Made available in DSpace on 2013-08-07T19:12:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000439221-Texto+Completo-0.pdf: 13000288 bytes, checksum: 7a380ac8b48ccfc7ae1c7cbae00ca5b0 (MD5) Previous issue date: 2012 / The most important impact of conifers in the environment is attributed to the release of phytotoxins/allelochemicals (predominantly phenolic compounds) from the fallen litter layers (Singh et al. , 1999). Polyphenols are considered to be one of the most widely distributed groups of the chemical substance produced to plants and had a potential allelochemicals due to its high water solubility and properties to inhibit growth of others species of the plants (Inderjit 1996; Graça et al. 2002).Pinus plantation has emerged as a solution to replace the source of feedstock for production of furniture, paneling, particle board, paper, cellulose, among others, and economically viable due to the use of fastgrowing species. The concern for the development of this activity is the consequences of the use of exotic species and the practice of monoculture on the local ecosystem. This study assesses the effects the aqueous extract of Pinus taeda (exotic species) and Araucaria angustifolia (native species) has: (1) on the biochemical composition, oxidative stress, and reproductive parameters of Hyalella castroi; (2) determine the concentrations of hydrosoluble phenolics in leaves of P. taeda and A. angustifolia collected in months of winter and summer of 2009 and 2010 in the south of Brazil; (3) quantify the litter produced by P. taeda and A. angustifolia; (4) determine, in laboratory conditions, the time required for leaching of hydrosoluble phenolics from leaves; (5) quantify the concentration of hydrosoluble phenolics in body water near the plantations; (6) evaluate the allelochemicals effect of aqueous extract of the P. taeda and A. angustifolia in seeds of Lactuca sativa; (7) determine, by HPLC, the profile of phenolics in the hydrosoluble extract from P. taeda and A. angustifolia; (8) evaluate the effect of plant dry material of two conifers, P. taeda and A. angustifolia in the activity of the respiratory electron transport system (ETS) of H. castroi and (9) evaluated the changes physical-chemical parameters and hydrosoluble phenolics in one body water near and another distant from the plantations of Pinus taeda. Amphipods were collected in summer and winter, in Rio Grande do Sul, Brazil. Part of the animals was frozen in the field and the remainder transported to the laboratory.Animals were acclimated for 7 days and frozen, the other animals were exposed for a further 7 days to the aqueous extract of both tree, containing different concentrations of hydrosoluble phenolics (0. 10, 0. 25, 0. 5, 0. 75mg/L), and one group was kept until the experiments finish only with diet (14 days). After cultivation, the animals were immediately frozen and divided into five pools for determining the levels of arginine, arginine phosphate, glycogen, proteins, lipids, triglycerides, glycerol, cholesterol, lipid peroxidation, and the activity of catalase, SOD, GST, Na+/K+ATPase and ETS by spectrophotometric technique. Reproductive parameters (number of breeding pairs, ovigerous females and eggs in the pouch) were analyzed in animals exposed to both extracts and the control groups. Leaves of P. taeda and A. angustifolia were collected from trees older than 20 years old cultivated in a commercial culture in São Francisco de Paula Municipality. The radical scavenging activity of the plant aqueous extracts was also evaluated. We collected samples in two body waters: one in São José dos Ausentes Municipality (28°47'00"S – 49°50'53"W; 1200 m a. s. l. ) distant of the Pinus taeda plantation, and other in São Francisco de Paula Municipality (29°23'36. 2"S – 50°22'50. 7"W; 900 m a. s. l. ) near the P. taeda plantation, both in Rio Grande do Sul, Brazil during summer and winter of 2009 and 2010. The parameters measured were total levels of phenolic compounds, total and fecal coliforms, hardness, nitrite, nitrate, total solids, sulphate, biological oxygen demand (BOD), chemical oxygen demand (COD), dissolved oxygen, pH and water temperature. Our results revealed that the aqueous extract from P. taeda induces a decrease in all metabolites and reproductive parameters studied. On the other hand, the levels of lipoperoxidation and activities of catalase, SOD and GST increased during exposition.Already the animals exposed to the extract of A. angustifolia showed no alteration of the biochemical composition and reproductive parameters. This extract determined a decrease in the lipoperoxidation levels, this response suggests an antioxidant effect of the extract of native wood. The analyses of the leaves suggest that hydrosoluble compounds produced by extract of coniferae species have different antioxidant potentials and affect the amphipods in a divergent form in terms of the ETS. Out of the parameters analyzed in the present work only BOD, oxygen dissolved and pH seemed to change by the presence of the Pinus taeda plantation near of the body water and results suggest that the alteration are related with the presence of the needles as well as the high concentration of the phenolic compounds verified in the body water. After analyze of the profile of the phenolic compounds we observed that others phenolic compounds are present in the extracts of P. taeda, and this combination is probably the factor that determined the deleterious effect of the extract of P. taeda. This pattern of response can help to explain how exotic species of conifers