Esta tese é composta de estudos realizados com a finalidade de encontrar condições experimentais e gerar informações confiáveis que possam ser utilizadas em síntese de peptídeos mediada por lipases. Inicialmente, foram caracterizadas por eletroforese do tipo PAGE-SDS e medida de atividade em óleo de oliva duas lipases purificadas de Candida cylindracea (CCL) e duas pancreáticas suínas, purificada (pPPL) e bruta (cPPL). As CCLs apresentaram atividades lipásicas e graus de purezas superiores às PPLs. Dentre os contaminantes das PPLs, foram identificadas a tripsina e a α-quimotripsina (α-QT). Em seguida, foi realizado um estudo sistemático da síntese do dipeptídeo modelo Ac-Tyr-Gly-NH2. A melhor condição experimental encontrada foi: mistura de n-hexano/tampão Tris-HCl, 0,5M, pH 8,0, (80/20,v/v), 50mg/mL de cPPL, 0,05M de Ac-Tyr-OEt, 0,5M de Gly¬NH2, 37°C e agitação de 300 rpm, que forneceu rendimento de ~90 % em 5 min de reação. Porém, nesta condição foi observada a hidrólise secundária do produto formado, a qual foi extinta pelo tratamento da cPPL com um inibidor específico de α-QT. A condição otimizada de síntese de Ac-Tyr-Gly-NH2 também se mostrou adequada à preparação de Z¬Asp-Gly-NH2 a partir de Z-Asp-OMe e de Gly-NH2. Quando se estudou a influência da percentagem de n-hexano na eficiência da formação de ligação peptídica, ela também foi a melhor condição. Tendo escolhido a lipase e o meio reacional, iniciou-se um estudo sistemático da hidrólise do éster de onze Z-aminoácidos-OMe, o qual visou gerar informações que possibilitassem prever quais aminoácidos deveriam compor o doador de acila esterificado a ser empregado em síntese de peptídeos catalisada por cPPL. A ordem de preferência desta preparação enzimática na hidrólise de ésteres dos Z-aminoácidos-OMe testados foi a seguinte: (Lys, Arg e His)>(Phe e Tyr)>(Asp, Glu, Gln, Ser, Thr e Leu). Também foi estudada a influência da natureza do éster e do protetor de grupo α-amino na hidrólise de ésteres de Nα-acil-Asp ou -Glu. A cPPL preferiu hidrolisar o éster benzílico de Z ou Boc-Asp e de Z-Glu. Em algumas incubações para a hidrólise do éster de Z-aminoácidos-OMe foi observada uma reação secundária com possível aplicação na química de peptídeos: a remoção do grupo Z com formação do aminoácido livre correspondente. Esta ocorreu mesmo quando a tripsina e a α-QT foram inibidas irreversivelmente. Assim, Z-aminoácidos foram incubados com a cPPL e os resultados obtidos demonstraram que ela foi capaz de remover o grupo Z de onze deles com velocidades iniciais que obedecem a seguinte ordem: Tyr>Phe>Ser>Gln>Lys>His>Trp>Leu>Met>Arg>Ile. A remoção em questão também foi observada quando o dipeptídeo Z-Gly-Phe foi incubado em presença de cPPL. A formação de glicina no meio reacional decorreu da hidrólise da ligação peptídica. Sumarizando, as contribuições mais relevantes deste trabalho são: 1) a proposição inédita de um sistema bifásico para a formação da ligação peptídica catalisada por cPPL; 2) a demonstração inequívoca da presença de tripsina e α-QT e a sugestão de contaminação por carboxipeptidase A na cPPL. Estes contaminantes podem contribuir para a eficiência das sínteses de peptídeos catalisadas por esta preparação enzimática; 3) a constatação de que apesar de mais impura, a cPPL catalisou mais eficientemente do que as CCLs a formação de ligação peptídica via aminólise de ésteres; 4) a obtenção de resultados de um estudo sistemático de hidrólise de ésteres de Z-aminoácidos que podem auxiliar na escolha de doadores de acila a serem usados em sínteses de peptídeos catalisadas por cPPL; 5) a observação inédita de remoção do grupo Z de alguns Z-aminoácidos em presença de cPPL que indicou a possibilidade de novas aplicações desta preparação enzimática em química de peptídeos e, provavelmente, em síntese orgânica. / This work aimed to determine experimental conditions and reliable information to be used in peptide synthesis mediated by lipases. Thus, two Candida cylindracea lipases (CCL) and two porcine pancreatic lipases, a purified (pPPL) and a crude (cPPL), were characterized by PAGE-SDS electrophoresis and activity in olive oil. CCLs presented higher purities and enzymatic activities than PPLs. Trypsin (T) and α-chymotrypsin (α¬CT) were identified among the cPPL contaminants. A systematic investigation of Ac-Tyr¬Gly-NH2 was then performed using the CCLs, the PPLs and several experimental conditions. The best combination was: 0.05M Ac-Tyr-OEt, 0.5M Gly-NH2, 50mg/mL cPPL, mixture of n-hexane/Tris-HCl buffer 0.5M, pH 8.0, (80/20,v/v), temperature of 37176;C, shaking at 300 rpm (yield near 90% in 5 min of reaction). As secondary hydrolysis occurred in long-lasting reactions, cPPL was treated with the irreversible inhibitor of α-CT and had the amidase activity extinguished. The optimized synthesis conditions were also suitable for the preparation of Z-Asp-Gly-NH2. When the effect of the n-hexane content on coupling efficiency was examined, those were confirmed as the best conditions to be used. A further systematic investigation aiming to determine which esterified Nα-acyl-amino acids are good substrates for cPPL was then conducted using Z-amino acids-OMe. The results obtained in the monitoring of the ester hydrolysis indicated the following preference: (Z-Lys-OMe, -Arg-, -His-)>(Z-Phe-OMe, Tyr-)>(Z-Asp-OMe, -Glu-, -Gln-, ¬Ser-, -Thr-, Leu-). The natures of the ester and N-protecting group influenced the ester hydrolyses of Nα-acyl-Asp