Neste estudo foram realizados inicialmente, experimentos para avaliar a ação sinérgica do peptídeo antimicrobiano P34 com sobrenadantes de culturas de algumas bactérias lácticas selecionadas e isoladas de queijo Minas Frescal. Foi investigada a influência deste peptídeo na expressão de genes em L. monocytogenes e L. seeligeri, sua citotoxicidade em diferentes células eucarióticas e toxicidade “in vivo”. Também foram realizados alguns testes para avaliar a citotoxicidade do peptídeo antimicrobiano P40. A adição do peptídeo P34 no queijo provocou uma diminuição de até 3 ciclos logarítmicos na contagem de células viáveis de L. monocytogenes inoculada artificialmente. Um aumento significativo na expressão dos genes dltA, Imo 1695 e mptA de L. monocytogenes foi observado após 96 h com a presença do peptídeo P34 no queijo. A influência do peptídeo P34 na expressão de genes associados aos componentes do envelope celular de L. monocytogenes e L. seeligeri, promoveu um aumento não significativo nos níveis de transcrição de genes dltA, Imo1695 e mptA observados em L. monocytogenes após inoculação em placas e incubação por 24 h a 37°C ou 240 h a 4°C. Em L. seeligeri uma diminuição significativa na expressão do gene dltA foi observada. Os genes Imo1695 e mptA demonstraram uma diminuição significativa de sua expressão (2000 e 31872 vezes, respectivamente) na presença do peptídeo P34 e incubação por 24 h a 37°C. A inoculação da placa com o peptídeo P34 e incubação por 240 h a 4ºC não promoveu diminuição significativa da expressão do gene mptA. A citotoxicidade dos peptídeos P34 e P40 foi avaliada em células VERO, tratadas com diferentes concentrações (0,02 - 2,5 μg ml-1). Nos ensaios de MTT, NRU e LDH as EC50 para o peptídeo P34 foram 0.60, 1.25, 0.65 μg ml-1 e do peptídeo P40 foram 0,30, 0,51 e 0,57 μg ml-1, respectivamente. A atividade hemolítica em eritrócitos humanos foi de (5,8%) e (19%), respectivamente. Os efeitos sobre a viabilidade, motilidade e exocitose acrossomal de espermatozóides humanos também foram avaliadas para o peptídeo P34. Não houve reações de hipersensibilidade ou aumento significativo de títulos de anticorpos durante os experimentos imunogenicidade ou morte dos animais durante experimentos de toxicidade aguda ou subcrônica. A DL50 foi superior a 332,3 ± 0,76 mg/kg. Não foram observadas alterações significativas nos parâmetros bioquímicos séricos nos animais tratados com o peptídeo P34. Não foram detectados sinais de possível toxicidade nos animais do grupo tratado com 0,825 mg/ kg/dia do peptídeo P34. Neste grupo apenas alterações histológicas no baço com a presença de megacariócitos foram observadas. A partir destes resultados evidencia-se o potencial do peptídeo P34 para ser utilizado como bioconservante em alimentos. / In this study initial experiments were performed to evaluate synergistic action of the antimicrobial peptide P34 and culture supernatants of some selected lactic acid bacteria isolated from Minas Frescal cheese. The influence of this peptide in the expression of genes in L. monocytogenes and L. seeligeri, their cytotoxicity in differents eukaryotic cells and “in vivo” toxicity was investigated. Also, some tests were carried out o evaluate the cytotoxicity of the antimicrobial peptide P40. The peptide P34 caused a decrease of up to 3 log cycles in viable counts of L. monocytogenes artificially inoculated in cheese. A significant increase in expression of genes dltA, Imo1695 mptA of L. monocytogenes was observed after 96 h incubation of the peptide P34 in cheese. The influence of peptide P34 on the expression of genes associated to components of cell envelope of L. monocytogenes and L. seeligeri, promoted a non significant increase in the levels of transcription of genes dltA, Imo1695 and mptA were observed after incubation of L. monocytogenes for 24 hs at 37°C and 240 hs at 4°C in plates. In L. seeligeri a significant decrease was observed in gene expression dltA. The gene Imo1695 showed a significant decrease in its expression (2000-fold) after inoculation with the peptide P34. A significant decrease of expression was also observed for the gene mptA (31872 - times) after inoculation with the peptide P34 and incubation for 24 hours at 37°C. The inoculation of the plate with the P34 peptide and incubated for 240 hrs at 4°C, showed a non-significant decrease of gene expression. The cytotoxicity of the peptide P34 and P40 was assessed in VERO cells treated with different concentrations (0.02 - 2.5 μg ml- 1). In MTT, NRU and LDH assays the EC50 to the peptide P34 were 0.60, 1.25, 0.65 μg ml-1 and the peptide P40 were 0.30, 0.51 and 0.57 μg ml-1, respectively. The hemolytical activity on human erythrocytes was of (5.8%) and (19%), respectively. The effects on viability, motility and acrosomal exocytosis of humam sperm were also evaluated for peptideP34. There were no hypersensitivity reactions or significant increase in antibody titer during the immunogenicity experiment or death of animals during the acute or subchronic toxicity tests. The LD50 was more the 332.3 ± 0.76 mg/kg. No significant changes in the serum biochemical parameters were observed in the animals treated with the peptide P34. Signs of possible toxicity were no detected in animals in the group treated with 0.825 mg/kg day of peptide P34. In this group only histological changes in the spleen with the presence of megakaryocytes were observed. From these results show the potential o peptide P34 to be used in future as biopreservative in foods.