such as P. taeda, modify the natural environment and can cause severe alterations in freshwater ecosystem. / O impacto mais importante das coníferas no ambiente é atribuído à liberação de fitotoxinas/aleloquímicos (predominantemente compostos fenólicos) da biomassa no solo (Singh et al. , 1999). Os polifenóis são considerados um dos grupos mais amplamente distribuídos entre as substâncias químicas produzidas pelas plantas e têm potencial aleloquímico devido à sua alta solubilidade em água e sua propriedade de inibir o crescimento de outras espécies de plantas (Inderjit 1996;. Graça et al 2002 ). A plantação de Pinus surgiu como uma solução para substituir a fonte de matéria-prima para produção de móveis, painéis, celulose, papel, compensado, entre outros, e é economicamente viável devido ao uso de espécies de crescimento rápido.A preocupação com o desenvolvimento desta atividade são as conseqüências do uso de espécies exóticas na prática da monocultura sobre o ecossistema local. Este estudo avaliou os efeitos do extrato aquoso de Pinus taeda (espécie exótica) e Araucaria angustifolia (espécie nativa): (1) sobre a composição bioquímica, estresse oxidativo e parâmetros reprodutivos de Hyalella castroi; (2) determinou as concentrações de compostos fenólicos hidrossolúveis em folhas de P. taeda e A. angustifolia coletados nos meses de inverno e verão de 2009 e 2010 no sul do Brasil, (3) quantificou a biomassa produzida por P. taeda e A. angustifolia; (4) determinou, em condições de laboratório, o tempo necessário para a lixiviação de compostos fenólicos hidrossolúveis das folhas; (5) quantificou a concentração de compostos fenólicos hidrossolúveis em corpo d’água perto das plantações; (6) avaliou o efeito de aleloquímicos extrato aquoso da P. taeda e A. angustifolia em sementes de Lactuca sativa, (7) determinou, por HPLC, o perfil dos compostos fenólicos no extrato hidrossolúvel de P. taeda e A. angustifolia; (8) avaliou o efeito de material vegetal seco de duas coníferas, P. taeda e A. angustifolia na atividade do sistema de transporte de elétrons (ETS) de H. castroi e (9) avaliou as alterações dos parâmetros físico-químicos e os níveis de compostos fenólicos hidrossolúveis em um corpo de água perto e outro distante das plantações de P. taeda. Os anfípodos foram coletados no verão e inverno, no Rio Grande do Sul, Brasil.Parte dos animais foi congelado no campo e o restante transportado para o laboratório. Os animais foram aclimatados por 7 dias e congelados, os outros animais foram expostos por mais 7 dias ao extrato aquoso de ambas as árvore, contendo diferentes concentrações de compostos fenólicos hidrossolúveis (0,10, 0,25, 0,5, 0,75 mg/L), e um grupo foi mantido até os experimentos terminarem apenas com a dieta (14 dias). Após o cultivo, os animais foram imediatamente congelados e dividido em cinco pools para determinar os níveis de arginina, arginina fosfato, glicogênio, proteínas, lipídeos, triglicerídeos, glicerol, o colesterol, a lipoperoxidação, e a atividade da catalase, SOD, GST, Na+/K+ ATPase e ETS por técnicas espectrofotométricas. Parâmetros reprodutivos (número de casais reprodutivos, fêmeas ovígeras e ovos no marsúpio) foram analisados em animais expostos a ambos os extratos e nos grupos de controle. Folhas de P. taeda e A. angustifolia foram coletadas de árvores com mais de 20 anos de idade cultivadas em uma floresta comercial no município São Francisco de Paula. A atividade de radicais livres dos extratos aquosos de plantas também foi avaliado. Foram coletadas amostras em duas corpos d’águas: um no município de São José dos Ausentes (28°47'00"S - 49°50'53"W; 1200m de altitude) distante da plantação de P. taeda, e outro em São Francisco de Paula (29°23'36. 2"S - 50°22'50. 7"W; 900m de altitude), perto da plantação de P. taeda, no Rio Grande do Sul, Brasil durante o verão e inverno de 2009 e 2010.Os parâmetros medidos foram os níveis de compostos fenólicos totais, coliformes totais e fecais, dureza, nitrito, nitrato, sólidos totais, sulfato, demanda biológica de oxigênio (DBO), demanda química de oxigênio (DQO), oxigênio dissolvido, pH e temperatura da água. Nossos resultados revelaram que o extrato aquoso de P. taeda induz uma diminuição em todos os metabólitos e parâmetros reprodutivos estudados. Por outro lado, os níveis de lipoperoxidação e atividades de catalase, SOD e GST aumentaram durante a exposição. Já os animais expostos ao extrato de A. angustifolia não alterou a composição bioquímica e os parâmetros reprodutivos. Este extrato determinou uma diminuição nos níveis de lipoperoxidação, esta resposta sugere um efeito antioxidante do extrato da espécie nativa. As análises das folhas sugerem que os compostos produzidos por extrato hidrossolúvel de espécies Coniferae têm potenciais antioxidantes diferentes e afetam a anfípodos de forma divergente em termos da ETS. Dos parâmetros analisados no presente trabalho apenas DBO, oxigênio dissolvido e pH alteraram com a presença da plantação de P. taeda perto do corpo d’água e os resultados sugerem que a alteração está relacionada com a presença das acículas, bem como a alta concentração de compostos fenólicos verificada na água. Depois de analisar o perfil dos compostos fenólicos foi observada a presença de outros compostos fenólicos nos extratos de P. taeda, e esta combinação é provavelmente o fator que determinou o efeito deletério do extrato de P. taeda. Este padrão de resposta pode ajudar a explicar como as espécies exóticas de coníferas, como P. taeda, modificam o ambiente natural e podem causar alterações graves nos ecossistemas de água doce.

