As Enfermidades Transmitidas por Alimentos representam um crescente e relevante problema de saúde pública. Além do prejuízo social, a contaminação de alimentos com microrganismos patogênicos gera um enorme prejuízo econômico. Técnicas de Análise de Risco permitem mensurar de forma mais adequada o impacto dos microrganismos contaminantes de alimentos na saúde da população. Uma Análise de Riscos, associada a uma combinação patógeno-alimento, envolve três passos: avaliação do risco, gestão do risco e comunicação do risco. Uma das etapas da avaliação do risco é a avaliação da exposição, baseada em dados sobre freqüência e nível de contaminação dos alimentos pelo patógeno avaliado no alimento em questão, o nível atingido pelo patógeno no momento do consumo e os padrões de consumo. Os produtos cárneos são os principais alimentos responsáveis pela veiculação de patógenos ao homem e os microrganismos de maior relevância nestes produtos são Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Campylobacter spp. e Escherichia coli produtora de toxina de Shiga. O objetivo do presente estudo foi levantar informações qualitativas e quantitativas desses quatro patógenos em produtos cárneos (salsicha bovina, lingüiça suína, carne bovina moída e coxa de frango) comercializados no município de São Paulo, de forma a contribuir com dados para futuras avaliações de risco em relação a estes microrganismos nestes produtos. Das 552 amostras de produtos cárneos analisadas, L. monocytogenes foi o patógeno isolado com maior freqüência, sendo detectado em 48,7% das amostras, seguido por Campylobacter spp. em 6,0% e Salmonella spp. em 5,8%. E. coli produtora de toxina de Shiga não foi detectada em nenhuma das amostras estudadas. Listeria monocytogenes foi detectada em todos os tipos de produtos cárneos estudados, com freqüências mais elevadas nas amostras de carne bovina moída (59,4%), seguido de coxa de frango (58,0%), lingüiça suína (39,8%) e salsicha bovina (37,7%). Na maioria das amostras (94,4%), as contagens de L. monocytogenes foram inferiores a 102 UFC/g. As cepas de L. monocytogenes apresentaram ampla distribuição, sendo detectados os quatro grupos de sorotipos: 28,7% pertenceram ao Grupo 1 (sorotipos 1/2a e 3a), 21,0% ao Grupo 2 (sorotipos 1/2c e 3c), 17,0% ao Grupo 3 (sorotipos 1/2b, 3b e 7) e 13,8% ao Grupo 4 (sorotipos 4b, 4d e 4e). Salmonella spp. foi detectada em 32 amostras, sendo 20 (14,5%) de lingüiça e 12 (10,6%) de coxa de frango. As contagens foram baixas, variando de 3,0 a 9,3x10 NMP/g e os sorovares mais freqüentemente isolados foram S. Typhimurium (28,1%), S. Enteritidis (12,5%), S. Derby (12,5%) e S. I 4,[5],12:i:- (12,5%). Campylobacter spp. foi detectado em 33 amostras (6,0%), sendo 27 de coxa de frango (19,6%) e seis amostras de carne moída (4,3%). A presença de L. monocytogenes, Salmonella spp. e Campylobacter spp. nos produtos cárneos analisados representa um risco à saúde da população. O consumo destes produtos quando submetidos à cocção inadequada e/ou a contaminação cruzada com outros alimentos pode levar a ocorrência de Enfermidades Transmitidas por Alimentos. / Foodborne Diseases represent an increasingly important public health problem. Besides the social losses, contamination of food with pathogenic microorganisms generates an enormous economic damage. A more accurate measurement of the impact of microorganisms in food health can be achieved using Risk Analysis techniques. A risk analysis is composed by three elements: risk assessment, risk management and risk communication. One of the four steps of a risk assessment is the exposure assessment, based on data on frequency and level of contamination of a food by the pathogen under evaluation, levels of the pathogen in the food at the time of consumption and consumption patterns. Meat products are the main vehicles of pathogens to humans, where Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Campylobacter spp. and Shiga toxin-producing Escherichia coli are the most relevant pathogens. The aim of this study was to obtain qualitative and quantitative information on these four pathogens in four types of meat products (beef sausage, pork sausage, ground beef and chicken leg) marketed in the city of Sao Paulo in order to contribute with data for future risk assessments for these microorganisms in these products. L. monocytogenes is the most frequent pathogen in the 552 samples of meat products analyzed, being detected in 48.7% of the samples, followed by Campylobacter spp. 6.0% and Salmonella spp. 5.8%. Shiga toxin-producing E. coli was not detected in any sample. L. monocytogenes was detected in all types of meat products, with highest frequency in ground beef (59.4%), followed by chicken leg (58.0%), pork sausage (39.8%) and beef sausage (37.7%). In most samples (94.4%), the counts of L. monocytogenes were below 102 CFU/g. L. monocytogenes strains were widely distributed in the four groups of serotypes: 28.7% belonged to Group 1 (serotypes 1/2a and 3a), 21% to Group 2 (serotypes 1/2c and 3c), 17% to Group 3 (serotypes 1/2b, 3b and 7) and 13.8% to Group 4 (serotypes 4b, 4d and 4e). Salmonella spp. was detected in 32 samples, being 20 (14.5%) of pork sausage and 12 (10.6%) of chicken leg. The counts were low, ranging from 3.0 to 9.3 x 10 MPN/g and the most frequent serovars were S. Typhimurium (28.1%), S. Enteritidis (12.5%), S. Derby (12.5%) and S. I 4, [5], 12: i: - (12.5%). Campylobacter spp. was detected in 33 samples (6.0%), being 27 of chicken leg (19.6%) and six samples of ground beef (4.3%). The presence of L. monocytogenes, Salmonella spp. and Campylobacter spp. in the tested meat products represent a risk to health. The consumption of inadequately cooked products and/or subjected to cross-contamination with other foods may lead to occurrence of foodborne diseases.