Caracterização molecular e susceptibilidade antimicrobiana de linhagens de Listeria monocytogenes isoladas de alimentos no RS Mestranda: Fernanda De Nes Orientador: Jeverson Frazzon Listeria monocytogenes é o microrganismo causador de listeriose, uma doença infecciosa adquirida através do consumo de alimentos contaminados e que afeta principalmente pessoas com o sistema imunológico comprometido como gestantes e recém nascidos. É um microrganismo ambiental, podendo ser encontrado no solo, água e alimentos como vegetais, produtos cárneos, leites crus ou mal pasteurizados, queijos, entre outros. São bactérias invasivas e possuem facilidade para penetrar na célula hospedeira. O ataque a essas células é intermediado pelas internalinas, que são proteínas associadas a genes de virulência. As internalinas InlA e InlB, codificadas pelo gene inlAB, são proteínas associadas com a invasão e internalização da bactéria na célula hospedeira. Este trabalho teve o objetivo de caracterizar um total de 19 linhagens de Listeria monocytogenes, sorovares 1/2b, 1/2a, 4b, 4c, isoladas de produtos lácteos do Rio Grande do Sul. Para a caracterização molecular foram utilizadas as técnicas moleculares de Amplificação Randômica do DNA Polimórfico (RAPD) e Análise por Enzimas de Restrição (PCRREA), com a amplificação de um segmento de 2916 pb que incluem partes dos genes inlA e inlB, utilizando para isso duas enzimas de restrição AluI e EcoRI. As técnicas moleculares utilizadas foram ferramentas úteis para caracterizar as linhagens de Listeria monocytogenes isoladas de produtos lácteos do Rio Grande do Sul. Ainda, foi observado o perfil de resistência antimicrobiana desses microrganismos frente a vários antimicrobianos, das amostras analisadas todas foram susceptíveis aos antimicrobianos testados. / Listeria monocytogenes is a microorganism which causes listeriosis, an infection disease caused by consuming contaminated food and it mainly affects individuals with the immune system at risk like pregnant women and newborn infants. It is an environmental microorganism, being found in soil, water and food like vegetables, meat products, unpasteurized milk and cheese. They are invasive bacteria which have special facility to penetrate the host cell. The attack to those cells is carried out by internalins, which are proteins associated with virulence genes. The InlA and InlB internalins, codified by inlAB gene, are proteins associated with the invasion and internalization of the bacteria in the host cell. This work aimed at categorizing a total of 19 strains of Listeria monocytogenes, 1/2b, 1/2a, 4b and 4c serovars, isolated from dairy products from the State of Rio Grande do Sul. For the molecular categorization, it was used the molecular techniques of Polymorphic DNA Random Amplification (RAPD) and Restriction Enzymatic Analysis (PCR-REA), with the amplification of a segment of 2916 pb which includes part of inlA and inlB genes, using for that purpose two restriction enzymes, AluI and EcoRI. The molecular techniques applied were useful tools to categorize strains of L. monocytogenes isolated from dairy products of the State of Rio Grande do Sul. Furthermore, it was observed the antimicrobial resistant profile of those microorganisms in front of various antimicrobials. All of the analyzed samples were susceptible to tested antimicrobials.

L'industrie alimentaire cherche constamment à améliorer les processus de conservation des aliments. La biopréservation s’impose comme une alternative à l’utilisation de conservateurs dits «chimiques» et fait appel à des micro-organismes sélectionnés en tant que cultures protectrices pour leurs propriétés antimicrobiennes naturels. L'objectif de cette étude était de tirer profit de la diversité de Carnobacterium maltaromaticum afin d’identifier des souches capables d'inhiber la croissance du pathogène alimentaire Listeria monocytogenes. Pour cela, une méthode de typage moléculaire permettant la reconnaissance fine de souches a été établie, puis une méthode de criblage d’activités antibactériennes à robustesse élevée a été mise au point. La méthode de typage moléculaire est une méthode MLVA (Multiple-locus variable-number tandem repeat (VNTR) analysis) avec 3 loci de VNTR (VNTR-A, VNTR-B, VNTR-C) permet de discriminer 15 génotypes différents au sein d’une collection de 24 souches. Cela confirme la grande diversité génotypique et phénotypique présente au sein de la population de C. maltaromaticum et la performance de la méthode. La méthode de criblage est basée sur la réalisation d’essais de compétition à haut débit où chaque membre d’une collection de C. maltaromaticum a été co-cultivé avec une souche bioluminescente de L. monocytogenes. Il a été montré que la production de luminescence est le reflet de la croissance de L. monocytogenes en micro-culture et qu’il est ainsi possible de tester la stabilité du pouvoir antagoniste de chaque membre de la collection dans de multiples conditions de cultures différentes. Cette méthode a ainsi permis d’identifier des souches de C. maltaromaticum dont la propriété anti-L. monocytogenes est peu influencée par les conditions de cultures. Outre l’intérêt fondamental que présente cette méthode pour l’étude des interactions compétitives dans l’aliment, elle a permis d’identifier des souches présentant un fort potentiel de valorisation dans le domaine de la biopréservation alimentaire / The food industry is constantly seeking to improve food preservation processes. Biopreservation imposes itself as an alternative to the use of chemical preservatives and involves micro-organisms selected as protective cultures for their natural antimicrobial properties. The aim of this study was to benefit from the diversity of Carnobacterium maltaromaticum in order to identify strains capable of inhibiting the growth of Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. For this purpose, a molecular typing method that enables fine strain identification has been established, then a method of screening of antibacterial activities with high robustness has been developed. The molecular typing method is a MLVA (Multiple-locus variable-number tandem repeat (VNTR) analysis) with 3 VNTR loci (VNTR-A, VNTR-B, VNTR-C). It allowed to discriminate 15 different genotypes among a collection of 24 C. maltaromaticum strains. These results confirmed the high strain diversity within this species and showed the high performance of this method. The screening method is based on high throughput competition assays where each member of a collection of C. maltaromaticum strains was co-cultivated with a bioluminescent strain of L. monocytogenes. It was established that the bioluminescence of this strains is highly correlated to bacterial growth in micro-cultures, indicating that it is possible to investigate the stability of antagonistic properties of each collection member under multiple different culture conditions. The use of this method allowed to identify C. maltaromaticum strains with bioprotection properties that are poorly influenced by culture conditions. Besides the fundamental interest of this method for investigations of competitive interactions in food, it allowed to identify strains with high potential for bioprotection applications