Evidências acumuladas em diversos estudos tem demonstrado que as Espécies Ativas do Oxigênio (EAO) contribuem para o dano celular decorrente da isquemia e reperfusão de órgãos, principalmernte, em função da propriedade oxidativa das mesmas sobre os constituintes lipídicos das membranas celulares. O alopurinol tem sido sugerido como droga capaz de interferir beneficamente diminuindo o dano celular decorrente da reperfusão de órgãos previamente isquêmicos, tendo em vista o seu potencial de inibir a enzima xantina-oxidase, a mais frequentemente referida como geradora de EAO. Este estudo foi desenvolvido como o objetivo de avaliar os efeitos da isquemia e reperfusão hepática em ratos e também os efeitos do prétratamento com o alopurinol, sobre a função deste órgão, lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos e, características histopatológicas decorrentes. Para tanto, ratos Wistar, pesando entre 250 e 300 gramas foram utilizados e divididos em 6 experimentos interdependentes. Experimento 1: realizado para avaliar os efeitos de diferentes procedimentos sobre a função hepática. Os animais foram divididos em 4 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia troncular total e intermitente durante um tempo de 45 minutos, tendo sido permitida a reperfusão durànte 5 minutos após os dois primeiros intervalos de 15 minutos; Grupo 3- ratos submetidos a hepatectomia parcial (lobo médio e esquerdo); Grupo 4- ratos submetidos a isquemia conforme descrito e, no final do período, a hepatectomia parcial como no grupo anterior. Colheitas de sangue 12, 24, 48, 72, 96, 120 horas e no 14, 21 e 28 dias foram obtidas para determinação da atividade das transaminases oxalo-pirúvicas (AL T), oxaloacética (AST) e fosfatase alcalina (FA). Experimento 2: realizado para avaliar o grau de lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos, através dos métodos de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e da Quimiluminescência (QL), em diferentes tempos de reperfusão sanguínea. Para tanto, 40 ratos foram utilizados e divididos em 4 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1: ratos controle (submetidos a laparotomia); Grupo 2- ratos submetidos a isquemia total durante 60 minutos não tendo sido permitida a reperfusão; Grupo 3- lsquemia total de 60 minutos e reperfusão por 30 minutos; Grupo 4- lsquemia total de 60 minutos e reperfusão por igual tempo. A ressecção do lobo médio, ao final de cada tempo operatório, foi realizada e, o tecido removido utilizado para medidas do grau de lipoperoxidação pelos métodos do TBARS e QL. Experimento 3: realizado para avaliar os efeitos do alopurinol sobre a função hepática em situações de isquemia e reperfusão. Para tanto 30 ratos foram utilizados, e divididos em 3 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- lsquemia seletiva do lobo médio e esquerdo durante 45 minutos, porém em ratos pré-tratados com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente; Grupo 3- ratos submetidos a isquemia seletiva conforme descrito anteriormente. Medidas da ALT, AST e FA foram realizadas 12, 24, 48 e 72 horas após os procedimentos. Experimento 4: avaliar o efeito do alopurinol sobre o grau de lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos. Para tanto, 30 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos com 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle, submetidosum período de anestesia e laparotomia de 1 hora e 45 minutos; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia de 45 minutos e reperfusão de 1 hora porém, pré-tratados com suspensão de alopurinol conforme descrição prévia. Grupo 3- ratos submetidos a isquemia de 45 minutos e reperfusão de 1 hora. Após os respectivos tempos operatórios,os animais foram submetidos a ressecção do lobo médio, utilizado para as medidas da lipoperoxidação pelos métodos do TBARS e QL. Experimento 5: avaliar os efeitos do alopurinol sobre a mortalidade pósoperatória em ratos submetidos a isquemia e reperfusão. Para tanto, 30 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia seletiva do lobo médio e esquerdo durante 45 minutos, porém com pré-t r~tamento com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente. Grupo 3- lsquemia seletiva conforme descrito anteriormente. Experimento 6: avaliar as alterações histopatológicas da isquemia hepática em ratos pré-tratados e não com alopurinol. Para tanto, 60 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos de 20 animais: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia seletiva do lobo médio e esquerdo, durante 45 minutos, porém em ratos pré-tratados com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente. Grupo 3- lsquemia seletiva conforme descrito anteriormente. A cada 24 horas durante 4 dias, 5 animais de cada grupo eram sacrificados e, os lobos médio e esquerdo foram removidos para estudo histopatológico. Experimento 1- Significativa elevação nas concentrações séricas, nas medidas das 12 e 24 horas após o procedimento, das enzimas AL T e AST foram observadas nos Grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle (Grupo 1) (p<O.OS). Além disso, naqueles animais do Grupo 4 elevações mais pronunciadas foram eveifenciadas em relação aos demais grupos nas determinações efetuadas 12, 24 e 48 após a cirurgia (p<O.OS). A soma dos valores das medidas individuais dos Grupo 2 e 3 não se distinguiram daquelas obtidas no Grupo 4 (p>O.OS). A concentração sérica da FA foi mais elevada em todas as determinações efetuadas naqueles animais submetidos a hepatectomia (G.3 e 4) em relação aos grupos de animais nos quais este procedimento não foi efetuado (Grupos 1 e 2) (p<O.OS). Experimento 2- Foi observado uma maior formação de malondialdeído (TBARS) nos tecidos hepáticos dos Grupos 3 e 4 em relação aos Grupos 1 e 2 (p<O.OS) e, além disso, ausência de diferença entre os Grupos 3 e 4 e entre os Grupos 