and Glu. The best substrates were Z or Boc-Asp-OBzl and Z-Glu-OBzl. Surprisingly, Z-group removal occurred in a few ester hydrolysis reactions since the resulting Z-amino acids were consumed and the corresponding free amino acids were formed. This unexpected reaction was not avoided when cPPL was treated with irreversible inhibitors of T or of α-QT. Incubation of cPPL with 11 of the 20 Z-amino acids tested gave Z-group removal initial rates that followed the order: Tyr>Phe>Ser>Gln>Lys>His>Trp>Leu>Met>Arg>Ile. In the presence of cPPL the Z-group was also removed from the dipeptide Z-Gly-Phe. Interestingly, free Gly was also detected in the reaction medium. In summary, the most relevant contributions of the present work are: 1) the proposal of a biphasic solvent system suitable for peptide bond formation catalyzed by cPPL; 2) the unequivocal demonstration that T and α-QT are contaminants of cPPL and the suggestion that carboxypeptidase A can also be present in it (all of them may interfere in the efficiency of peptide formation catalyzed by cPPL); 3) the verification that, although impure, cPPL catalyzed dipeptide synthesis more efficiently than the CCLs; 4) the performance of the first systematic study of ester hydrolysis of Z-amino acids catalyzed by cPPL; 5) the observation of Z group removal during some Z-amino acid ester hydrolyses catalyzed by cPPL and the confirmation that this is also feasible for some Z¬amino acids and a Z-dipeptide.

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2017-07-12T22:04:17Z No. of bitstreams: 1 Tese vers?o final com ficha.pdf: 2919026 bytes, checksum: e0cf3c8db3a8cc81cb105cb2fbb154b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-12T22:04:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese vers?o final com ficha.pdf: 2919026 bytes, checksum: e0cf3c8db3a8cc81cb105cb2fbb154b3 (MD5) Previous issue date: 2016-08-03 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The flavonoid rutin (3-0-rutinos?deo-quercetin) stands out among the natural products as a promising alternative in the fight against degenerative diseases and related to aging. However, the low solubility and stability thereof in different media, especially lipophilic limited applications in pharmaceutical preparations. The biocatalytic transformation by enzymatic acylation has been suggested by several authors, with good reaction yields. In this sense, the objective of this study was to promote the enzymatic acylation of rutin, using castor oil as acylating agent and lipase as a catalyst, to characterize the formed product, estimate the efficiency of bioconversion, and to investigate in vitro the antioxidant activity and cytotoxic effect opposite the reaction product Vero cells. The catalytic transformation occurred at 50?C for 120 hours. The product was subjected to column chromatography, followed by filtration by Sephadex LH-20. The chemical structure of rutin-O-ricinoleate was determined by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) 1H and 13C and by liquid chromatography / mass spectroscopy (HPLC/MS). In another experiment, it was observed the formation of the ester content by High Performance Liquid Chromatography coupled to a detector diode arrangements (HPLC-DAD) under conditions which allow assessing the reaction yield over 120 hours. The analytical method proposed has been validated considering the linearity parameters, accuracy, precision, limit of quantification and detection proved to be suitable for quantification of ricinoleato rutin. It was found by this method that the reaction product maintained the antioxidant capacity of rutin and there was no evidence of cytotoxicity. / O flavonoide rutina (quercetina-3-0-rutinos?deo) se destaca entre os produtos naturais como uma alternativa promissora no combate ?s doen?as degenerativas e relacionadas ao envelhecimento. No entanto, a baixa solubilidade e estabilidade da mesma em diferentes meios, especialmente lipof?licos, limitam as aplica??es em prepara??es farmac?uticas. A transforma??o biocatal?tica, atrav?s da acila??o enzim?tica, tem sido sugerida por diversos autores, com bons rendimentos reacionais. Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi promover a acila??o enzim?tica da rutina, utilizando ?leo de mamona como agente acilante e lipase como catalizador, caracterizar o produto formado, estimar o rendimento da bioconvers?o, al?m de investigar in vitro a atividade antioxidante e o efeito citot?xico do produto reacional frente ?s c?lulas Vero. A transforma??o catal?tica ocorreu em temperatura de 50?C, durante 120 horas. O produto foi submetido ? cromatografia em coluna, seguida de filtra??o por Sephadex LH-20. A estrutura qu?mica da rutina-O-ricinoleato, foi determinada por Resson?ncia Magn?tica Nuclear (RMN) 1H e de 13C e por cromatografia l?quida/espectroscopia de massas (CLAE/EM). Em outro experimento, foi verificado o teor de forma??o do ?ster por Cromatografia ? L?quidos de Alta Efici?ncia acoplado a um detector de arranjos Diodos (CLAE-DAD), em condi??es que permitiram avaliar o rendimento reacional ao longo de 120 horas. O m?todo anal?tico proposto foi validado considerando os par?metros de linearidade, exatid?o, precis?o, Limites de quantifica??o e de detec??o mostrando-se adequado para a quantifica??o da rutina ricinoleato. Verificou-se pelos m?todos avaliados, que o produto reacional manteve a capacidade antioxidante da rutina e que n?o houve evid?ncia de citotoxicidade.