Neste estudo foram realizados inicialmente, experimentos para avaliar a ação sinérgica do peptídeo antimicrobiano P34 com sobrenadantes de culturas de algumas bactérias lácticas selecionadas e isoladas de queijo Minas Frescal. Foi investigada a influência deste peptídeo na expressão de genes em L. monocytogenes e L. seeligeri, sua citotoxicidade em diferentes células eucarióticas e toxicidade “in vivo”. Também foram realizados alguns testes para avaliar a citotoxicidade do peptídeo antimicrobiano P40. A adição do peptídeo P34 no queijo provocou uma diminuição de até 3 ciclos logarítmicos na contagem de células viáveis de L. monocytogenes inoculada artificialmente. Um aumento significativo na expressão dos genes dltA, Imo 1695 e mptA de L. monocytogenes foi observado após 96 h com a presença do peptídeo P34 no queijo. A influência do peptídeo P34 na expressão de genes associados aos componentes do envelope celular de L. monocytogenes e L. seeligeri, promoveu um aumento não significativo nos níveis de transcrição de genes dltA, Imo1695 e mptA observados em L. monocytogenes após inoculação em placas e incubação por 24 h a 37°C ou 240 h a 4°C. Em L. seeligeri uma diminuição significativa na expressão do gene dltA foi observada. Os genes Imo1695 e mptA demonstraram uma diminuição significativa de sua expressão (2000 e 31872 vezes, respectivamente) na presença do peptídeo P34 e incubação por 24 h a 37°C. A inoculação da placa com o peptídeo P34 e incubação por 240 h a 4ºC não promoveu diminuição significativa da expressão do gene mptA. A citotoxicidade dos peptídeos P34 e P40 foi avaliada em células VERO, tratadas com diferentes concentrações (0,02 - 2,5 μg ml-1). Nos ensaios de MTT, NRU e LDH as EC50 para o peptídeo P34 foram 0.60, 1.25, 0.65 μg ml-1 e do peptídeo P40 foram 0,30, 0,51 e 0,57 μg ml-1, respectivamente. A atividade hemolítica em eritrócitos humanos foi de (5,8%) e (19%), respectivamente. Os efeitos sobre a viabilidade, motilidade e exocitose acrossomal de espermatozóides humanos também foram avaliadas para o peptídeo P34. Não houve reações de hipersensibilidade ou aumento significativo de títulos de anticorpos durante os experimentos imunogenicidade ou morte dos animais durante experimentos de toxicidade aguda ou subcrônica. A DL50 foi superior a 332,3 ± 0,76 mg/kg. Não foram observadas alterações significativas nos parâmetros bioquímicos séricos nos animais tratados com o peptídeo P34. Não foram detectados sinais de possível toxicidade nos animais do grupo tratado com 0,825 mg/ kg/dia do peptídeo P34. Neste grupo apenas alterações histológicas no baço com a presença de megacariócitos foram observadas. A partir destes resultados evidencia-se o potencial do peptídeo P34 para ser utilizado como bioconservante em alimentos. / In this study initial experiments were performed to evaluate synergistic action of the antimicrobial peptide P34 and culture supernatants of some selected lactic acid bacteria isolated from Minas Frescal cheese. The influence of this peptide in the expression of genes in L. monocytogenes and L. seeligeri, their cytotoxicity in differents eukaryotic cells and “in vivo” toxicity was investigated. Also, some tests were carried out o evaluate the cytotoxicity of the antimicrobial peptide P40. The peptide P34 caused a decrease of up to 3 log cycles in viable counts of L. monocytogenes artificially inoculated in cheese. A significant increase in expression of genes dltA, Imo1695 mptA of L. monocytogenes was observed after 96 h incubation of the peptide P34 in cheese. The influence of peptide P34 on the expression of genes associated to components of cell envelope of L. monocytogenes and L. seeligeri, promoted a non significant increase in the levels of transcription of genes dltA, Imo1695 and mptA were observed after incubation of L. monocytogenes for 24 hs at 37°C and 240 hs at 4°C in plates. In L. seeligeri a significant decrease was observed in gene expression dltA. The gene Imo1695 showed a significant decrease in its expression (2000-fold) after inoculation with the peptide P34. A significant decrease of expression was also observed for the gene mptA (31872 - times) after inoculation with the peptide P34 and incubation for 24 hours at 37°C. The inoculation of the plate with the P34 peptide and incubated for 240 hrs at 4°C, showed a non-significant decrease of gene expression. The cytotoxicity of the peptide P34 and P40 was assessed in VERO cells treated with different concentrations (0.02 - 2.5 μg ml- 1). In MTT, NRU and LDH assays the EC50 to the peptide P34 were 0.60, 1.25, 0.65 μg ml-1 and the peptide P40 were 0.30, 0.51 and 0.57 μg ml-1, respectively. The hemolytical activity on human erythrocytes was of (5.8%) and (19%), respectively. The effects on viability, motility and acrosomal exocytosis of humam sperm were also evaluated for peptideP34. There were no hypersensitivity reactions or significant increase in antibody titer during the immunogenicity experiment or death of animals during the acute or subchronic toxicity tests. The LD50 was more the 332.3 ± 0.76 mg/kg. No significant changes in the serum biochemical parameters were observed in the animals treated with the peptide P34. Signs of possible toxicity were no detected in animals in the group treated with 0.825 mg/kg day of peptide P34. In this group only histological changes in the spleen with the presence of megakaryocytes were observed. From these results show the potential o peptide P34 to be used in future as biopreservative in foods.