1 e 2 (p>O.OS). Resultados semelhantes foram obtidos pelo método da QL. Experimento 3- A concentração sérica da AL Te AST foi superior (p<O.OS) nos Grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle (Grupo 1) nas medidas efetuadas 12 e 24 horas após o procedimento e, nas determinações das 48 horas do Grupo 3 em relação aos demais (p<O.OS). A FA foi semelhante em todos os grupos de animais (p>O.OS). Experimento 4- A formação de malondialdeído foi maior nos animais do Grupo 3 em relação aos Grupo 1 e 2 (p<O.OS). Entre estes dois últimos grupos não houve diferença estatisticamente detectável (p>O.OS). Além disso, a QL demonstrou uma maior emissão de energia luminosa no Grupo 3 em relação aos demais (p<0.05) e, entre estes dois últimos os resultados foram semelhantes (p>0.05). Experimento 5- A taxa de mortalidade no grupo de animais submetidos a isquemia sem pré-tratamento como alopurinol (Grupo 3) foi de 40% nas primeiras 24h após o procedimento, estatisticamente distinta quando comparado ao Grupo 1 (cbntrole)(p<0.05). Entretanto, entre os animais do Grupo 2, ou seja, submetidos a isquemia e pré-tratamento com alopurinol, 13.3% foram ao óbito e este valor não se distingue dos animais do Grupo 1 (p>0.05). A avaliação entre os Grupos 2 e 3 não demonstrou diferença estatística (p>0.05). A mortalidade na avaliação das 48 horas foi igual entre os dois grupos (6.6% e 6.6%) (2 e 3) e não distintas, estatisticamente (p>0.05). Os demais animais sobreviveram durante o período de observação. Experimento 6- Congestão vascular hepática e necrose hepatocitária foram significativamente mais pronuncidas nos animais dos Grupos 2 e 3 em relação aos animais do grupo controle na avaliação efetuada 24 e 48 horas após a isquemia (p<0.05) e, além disso, a necrose foi maior nos animais do Grupo 3 em relação aos do Grupo 2 (p<0.05) apenas na avaliação das primeiras 24 horas após o procedimento cirúrgico. Não se observaram diferenças estatisticamente demonstráveis nas avaliações realizadas 72 e 96 horas após a cirurgia(p>0.05). Estes resultados sugerem que a via da xantina oxidase é uma das mais importantes rotas metabólicas envolvidas na geraçãode EAO, elementos quimicamente reativos e com potencial lesivo ao nível das membranas celulares dos hepatócitos e, que pelo menos em parte, são responsáveis pelos danos funcionais do fígado na síndrome da isquemia e reperfusão. Além disso, o alopurinol demonstrou efeitos protetores contra a lipoperoxidação decorrente da injúria reperfusional, embora a análise histopatológica não tenha demonstrado uma diferença estatisticamente significativa, o que pode ser justificado pelo fato das alterações provocadas nesta síndrome ocorram a nível de biomembranas celulares e de organelas não adequadamente visualizáveis pela microscopia óptica. / lt has been demonstrated that the oxygen free radical (EAO) contributes to the cellular damage induced by ischemia/reperfusion, probably mainly due to its lipid-oxidative characteristics. lt has been suggested that allopurinol has beneficiai effects in reducing the injury due to the reperfusion of previously ischemic organs, in this syndrome, as a result of its property of inhibiting the enzyme xanthine oxidase, most frequently referred as responsible for the EAO generation. This study was carried out with the purpose of elucidating the effects of hepatic ischemia-reperfusion in rats, the effects of allopurinol in this syndrome, the development of the assay for lipid peroxidation of hepatocyte membranes and the histopathologic features. To achieve this goal, the functional repercussion and the histopathologic features (analized 24 hours and eight days after surgery) were evaluated in wistar rats weighing 250-300 g. Experíment 1: performed for evaluating the way in which different procedures reflected upon the hepatic function. The animais were divided into 4 groups of 1 O rats each. Group 1- Contrais (sham operation); Group 2- rats submitted to total intermittent hepatic ischemia for 45 minutes: the first two 15-minute periods of ischemia were intercalated with 5 minutes of reperfusion; Group 3- rats which underwent partia! hepatectomy (mediai and left lobes). Group 4- lschemia as described above and at the end of partia! hepatectomy. Blood samples were obtained at 12, 24, 48, 72, 96 and 120 hours and 4, 21 and 28 days after the procedure to determine the leveis of the enzymes oxalopiruvic transaminase (AL T), oxaloacetic transaminase (AST) and alkaline phosphatase (AF). Experiment 2: performed for evaluating the lipoperoxidation of hepatocyte membranes by the methods of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and Chemoluminescence (QL) at different times of reperfusion. The animais were divided into 4 groups of 10 rats each: Group 1- Contrais (sham operation); Group 2- rats submitted to total hepatic ischemia for 60 minutes ; Group 3- total hepatic ischemia for 60 minutes and reperfusion for 30 minutes; Group 4- total hepatic ischemia for 60 minutes and reperfusion for 60 minutes. At the end of each operation time, a resection of the mediai lobe was performed, and hepatic tissue was removed and used for measuring lipid peroxidation by the methods described above. Experiment 3: performed for evaluating the effects of allopurinol on hepatic function in the setting of ischemia-reperfusion. The animais were divided into 3 groups of 1 O rats each: Group 1- Contrais (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 5 minutes of reperfusion 22,5 minutes later. Blood samples were obtained 12, 24, 48 and 72 hours after the procedure to determine the activities of the AL T, AST and AF enzymes. Experiment 4: performed for evaluating the effects of allopurinol on hepatocyte membrane lipoperoxidation by the methods of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and Chemoluminescence (QL). The animais were divided