O desenvolvimento sustentável é atualmente um dos maiores focos das pesquisas no mundo em virtude dos impactos ambientais, tais como aquecimento global, geração de resíduos e emissão de gases poluentes causados pelo uso de combustíveis fósseis. Deste modo, pesquisas têm sido concentradas em tecnologias que permitam a substituição de refinarias à base de petróleo por biorrefinarias que utilizam matérias-primas renováveis. Neste contexto, os fungos filamentosos surgem como um recurso promissor no desenvolvimento de novos produtos sustentáveis, entre os quais os fungos pertencentes ao filo Zigomiceto, contribuem significativamente para esse desenvolvimento e estão sendo extensivamente estudados para a aplicação em biorrefinarias, com destaque especial para os fungos do gênero Mucor. Esse gênero, particularmente da espécie Mucor circinelloides, é um potencial produtor da enzima lipase e de biomassa com quantidades significativas de lipídios (single cell oil) o que permite sua exploração no processo de produção de biodiesel. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi explorar importantes aplicações biotecnológicas da linhagem de Mucor circinelloides URM 4182, tanto para produção de lipases quanto de lipídios. O trabalho experimental realizado consolidou dados da potencialidade do fungo para produção de lipase ligada ao micélio e sua utilização como biocatalisador para obtenção de biodiesel partir de óleos vegetais alternativos, como andiroba, coco, macaúba, palma e pinhão manso. Nas condições estudadas, foram obtidos rendimentos de transesterificação entre 88% a 97% e as conversões mais elevadas foram alcançadas para os óleos láuricos sugerindo seletividade da lipase para ácidos de cadeia curta. A potencialidade da linhagem Mucor circinelloides URM 4182 foi comprovada na obtenção de lipídios em cultivos efetuados em biorreator utilizando glicose e milhocina, respectivamente, como fontes de carbono e de nutrientes alternativos aos suplementos sintéticos. Nessas condições, valores médios de produtividade biomassa (3,10 ± 0,01 g/L/dia) contendo (31 ±0,01 % m/m) de lipídios, correspondendo produtividade lipídica de (0,97 ± 0,01 g/L.dia) foram alcançados. A composição do óleo microbiano revelou elevados teores dos ácidos graxos saturados palmítico (C16:0) e esteárico (C18:0) e dos insaturados oleico (C18:1) e linoleico (C18:2), que são os ácidos graxos semelhantes aos dos óleos vegetais convencionais utilizados para a produção de biodiesel. Além disso, foram verificados teores consideráveis do ácido gama-linolênico (GLA - C18:3), que tem relevante importância nas indústrias farmacêutica e de alimentos. A esterificação e transesterificação simultâneas do óleo microbiano ou diretamente da biomassa celular com etanol mediada por catalisadores heterogêneos bioquímicos e químicos forneceram amostras de biodiesel com elevados teores de ésteres de etila (> 97%) que atendem as normas de qualidade para uso como biocombustível. / Sustainable development is now the major research focus in the world because of the environmental impacts, such as global warming, waste generation and greenhouse gas emissions caused by the use of fossil fuels. Thus, research has been focused on technologies that enables the replacement of petroleum based refineries by biorefinery based on renewable raw materials. In this context, filamentous fungi emerge as a promising resource in the development of new sustainable products, including the fungi belonging to the phylum Zigomicete which contribute significantly to this development and are being extensively studied for using in biorefineries, with particular emphasis on the Mucor sp. fungus genus. This genus, particularly from the species of Mucor circinelloides, is a potential producer of the enzyme lipase and biomass having significant amounts of lipids (single cell oil) which allows its exploitation in the biodiesel production. Thus, the aim of this study was to explore important biotechnological applications of a Brazilian strain of Mucor circinelloides URM 4182 for both production of lipases and lipids. The experimental work consolidated this fungus capability to produce mycelium bound lipase and its use as biocatalysts for biodiesel production from alternative vegetable oils such as andiroba, coconut, macaw palm, palm and jatropha. The attained transesterification yields were in the range from 88 to 97%, and the highest conversions were achieved for lauric oils suggesting that M. circinelloides lipase has high selectivity for short chain fatty acids. The capability of this strain was also proven to produce lipids at cultivation conditions established in this work using glucose and corn steep liquor, respectively, as carbon sources and alternative nutrients to the mineral supplements. Under these conditions, average values for biomass productivity (3.10 ± 0.01 g/L/day) containing high lipis levels (31.2 ± 0.01% m/m) and lipid productivity of 0.97 ± 0.01 g/L.dia were achieved. The composition of microbial oil revealed high levels of saturated fatty acids such as palmitic acid (C16:0) and stearic (C18:0) and unsaturated oleic (C18:1) and linoleic (C18:2), which are fatty acids similar to conventional vegetable oils used for the production of biodiesel. In addition, considerable levels of gamma-linolenic acid (GLA-C18:3) were also verified which has relevant importance in the pharmaceutical and food industries. The simultaneous esterification and transesterification from microbial oil or direct fungal biomass with ethanol mediated by heterogeneous catalysts (biochemical and chemical) provided samples with high levels of ethyl esters (> 97%) that meet the quality standards for using as biofuel.

