Submitted by ACACIO DUARTE PACHECO (acacio@fmva.unesp.br) on 2016-09-01T16:16:58Z No. of bitstreams: 1 Acácio Impressão Tese Final.pdf: 1381975 bytes, checksum: 5982f80f260a714c02111156f309cccb (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-09-02T18:54:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pacheco_ad_dr_araca.pdf: 1381975 bytes, checksum: 5982f80f260a714c02111156f309cccb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T18:54:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pacheco_ad_dr_araca.pdf: 1381975 bytes, checksum: 5982f80f260a714c02111156f309cccb (MD5) Previous issue date: 2016-07-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A ocorrência de miocardite em cães naturalmente acometidos por Leishmania infantum chagasi tem sido demonstrada em estudos recentes, contudo o tipo de resposta imune incitada no tecido cardíaco de cães com leishmaniose visceral (LV) ainda não foi determinada. Sendo assim, foram avaliados fragmentos da: parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), parede livre de ventrículo esquerdo (VE) e septo interventricular (SIV) de 20 cães naturalmente acometidos por LV para determinação das alterações histopatológicas e da resposta imune no tecido cardíaco. A presença de miocardite foi observada em 75% dos animais avaliados, sendo o infiltrado inflamatório do tipo linfoplasmocitário a alteração mais comum nesses fragmentos. A imunomarcação de Leishmania spp. foi observada em 60% dos animais. Não houve correlação entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a presença de Leishmania sp. no miocárdio (p=0,0682). A imunomarcação do parasito apresentou correlação com a presença de linfócitos T CD4+ (p<0,0001) e T CD8+ (p=0,0002), linfócitos B CD79+ (p=0,046) e IgG (p=0,040). Os níveis de IL-4 (p=0,030), IL-12 (p=0,002), IFN- (p<0,0001) foram menores em cães infectados em relação ao grupo controle, independente da presença ou não do parasito no miocárdio (p>0,05). No presente estudo, a presença de alterações miocárdicas, associadas a resposta imunológica mista foram comuns em cães com LV. Novos estudos avaliando paralelamente, a presença de inflamação miocárdica e o perfil de citocinas no tecido cardíaco, à resposta imunológica sistêmica são indicados para confirmação da resposta imunológica presente no miocárdio de cães acometidos por LV. / Recent studies have demonstrated the occurrence of myocarditis in dogs naturally infected with Leishmania infantum chagasi, however the type of immune response in cardiac tissue of dogs with visceral leishmaniasis (VL) has not been determined. For this purpose, fragments from right atrial free wall (AD), right ventricular free wall (RV), left ventricular free wall (LV) and interventricular septum (IVS) of 20 dogs naturally affected by VL were evaluated to determine the histopathological changes and the immune response in heart tissue. The presence of myocarditis has been reported in 75% of the evaluated animals, and an lymphoplasmocytic inflammatory infiltrate was the most common change in these fragments. The immunostaining of Leishmania sp. was observed in 60% of the evaluated animals. There was no correlation between the intensity of the inflammatory infiltrate and the presence of Leishmania sp. (p = 0.0682). The immunostaining of the parasite correlated with the presence of CD4 + (p <0.0001) and CD8 + T lymphocytes (p = 0.0002), CD79 + B lymphocytes (p = 0.046) and IgG (p = 0.040). IL-4 (p = 0.030), IL-12 (p = 0.002) and IFN- levels (p <0.0001) were lower in the infected dogs when compared to control group, regardless of the presence or absence parasite in the myocardium (p> 0.05). The results obtained in this study suggest that the presence of myocardial changes is common in dogs with VL, associated with a mixed immune response in heart tissue. However, the local inflammatory process seems not enough to trigger the production of cytokines normally involved in VL, possibly due to a low parasite load in dogs myocardium, especially when compared to other organs such as spleen, liver and bone marrow. Further studies evaluating at the same time the presence of myocardial inflammation and the behavior of these circulating cytokines in target organs with immune activity are indicated to confirm the immune response present in the myocardium of dogs affected by VL. / FAPESP: 2013/12129-8 / CNPq: 141536/2013-6