into 3 groups of 1 O rats each: Group 1- Contrais (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 60 minutes of reperfusion and treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and reperfusion during 60 minutes. After the respective surgical times, the left and mediai lobes were removed and used for the lipoperoxidation assay by the TBARS and QL methods. Experiment 5: performed for evaluating the effects of allopurinol on mortality after the ischemia-reperfusion procedure. Forty animais were used and divided into 3 groups: Group 1- 10 control rats (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- 15 rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3: 15 rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 5 minutes of reperfusion 22,5 minutes later. The animais were observed for 7 days after the procedure. Experiment 6: performed for analyzing the hepatic histopathologic features and the effects of the pre-treatment wíth allopurinol in the rats submitted to ischemia-reperfusion. Sixty animais were used and divided into three groups of twenty animais each: Group 1- Contrai rats (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes. Twenty-four, 48, 72 and 96 hours after the procedure, 5 rats of each group were sacrificed, and their left and right lobes were removed for histopathologic study (vascular congestion, necrosis and steatosis). Experiment 1: The determination of the AL T and AST leveis, after the procedure, demonstrated that these leveis were significantly higher in the groups 2 and 3 than in group 1 (p<0,05). Besides, among the animais of ali groups, those of group 4 had the highest leveis 12, 24 and 48 hours after the surgery. When the values of group 3 were added to the values of group 2, the results were not different from the values of group 4 (p>0,05). AF was higher in ali determinations, in the animais which underwent hepatectomy (groups 3 and 4) compared to those which were not submitted to this procedure (groups 1 and 2) (p< 0,05). Experiment 2: Malondialdehyde (TBARS) formation was higher in the groups 3 and 4 than in the groups 1 and 2 (p<0,05); besides, no difference was observed between the groups 3 and 4 and between the groups 1 and 2 (p>0,05). Similar results were observed with the QL method. These results suggest that the enzyme xanthine oxidase is one of the most important pathways involved in the generation of the EAbs, chemical reactive elements with injury potential at the levei of the hepatocyte membranes in the ischemia-reperfusion syndrome. At last, the results showed that allopurinol had beneficiai effects on hepatic function and lipid peroxidation and protective effects against hepatic ischemia-reperfusion injury. The histopathologic findings can be explained by the fact that the changes induced by this mechanism occur in organelles and biomembranes which are not visualized by light microscopy.

Neste estudo, foram analisados os efeitos da anoxia ambiental (8 h) e de diferentes períodos de reoxigenação (20 e 40 min.) sobre o balanço oxidativo nas brânquias do caranguejo Chasmagnathus granulata. A exposição à anoxia causou no tecido branquial um aumento na atividade das enzimas CAT e GST, e uma diminuição na atividade da SOD. As enzimas estudadas tendem a retornar aos níveis de controle durante a recuperação. A atividade destas enzimas parecem responder diretamente às variações na concentração do oxigênio ambiental. As BP apresentaram uma maior atividade das enzimas antioxidantes do que as BA. Nos tecidos analisados, as defesas antioxidantes não-enzimáticas (TRAP) não apresentaram nenhuma alteração a exposição a anoxia. Contudo, durante a recuperação observou-se um aumento no TRAP em ambos os tecidos. A exposição a anoxia não causou nenhuma alteração na lipoperoxidação (DC e TBA-RS), nos tecidos analisados. Entretanto, durante a recuperação observou-se uma diminuição nos níveis de DC, seguido de um aumento nos níveis de TBA-RS. Os resultados deste estudo, demonstram que o C. granulata ,assim como, outras espécies intertidais apresenta adaptações em seus sistemas de defesa antioxidantes, que o capacitam a ocupar e a manter-se em ambientes com extremas variações das características físico-químicas, como os estuários.

Os metais presentes no material particulado lançado pelas emissões veiculares, quando em grandes concentrações podem apresentar toxicidade aos organismos vegetais e animais. Metais de transição, são na maioria das vezes indutores da formação de radicais livres nos sistemas biológicos, causando uma consequente peroxidação de moléculas orgânicas. A peroxidação de lipídios é uma evidência da injúria causada por radicais livres. Os objetivos deste trabalho são verificar o impacto ambiental causado por tráfego automotivo com caracterização da concentração de metais tóxicos em diferentes compartimentos ambientais em áreas próximas a estradas e a sua correlação com a formação de lipoperóxidos na citada espécie. Foram capturados indivíduos de Ctenomys minutus (em três locais e nas quatro estações do ano) com auxílio de armadilha do tipo Oneida-Victor n° zero e anestesiados com Zoletil. De cada animal foi retirado 1 a 2 ml de sangue de cada animal para quantificação de subprodutos da lipoperoxidação Em cada ponto de amostragem foram retiradas alíquotas de pêlos e pelotas fecais do animal, de vegetação da qual o animal se alimenta e de solo para formação de amostras compostas representativas do ponto de coleta. Foi dosada a concentração de Cd, Ni, Pb e Zn via atomização eletrotérmica em Forno de Grafite ou via atomização em Espectrofotômetro de Chama. Em relação aos aspectos ambientais, o estudo possibilitou a avaliação do grau de contaminação de metais tóxicos em compartimentos do ambiente em estudo, assim como a avaliação de alguns efeitos biológicos causados pelas emissões veiculares em Ctenomys minutus.

