruim dos linfócitos T CD8+, nem como a vacinação reverte esta resposta. Estas questões foram objeto de estudo da presente tese. O envolvimento do imunoproteassomo foi investigado na indução de imunidade in vivo em animais triplamente deficientes das subunidades 1i, 2i e 5i (TKO), indicando que o imunoproteassomo é essencial para o processamento dos epítopos de T. cruzi relacionados à imunidade protetora de linfócitos T CD8+ gerados durante a infecção e na vacinação. Também foi observado que T. cruzi, mas não adenovírus, é capaz de tornar uma resposta ótima de linfócitos transgênicos induzidos in vivo em subótima. A interferência do parasito envolveu a supressão ativa do priming dos linfócitos T CD8+ mediada por linfócitos T CD4+ CD25- Foxp3+ de modo independente de IL-10, mas parcialmente dependente de TGF- e CTLA-4. / The control of infection by Trypanosoma cruzi relies on the response of CD8+ T cells. However, the parasite suboptimally induces these lymphocytes, which can be corrected by genetic vaccination. It is unknown how T. cruzi induces a poor response of CD8+ T cells and how vaccination reverts this. These questions were subject of study in this thesis. The involvement of the immunoproteasome was investigated in the in vivo induction of immunity in mice triply deficient of the subunits β1i, β2i e β5i (TKO), indicating that the immunoproteasome is essential for the processing of T. cruzi epitopes related to the protective immunity of CD8+ T cells generated upon infection and vaccination. Also, it was observed that T. cruzi, and not adenovirus, is capable of turning an optimal response of in vivo-induced transgenic CD8+ T cells into suboptimal. The parasite interference involved the active suppression of CD8+ T cell priming mediated by CD4+ CD25- Foxp3+ lymphocytes, in an IL-10-independent, but TGF-β and CTLA-4 partially dependent manner.

Utilizando modelo de coinflamação tuberculose e alergia (TB/OVA), nosso grupo mostrou que camundongos BALB/c coinflamados apresentaram diminuição significativa no número de bacilos, associada com diminuição no infiltrado granulomatoso no pulmão, aumento na produção de leucotrieno B4 e no número de células CD8+, quando comparados ao grupo infectado com Mycobacterium tuberculosis (TB). No presente estudo, nosso objetivo foi avaliar os mecanismos envolvidos na restrição ao crescimento dos bacilos nos animais do grupo TB/OVA. Quatro estratégias foram usadas: I) Para avaliar o papel dos linfócitos CD8+ no modelo TB/OVA, foram utilizados camundongos deficientes para a molécula CD8 (CD8KO). Foi observado que não houve diferenças significativas no crescimento do bacilo no pulmão dos animais CD8KO-TB/OVA e WT-TB/OVA. No entanto, nos pulmões dos animais WT-TB/OVA houve maior crescimento de bacilos em relação aos animais WT-TB, diferente do previamente observado com os animais TB/OVA da linhagem BALB/c. Para avaliar o papel dos leucotrienos foram usadas as seguintes estratégias: II). Camundongos da linhagem 129Sv tratados com MK886, inibidor da enzima 5-lipoxigenase (5LO), envolvida na síntese de mediadores lipídicos; III) animais 129Sv, deficientes para a expressão da 5LO (5LOKO). Foi observado que o tratamento com MK886 não afetou o número de bacilos no pulmão do grupo coinflamado TB/OVA quando comparado ao grupo TB/OVA. Além disso, diferente do que foi previamente observado em animais BALB/c, os animais 129Sv coinflamados foram mais susceptíveis que os animais 129Sv infectados. Do contrário, animais 5LOKO-TB/OVA foram mais resistentes que os camundongos WT-TB/OVA. Para avaliar se alterações no infiltrado granulomatoso estavam relacionadas com o infiltrado de macrófagos no pulmão, usamos a quarta estratégia: IV) quantificação das populações de macrófagos M1 e M2. Foi observado que os animais TB/OVA apresentaram aumento da população de macrófagos M2 no pulmão, enquanto a população de macrófagos M1 manteve-se inalterada comparado-se ao grupo apenas