Caracterização molecular e susceptibilidade antimicrobiana de linhagens de Listeria monocytogenes isoladas de alimentos no RS Mestranda: Fernanda De Nes Orientador: Jeverson Frazzon Listeria monocytogenes é o microrganismo causador de listeriose, uma doença infecciosa adquirida através do consumo de alimentos contaminados e que afeta principalmente pessoas com o sistema imunológico comprometido como gestantes e recém nascidos. É um microrganismo ambiental, podendo ser encontrado no solo, água e alimentos como vegetais, produtos cárneos, leites crus ou mal pasteurizados, queijos, entre outros. São bactérias invasivas e possuem facilidade para penetrar na célula hospedeira. O ataque a essas células é intermediado pelas internalinas, que são proteínas associadas a genes de virulência. As internalinas InlA e InlB, codificadas pelo gene inlAB, são proteínas associadas com a invasão e internalização da bactéria na célula hospedeira. Este trabalho teve o objetivo de caracterizar um total de 19 linhagens de Listeria monocytogenes, sorovares 1/2b, 1/2a, 4b, 4c, isoladas de produtos lácteos do Rio Grande do Sul. Para a caracterização molecular foram utilizadas as técnicas moleculares de Amplificação Randômica do DNA Polimórfico (RAPD) e Análise por Enzimas de Restrição (PCRREA), com a amplificação de um segmento de 2916 pb que incluem partes dos genes inlA e inlB, utilizando para isso duas enzimas de restrição AluI e EcoRI. As técnicas moleculares utilizadas foram ferramentas úteis para caracterizar as linhagens de Listeria monocytogenes isoladas de produtos lácteos do Rio Grande do Sul. Ainda, foi observado o perfil de resistência antimicrobiana desses microrganismos frente a vários antimicrobianos, das amostras analisadas todas foram susceptíveis aos antimicrobianos testados. / Listeria monocytogenes is a microorganism which causes listeriosis, an infection disease caused by consuming contaminated food and it mainly affects individuals with the immune system at risk like pregnant women and newborn infants. It is an environmental microorganism, being found in soil, water and food like vegetables, meat products, unpasteurized milk and cheese. They are invasive bacteria which have special facility to penetrate the host cell. The attack to those cells is carried out by internalins, which are proteins associated with virulence genes. The InlA and InlB internalins, codified by inlAB gene, are proteins associated with the invasion and internalization of the bacteria in the host cell. This work aimed at categorizing a total of 19 strains of Listeria monocytogenes, 1/2b, 1/2a, 4b and 4c serovars, isolated from dairy products from the State of Rio Grande do Sul. For the molecular categorization, it was used the molecular techniques of Polymorphic DNA Random Amplification (RAPD) and Restriction Enzymatic Analysis (PCR-REA), with the amplification of a segment of 2916 pb which includes part of inlA and inlB genes, using for that purpose two restriction enzymes, AluI and EcoRI. The molecular techniques applied were useful tools to categorize strains of L. monocytogenes isolated from dairy products of the State of Rio Grande do Sul. Furthermore, it was observed the antimicrobial resistant profile of those microorganisms in front of various antimicrobials. All of the analyzed samples were susceptible to tested antimicrobials.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 918537 bytes, checksum: d0cf5c8653a05a7ff7894f8cbefa4a61 (MD5) Previous issue date: 2010-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The Minas frescal cheese is one of the most appreciated dairy products in Brazil. Their chemical characteristics constitute a suitable medium for the growth of spoilage and pathogens microorganisms. This study aims to evaluate the effect of bovicin HC5 and nisin on the growth of both Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus in the Minas frescal cheese. Growth of strains of L. monocytogenes, L. innocua and S. aureus was carried out in tryptic soy broth (TSB) and in whole milk commercially sterilized (UHT) at 37 ºC in the presence of bovicin HC5 and nisin either added individually or in combination. Minas frescal cheese was manufactured and inoculated with an initial population of 104 CFU.g-1 of both L. monocytogenes and S. aureus, 600 AU.mL-1 of both bovicin HC5 and nisin were then added. The increase in the lag phase and the reduction of the specific growth rate of the strains of L. monocytogenes, L. innocua and S. aureus was verified at the concentrations of 10, 20 and 50 AU.mL-1 of bovicin HC5 in TSB broth. Growth was completely inhibited when bovicin HC5 was added at concentrations of 100 and 150 AU.mL-1 and at nisin concentrations above 10 AU.mL-1. L. innocua isolated from Minas cheese was sensitive to low concentrations of both bacteriocins while L. innocua LMA83 had an increase in 10 h in the lag phase when 10 and 20 AU.mL-1 of nisin were added to the TSB broth. In nisin and bovicin HC5 concentrations above 50 AU.mL-1, no growth of such strains was observed. The presence of the bacteriocins at concentrations up to 50 AU.mL-1 increased the lag phase but did not prevent the growth of S. aureus. On the other hand, concentrations of 100 or 150 AU.mL-1 of bovicin HC5 inhibited the bacterial multiplication. The combination of the two bacteriocins bovicin HC5 and nisin in TSB broth inhibited the growth of L. monocytogenes, S. aureus EMBRAPA 4018 and L. innocua at lower concentrations. However when used separately, higher concentrations of each bacteriocin should be applied. In milk, concentrations of bovicin HC5 above 400 AU.mL-1 reduced the number of viable cells of L. monocytogenes Scott A in one log cycle. However, nisin wasbactericidal just when used at 1200 AU.mL-1, being the growth resumed after 3 h of incubation. L. innocua LMA83 was sensitive to all bovicin HC5 concentrations added to milk while no reduction in the number of viable cells was observed after adding nisin. S. aureus ATCC 6538 in milk would still grow in the presence of 400 or 800 AU.mL-1 of bovicin HC5, being the bacteriostatic effect observed at the concentration 