A utilização de fatores hepatotróficos (FH) tem trazido importantes avanços no tratamento de algumas doenças hepáticas. A avaliação dos efeitos dessas substâncias pode ser feita com o uso de modelos in vivo, como a regeneração hepática após a hepatectomia parcial ou in vitro, como a cultura de hepatócitos, células estreladas ou outros tipos celulares do fígado. O modelo de cultura demonstra ser útil por possibilitar a análise individualizada de determinadas substâncias ou soluções diretamente nas células-alvo, facilitando o delineamento de seu mecanismo de ação. Dessa forma, o presente trabalho estudou in vitro os efeitos da administração de fatores hepatotróficos (FH) em hepatócitos isolados de fígados de ratos, avaliando seu metabolismo e proliferação celular. Trinta ratos Wistar fêmeas foram utilizados, o fígado retirado e, por digestão enzimática in situ, suas células foram dissociadas e os hepatócitos separados em gradiente de Percoll 45%; cultivados em meio DMEM/F12, tratadas com diferentes concentrações dos FH (1X, 5X e 10X) e analisadas em intervalos de 24, 48 e 72 horas. A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas pelo método colorimétrico MTT, a toxicidade pelo iodeto de propídeo, o potencial elétrico da membrana mitocondrial pela Rodamina 123 e a expressão da citoqueratina 8, 18 e desmina como marcadores do citoesqueleto. O metabolismo hepático foi avaliado pela depuração do verde de indocianina (VIC), pela quantificação de colágeno tipo I e pela formação de radicais lipídicos poliinsaturados peroxidados. A técnica utilizada para a obtenção de hepatócitos mostrou-se eficaz com viabilidade superior a 90%, sem apresentar toxicidade, com manutenção do potencial mitocondrial e com marcação positiva para citoqueratinas 8, 18 e desmina. A adição dos FH aumentou a proliferação dos hepatócitos nos três períodos analisados em relação ao grupo controle. Os FH não demonstraram toxicidade em cultura primária de hepatócitos em nenhuma das concentrações avaliadas ao longo de todos os períodos experimentais. A adição dos FH na concentração de 10X evitou a formação de radicais livres, protegendo os hepatócitos da lipoperoxidação. Por outro lado, a avaliação funcional das culturas primárias pelo teste VIC mostrou-se eficaz na determinação do metabolismo dos hepatócitos, como a manutenção dos níveis das transaminases e amilase. Os hepatócitos mantidos em cultura primária após a adição dos FH em todos os períodos analisados aumentaram a produção de colágeno, e também foram capazes de modificar a distribuição da população de células nas fases quiescentes, aumentando sua capacidade de síntese. A adição dos FH nas concentrações estudadas nas culturas de hepatócitos mostrou-se eficaz na manutenção dessas células, mantendo-se funcionalmente ativos, com a expressão dos marcadores de seu metabolismo e diferenciação. / The use of hepatrotophic hic factors (HF) has provided important advances in the treatment of several hepatic disorders. The evaluation of this treatment may be carried out by in vivo models, as experiments on hepatic regeneration after partial hepatectomy; or in vitro models as culture of hepatocytes, stellate cells or any other hepatic cell. This last model allows an individual analysis of the studied substances on their target cells, providing the possibility of further investigation on the mechanisms involved. Therefore, the present study evaluated the in vitro effects of the hepatotrophic factors administration on the metabolism and proliferation of cultured hepatocytes from normal rat liver. Liver from 30 Wistar rats were used, and after in situ enzimatic dissociation, hepatocytes were collected and separated by 45% Percoll density gradient, cultivated in DMEN/F12 media supplemented with different HF concentrations (1×, 5× and 10×) and finally analyzed at 24, 48 and 72hs intervals. Cell viability and proliferation were assessed by MTT colorimetric assay, cell toxicity by propidium iodide, mitochondrial membrane electrical potential by 123 rodamine test and cytokeratin 8, 18 and desmin as cytoskeleton markers. Hepatic metabolism was evaluated by infusion of indocianine green (ICG), by type I collagen quantification and by peroxided polyunsaturated lipid radicals production. The techniques used in order to collect hepatocytes proved to be efficient, with a viability higher than 90%, no toxicity, and the maintenance of the mitochondrial membrane potential and positive labeling for cytokeratins (CK) 8, 18 and desmin. The HF addition increased the proliferation of hepatocytes in the three periods analyzed, when compared to the control group. The HF did not show any toxicity in primary hepatocytes culture regardless of the concentration evaluated along the experimental periods. The HF addition impaired the production of free radicals, protecting the hepatocytes from the lipid peroxidation. On the other hand, the functional evaluation of primary hepatocytes cultures using the ICG test proved to be efficient in the determination of the hepatocytes metabolism, as the maintenance of the transaminase and amylase levels. The hepatocytes kept in primary culture after HF addition in all the analyzed periods increased the collagen production and were also able to shift the distribution of quiescent cells population of, thus increasing their synthesis capacity. The HF addition in the studied concentrations in hepatocytes cultures proved to be efficient in the maintenance of these cells, that remain functionally active and expressing their metabolism and differentiation characteristic markers.