As enzimas têm papel fundamental em diversos segmentos como, por exemplo, nas indústrias de detergentes, fármacos, têxtil e alimentícia. A identificação de novas fontes microbianas para a produção de enzimas é de grande interesse industrial, bem como a otimização do meio de cultivo para sua produção. A aplicação de abordagens estatísticas envolvendo as metodologias de Plackett-Burman e superfície de resposta são ferramentas úteis para compreensão e otimização das interações entre os diversos parâmetros envolvidos na produção de determinada enzima. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial, como produtoras enzimáticas, de linhagens de leveduras isoladas a partir de cocos de babaçu (Orbignya sp.), buriti (Mauritia flexuosa), tucum (Bactris inundata), inajá (Attalea maripa) e macaúba (Acrocomia aculeata), frutas típicas do Cerrado tocantinense. Foram testadas 142 leveduras quanto a capacidade de produção das enzimas lipase, amilase, protease e pectinase em meios sólidos específicos com tempo de incubação de 21 dias e temperatura de 35 °C. Um total de 61 linhagens apresentaram resultados positivos para lipase, das quais 28 (45,9%) tinham índice enzimático (IE) ≥ 2. Apenas uma levedura apresentou halo indicador de produção de amilase (IE = 1,57), e não houve resultados positivos para pectinase e protease. Posteriormente, a levedura codificada com número 13, que obteve a melhor atividade lipolítica em meio sólido, foi submetida ao cultivo em meio submerso de acordo com um planejamento experimental Plackett-Burman seguido por um delineamento composto central rotacional para otimizar as condições de produção da enzima. A melhor condição encontrada, com atividade lipolítica de 41,45 U.mL-1, foi: 10 g.L-1 de extrato de levedura, 10 g.L-1 de peptona, 30 g.L-1 de (NH4)2SO4, 1 g.L-1 de Tween 20, 1,5 g.L-1 de MgSO4.7H2O, 0,7 g.L-1 de KH2PO4 e 10 g.L-1 de óleo de oliva. Quando comparado com os óleos de buriti e babaçu, o óleo de oliva se mostrou o melhor indutor para a produção de lipase. / Enzymes have an essential role in various segments, for example, in detergents, pharmaceuticals, textile and food industries. The identification of new microbial sources for production of enzymes is of great industrial interest, as well as the optimization of culture medium for production. The application of statistical approaches involving the Plackett- Burman and response surface methodologies are useful tools for understanding and optimizing interactions between the various parameters involved in the production of a particular enzyme. This study aimed to evaluate the enzymatic production potential of yeasts strains from babassu coconuts (Orbignya sp.), buriti palm (Mauritia flexuosa), tucumán (Bactris inundata), inajá (Attalea maripa) and macaúba (Acrocomia aculeata), typical fruits of the Cerrado in Tocantins. A total of 142 yeasts were tested for their ability to produce lipase, amylase, protease and pectinase in specific solid media at incubation time of 21 days at 35 °C. A total of 61 strains were positive for lipase, of which 28 (45.9%) had an enzymatic index (EI) ≥ 2. Only one yeast presented halo indicator of amylase production (EI = 1.57), and there were no positive results for pectinase and protease. Subsequently, the yeast coded with number 13, which obtained the best lipolytic activity on solid medium, was subjected to cultivation in liquid medium according to a Plackett-Burman experimental design followed by a rotational central composite design to optimize the enzyme production conditions. The best condition, with lipase activity of 41.45 U.mL-1, was found to be 10 g.L-1 of yeast extract, 10 g.L-1 peptone, 30 g.L-1 (NH4) 2SO4, 1 g.L-1 Tween 20, 1.5 g.L-1 MgSO4.7H2O, 0.7 g.L-1 KH2PO4 and 10 g.L-1of olive oil. When compared with buriti and babassu oils, the olive oil was the best inducer for the lipase production.