1200 AU.mL-1. Bactericidal effect on S. aureus cells was showed by nisin at 1200 AU.mL-1. In Minas frescal cheese, the number of initial viable cells was reduced from 104 CFU.g-1 of L. monocytogenes Scott A to values below 1 CFU.25 g-1 by additions of the bacteriocins combined at the concentration of 600 AU.mL-1 after nine days of storage at 4 ºC. After adding the combined bacteriocins in cheese for 15 days of storage at 4 ºC, bactericidal effect on S. aureus ATCC 6538 was observed. However, growth was resumed after that period. The presence of the combined bacteriocins at 600 AU.mL-1 did not prevent the production of staphylococcal enterotoxin C by S. aureus EMBRAPA 4018 in cheeses stored under 15 ºC. The present results demonstrate that bovicin HC5 and nisin are indeed effective in the control of pathogens assessed in milk and Minas frescal cheese, especially when associated. / O queijo Minas frescal é um dos produtos lácteos mais consumidos no Brasil e suas características químicas tornam-o um meio apropriado para o crescimento de micro-organismos deterioradores e patogênicos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de bovicina HC5 e nisina sobre o crescimento de Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus em queijo Minas frescal. O crescimento de estirpes de L. monocytogenes, L. innocua e S. aureus foi acompanhado em caldo tripticase de soja (TSB) e em leite integral comercialmente esterilizado (UAT), a 37 ºC em presença de bovicina HC5 e nisina adicionadas isoladas ou combinadas. Queijo Minas frescal foi produzido e inoculado com população inicial de 104 UFC.g-1 de L. monocytogenes e S. aureus e adicionado de 600 UA.mL-1 de bovicina HC5 e nisina. Na presença de concentrações de 10, 20 e 50 UA.mL-1 de bovicina HC5 em caldo TSB houve aumento da fase lag e redução da velocidade específica de crescimento das estirpes de L. monocytogenes, L. innocua e S. aureus. O crescimento foi completamente inibido quando bovicina HC5 foi adicionada nas concentrações 100 e 150 UA.mL-1 e em concentrações de nisinaacima de 10 UA.mL-1. L. innocua isolado de queijo Minas foi sensível a baixas concentrações das bacteriocinas enquanto L. innocua LMA83 apresentou um aumento de 10 h na fase lag quando 10 e 20 UA.mL-1 de nisina foram acrescentadas ao caldo TSB. Em concentrações de nisina e bovicina HC5 acima de 50 UA.mL-1, nenhum crescimento de L. innocua foi observado. A presença das bacteriocinas em concentrações de até 50 UA.mL-1 aumentou a fase lag mas, não impediu o crescimento de S. aureus enquanto as concentrações 100 ou 150 UA.mL-1 de bovicina HC5 inibiram a multiplicação bacteriana. A combinação das bacteriocinas bovicina HC5 e nisina em caldo TSB inibiu o crescimento de L. monocytogenes, S. aureus EMBRAPA 4018 e L. innocua em concentrações inferiores do que quando usadas isoladamente. Em leite UAT, concentrações de bovicina HC5 acima de 400 UA.mL-1 reduziram o número de células viáveis de L. monocytogenes Scott A em um ciclo log. Entretanto, nisina foi bactericida apenas quando foi usada na concentração de 1200 UA.mL-1, sendo o crescimento reassumido após 3 h de incubação. L. innocua LMA83 foi sensível a todas as concentrações de bovicina HC5 adicionadas ao leite enquanto nenhuma redução no número de células viáveis foi observada após adição de nisina. S. aureus ATCC 6538 cresceu em leite mesmo na presença de 400 ou 800 UA.mL-1 de bovicina HC5 e efeito bacteriostático foi observado na concentração 1200 UA.mL-1. A concentração 1200 UA.mL-1 de nisina exerceu efeito bactericida sobre células de S. aureus. Em queijo Minas frescal, a adição das bacteriocinas bovicina HC5 e nisina combinadas na concentração 600 UA.g-1 reduziu o número de células viáveis inicial de 104 UFC.g-1 de L. monocytogenes Scott A para valores abaixo de 1 UFC.25 g-1, após nove dias de estocagem a 4 ºC. Efeito bactericida sobre S. aureus ATCC 6538 foi observado nos queijos adicionados das bacteriocinas combinadas durante 15 dias de estocagem a 4 ºC. Entretanto, após esse período, a multiplicação de S. aureus foi retomada. A presença das bacteriocinas combinadas na concentração 600 UA.g-1 não impediu a produção de enterotoxinas estafilocócica C por S. aureus EMBRAPA 4018 em queijos mantidos sob temperatura de 15 ºC de estocagem. Estes resultados demonstraram que bovicina HC5 e nisina foram efetivas no controle dos patógenos avaliados em leite e queijo Minas frescal, em especial quando usadas associadas.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA13MA102.pdf: 258664 bytes, checksum: d3d029859f1ae232cdc1f3a89a0983b3 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / The handmade serrano cheese of Santa Catarina is a typical product made on small farms in the Serrana Region Catarinense. Its main feature is to be manufactured from raw milk without suffering any heat treatment in order to eliminate pathogenic microorganisms that may be present. This fact has major implications, especially for the public health risk that product cause foodborne illness. Current law allows handmade cheeses from raw milk to be aged for a period less than 60 days, however, but also declares the need for technical-scientific studies to prove the best time of maturation, to ensure the quality and safety of the product. The present study aimed to realize the isolation and identification of Listeria monocytogenes and Salmonella sp. and isolating and quantifying Staphylococcus aureus, Escherichia coli and total coliforms and relate the maturation time with contamination of handmade cheeses, thus verifying the best time of maturation to make a product that is safe for consumers. The experiment was conducted using 108 samples of handmade serranos cheese from various cities in the mountainous region of SC, with maturity periods of between 14, 28, 42 and 63 days. In Animal Microbiological Diagnostic Center - CEDIMA were performed the following analyzes: isolation of Listeria monocytogenes using the method USDA/2009 and of Salmonella sp. methodology according to ISO 6579/2007. The bacteria identified as Listeria monocytogenes were sent for serotyping the Instituto Oswaldo Cruz Foundation. The