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Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

Os compostos carbonílicos no estado triplete (CCT) são considerados espécies reativas de oxigênio uma vez que possuem comportamento químico semelhante ao de radicais alcoxil. Quando formadas em sistemas biológicos, estas espécies podem estar envolvidas tanto em processos benéficos quanto deletérios ao organismo, como é o caso da lipoperoxidação, onde CCT não só são gerados como também iniciam ou amplificam o processo. Visando estudar a capacidade de dienos conjugados de suprimir a energia triplete de tais compostos, de forma a diminuir seus efeitos deletérios, determinou-se as constantes de supressão, para quatro diferentes dienos, de acetona triplete gerada pela da termólise do tetrametil-1 ,2- dioxetano e pelo sistema enzimático isobutanal/ \"horseradish peroxidase\"/O2 Todos os dienos apresentaram constantes de supressão de ordem difusional. Foi analisada também a forma pela qual os dienos suprimem a acetona triplete e concluiu-se que tanto dienos com hidrogênios alílicos (2,4-hexadienoato e seu éster etílico), potencialmente abstraíveis, quanto dienos sem estes hidrogênios (2 ,4-pentadienoato e seu éster metílico), suprimem a acetona por um processo físico de transferência de energia, que leva à sua fotoisomerização cis,trans. A reatividade destes dienos frente a espécies reativas de oxigênio comumente formadas em sistemas de lipoperoxidação, como o oxigênio singlete, radicais hidroxil, peroxil e superóxido, foi também testada, mostrando que nenhum dos dienos apresenta atividade sequestradora destas espécies. Experimentos preliminares de lipoperoxidação em sistemas biomiméticos (mitocôndrias e microssomos isolados de fígado de rato), mostraram que o trans, trans-2,4-hexadienoato de etila é capaz de inibir o inchamento mitocondrial induzido por benzofenona triplete e de suprimir a quimiluminescência de microssomos induzida por Fe2+/ ascorbato. Concluiu-se assim que dienos conjugados, contendo ou não hidrogênios alílicos, podem ser usados como supressores específicos de compostos carbonílicos triplete em sistemas biológicos e contribuir para o esclarecimento dos mecanismos de reação destes processos. / Triplet carbonyls can be named reactive oxygen species once they behave chemically as alkyloxyl radicals and therefore can potentially drive beneficial and deleterious processes in biological systems. In the case of lipid peroxidation, these species have been found not only to be reaction products but also to amplify the radical chain by hydrogen abstraction of polyunsatured lipid molecules. With the aim of finding efficient and reliable chemical probes for triplet carbonyls, we studied here the quenching properties of conjugated dienes, namely 2,4-hexadienoate and 2,4- pentadienoate anions and corresponding alkyl esters, upon triplet acetone generated either chemically (thermolysis of tetramethyl-1 ,2-dioxetane) or enzymically (aerobic oxidation of isobutanal/horseradish peroxidase). As expected, the quenching rate constants were found to be diffusion controlled, although those for the pentadienoate derivatives were 3-fold lower than those measured for the hexadienoates. Therefore, independently of the presence of allylic hydrogens in the diene probe, the triplet acetone quenching occurred by a physical process followed by cis,trans-isomerization, without hydrogen abstraction from the quencher. The reactivity of the studied dienes towards oxygen reactive species known to be formed during lipid peroxidation, such as singlet oxygen, and peroxyl, hydroxyl and superoxide radicals, was also investigated to assure they would not interfere with the radical lipoperoxidation chain. Indeed, none of the dienes showed antioxidant activity on classical model systems. Preliminary experiments with model systems widely used to study lipid peroxidation showed that the trans, trans-ethyl sorbate can inhibit the mitochondrial swelling induced by enzymically formed triplet benzophenone and to quench the chemiluminescence of microsome preparations challenged with iron/ascorbate. This is in agreement with reported work showing that the lipid peroxidation chain associated with mitochondria permeabilization and polyunsaturated fatty acid peroxidation is amplified by intermediate triplet carbonyl products. Altogether our data indicate that conjugated dienes can be used as specific quenchers of triplet carbonyls formed in biological systems without reacting with other reactive intermediates.

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Este trabalho centrou-se no desenvolvimento tecnológico e na caracterização de nanopartículas poliméricas (nanocápsulas ou nanoesferas) contendo melatonina, empregando diferentes composições, métodos de preparação e concentrações de melatonina. De uma maneira geral, as diferentes suspensões nanoparticuladas foram caracterizadas segundo a determinação dos teores totais de melatonina, a determinação das taxas de associação da melatonina aos nanocarreadores, a análise morfológica, a determinação dos diâmetros médios de partículas e polidispersões, além da determinação dos valores de potenciais zeta. As suspensões de nanocápsulas ou de nanoesferas foram preparadas pelos métodos de deposição interfacial ou de nanoprecipitação, respectivamente. Foram avaliadas as influências do tipo de polímero [Eudragit® S100, Eudragit® RS100, poli(ε-caprolactona) ou poli(lactideo)], de óleo (triglicerídeos dos ácidos cáprico e caprílico, óleo mineral ou Eutanol G®) e de tensoativos (polissorbato 80, poloxamer 188, monooleato de sorbitano, monoestearato de sorbitano ou lecitina) sobre as características físico-químicas das suspensões. Os resultados demonstraram que as nanopartículas apresentaram diâmetros inferiores a 350 nm, encapsulação parcial da melatonina e morfologia esférica. As suspensões de nanoesferas apresentaram eficiências de encapsulação similares, mas diâmetros inferiores às respectivas nanocápsulas. O tipo de polímero empregado influenciou nas taxas de associação da melatonina. De acordo com a maior eficiência de encapsulação (56 %), nanocápsulas preparadas com Eudragit S100® foram selecionadas para secagem por aspersão, empregando dióxido de silício coloidal (3 % m/V). As micropartículas nanorrevestidas obtidas apresentaram eficiência de encapsulação de 93 % e foram capazes de controlar a velocidade de liberação da melatonina, comparativamente ao fármaco puro. O estudo de estabilidade das suspensões de nanocápsulas, comparativamente à nanoemulsão e à nanodispersão dos tensoativos, mostrou que a composição dos sistemas e as condições de armazenamento