O presente estudo trata da produção de etil-ésteres de ácidos graxos (EEAGs) por reação de transesterificação do resíduo gorduroso de fritura usado num sistema isento de solvente, catalisado pela lipase microbiana de Pseudomonas fluorescens (Lipase AK), imobilizada em resíduo inerte do tipo polihidroxibutirato (PHB), por adsorção física. A atividade hidrolítica máxima, medida sobre a hidrólise de emulsão de azeite, a pH 7,0 e temperatura de 37 ° C, foi de 413,76 U / g de suporte , com uso de um carregamento de proteína igual a 30 mg / g suporte. No presente estudo, foi utilizado um planejamento fatorial completo com 22 variáveis ??do processo que tiveram uma influência significativa na síntese enzimática dos EEAGs por transesterificação do resíduo gorduroso usado. As reações foram realizadas a uma concentração de fixa do biocatalisador em 10% m / m, sob agitação contínua a 200 rpm, e tempo de reação de 15 h. Em condições ótimas de experimentação (razão molar de óleo: etanol de 1: 4,7 e temperatura de reação de 34 ° C), o percentual de rendimento máximo foi 67,9% de transesterificação foi atingido. No entanto, EEAGs purificados produzidos numa razão molar de óleo:etanol 1:3, em temperatura de 45 ° C exibiu uma viscosidade cinemática de 3,82 centipoise. Este estudo demonstrou que o design experimental é adequado para a maximização da síntese EEAGs por transesterificação de resíduo gorduroso de fritura usado num sistema livre de solventes. Esta metodologia também faz com que seja possível determinar uma região de trabalho desejável onde um melhor desempenho da reação de transesterificação pode ser obtido. / The present study deals with the production of fatty acids ethyl esters (FAEEs) by transesterification reaction of waste cooking oil in a solvent-free system mediated by microbial lipase from Pseudomonas fluorescens (Lipase AK) immobilized by physical adsorption on polyhydroxybutyrate (PHB) particles. The maximum hydrolytic activity, measured on the hydrolysis of olive oil emulsion at pH 7.0 and 37 °C, was 413.76 U/g of support for the biocatalyst prepared by offering protein loading of 30 mg/g of support. In the present study, it was proposed a 22 full factorial design to find the variables of the process that have a significant influence on the enzymatic synthesis of FAEEs by transesterification of waste cooking oil. The reactions were performed at fixed biocatalyst concentration of 10 % m/m, continuous agitation of 200 rpm and time reaction of 15 h. Under optimal experimental conditions (molar ratio oil:ethanol of 1:4.7 and reaction temperature of 34 °C), maximum transesterification yield percentage of 67.9% was reached. However, purified FAEEs produced at molar ratio oil:ethanol 1:3 and 45°C exhibited kinematic viscosity of 3.82 centipoise. This study demonstrated that the experimental design is appropriate for the maximization of FAEEs synthesis by transesterification of waste cooking oil in a solvent-free system. This methodology also makes it possible to determine a desirable working region where a better performance for the transesterification reaction can be achieved. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Este trabalho teve por objetivo estudar a partição da Lipase de Geotrichum candidum (LGc) em sistemas aquosos bifásicos (SAB) formados por PEG 1500 ou 4000 ou 6000 g mol-¹ + citrato de sódio + água e por copolímero tribloco L35 1900 g mol-¹ + citrato de sódio + água. A lipase extracelular foi produzida pelo microrganismo Geotrichum candidum NRRL Y - 552 por fermentação a 30,0 oC, pH 7,0 e sob agitação de 250 rpm. Os estudos de partição foram conduzidos com o sobrenadante do caldo fermentado, rico em lipase, após filtração para eliminação dos microrganismos. Estudos cinéticos e de eletroforese SDS-PAGE confirmaram a obtenção da lipase na etapa de fermentação. A influência da temperatura, pH, adição de NaCl, massa molar do polímero, hidrofobicidade do sistema e composição de mistura de PEG e do citrato de sódio sob o coeficiente de partição da lipase foram estudadas. Em todos os experimentos realizados a enzima particionou preferencialmente para a fase inferior com valores de KLGc em torno de 0,05-0,6. Medidas da atividade da lipase nas fases dos SAB mostraram que houve significativa perda da atividade enzimática durante o processo. Os valores médios da atividade nas fases superior e inferior foram de 1,5 U/ml e 5,5 U/ml, respectivamente, enquanto que no caldo bruto filtrado a atividade foi de 11,75 U/ml. Parâmetros termodinâmicos do processo de transferência de material entre as fases foram obtidos usando a aproximação de Van't Hoff nos estudos de partição realizados em diferentes temperaturas. O elevado valor negativo obtido para a variação de entalpia de transferência constituem evidência da existência de fortes interações entre a LGc e o PEG, contudo, os baixos coeficientes de partição encontrado nos SAB sugerem que o processo de transferência da LGc nestes sistemas seja entropicamente dirigido. Os SAB formados pela mistura de PEG 1500 g mol-¹ + citrato de sódio + água em pH 7,0 foram otimizados pela metodologia de superfície resposta. As condições que maximizam a partição do LGc na fase inferior foram determinadas nas concentrações extremas de PEG e citrato de sódio dentro das faixas de concentrações estudadas. / The aim of this work was to study the Geotrichum candidum lipase (GcL) partition in aqueous two-phase systems (ATPSs) formed by PEG 1500, 4000 or 6000 g mol-¹ + sodium citrate + water and by triblock copolymer L35 1900 g mol-¹ + sodium citrate + water. Extracellular lipase was produced by the microorganism Geotrichum candidum NRRL Y-552 by fermentation at 30.0oC%, pH 7.0, and stirring at 250rpm. Partition studies were carried out with the surfactant from the fermented, lipase rich broth, after filtration for elimination of microorganisms. Kinetic studies and SDS-PAGE electrophoresis confirmed lipase in the fermentation stage. The influence of temperature, pH, NaCl addition, polymer molar mass, hydrophobicity of the system and compounding of the PEG and sodium citrate blend under the lipase coefficient of partition were studied. In all experiments carried out, the enzyme partitioned preferentially to the lower phase with KGcL values around 0.05-0.6. Measurements of the lipase activity in phases of ATPSs showed that there was relevant loss of the enzymatic activity during the process. Mean activity values in the upper and lower phases were of 1.5 U/ml and 5.5 U/ml, respectively, while activity in the raw broth was of 11.75 U/ml. Thermodynamic parameters of material transfer process between phases were obtained by using Van’t Hoff’s approximation in the partition studies carried out at different temperatures. The high negative value obtained for the enthalpy transfer variation point out the existence of strong interaction between the GcL and the PEG. However, the low coefficients of partition found in the ATPSs suggest that the GcL transfer process in these systems is entropically driven. The ATPSs formed by the blend PEG 1500 g mol-¹ + sodium citrate + water in pH 7.0 were optimized by the response surface methodology. The conditions that maximize the GcL partition in the lower phase were determined in extreme external conditions of PEG and sodium citrate within the concentration bands studied. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