enumeration of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Total Coliform was performed on petrifilm plates. The sanitary quality of the cheeses analyzed was unsatisfactory, because the presence of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and total coliform was found above the levels permitted by law, indicating deficiency in hygiene procedures during manufacture of the product. Salmonella sp. not detected in any sample, but, the presence of Listeria monocytogenes makes cheese unfit for human consumption, as it offers potential risk to consumer health .The maturing period up to 60 days did not affect the isolation of the microorganisms statistically analyzed / O queijo artesanal serrano de Santa Catarina é um produto típico produzido em pequenas propriedades rurais na Serrana Catarinense. Sua principal característica é ser fabricado a partir do leite cru, sem sofrer nenhum tratamento térmico que elimine os microrganismos patogênicos que podem estar presente. Este fato traz grandes implicações, principalmente, para saúde pública pelo risco desse produto causar doenças transmitidas por alimentos. A legislação vigente permite que queijos artesanais elaborados a partir de leite cru sejam maturados por um período inferior a 60 dias, porém, declara a necessidade de estudos técnico-científicos a fim de comprovarem a melhor época de maturação, para que se possa garantir a qualidade e a inocuidade do produto. O presente estudo teve por objetivo realizar o isolamento e a identificação de Listeria monocytogenes e Salmonella sp. e o isolamento e quantificação de Staphylococcus aureus, Escherichia coli e coliformes totais e relacionar o tempo de maturação com a contaminação dos queijos artesanais, verificando assim, a melhor época de maturação para comercializar um produto que seja seguro ao consumidor. O experimento foi conduzido utilizando 108 amostras de queijo artesanais serranos provenientes de várias cidades da Região Serrana de SC, com períodos de maturação entre 14, 28, 42 e 63 dias. No Centro de Diagnóstico Microbiológico Animal - CEDIMA foram realizadas as seguintes análises: pesquisa de Listeria monocytogenes segundo o método USDA/2009 e isolamento de Salmonella sp. segundo a metodologia ISO 6579/2007. As bactérias identificadas como Listeria monocytogenes foram enviadas para sorotipificação na Fundação Instituto Oswaldo Cruz. A contagem de Staphylococcus aureus, Coliformes Totais e Escherichia coli foi realizada em placas de petrifilm . A qualidade higiênicosanitária dos queijos analisados foi insatisfatória, pois a presença de Staphylococcus aureus, Escherichia coli e coliformes totais encontrou-se acima dos valores permitidos pela legislação, indicando deficiência nos procedimentos de higiene durante a fabricação do produto. A Salmonella sp. não detectada em nenhuma das amostras, porém, a presença de Listeria monocytogenes torna o queijo impróprio para o consumo humano, uma vez que oferece risco potencial a saúde do consumidor. O período até 60 dias maturação não influenciou estatisticamente no isolamento dos microrganismos analisados

As Enfermidades Transmitidas por Alimentos representam um crescente e relevante problema de saúde pública. Além do prejuízo social, a contaminação de alimentos com microrganismos patogênicos gera um enorme prejuízo econômico. Técnicas de Análise de Risco permitem mensurar de forma mais adequada o impacto dos microrganismos contaminantes de alimentos na saúde da população. Uma Análise de Riscos, associada a uma combinação patógeno-alimento, envolve três passos: avaliação do risco, gestão do risco e comunicação do risco. Uma das etapas da avaliação do risco é a avaliação da exposição, baseada em dados sobre freqüência e nível de contaminação dos alimentos pelo patógeno avaliado no alimento em questão, o nível atingido pelo patógeno no momento do consumo e os padrões de consumo. Os produtos cárneos são os principais alimentos responsáveis pela veiculação de patógenos ao homem e os microrganismos de maior relevância nestes produtos são Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Campylobacter spp. e Escherichia coli produtora de toxina de Shiga. O objetivo do presente estudo foi levantar informações qualitativas e quantitativas desses quatro patógenos em produtos cárneos (salsicha bovina, lingüiça suína, carne bovina moída e coxa de frango) comercializados no município de São Paulo, de forma a contribuir com dados para futuras avaliações de risco em relação a estes microrganismos nestes produtos. Das 552 amostras de produtos cárneos analisadas, L. monocytogenes foi o patógeno isolado com maior freqüência, sendo detectado em 48,7% das amostras, seguido por Campylobacter spp. em 6,0% e Salmonella spp. em 5,8%. E. coli produtora de toxina de Shiga não foi detectada em nenhuma das amostras estudadas. Listeria monocytogenes foi detectada em todos os tipos de produtos cárneos estudados, com freqüências mais elevadas nas amostras de carne bovina moída (59,4%), seguido de coxa de frango (58,0%), lingüiça suína (39,8%) e salsicha bovina (37,7%). Na maioria das amostras (94,4%), as contagens de L. monocytogenes foram inferiores a 102 UFC/g. As cepas de L. monocytogenes apresentaram ampla distribuição, sendo detectados os quatro grupos de sorotipos: 28,7% pertenceram ao Grupo 1 (sorotipos 1/2a e 3a), 21,0% ao Grupo 2 (sorotipos 1/2c e 3c), 17,0% ao Grupo 3 (sorotipos 1/2b, 3b e 7) e 13,8% ao Grupo 4 (sorotipos 4b, 4d e 4e). Salmonella spp. foi detectada em 32 amostras, sendo 20 (14,5%) de lingüiça e 12 (10,6%) de coxa de frango. As contagens foram baixas, variando de 3,0 a 9,3x10 NMP/g e os sorovares mais freqüentemente isolados foram S. Typhimurium (28,1%), S. Enteritidis (12,5%), S. Derby (12,5%) e S. I 4,[5],12:i:- (12,5%). Campylobacter spp. foi detectado em 33 amostras (6,0%), sendo 27 de coxa de frango (19,6%) e seis amostras de carne moída (4,3%). A presença de L. monocytogenes, Salmonella spp. e Campylobacter spp. nos produtos cárneos analisados representa um risco à saúde da população. O consumo destes produtos quando submetidos à cocção inadequada e/ou a contaminação cruzada com outros