infectado. A diminuição no crescimento de bacilos nos animais TB/OVA foi dependente dos macrófagos M2, pois animais deficientes para a expressão do receptor de IL-33 submetidos ao protocolo de coinflamação tiveram diminuição da população de macrófagos M2, e foram susceptíveis à infecção. Esses resultados mostram que a diminuição no crescimento de bacilos nos animais coinflamados TB/OVA é dependente do aumento da população de macrófagos M2. / Using model of coinfection allergy and tuberculosis (TB / OVA), our group showed that coinfected BALB/c showed a significant decrease in the number of bacilli, associated with a decrease in granulomatous infiltrate the lung, increased production of leukotriene B4 and the number of cells CD8+, compared to the group infected with Mycobacterium tuberculosis (TB). To evaluate the mechanisms involved in reducing the growth of bacilli in group TB/OVA, were used four strategies: I) To assess the role of CD8+ lymphocytes in model TB/OVA, we used mice deficient for the molecule CD8 (CD8KO).We was observed that the number of bacilli in the lungs of animals in the group CD8KO-TB/OVA and WT-TB/OVA was similar. However, the lungs of animals WT-TB/OVA growth of bacillus was higher compared to WT animals, TB, unlike what was previously observed with background genetic BALB/c. To evaluate the role of leukotrienes, we use the following strategies: II) strain 129Sv mice treated with MK886, an inhibitor of the enzyme 5-lipoxygenase (5LO), involved in the synthesis of lipid mediators, III) 129Sv animals deficient for the expression of 5LO (5LOKO). We observed that treatment with MK886 did not affect the number of bacilli in the lung of the coinfected group TB/OVA. Moreover, unlike what was previously observed in animals BALB/c mice, coinfected 129Sv were more susceptible than the animals infected 129Sv. On the contrary, 5LOKO-TB/OVA animals were more resistant than mice WT-TB/OVA. To assess whether changes in granulomatous infiltrates were related to macrophages, we use the fourth strategy: IV) quantification of macrophage populations M1 and M2. We observed that M2 population in animals TB/OVA showed increased lung. The decrease in bacilli growth of animals TB/OVA was dependent on macrophage M2, since animals deficient for the expression of IL-33 protocol submitted to coinfected protocol had decreased macrophage population M2, and were susceptible to infection. These results show that the reduction in growth of bacilli in coinfected animals TB/OVA is dependent increase in macrophage population M2.

Introdução: A resistência a infecção pelo HIV-1 depende de fatores virais, genéticos e imunológicos do hospedeiro, incluindo os componentes da resposta imune inata e adaptativa. As células Natural Killer (NK) e as células T CD8+ são as principais células efetoras que medeiam atividade citotóxica contra células transformadas ou infectadas, que exercem importante papel protetor nos indivíduos expostos e não infectados por HIV-1 (ENI). Objetivo: Avaliar a expressão de receptores de ativação e inibição/exaustão nas células NK e T CD8+, e a capacidade das células NK em secretar citocinas e componentes citotóxicos após estimulação via receptores Toll-like (TLRs), e a resposta de células T CD8+ a peptídeos da Gag do HIV-1 em indivíduos ENI e seus parceiros infectados por HIV-1. Resultados: No grupo ENI foi observado aumento da frequência de células NK CD56bright que expressam moléculas de ativação NKG2D e CD95 na população CD56dim, enquanto no grupo HIV-1 foi mais prevalente a expressão de MIC A/B em ambas populações de células NK, com redução da expressão de NKG2D na população CD56dim. Além disto, foi observado expansão da população de células NK CD56dim que expressam CD94, NKG2C e principalmente de CD57 foi mais prevalente nos indivíduos ENI, com correlação positiva com títulos de anticorpos IgG anti-citomegalovírus humano. Nos indivíduos ENI foi observado que a ativação