A aplicação da tecnologia enzimática em óleos e gorduras vem se consolidando como uma alternativa atraente para a substituição dos processos químicos tradicionais. A hidrólise de óleos vegetais é um processo pelo qual se pode obter vários compostos de interesse industrial, possibilitando agregar valor tanto a cadeia produtiva como aos produtos finais. O presente trabalho teve como objetivo a produção de um biocatalisador ativo e estável a partir das células íntegras do fungo filamentoso Penicilliumcitrinumpara aplicação na reação de hidrólise de óleos vegetais. As células íntegras contendo lipase ligada ao micélio foram produzidas na sua forma livre e imobilizada em espumas de poliuretano cortadas em cubos de 6 mm de aresta. Os biocatalisadores obtidos foram caracterizados quanto suas propriedades bioquímicas e cinéticas incluindo valores ótimos de pH, temperatura e constantes cinéticas, utilizando o método de hidrólise do azeite de oliva. As células livres apresentaram valores ótimos de atuação em pH 7,5 e temperatura de 45 °C. O tempo de meia vida obtido a 60 °C foi de 1,81 h, com velocidade máxima de 267,33 U/g. Para as células imobilizadas, a melhor atuação da lipase ligada ao micélio foi em pH 8,0 e temperatura de 40 °C, com velocidade máxima de 123,24 U/g e tempo de meia vida a 60 °C de 2,23 h. Definidas as condições ótimas de atuação das células, a próxima etapa do trabalho consistiu em realizar a hidrólise do óleo de soja empregando inicialmente as células livres, avaliando-se os efeitos da temperatura, pH, agitação e uso de solventes. Com o objetivo de melhorar a produtividade do sistema, os parâmetros temperatura e razão mássica óleo/tampão foram otimizados por meio do planejamento experimental, em busca das melhores condições para a reação. A condição otimizada predita pelo planejamento fatorial foi temperatura de 37°C e razão mássica óleo/tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,0 de 20%, obtendo-se uma porcentagem máxima de hidrólise de 38,6% após 3 horas de reação empregando 10% m/m de biocatalisador em sua forma livre na presença de agente emulsificante. A etapa seguinte explorou a utilização de ondas ultrassônicas na hidrólise do óleo de soja sendo constatados incrementos significativos no grau de hidrólise máximo em um período de tempo de 9 h. Foram obtidos valores de 77 e 96% de grau de hidrólise com e sem agente emulsificante, evidenciando a influência positiva das ondas ultrassônicas na reação. A análise cromatográfica do hidrolisado revelou que as células de P. citrinumforneceram os principais ácidos graxos presentes no óleo de soja, com predominância dos ácidos graxos C18:1 e C18:2. A influência de óleos vegetais contendo diferentes composições em ácidos graxos (oliva, canola e girassol) também foi avaliada na reação de hidrólise, sendo constatada a preferência do biocatalisador livre na conversão em ácidos graxos de cadeia longa, presentes no óleo de girassol. Ao final, o desempenho do biocatalisador imobilizado foi investigado na reação de hidrólise do óleo de soja e revelou resultados promissores, com grau de hidrólise máximo de 55,7% em 12h de reação. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que o emprego de células íntegras como biocatalisador em reações de hidrólise de óleos vegetais é uma alternativa promissora à catálise convencional, principalmente na obtenção de ácidos graxos poli-insaturados, como ômega 6. / The application of enzymatic technology in oils and fats has been consolidated as an attractive alternative for the substitution of traditional chemical processes.The hydrolysis of vegetable oils is a process by which several compounds of industrial interest can be obtained, allowing to add value both the production chain and the final products.This study aimed to the production of an active biocatalyst and stable from whole cells of the filamentous fungus Penicillium citrinum for application in the hydrolysis reaction of vegetable oils.The whole cells containing intracellular lipase attached to the mycelium were produced in free and immobilized form polyurethane foams cut into cubes 6 mm edge. The biocatalysts were characterized as their biochemical and kinetic properties including optimum values of pH, temperature and kinetic constants. The free cells showed optimal values of activity at pH 7.5 and temperature 45 ° C.O half-life obtained at 60 ° C was 1.81 h, with a maximum speed of 267,33 U / g. For immobilized cells, the best performance of intracellular lipase was at pH 8.0 and 40 ° C, with a maximum speed of 123,24 U / g and half-life at 60 ° C for 2,23 h.After the optimum conditions of cell performance were determined, the next stage of the work consisted in hydrolysis of soybean oil using the free cells, evaluating the effects of temperature, pH, agitation and solvent use.In order to improve system productivity, the temperature parameters and ratio by weight oil / buffer were optimized through experimental design, in search of better conditions for reaction. The optimized conditions predicted by the experimental design was 37 ° C and weight ratio oil / 20% buffer to give a maximum percentage of hydrolysis of 38.6% after 3 hours of reaction using 10% m / m biocatalyst in free form in the presence of emulsifying agent. The next step explored the use of ultrasonic waves in the hydrolysis of soybean oil with significant increases in the degree of maximum hydrolysis in a time period of 9 h.The values of 77 and 96% of hydrolysis degree with and without emulsifying agent were obtained, evidencing the positive influence of the ultrasonic waves in the reaction.The chromatographic analysis of the hydrolyzate showed that the P. citrinumcells provided the main fatty acids present in soybean oil, predominantly C18:1 and C18:2 fatty acids.The influence of vegetable oils containing different compositions in fatty acids (olive, canola and sunflower) was also evaluated in the hydrolysis reaction, being verified the preference of the free biocatalyst in the conversion to long chain fatty acids present in sunflower oil.At the end, the performance of the immobilized biocatalyst was investigated in the hydrolysis reaction of soybean oil and showed promising results, with a maximum hydrolysis degree of 55.7% in 12 hours of reaction.The results obtained in this work demonstrate that the use of intact cells as a biocatalyst in hydrolysis reactions of vegetable oils is a promising alternative to conventional catalysis, especially in the production of polyunsaturated fatty acids, such as omega 6.