Orientador: Mary Marcondes / Banca: Wagner Luis Ferreira / Banca: Katia denise Saraiva Bresciani / Banca: Heitor Flavio ferrari / Banca:fernanda Muller de Oliveira Ravai / Resumo: A ocorrência de miocardite em cães naturalmente acometidos por Leishmania infantum chagasi tem sido demonstrada em estudos recentes, contudo o tipo de resposta imune incitada no tecido cardíaco de cães com leishmaniose visceral (LV) ainda não foi determinada. Sendo assim, foram avaliados fragmentos da: parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), parede livre de ventrículo esquerdo (VE) e septo interventricular (SIV) de 20 cães naturalmente acometidos por LV para determinação das alterações histopatológicas e da resposta imune no tecido cardíaco. A presença de miocardite foi observada em 75% dos animais avaliados, sendo o infiltrado inflamatório do tipo linfoplasmocitário a alteração mais comum nesses fragmentos. A imunomarcação de Leishmania spp. foi observada em 60% dos animais. Não houve correlação entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a presença de Leishmania sp. no miocárdio (p=0,0682). A imunomarcação do parasito apresentou correlação com a presença de linfócitos T CD4+ (p<0,0001) e T CD8+ (p=0,0002), linfócitos B CD79+ (p=0,046) e IgG (p=0,040). Os níveis de IL-4 (p=0,030), IL-12 (p=0,002), IFN- (p<0,0001) foram menores em cães infectados em relação ao grupo controle, independente da presença ou não do parasito no miocárdio (p>0,05). No presente estudo, a presença de alterações miocárdicas, associadas a resposta imunológica mista foram comuns em cães com LV. Novos estudos avaliando paralelamente, a presença de inflamação miocá... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Recent studies have demonstrated the occurrence of myocarditis in dogs naturally infected with Leishmania infantum chagasi, however the type of immune response in cardiac tissue of dogs with visceral leishmaniasis (VL) has not been determined. For this purpose, fragments from right atrial free wall (AD), right ventricular free wall (RV), left ventricular free wall (LV) and interventricular septum (IVS) of 20 dogs naturally affected by VL were evaluated to determine the histopathological changes and the immune response in heart tissue. The presence of myocarditis has been reported in 75% of the evaluated animals, and an lymphoplasmocytic inflammatory infiltrate was the most common change in these fragments. The immunostaining of Leishmania sp. was observed in 60% of the evaluated animals. There was no correlation between the intensity of the inflammatory infiltrate and the presence of Leishmania sp. (p = 0.0682). The immunostaining of the parasite correlated with the presence of CD4 + (p <0.0001) and CD8 + T lymphocytes (p = 0.0002), CD79 + B lymphocytes (p = 0.046) and IgG (p = 0.040). IL-4 (p = 0.030), IL-12 (p = 0.002) and IFN- levels (p <0.0001) were lower in the infected dogs when compared to control group, regardless of the presence or absence parasite in the myocardium (p> 0.05). The results obtained in this study suggest that the presence of myocardial changes is common in dogs with VL, associated with a mixed immune response in heart tissue. However, the local inflam... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A proteína Bim é uma potente molécula pró-apoptótica da família Bcl-2 que participa na indução da via intrínseca de apoptose. Pouco se sabe sobre o papel de Bim na resposta imune contra patógenos. Utilizando um modelo murino de infecção pelo T. cruzi, nós observamos um aumento da carga parasitaria e da mortalidade de animais Bim-/-. Macrófagos peritoneais isolados de camundongos Bim-/- no pico de sua parasitemia apresentaram diminuição da produção de NO e da sua atividade microbicida, provavelmente devido a uma deficiência no influxo da subpopulação SPM (small peritoneal macrophages). Ademais, neste mesma fase, esplenócitos apresentaram uma deficiência da produção de NO e das citocinas pró-inflamatórias IFN-&gamma; e IL-6 e os animais Bim-/- apresentaram uma diminuição da citotoxicidade in vivo contra antígenos específicos ao T. cruzi. Em conjunto, nossos resultados sugerem um papel importante da proteína Bim no controle da replicação e eliminação do parasita na fase inicial da infecção. / Bim protein is a potent pro-apoptotic molecule of Bcl-2 family that participates in the induction of intrinsic apoptosis pathway. Little is known about its role on the immune response against pathogens. Using a murine model of T. cruzi infection, we observed an increased parasitemia and mortality in Bim-/- mice. Peritoneal macrophages isolated from these mice at the peak of parasitemia displayed decreased NO production and microbicidal activity, probably due to a defect in the influx of the small peritoneal macrophage (SPM) subpopulation. Moreover, we also observed a deficiency in nitric oxide production, pro-inflammatory cytokines IFN-&gamma; and IL-6 secretion by splenocytes at this period of infection. Finally, Bim-/- mice has an impaired in vivo cytotoxic response against antigens from T. cruzi. Together, our results suggest an important role of Bim in the control of parasite replication and elimination in acute phase of T. cruzi infection.