alimentos pode levar a ocorrência de Enfermidades Transmitidas por Alimentos. / Foodborne Diseases represent an increasingly important public health problem. Besides the social losses, contamination of food with pathogenic microorganisms generates an enormous economic damage. A more accurate measurement of the impact of microorganisms in food health can be achieved using Risk Analysis techniques. A risk analysis is composed by three elements: risk assessment, risk management and risk communication. One of the four steps of a risk assessment is the exposure assessment, based on data on frequency and level of contamination of a food by the pathogen under evaluation, levels of the pathogen in the food at the time of consumption and consumption patterns. Meat products are the main vehicles of pathogens to humans, where Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Campylobacter spp. and Shiga toxin-producing Escherichia coli are the most relevant pathogens. The aim of this study was to obtain qualitative and quantitative information on these four pathogens in four types of meat products (beef sausage, pork sausage, ground beef and chicken leg) marketed in the city of Sao Paulo in order to contribute with data for future risk assessments for these microorganisms in these products. L. monocytogenes is the most frequent pathogen in the 552 samples of meat products analyzed, being detected in 48.7% of the samples, followed by Campylobacter spp. 6.0% and Salmonella spp. 5.8%. Shiga toxin-producing E. coli was not detected in any sample. L. monocytogenes was detected in all types of meat products, with highest frequency in ground beef (59.4%), followed by chicken leg (58.0%), pork sausage (39.8%) and beef sausage (37.7%). In most samples (94.4%), the counts of L. monocytogenes were below 102 CFU/g. L. monocytogenes strains were widely distributed in the four groups of serotypes: 28.7% belonged to Group 1 (serotypes 1/2a and 3a), 21% to Group 2 (serotypes 1/2c and 3c), 17% to Group 3 (serotypes 1/2b, 3b and 7) and 13.8% to Group 4 (serotypes 4b, 4d and 4e). Salmonella spp. was detected in 32 samples, being 20 (14.5%) of pork sausage and 12 (10.6%) of chicken leg. The counts were low, ranging from 3.0 to 9.3 x 10 MPN/g and the most frequent serovars were S. Typhimurium (28.1%), S. Enteritidis (12.5%), S. Derby (12.5%) and S. I 4, [5], 12: i: - (12.5%). Campylobacter spp. was detected in 33 samples (6.0%), being 27 of chicken leg (19.6%) and six samples of ground beef (4.3%). The presence of L. monocytogenes, Salmonella spp. and Campylobacter spp. in the tested meat products represent a risk to health. The consumption of inadequately cooked products and/or subjected to cross-contamination with other foods may lead to occurrence of foodborne diseases.

Caracterização molecular e susceptibilidade antimicrobiana de linhagens de Listeria monocytogenes isoladas de alimentos no RS Mestranda: Fernanda De Nes Orientador: Jeverson Frazzon Listeria monocytogenes é o microrganismo causador de listeriose, uma doença infecciosa adquirida através do consumo de alimentos contaminados e que afeta principalmente pessoas com o sistema imunológico comprometido como gestantes e recém nascidos. É um microrganismo ambiental, podendo ser encontrado no solo, água e alimentos como vegetais, produtos cárneos, leites crus ou mal pasteurizados, queijos, entre outros. São bactérias invasivas e possuem facilidade para penetrar na célula hospedeira. O ataque a essas células é intermediado pelas internalinas, que são proteínas associadas a genes de virulência. As internalinas InlA e InlB, codificadas pelo gene inlAB, são proteínas associadas com a invasão e internalização da bactéria na célula hospedeira. Este trabalho teve o objetivo de caracterizar um total de 19 linhagens de Listeria monocytogenes, sorovares 1/2b, 1/2a, 4b, 4c, isoladas de produtos lácteos do Rio Grande do Sul. Para a caracterização molecular foram utilizadas as técnicas moleculares de Amplificação Randômica do DNA Polimórfico (RAPD) e Análise por Enzimas de Restrição (PCRREA), com a amplificação de um segmento de 2916 pb que incluem partes dos genes inlA e inlB, utilizando para isso duas enzimas de restrição AluI e EcoRI. As técnicas moleculares utilizadas foram ferramentas úteis para caracterizar as linhagens de Listeria monocytogenes isoladas de produtos lácteos do Rio Grande do Sul. Ainda, foi observado o perfil de resistência antimicrobiana desses microrganismos frente a vários antimicrobianos, das amostras analisadas todas foram susceptíveis aos antimicrobianos testados. / Listeria monocytogenes is a microorganism which causes listeriosis, an infection disease caused by consuming contaminated food and it mainly affects individuals with the immune system at risk like pregnant women and newborn infants. It is an environmental microorganism, being found in soil, water and food like vegetables, meat products, unpasteurized milk and cheese. They are invasive bacteria which have special facility to penetrate the host cell. The attack to those cells is carried out by internalins, which are proteins associated with virulence genes. The InlA and InlB internalins, codified by inlAB gene, are proteins associated with the invasion and internalization of the bacteria in the host cell. This work aimed at categorizing a total of 19 strains of Listeria monocytogenes, 1/2b, 1/2a, 4b and 4c serovars, isolated from dairy products from the State of Rio Grande do Sul. For the molecular categorization, it was used the molecular techniques of Polymorphic DNA Random Amplification (RAPD) and Restriction Enzymatic Analysis (PCR-REA), with the amplification of a segment of 2916 pb which includes part of inlA and inlB genes, using for that purpose two restriction enzymes, AluI and EcoRI. The molecular techniques applied were useful tools to categorize strains of L. monocytogenes isolated from dairy products of the State of Rio Grande do Sul. Furthermore, it was observed the antimicrobial resistant profile of those microorganisms in front of various antimicrobials. All of the analyzed samples were susceptible to tested antimicrobials.