Orientador: Valéria de Carvalho Santos Ebinuma / Coorientador: Ariela Veloso de Paula / Coorientador no exterior: Jose M. Palomo / Banca: Tales Alexandre da Costa e Silva / Banca: Marcdelo Chuei Matsudo / Banca: Fernando Masarin / Banca: Ana Lúcia Martiniano Nasser / Resumo: As lipases são enzimas amplamente aplicadas em processos industriais. Sua obtenção por fungos filamentosos apresenta algumas vantagens em relação às outras fontes e por isso estudos de incremento de sua produção vêm sendo realizados. Aliado ao processo de obtenção, técnicas de imobilização de enzimas podem melhorar sua estabilidade em relação à temperatura e pH, e diminuir custos associados à sua aplicação devido à possibilidade de reaproveitamento da enzima imobilizada nos processos biocatalíticos. Objetivo: este trabalho teve como objetivo estudar a produção de lipases pela cepa Aspergillus sp. DPUA 1727, a imobilização da referida enzima em suporte octil-sepharose, sua caracterização na forma livre e imobilizada e a aplicação da enzima imobilizada na obtenção de ésteres. Métodos: a produção da enzima foi realizada por 96 horas em cultivo submerso, avaliando-se diferentes fontes de carbono (óleos de soja, oliva, semente de uva e de algodão) como substratos indutores da produção enzimática. Posteriormente, estudou-se a imobilização da enzima em suporte octil-sepharose® por adsorção através de interação hidrofóbica, após o meio fermentado ter sido submetido à 4 ciclos de extração do óleo residual da fermentação com n-hexano. O processo de imobilização da enzima foi realizado em cascata em 4 ciclos com a finalidade de sobrecarga da enzima no suporte. Os testes de estabilidade foram feitos por 24 horas, nas temperaturas de 30 à 70ºC e pH de 3 a 9 com a enzima livre e imobilizad... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lipases are enzymes widely applied in industrial processes. They can be obtained by filamentous fungi which presents some advantages in relation to other sources and for this reason, studies aiming to increase its production have been performed. Moreover, the process of enzyme immobilization can improve the enzyme stability in relation to temperature and pH, and reduce the costs associated with its application due to the possibility of immobilized enzyme reuse in biocatalytic processes. The objective of this work was to study the production of lipases by Aspergillus sp. DPUA 1727, the immobilization of lipases produced in octyl-sepharose support and make the enzyme characterization in its free and immobilized form. Furthermore, the immobilized enzyme was applied to obtain the ester isoamyl propionate. Methods: the enzyme production was carried out for 96 hours in submerged culture, with different carbon sources (soybean, olive, grape seed, and cotton oils) as substrates. Subsequently, the enzyme immobilization in octyl-sepharose® support by adsorption through hydrophobic interaction was studied ( to this experiment the fermented medium was submitted to 4 cycles to extract the residual oil with n-hexane). The enzyme immobilization process was carried out in cascade employing 4 cycles with the purpose of overloading the enzyme in the support. Stability studies were done for 24 hours, at temperatures from 30 to 70ºC and pH from 3 to 9 with the enzyme-free and immobilized. As the last step of this work, the immobilized enzyme was applied in the preparation of the ester isoamyl propionate. Results: In the production stage, the best condition to obtain the enzyme... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Lipases são enzimas que hidrolisam especificamente óleos e gorduras, podendo ser de grande interesse para vários segmentos industriais como têxtil, cosméticos, alimentícios e tratamento de efluentes com elevada carga de gordura. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a produção de complexos enzimáticos lipolíticos produzidos por microrganismos isolados de um sistema de tratamento biológico de efluentes de um hotel, visando obter lipases com potencial para emprego em processos biotecnológicos. Para a seleção do microrganismo lipolítico foram utilizados 65 isolados bacterianos oriundos do efluente bruto e tratado da wetland e da caixa de gordura do restaurante do hotel. A produção de lipase foi testada em placa em meio de cultivo acrescido de azeite de oliva e rodamina B, incubados a 25°C e 30ºC por 24h-48h e as placas observadas sob luz UV 350 nm. Deste total de isolados, sete oriundos da wetland e 22 isolados da caixa de gordura foram positivos para lipase, pois apresentaram halos fluorescentes alaranjado. Os isolados foram testados novamente em placa, porém numa condição mais estressante em termos de nutrientes para induzir a utilização do azeite e assim selecionar as melhores produtoras de enzimas Desses, 12 isolados apresentaram atividade lipolítica e aquele que apresentou halo mais evidente e maior foi selecionado para ensaios com crescimento em cultura submersa em agitador orbital e biorreator em três substratos diferentes (azeite de oliva, óleo de semente de uva e óleo de canola) para a determinação da atividade