Introdução: A resistência a infecção pelo HIV-1 depende de fatores virais, genéticos e imunológicos do hospedeiro, incluindo os componentes da resposta imune inata e adaptativa. As células Natural Killer (NK) e as células T CD8+ são as principais células efetoras que medeiam atividade citotóxica contra células transformadas ou infectadas, que exercem importante papel protetor nos indivíduos expostos e não infectados por HIV-1 (ENI). Objetivo: Avaliar a expressão de receptores de ativação e inibição/exaustão nas células NK e T CD8+, e a capacidade das células NK em secretar citocinas e componentes citotóxicos após estimulação via receptores Toll-like (TLRs), e a resposta de células T CD8+ a peptídeos da Gag do HIV-1 em indivíduos ENI e seus parceiros infectados por HIV-1. Resultados: No grupo ENI foi observado aumento da frequência de células NK CD56bright que expressam moléculas de ativação NKG2D e CD95 na população CD56dim, enquanto no grupo HIV-1 foi mais prevalente a expressão de MIC A/B em ambas populações de células NK, com redução da expressão de NKG2D na população CD56dim. Além disto, foi observado expansão da população de células NK CD56dim que expressam CD94, NKG2C e principalmente de CD57 foi mais prevalente nos indivíduos ENI, com correlação positiva com títulos de anticorpos IgG anti-citomegalovírus humano. Nos indivíduos ENI foi observado que a ativação via TLR-3, TLR-7 ou TLR-7/8 foi capaz de potencializar a expressão de marcadores de desgranulação e de citotoxicidade, CD107a e granzima B, principalmente na população CD56dim, e de IFN-y e TNF nas populações CD56bright e CD56dim. Além disto, somente o grupo ENI, foi detectado aumento da freqüência de células NK secretoras de CD107a, granzima B, IFN-y e TNF, após estimulação com acetato de miristato de forbol e ionomicina. A frequência de expressão de alelos de KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) foi similar entre os grupos analisados. Elevada frequência de células T CD8+ CD38+ e CD8+PD-1+ (programmed cell death protein 1) foi detectado nos grupos ENI e HIV-1, cuja alteração foi observada em todas as fases de maturação celular. Os indivíduos ENI mostraram presença de resposta antígeno-específica de células T CD8+ secretoras de CD107a, granzima B, IFN-y e TNF, semelhante ao grupo HIV-1. Conclusão: Os resultados mostraram que no grupo ENI, as células NK expressam um perfil de ativação, com potente resposta aos estímulos de resposta inata e células NK com perfil de memória. Presença de células TCD8+ antígeno-específica foi evidenciada no grupo ENI, com perfil semelhante, mas de menor magnitude ao detectado no grupo infectado por HIV. Em conjunto, os achados mostraram que no grupo ENI a resposta inata está potencialmente ativa, e que em associação a resposta T CD8+ antígeno-específica podem contribuir para a resistência a infecção pelo HIV-1 / Introduction: Resistance to human immunodeficency virus 1 (HIV-1) is dependent on viral, genetic and immunological host factors, including components of innate and adaptive immune response. Natural Killers cells (NK) and CD8+ T cells are main effectors cells mediating cytotoxic role against transformed or infected cells, playing a crucial role in HIV-1 exposed uninfected individuals (EU). Aim: To evaluate the expression of activation and inhibitory/exhaustion receptors on NK cells and CD8+ T-cells, and to determine the NK cells ability to cytokines and cytotoxic molecules secretion upon Toll-like receptors (TLRs) pathway activation as well as CD8+ T-cells response to HIV Gag peptides in EU individuals and HIV-1 infected partner. Results: Increased frequency of NK CD56bright cells expressing NKG2D and CD95 on CD56dim cells have been observed in EU group, while HIV-1 group was more prevalent MIC A/B expression in both NK cells subsets, with reduced expression of NKG2D in CD56dim cells. Moreover, expansion of NK CD56dim cells expressing CD94, NKG2C, and CD57 was prevalent on ENI group, which positive correlation with anti-human cytomegalovirus IgG serum titers. EU individuals showed that TLR-3, TLR-7 or TLR-7/8 pathway activation was able to enhance CD107a and granzyme B expression in CD56dim cells, and IFN-y and TNF expressions levels in both CD56bright and CD56dim NK cells. Moreover, only in EU group, high frequency of NK cells expressing CD107a, granzyme B, IFN-y and TNF were detected upon phorbol myristate acetate and ionomicyn stimulation. Frequency of KIR alleles (killer cell immunoglobulin-like receptors) was similar between groups. High frequency of CD8+CD38+ and CD8+PD-1+ (programmed cell death protein 1) T-cells were observed in EU and HIV-1 groups, in all stages of cellular differentiation. EU subjects showed presence of antigen-specific response by CD8+ T-cells secreting CD107a, granzyme B, IFN-y and TNF similar to HIV-1 group. Conclusion: The results showed that NK cells in EU subjects express activating profile, with potent ability to innate immune stimuli, as well as NK cells with memory profile. Presence of antigen-specific CD8+ T-cells was detected in EU group, with similar profile, but in less magnitude than HIV-1 group. Taken together, the findings showed an enhanced innate immune response in EU subjects, in association with antigen-specific CD8+ T-cell response can contribute to resistance to HIV-1 infection

A doença de Chagas, moléstia causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, resulta freqüentemente em um quadro de miocardite crônica que pode levar à morte do paciente. As causas que determinam a afetação cardíaca não estão totalmente esclarecidas. A nossa hipótese de trabalho é que o desafio poderia aumentar a ação efetora do sistema imune frente ao T. cruzi, resultando em redução da carga parasitária sistêmica e local, e, em longo prazo, em diminuição da patologia. A análise histopatológica mostrou que a manutenção prolongada do desafio foi capaz de reduzir moderadamente mas significantemente a patologia no coração. Estas experiências podem auxiliar a esclarecer a etiopatogenia do processo patológico cardíaco, confirmando que esta seja devida à reação frente aos parasitas remanescentes. Mais importante, os nossos resultados podem abrir uma esperançosa perspectiva de tratamento aos indivíduos de fase crônica. / Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi frequently results in chronic myocarditis that may result in death. The mechanisms underlying cardiac pathology are not totally clear. Our working hypothesis was that challenge could increase the immune systems effector activity against T. cruzi, leading to reduction in systemic and local parasite loads, which in turn could result, at the long run, in pathology diminution. The hystopathological analysis revealed that sustained challenge led to a small, but significant, decrease in heart pathology. These results could help to elucidate the etiopathogeny of chagasic heart lesions, inasmuch as they support the hypothesis of reactivity towards locally-persisting parasites. More important, our results open a hopeful perspective for the treatment of patients at the chronic phase.