via TLR-3, TLR-7 ou TLR-7/8 foi capaz de potencializar a expressão de marcadores de desgranulação e de citotoxicidade, CD107a e granzima B, principalmente na população CD56dim, e de IFN-y e TNF nas populações CD56bright e CD56dim. Além disto, somente o grupo ENI, foi detectado aumento da freqüência de células NK secretoras de CD107a, granzima B, IFN-y e TNF, após estimulação com acetato de miristato de forbol e ionomicina. A frequência de expressão de alelos de KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) foi similar entre os grupos analisados. Elevada frequência de células T CD8+ CD38+ e CD8+PD-1+ (programmed cell death protein 1) foi detectado nos grupos ENI e HIV-1, cuja alteração foi observada em todas as fases de maturação celular. Os indivíduos ENI mostraram presença de resposta antígeno-específica de células T CD8+ secretoras de CD107a, granzima B, IFN-y e TNF, semelhante ao grupo HIV-1. Conclusão: Os resultados mostraram que no grupo ENI, as células NK expressam um perfil de ativação, com potente resposta aos estímulos de resposta inata e células NK com perfil de memória. Presença de células TCD8+ antígeno-específica foi evidenciada no grupo ENI, com perfil semelhante, mas de menor magnitude ao detectado no grupo infectado por HIV. Em conjunto, os achados mostraram que no grupo ENI a resposta inata está potencialmente ativa, e que em associação a resposta T CD8+ antígeno-específica podem contribuir para a resistência a infecção pelo HIV-1 / Introduction: Resistance to human immunodeficency virus 1 (HIV-1) is dependent on viral, genetic and immunological host factors, including components of innate and adaptive immune response. Natural Killers cells (NK) and CD8+ T cells are main effectors cells mediating cytotoxic role against transformed or infected cells, playing a crucial role in HIV-1 exposed uninfected individuals (EU). Aim: To evaluate the expression of activation and inhibitory/exhaustion receptors on NK cells and CD8+ T-cells, and to determine the NK cells ability to cytokines and cytotoxic molecules secretion upon Toll-like receptors (TLRs) pathway activation as well as CD8+ T-cells response to HIV Gag peptides in EU individuals and HIV-1 infected partner. Results: Increased frequency of NK CD56bright cells expressing NKG2D and CD95 on CD56dim cells have been observed in EU group, while HIV-1 group was more prevalent MIC A/B expression in both NK cells subsets, with reduced expression of NKG2D in CD56dim cells. Moreover, expansion of NK CD56dim cells expressing CD94, NKG2C, and CD57 was prevalent on ENI group, which positive correlation with anti-human cytomegalovirus IgG serum titers. EU individuals showed that TLR-3, TLR-7 or TLR-7/8 pathway activation was able to enhance CD107a and granzyme B expression in CD56dim cells, and IFN-y and TNF expressions levels in both CD56bright and CD56dim NK cells. Moreover, only in EU group, high frequency of NK cells expressing CD107a, granzyme B, IFN-y and TNF were detected upon phorbol myristate acetate and ionomicyn stimulation. Frequency of KIR alleles (killer cell immunoglobulin-like receptors) was similar between groups. High frequency of CD8+CD38+ and CD8+PD-1+ (programmed cell death protein 1) T-cells were observed in EU and HIV-1 groups, in all stages of cellular differentiation. EU subjects showed presence of antigen-specific response by CD8+ T-cells secreting CD107a, granzyme B, IFN-y and TNF similar to HIV-1 group. Conclusion: The results showed that NK cells in EU subjects express activating profile, with potent ability to innate immune stimuli, as well as NK cells with memory profile. Presence of antigen-specific CD8+ T-cells was detected in EU group, with similar profile, but in less magnitude than HIV-1 group. Taken together, the findings showed an enhanced innate immune response in EU subjects, in association with antigen-specific CD8+ T-cell response can contribute to resistance to HIV-1 infection