enzimática. As bactérias lipolíticas identificadas bioquimicamente foram do gênero Enterobacter, Acinetobacter, Pseudomonas, Klebsiella e Burkholderia. Os ensaios em cultura submersa em biorreator nos três substratos avaliados apresentaram a máxima produção de lipase após 12 horas de cultivo; azeite de oliva 0,358 U/mL.min-1, óleo de semente de uva 0,352 U/mL.min-1 e óleo de canola 0,348 U/mL.min-1. Em cultivo submerso em agitador orbital, o meio de cultivo na presença de Tween 80, apresentou melhor atividade enzimática que o meio de cultivo sem a presença do emulsionante. A identificação molecular do isolado apresentou identidade com o gênero Acinetobacter baylyi. A análise por SDS-PAGE sugere uma lipase com massa molecular de 35 kDa. / Lipases are enzymes that specifically hydrolyze oils and fats and may be of great interest to various industrial segments such as textiles, cosmetics, food and effluent treatment with the high fat load. The aim of this work was to evaluate the production of lipolytic enzymatic complexes produced by microorganisms isolated from a biological treatment system of effluents of a hotel, aiming to obtain lipases with potential for use in biotechnological processes. To select the best lipolytic microorganism, we used 65 bacterial isolates, recovered from the raw and treated effluent of the wetland system and from the fat tank of the hotel restaurant. Lipase production was evaluated in culture medium supplemented with olive oil and rhodamine B, incubated at 25°C and 30°C for 24h-48h. The grown colonies were observed under UV light at 350 nm. Out of that, seven isolates from wetland and 22 isolated from the fat tank were positive for lipase as they exhibited orange fluorescent halos. The isolates were again seeded on medium with a stressful nutrient condition to induce the use of olive oil and thus select the best enzyme producers Of these, 12 isolates presented lipolytic activity, and the one that showed the most evident halo was selected for assays in submerged culture in an orbital shaker and bioreactor using three different substrates (olive oil, grape seed oil, and canola oil). The lipolytic bacteria identified were of the genus Enterobacter, Acinetobacter, Pseudomonas, Klebsiella, and Burkholderia. The assays run in the bioreactor showed the maximum lipase production after 12 hours of culture with the three substrates evaluated; 0,358 U/mL.min-1 in olive oil, 0,352 U/mL.min-1 grape seed oil, and 0.348 U/mL.min-1 canola oil. The results obtained in an orbital shaker showed better enzymatic activities in the presence of Tween 80 on the culture medium. The molecular identification showed identity with the genus Acinetobacter baylyi. Analysis by SDS-page suggests a lipase with a molecular mass of 35 kDa.

Influenza A virus (IAV) causes annual epidemics and sporadic pandemics of respiratory disease in humans. One of the main complications of primary IAV infection is increased susceptibility to secondary bacterial co-infection, with Staphylococcus aureus being the most common co-infecting species. Previous work identified secreted proteases from S. aureus as a pro-viral factor, leading to specific cleavage of the IAV surface hemagglutinin and increase in infectious viral titre. The aim of this study was to investigate the effect of bacterial proteases, and other secreted bacterial proteins, on IAV replication. Supernatants from the S. aureus community-associated epidemic clone USA300 were separated by size exclusion chromatography and each fraction was tested for an impact on IAV replication in primary chicken embryo fibroblast (CEF) cells. A fraction that increased viral titre by at least 10-fold was identified, but this effect was independent of known secreted proteases. Through the use of mass spectrometry fingerprinting and bacterial mutagenesis, a single protein, S. aureus lipase 1, was identified to be responsible for the pro-viral effect. Lipase 1 is expressed by an array of diverse S. aureus strains of distinct clonal origins. Both the native and recombinant form of lipase 1 were pro-viral only during the infection of primary cells, including primary human lung fibroblasts. Further validation of this interaction indicated lipase 1 was pro-viral in a concentration dependant manner and for a range of IAV strains. Investigation into the mechanism of action of lipase 1 revealed the protein acts during a single infectious cycle in a manner dependent on its active site. Time of addition studies and western blot analysis showed lipase 1 affects the later stages of virus replication, but there is no direct interaction with the virus particle; rather, the protein manipulates the cell, resulting in an increased number of infectious particles being produced. This work has identified and validated a single S. aureus protein, which affects IAV replication. Thus, it has elucidated some of the complex interactions that occur between the virus and bacteria during co-infection. It has also demonstrated a novel role for a bacterial enzyme in IAV replication, the study of which can further our understanding of both IAV and cell biology.