Taquizoítos de T. gondii esterilizados por radiação ionizante é uma vacina interessante para induzir uma imunidade semelhante à infecção, mas sem a formação de cistos. Neste estudo avaliamos as populações celulares do sangue e do baço induzidas pela imunização, a resposta imune humoral, celular e a proteção após desafio com parasitas viáveis. Camundongos foram imunizados com taquizoítos de T. gondii irradiados por v.o. ou i.p.. Os animais foram desafiados com 10 cistos da cepa ME-49 ou VEG por via oral e apresentaram altos níveis de proteção com baixa carga parasitária. Camundongos imunizados por i.p. e v.o. apresentaram anticorpos específicos no soro e o aumento das populações de células B, plasmócitos, células TCD4+ e TCD8+ tanto no sangue como no baço. As células esplênicas de camundongos imunizados por i.p. mostraram a produção de IL-10, IFN-&#947; e IL-4. Células TCD4+ e células B do baço de camundongos imunizados por i.p. proliferaram após a estimulação com antígeno. A imunização com esse modelo vacinal induziu uma resposta imune mediada com células B, TCD4+ e TCD8+, com aumento da resposta imune humoral e celular que são necessárias para proteção do hospedeiro após uma infecção. Essa resposta imune induzida é uma resposta semelhante a uma infecção natural, sendo assim o desenvolvimento de vacinas utilizando a radiação ionizante como uma ferramenta, pode ser um modelo atrativo e eficiente para testar novos imunógenos no futuro. / Tachyzoites of T. gondii sterilized by ionizing radiation is an interesting vaccine for inducing immunity to infection similarly but without the formation of cysts. In this study we evaluated the cell populations from blood and spleen induced by immunization, the humoral immune response, cellular and protection after challenge with viable parasites. Mice were immunized with irradiated tachyzoites of T. gondii by v.o. or i.p.. The animals were challenged with 10 cysts of the ME-49 or VEG strain orally and showed high levels of protection with low worm burden. Immunized mice by i.p. and v.o. present specific antibodies in the serum and increased populations of B cells, plasma cells, CD4+ and CD8+ T cells in blood and spleen. The spleen cells of immunized mice by i.p. showed the production of IL-10, IFN-&#947; and IL-4. CD4+ T cells and B cells in the spleen of immunized mice i.p. proliferated upon stimulation with antigen. The immunization with this vaccine model induced an immune response mediated by B cells, CD4+ and CD8+ with increased humoral and cellular immune response are necessary for host protection after infection. This induced immune response is a response similar to natural infection, therefore the development of vaccines using ionizing radiation as a tool, can be an attractive and efficient model for testing new immunogens in the future.

Indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) que controlam a replicação viral, mesmo na ausência de tratamento com drogas antirretrovirais, representam um exemplo de contenção bemsucedida do vírus. O entendimento das respostas imunes antivirais presentes nestes indivíduos pode auxiliar no delineamento de vacinas, particularmente no caso de estratégias vacinais desenvolvidas para induzir um fenótipo de controle da replicação viral e, assim, diminuir o ritmo da progressão à AIDS e/ou a taxa de transmissão para terceiros. A resposta imune celular contra HIV-1 é geralmente mapeada em ensaios de ELISPOT-IFN-&#947; empregando-se peptídeos pentadecâmeros sobrepostos por 11 aminoácidos sintetizados a partir de seqüências consensuais do vírus. Contudo, este método pode subestimar a detecção da real amplitude da resposta imune celular contra epitopos contidos na seqüência autóloga do vírus infectivo. Neste trabalho, foram comparadas respostas imunes celulares contra peptídeos 15-meros baseados nas seqüências de vif e nef do consenso do subtipo B do HIV-1 e respostas imunes contra peptídeos HLA-restritos de nove ou 10 aminoácidos baseados tanto nas seqüências de vif e nef do consenso do subtipo B do HIV-1, quanto nas seqüências autólogas dos vírus seqüenciados a partir de seis pacientes controladores da replicação do HIV-1. Nossa análise revelou que três dos seis pacientes investigados mostraram maior amplitude de resposta imune celular contra epitopos em Vif e Nef quando os peptídeos HLA-restritos foram empregados, tenham sido eles preditos a partir da seqüência consensual ou a partir das seqüências do vírus autólogo. O número de respostas positivas aumentou de quatro para 16 em Vif e de oito para 22 em Nef, com o uso dos reagentes HLA-restritos. Estes resultados sugerem que emprego de peptídeos 15-meros pode sub-representar a amplitude real da resposta imune celular envolvidas no controle da replicação do HIV-1 e que o conhecimento acerca das respostas imunes de sucesso em indivíduos controladores pode ser melhorado e ampliado com a revisão dos métodos empregados. / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals who spontaneously control viral replication represent an example of successful containment of the AIDS virus. Understanding the anti-viral immune responses in these individuals may help in vaccine design, particularly vaccine strategies designed to induce a controller phenotype and thus, prevent disease progression and decrease risk of transmission. Immune responses against HIV-1 are normally screened using 15-mer peptides overlapped by 11 amino acids from HIV-1 consensus sequences in ELISPOT-IFN-&#947; assays. However, this method may underestimate the real breadth of the cellular immune responses against the autologous sequence of the infecting virus. We compared cellular immune responses against nef and vif-encoded consensus B 15-mer peptides to responses against HLA class I-predicted minimal optimal epitopes from consensus B and autologous sequences in six patients who have controlled HIV-1 replication. Interestingly, our analysis revealed that three of our patients had broader cellular immune responses against Vif- and Nef-HLA class I-predicted minimal optimal epitopes from either autologous viruses or from the consensus B sequence, when compared to responses against the 15-mer HIV-1 consensus B peptides. The number of positive responses against epitopes in these two HIV-1 proteins increased from four to 16 for Vif and from eight to 22 for Nef. These findings suggest that immune responses assessed using 15-mers peptides may underrepresent the real breadth of the immune control of the infecting virus and the knowledge about the successful responses in controller individuals could be improved after reviewing the employed methods.

A pandemia Hiv/ Aids já resultou em mais de 34 milhões de pessoas infectadas pelo vírus no mundo até o momento. Causada pelo HIV, de caráter crônico que evolui para um quadro clínico de imunodeficiência (Aids), pode tornar o indivíduo susceptível a infecções oportunistas potencialmente letais. Diferentes fatores foram identificados por ativar o sistema imune, incluindo genótipos do hospedeiro (HLAB-27, HLA-B57, CCR5delta32), co-infecções (GBV-C) e alguns fatores virais como a capacidade de replicação (fitness) e tropismo celular. O HIV-1 possui diversidade genética extensa e dinâmica. Considerando a variabilidade genética dentro do cenário da epidemia no Brasil, as clades do HIV-1 predominantes são B, F e C, além de formas recombinantes. Contudo, ainda não foi completamente estabelecido se essa diversidade genética possa influenciar o curso clínico da doença. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de ativação celular induzido encontrado em indivíduos infectados por subtipos virais C e Não- C do HIV-1, durante o primeiro ano de infecção (analisando as fases recente e estabelecida). A análise comparativa dos dois grupos (subtipos C vs. Não-C), identificou no grupo do subtipo-C uma maior frequência de células T CD4+ totais ativadas, como também uma maior frequência e ativação nas subpopulações de células T CD4+ de memória, principalmente memória efetora e efetora terminal, na fase estabelecida. Em relação às células T CD8+, deparamos na fase estabelecida com uma maior frequência de células T CD8+ de memória efetora e ativação das mesmas no grupo do subtipo-C em relação ao grupo do subtipo Não-C. Investigamos também a presença de células T CD4+ que se diferenciaram em células T reguladoras, e foi encontrada uma frequência diminuída dessas células no grupo do subtipo C em relação ao Não- C tanto na fase recente como na fase estabelecida. Na análise comparativa das fases recente e estabelecida, o grupo do subtipo Não-C apresentou um declínio tanto na quantidade de células T CD4+ como na frequência de células T CD8+ ativadas após um ano de infecção. Com base nos resultados encontrados, os dois grupos apresentaram perfis de ativação e diferenciação celular diferentes no primeiro ano de infecção pelo HIV-1, o que aponta para diferentes histórias naturais quando comparamos infecção por clades virais distintas / The Hiv/ Aids pandemic has affected more than 34 million people worldwide, reaching men, women and children. Caused by the HIV virus, a chronic infection that develops into a clinical picture of immunodeficiency (Aids), it can make the individual susceptible to opportunistic infections and result in death. Different factors were identified by activating the immune system, including host genotypes (HLAB-27, HLA-B57, CCR5delta32), co-infections (GBV-C) and some viral factors such as fitness and cellular tropism. The HIV-1 presents an extensive and dynamic genetic diversity, favoring the production of variants with molecular differences. Considering the genetic variability within the scenario of the epidemic in Brazil, the predominant subtypes of HIV-1 are B, F and C. However, it has not yet been completely established if this genetic diversity can impact the clinical course of the disease. The objective of this study was to evaluate the induced cellular activation profile found in HIV-1 C and non-C viral subtypes groups in the first year of infection (analyzing the recent and established phases). The comparative analysis of the two groups (subtypes C vs. Non-C) identified a higher frequency of activated CD4+ T cells in the C-subtype group, as well as a higher frequency and activation in CD4+ T-cell subsets of memory, mainly effector memory and terminal effector on the established phase. About CD8+ T cells, we found in the established phase a higher frequency and activation in the effector memory subset in the C- subtype group compared to the non- C subtype group. We also investigated the presence of CD4+ T cells differentiated into regulators T cells, and a decreased frequency of these cells was found in the subtype C group over non- C in both the recent and established phases. In the recent and established phase comparative analysis evidenced that the non-C subtype group presented a decline in both the number of CD4+ T cells and the CD8+ T-cell activated frequency after 1 year of infection, however, it presented a positive correlation between the viral load and frequency of activated CD4+ and CD8+ T cells in both phases. Based on the results found, the two groups presented different activation and differentiation profiles in the first year of HIV-1 infection, which points to different natural histories when comparing infection with different viral clades

INTRODUÇÃO: Líquen plano (LP) é uma doença mucocutânea de natureza inflamatória crônica de etiologia ainda desconhecida. Alterações na resposta imune inata, como aos padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) podem levar à inflamação crônica e contribuir com a patogênese do LP. OBJETIVO: Avaliar o efeito da ativação via o DAMP S100A8 e o receptor Toll-like 4 (TLR-4) em células Natural killer (NK) e TCD8 citotóxicas e suas subpopulações de memória/efetoras em pacientes com LP. MÉTODOS: Foram selecionados 25 pacientes com LP (22 mulheres, 3 homens) com idade média de 43,46 anos ± 8,46 e um grupo controle com 25 indivíduos (22 mulheres, 3 homens) com idade média de 42 anos ± 5,5. A determinação transcricional e da expressão por imunohistoquimica dos DAMPs S100A8, HMGB-1 e de TLR-4 e RAGE foi realizada em biópsias de lesões cutâneas de indivíduos com LP, e os níveis séricos de S100A8, HMGB-1, MICA e MICB foram determinados por ELISA. As células mononucleares (CMNs) de sangue periférico foram avaliadas por citometria de fluxo quanto a frequência de TNF, IL-1beta e o marcador de desgranulação CD107a em células TCD8+ e células NK CD56+ e suas subpopulações. A avaliação da via de sinalização de TLR em células TCD8+ purificadas e ativadas com S100A8 foi analisada por PCR array e a determinação da expressão de mRNA dos componentes do inflamassoma em células TCD8+ ativadas com S100A8 por PCR em tempo real. RESULTADOS: Foi evidenciado nos indivíduos com LP elevada expressão da proteína S100A8 nas lesões cutâneas e de HMGB-1, TLR-4 e RAGE na derme, em paralelo ao aumento da expressão de mRNAs para S100A8 e S100A9 e diminuição de RAGE. Além disto, uma elevação dos níveis séricos do dímero S100A8/A9 foi detectada nos pacientes comparados aos controles, ao contrário do DAMP HMGB-1 que mostrou níveis similares em ambos os grupos. A influência do S100A8 em células TCD8+ e células NK, foi analisada em CMNs pela ativação com o lipopolissacáride e a proteína recombinante S100A8, ambos ligantes de TLR-4. Nos indivíduos com LP foi detectado aumento da resposta citotóxica de linfócitos TCD8+ e células NK CD56bright pela expressão