influenciaram a estabilidade físico-química das formulações. Um delineamento fatorial 23 foi também realizado objetivando-se a comparação das características físicoquímicas de nanocápsulas de Eudragit RS100® contendo melatonina obtidas através de deposição interfacial ou de emulsificação-difusão. As taxas de associação da melatonina não foram influenciadas pela composição das formulações e nem pelo método de preparação empregado. Por outro lado, os diâmetros, as polidispersões, os potenciais zeta, os valores de pH e a estabilidade físico-química foram influenciados pelo método de preparação e/ou pela composição dos sistemas. As propriedades antioxidantes da melatonina associada a nanopartículas foram também avaliadas. Desta forma, experimentos in vitro de lipoperoxidação de microssomas hepáticos e de lipossomas de fosfatidilcolina, induzida pelo radical ascorbil, foram realizados. Nanocápsulas ou nanoesferas preparadas com Eudragit S100® foram selecionadas para o estudo, com base na maior eficiência de associação do fármaco. Nanoemulsão também foi testada para verificar a influência da presença do polímero. A presença da melatonina foi capaz de proteger os lipídios em comparação aos controles, com influência da formulação, da dose de melatonina e do modelo de membrana empregado. Apenas os nanocarreadores poliméricos (nanocápsulas ou nanoesferas revestidas com polissorbato 80) contendo melatonina foram capazes de aumentar significativamente a atividade antioxidante deste fármaco nos dois modelos de membrana empregados. Finalmente, nanocápsulas de Eudragit S100® revestidas com polissorbato 80 foram administradas, intraperitonealmente em camundongos sadios, e os efeitos antioxidantes agudos da melatonina in vivo foram avaliados no cérebro (córtex frontal e hipocampo) e no fígado. Os resultados demonstraram que as nanocápsulas contendo melatonina foram capazes de reduzir significativamente a lipoperoxidação no córtex, no hipocampo e no fígado, ao passo que a solução do fármaco não exerceu efeito significativo. O conjunto dos resultados demonstrou a viabilidade tecnológica da preparação de sistemas poliméricos nanoparticulados e microparticulados contendo melatonina, na forma de suspensão ou de pós, com potencial aplicação tanto no aumento da atividade antioxidante quanto no controle da liberação deste fármaco. / This work has been based on the development and characterization of the melatoninloaded polymeric nanoparticles (nanocapsules or nanospheres) employing different system compositions, methods of preparation and melatonin concentrations. In general, the different nanoparticle suspensions were characterized in terms of melatonin content and its association within the particles, morphology, mean size and polydispersity of the particles, as well as the zeta potentials. The nanocapsule or nanosphere suspensions were prepared by interfacial deposition or nanoprecipitation methods, respectively. The influences of the type of the polymer [Eudragit® S100, Eudragit® RS100, poly(ε-caprolactone) or poly(lactide)], of the oil nature (caprylic/capric triglyceride, mineral oil or Eutanol G®) and of the type of surfactants (polysorbate 80, poloxamer 188, sorbitan monooleate, sorbitan monostearate or lecithin) on the physicochemical characteristics of suspensions were evaluated. The results demonstrated that the nanoparticles presented mean size lower than 350 nm, partial encapsulation of melatonin and they were spherically shape. The nanosphere suspensions presented similar encapsulation efficiencies to nanocapsules, however, the former presented a lower mean size of particles. The type of polymer used in the formulations influenced the encapsulation efficiencies. The nanocapsules prepared with Eudragit S100® were selected to be spray-dried, using colloidal silicon dioxide (3 % w/v), due to the highest encapsulation efficiency (56 %). The nanoparticle-coated microparticles presented the encapsulation efficiency of 93 % and they controlled the release rate of melatonin when compared to the pure drug. The physicochemical stability evaluation of the melatonin-loaded nanocapsule suspensions compared to the nanoemulsion or the nanodispersion of surfactants showed that the composition of the melatonin-loaded system and the storage conditions influenced the physicochemical stability of the formulations. Melatonin-loaded Eudragit RS100®-nanocapsule suspensions prepared by interfacial deposition or by emulsification-diffusion techniques were also compared in terms of physicochemical characteristics using a 23 fatorial-design. The formulation composition or the preparation methods did not influence the encapsulation efficiencies. However, the mean size, polydispersity, zeta potential, pH and physicochemical stability were influenced by the formulation composition and/or by the preparation methods. The antioxidant properties of the melatonin-loaded nanoparticle suspensions were also evaluated. Hence, phosphatidylcoline liposomes or liver microsomes were used as model of the lipid membrane and in vitro lipid peroxidation was induced by free radical ascorbyl. The melatonin-loaded Eudragit S100® nanoparticles (nanocapsules and nanospheres) were selected to this study based on the highest encapsulation efficiencies. The nanoemulsion was also evaluated for studying the influence of the presence of the polymer The results demonstrated that the lipids were protected against peroxidation due to the presence of the melatonin, and this effect depended on the type of formulation, drug concentration and on the type of the membrane model. Only the melatonin-loaded polymeric nanocarriers (polysorbate 80-coated nanocapsules or nanospheres) were able to improve the antioxidant action of melatonin in both membrane model. Finally, the in vivo acute antioxidant capacities of melatonin-loaded polysorbate 80-coated Eudragit S100® nanocapsules in the brain (frontal cortex and hippocampus) and in the liver were compared to the effect of the drug solution, after 1 h of intraperitoneal administration in mice. It was verified that the melatonin-loaded nanocapsules significantly decreased the lipid peroxidation in the cortex, in the hippocampus and in the liver. On the other hand, the melatonin solution did not significantly decrease the lipid peroxidation. Briefly, the results demonstrated the technological viability of the preparation of melatonin-loaded polymeric nanoparticulated and microparticulated systems in the form of suspension or powder. These polymeric particulated systems presented potential applications in both to improve the antioxidant activity and to control the release profile of melatonin.