Submitted by Gabriela Lopes (gmachadolopesufpel@gmail.com) on 2018-07-18T19:16:18Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO CORRGIDA BANCA-PDF.pdf: 1443908 bytes, checksum: 6572a3e5fc8336f513dc30069108bfa7 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2018-07-30T21:21:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO CORRGIDA BANCA-PDF.pdf: 1443908 bytes, checksum: 6572a3e5fc8336f513dc30069108bfa7 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2018-07-30T21:25:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO CORRGIDA BANCA-PDF.pdf: 1443908 bytes, checksum: 6572a3e5fc8336f513dc30069108bfa7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-30T21:25:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO CORRGIDA BANCA-PDF.pdf: 1443908 bytes, checksum: 6572a3e5fc8336f513dc30069108bfa7 (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / O controle do crescimento microbiano é de fundamental importância na indústria de alimentos, uma vez que assim pode-se preservar a qualidade do produto e/ou garantir a segurança do alimento. Muitos óleos essenciais foram relatados por possuírem forte atividade antimicrobiana e quando encapsulados podem ser aplicados em embalagens ativas antimicrobianas para alimentos. Embalagens ativas interagem com o alimento diretamente ou pelo espaço livre que com a finalidade de assegurar a qualidade e a segurança durante a vida útil do alimento. O estudo teve como objetivo produzir e caracterizar fibras ultrafinas de proteína isolada de soja (PIS), poli (óxido de etileno) (POE) e zeína, com diferentes concentrações de óleo essencial de gengibre (OEG) (Zingiber Officinale Roscoe), pela técnica de electrospinning, bem como aplicá-las em embalagem para controle de Listeria monocytogenes em queijo minas frescal. A atividade antimicrobiana foi avaliada contra cinco bactérias (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli 0157:H7, Salmonella Typhimurium e Pseudomonas aeruginosa). O OEG, em diferentes concentrações (0, 3, 6, 9 e 12%, v / v) foi encapsulado em fibras ultrafinas utilizando uma mistura polimérica de proteína isolada de soja, poli (óxido de etileno) e zeína em uma proporção de 1:1:1 (v/v/v) pela técnica de eletrospinning. As fibras foram avaliadas quanto à sua morfologia, propriedades térmicas, grupos funcionais, cristalinidade relativa e atividade antimicrobiana por micro-atmosfera. A partir de testes preliminares da análise antimicrobiana a fibra com 12% de OEG foi selecionada para aplicação in situ (queijo minas frescal) contra L. monocytogenes. O óleo essencial de gengibre teve um rendimento de 3,7% em base úmida, e foi um antimicrobiano efetivo contra todas as bactérias em teste. As fibras produzidas, independentemente da concentração do óleo essencial encapsulado, apresentaram atividade antimicrobiana contra L.monocytogenes, e demonstraram morfologia homogênea sem a presença de beads. A adição do OEG alterou ligeiramente as propriedades térmicas das fibras e diminuiu a cristalinidade relativa. O OEG encapsulado em fibras ultrafinas foi eficaz no controle de L. monocytogenes em queijo minas frescal por micro-atmosfera durante o armazenamento refrigerado de 12 dias, demonstrando grande potencial de aplicação embalagem ativa de alimentos. / The growth control of pathogenic and deteriorating microorganisms is important in the food industry. This control can preserve the quality of the product and / or guarantee the food safety Several essential oils have been reported for its high antimicrobial activity and,can be applied in active antimicrobial food packaging when encapsulated in fibers. Active packaging interacts with food to ensure the quality and safety during the food shelf life. The objective of this study was to produce and characterize ultrafine fibers from soy protein isolate, poly (ethylene oxide) and zein, with different concentrations of ginger essential oil (GEO (Zingiber Officinale Roscoe), by electrospinning, as well as apply the fibers in the packaging of Minas Frescal cheese for the control of Listeria monocytogenes. The antimicrobial activity was evaluated against five bacteria (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli 01571H7, Salmonella Typhimurium and Pseudomonas aeruginosa). The OEG, in different concentrations (0, 3, 6, 9 and 12%, v/v) was encapsulated in ultrafine fibers using a polymer blend of soy protein isolate, poly (ethylene oxide) and zein in a ratio of 1 : 1: 1 (v/v/v) by electrospinning. The ultrafine fibers were evaluated for its morphology, thermal properties, functional groups, relative crystallinity and micro-atmosphere antimicrobial activity. The fiber selected for application in situ (fresh Minas cheese) against L. monocytogenes by preliminary tests of the antimicrobial analysis was the fiber with 12% of GEO. The GEO presented yield of 3.7% on wet basis, and showed antimicrobial activity against all bacteria under test. The ultrafine fibers produced, regardless of the concentration of the encapsulated GEO, presented homogeneous morphology without beads. The addition of GEO slightly altered the thermal properties of the fibers and decreased relative crystallinity. Ultrafine fibers encapsulated OEG were effective in Listeria monocytogenes control in fresh Minas cheese by micro-atmosphere during refrigerated storage of 12 days, demonstrating great potential to be applied in active food packaging.