do marcador de desgranulação CD107a por citometria de fluxo. A proteína S100A8 foi capaz de induzir a expressão de genes pró-inflamatórios como IL-1beta, TNF e IL-6 em células TCD8+ de pacientes com LP em contraste com os indivíduos saudáveis que mostraram expressão IL-10 e IFN tipo I. As células TCD8+ de indivíduos com LP ativadas ou não com S100A8 expressam transcritos de NLRP1, NLRP3 e AIM-2 e produzem IL-1beta em níveis similares a controles saudáveis. Além disso, células TCD8+ ativadas com S100A8 mostraram aumento de expressão TLR3, TLR5, TLR7 e TLR8 na doença comparada às biopsias de controles. O aumento da resposta TCD8+ citotóxica foi principalmente mediado pelo subtipo de memória efetora (TEM, CCR7- CD45RA-). Elevação basal da expressão do receptor ativador NKG2D e inibidor NKG2A foi observado em células NK CD56dim nos indivíduos com LP e um nível similar do ligante solúvel MICB em ambos os grupos. CONCLUSÃO: Estes resultados evidenciam que componentes da imunidade inata, como a proteína S100A8 pode contribuir na manutenção do perfil inflamatório do LP / BACKGROUND: Lichen planus (LP) is a mucocutaneous inflammatory chronic disease of unknown etiology. Alterations in the innate immune response such as the pathogen-associated molecular pattern (PAMPs) and damage-associated molecular pattern (DAMPs) can lead to chronic inflammation and contribute to the pathogenesis of LP. OBJECTIVE: Evaluate the effect of the activation trough the DAMP S100A8 and the Toll-like receptor 4 (TLR-4) on the Natural killer cells (NK) and cytotoxic TCD8 cells and their memory / effector subsets in LP disease. METHODS: We selected 25 patients with LP (22 women, 3 men) with a mean age of 43.46 years ± 8.46 and a control group of 25 subjects (22 women, 3 men) with a mean age of 42 ± 5, 5. The transcriptional determination and protein expression by immunohistochemistry of DAMPs, S100A8 and HMGB-1 as well as TLR-4 and RAGE was performed on biopsies of skin lesions from patients with LP, and serum levels of S100A8, HMGB-1, MICA and MICB were determined by ELISA. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were assessed by flow cytometry to evaluate the frequency of TNF, IL-1beta and the degranulation marker CD107a in CD8+ T cells and CD56 + NK cells and their subsets. The evaluation of the TLR signaling pathway in purified CD8 + T cells activated with S100A8 were analyzed by PCR array and the determination of mRNA expression of inflammasome components on CD8 + T cells activated by S100A8 was measured by real time PCR. RESULTS: It was shown in the LP individuals an increased expression of the S100A8 protein in the cutaneous lesions and HMGB-1, TLR-4 and RAGE in the dermis, in parallel to increased level of mRNAs for S100A8 and S100A9 and decreased expression of RAGE. Moerover, increased serum levels of the dimer S100A8 / A9 was detected in patients compared to controls, in contrast to DAMP HMGB1 that revealed similar levels in both groups. The influence of S100A8 in CD8 + T cells and NK cells, was analyzed in PBMC activating with lipopolysaccharide and recombinant protein S100A8, both ligands of TLR-4. It was detected in LP individuals, an increased cytotoxic response of CD8+ T lymphocytes and CD56bright NK cells trough CD107a degranulation marker expression. The S100A8 protein was able to induce the pro-inflammatory genes expressions such as IL-1beta, TNF and IL-6 in CD8 + T cells of LP patients in contrast to healthy subjects who promoted IL-10 expression and type I IFN. CD8 + T cells of LP individuals activated or not with S100A8 are able to express NLRP1, NLRP3 and AIM-2 and IL-1beta production at similar levels to healthy controls. Moreover, CD8 + T cells activated with S100A8 showed increased expression of TLR3, TLR5, TLR7 and TLR8 in LP compared to biopsies from healthy controls. The increased CD8 + T cells cytotoxic response was mediated by the subtype of effector memory (TEM CD45RA- CCR7). The increased baseline expression of activating receptor NKG2D and the inhibitory NKG2A in the NK CD56dim cells in LP individulas, and the similar level of MICB soluble in both groups. CONCLUSION: These results shows that innate immunity components, such as S100A8 protein may contribute to the maintenance of LP inflammatory profile

INTRODUÇÃO: Líquen plano (LP) é uma doença mucocutânea de natureza inflamatória crônica de etiologia ainda desconhecida. Alterações na resposta imune inata, como aos padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) podem levar à inflamação crônica e contribuir com a patogênese do LP. OBJETIVO: Avaliar o efeito da ativação via o DAMP S100A8 e o receptor Toll-like 4 (TLR-4) em células Natural killer (NK) e TCD8 citotóxicas e suas subpopulações de memória/efetoras em pacientes com LP. MÉTODOS: Foram selecionados 25 pacientes com LP (22 mulheres, 3 homens) com idade média de 43,46 anos ± 8,46 e um grupo controle com 25 indivíduos (22 mulheres, 3 homens) com idade média de 42 anos ± 5,5. A determinação transcricional e da expressão por imunohistoquimica dos DAMPs S100A8, HMGB-1 e de TLR-4 e RAGE foi realizada em biópsias de lesões cutâneas de indivíduos com LP, e os níveis séricos de S100A8, HMGB-1, MICA e MICB foram determinados por ELISA. As células mononucleares (CMNs) de sangue periférico foram avaliadas por citometria de fluxo quanto a frequência de TNF, IL-1beta e o marcador de desgranulação CD107a em células TCD8+ e células NK CD56+ e suas subpopulações. A avaliação da via de sinalização de TLR em células TCD8+ purificadas e ativadas com S100A8 foi analisada por PCR array e a determinação da expressão de mRNA dos componentes do inflamassoma em células TCD8+ ativadas com S100A8 por PCR em tempo real. RESULTADOS: Foi evidenciado nos indivíduos com LP elevada expressão da proteína S100A8 nas lesões cutâneas e de HMGB-1, TLR-4 e RAGE na derme, em paralelo ao aumento da expressão de mRNAs para S100A8 e S100A9 e diminuição de RAGE. Além disto, uma elevação dos níveis séricos do dímero S100A8/A9 foi detectada nos pacientes comparados aos controles, ao contrário do DAMP HMGB-1 que mostrou níveis similares em ambos os grupos. A influência do S100A8 em células TCD8+ e células NK, foi analisada em CMNs pela ativação com o lipopolissacáride e a proteína recombinante S100A8, ambos ligantes de TLR-4. Nos indivíduos com LP foi detectado aumento da resposta citotóxica de linfócitos TCD8+ e células NK CD56bright pela expressão do marcador de desgranulação CD107a por citometria de fluxo. A proteína S100A8 foi capaz de induzir a expressão de genes pró-inflamatórios como IL-1beta, TNF e IL-6 em células TCD8+ de pacientes com LP em contraste com os indivíduos saudáveis que mostraram expressão IL-10 e IFN tipo I. As células TCD8+ de indivíduos com LP ativadas ou não com S100A8 expressam transcritos de NLRP1, NLRP3 e AIM-2 e produzem IL-1beta em níveis similares a controles saudáveis. Além disso, células TCD8+ ativadas com S100A8 mostraram aumento de expressão TLR3, TLR5, TLR7 e TLR8 na doença comparada às biopsias de controles. O aumento da resposta TCD8+ citotóxica foi principalmente mediado pelo subtipo de memória efetora (TEM, CCR7- CD45RA-). Elevação basal da expressão do receptor ativador NKG2D e inibidor NKG2A foi observado em células NK CD56dim nos indivíduos com LP e um nível similar do ligante solúvel MICB em ambos os grupos. CONCLUSÃO: Estes resultados evidenciam que componentes da imunidade inata, como a proteína S100A8 pode contribuir na manutenção do perfil inflamatório do LP / BACKGROUND: Lichen planus (LP) is a mucocutaneous inflammatory chronic disease of unknown etiology. Alterations in the innate immune response such as the pathogen-associated molecular pattern (PAMPs) and damage-associated molecular pattern (DAMPs) can lead to chronic inflammation and contribute to the pathogenesis of LP. OBJECTIVE: Evaluate the effect of the activation trough the DAMP S100A8 and the Toll-like receptor 4 (TLR-4) on the Natural killer cells (NK) and cytotoxic TCD8 cells and their memory / effector subsets in LP disease. METHODS: We selected 25 patients with LP (22 women, 3 men) with a mean age of 43.46 years ± 8.46 and a control group of 25 subjects (22 women, 3 men) with a mean age of 42 ± 5, 5. The transcriptional determination and protein expression by immunohistochemistry of DAMPs, S100A8 and HMGB-1 as well as TLR-4 and RAGE was performed on biopsies of skin lesions from patients with LP, and serum levels of S100A8, HMGB-1, MICA and MICB were determined by ELISA. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were assessed by flow cytometry to evaluate the frequency of TNF, IL-1beta and the degranulation marker CD107a in CD8+ T cells and CD56 + NK cells and their subsets. The evaluation of the TLR signaling pathway in purified CD8 + T cells activated with S100A8 were analyzed by PCR array and the determination of mRNA expression of inflammasome components on CD8 + T cells activated by S100A8 was measured by real time PCR. RESULTS: It was shown in the LP individuals an increased expression of the S100A8 protein in the cutaneous lesions and HMGB-1, TLR-4 and RAGE in the dermis, in parallel to increased level of mRNAs for S100A8 and S100A9 and decreased expression of RAGE. Moerover, increased serum levels of the dimer S100A8 / A9 was detected in patients compared to controls, in contrast to DAMP HMGB1 that revealed similar levels in both groups. The influence of S100A8 in CD8 + T cells and NK cells, was analyzed in PBMC activating with lipopolysaccharide and recombinant protein S100A8, both ligands of TLR-4. It was detected in LP individuals, an increased cytotoxic response of CD8+ T lymphocytes and CD56bright NK cells trough CD107a degranulation marker expression. The S100A8 protein was able to induce the pro-inflammatory genes expressions such as IL-1beta, TNF and IL-6 in CD8 + T cells of LP patients in contrast to healthy subjects who promoted IL-10 expression and type I IFN. CD8 + T cells of LP individuals activated or not with S100A8 are able to express NLRP1, NLRP3 and AIM-2 and IL-1beta production at similar levels to healthy controls. Moreover, CD8 + T cells activated with S100A8 showed increased expression of TLR3, TLR5, TLR7 and TLR8 in LP compared to biopsies from healthy controls. The increased CD8 + T cells cytotoxic response was mediated by the subtype of effector memory (TEM CD45RA- CCR7). The increased baseline expression of activating receptor NKG2D and the inhibitory NKG2A in the NK CD56dim cells in LP individulas, and the similar level of MICB soluble in both groups. CONCLUSION: These results shows that innate immunity components, such as S100A8 protein may contribute to the maintenance of LP inflammatory profile