La capacité de Listeria monocytogenes à adhérer et à persister sur les surfaces dans les ateliers agro-alimentaires pendant de longues périodes malgré l’application correcte et fréquente des opérations de nettoyage & désinfection (N&D), peut être responsable de la contamination croisée de produits alimentaires par simple contact avec une surface contaminée. De plus, il est important de prendre en considération la présence potentielle de bactéries viables non cultivables (VNC) qui ne sont pas détectées par les méthodes culturales utilisées lors de la recherche de L. monocytogenes dans un prélèvement de surface.Un des objectifs a été de vérifier si les milieux de culture conventionnels fréquemment utilisés pour les expérimentations en laboratoire étaient représentatifs des conditions environnementales des ateliers agro-alimentaires et de définir pour la suite des expérimentations un milieu synthétique pouvant modéliser une souillure alimentaire. Pour assurer la sécurité sanitaire des aliments et préserver la santé des consommateurs, optimiser les opérations d’hygiène est une nécessité. Dans ce but, la survie des cellules adhérentes de L. monocytogenes soumises à des conditions simulant en laboratoire l’alternance des phases de N&D et de production a été étudiée. Plusieurs facteurs pouvant influencer la survie de ces cellules ont été pris en considération et combinés par un plan d’expériences fractionnaire : la souillure alimentaire, la souche de L. monocytogenes, le matériau de surface, la présence d’une souche de Pseudomonas fluorescens qui favorise l’adhésion de L. monocytogenes et le scénario de l’opération d’hygiène. Dans les industries agro-alimentaires, les bactéries sont soumises à de nombreux stress, nécessitant pour survivre l’expression et l’induction appropriées de gènes et de protéines de réponse aux stress. Les mécanismes de réponse aux stress mis en place par les cellules de L. monocytogenes adhérentes après stress hydrique (dessiccation), stress chimique (N&D) et stress froid ont été déterminés par une analyse transcriptomique.Selon les critères étudiés (croissance, forces d’adhésion, distribution spatiale et état physiologique des cellules adhérentes), il s’avère que le milieu TSB/5m peut modéliser le jus de saumon fumé. Au contraire, aucun des milieux synthétiques testés ne permet de remplacer l’utilisation de l’exsudat de viande pour mimer les conditions de terrain. Concernant les facteurs influençant la survie de L. monocytogenes, les opérations d’hygiène impactent uniquement la cultivabilité des cellules adhérentes ; toutefois, le séchage des surfaces permet une optimisation de l’efficacité de la procédure de N&D, d’autant plus lorsqu’il est réalisé quotidiennement / Despite the correct and frequent application of cleaning & disinfection (C&D), Listeria monocytogenes has the ability to adhere to and persist on surfaces in food processing plants for long periods. Consequently, L. monocytogenes may be responsible for cross-contamination of food through contact with contaminated surfaces. In addition, it is important to consider the potential presence of viable but non culturable (VBNC) bacteria that are not detected by the microbiological methods used in the research of L. monocytogenes in a surface sample.One aim was to verify whether the conventional culture media commonly used for laboratory experiments were representative of the environmental conditions of food processing plants and define for further experiments a synthetic medium that can model a food soil. Optimization of the C&D procedures is a necessary to ensure food safety and protect the health of consumers. For this purpose, the survival of L. monocytogenes adherent cells subjected to laboratory conditions simulating alternating phases of C&D and production was studied. Several factors that may influence the survival of these cells were considered and combined with a fractional factorial design, including: the food soil, the strain of L. monocytogenes, the surface material, the presence of a strain of Pseudomonas fluorescens, which enhances the adhesion of L. monocytogenes, and the scenario of the sanitation procedure. Moreover, in the food industry, bacteria can be subject to many stresses; thus, the expression and induction of appropriate genes and stress response proteins are required for survival. The stress response mechanisms set up by the adherent L. monocytogenes cells after hydric stress (i.e. desiccation), chemical stress (i.e. C&D), and cold stress were determined by a transcriptomic analysis.According to the criteria studied (i.e. growth, adhesion forces, spatial distribution, and physiological state of adherent cells), TSB/5m medium was found to be a sufficient model for smoked salmon juice. In contrast, none of the tested synthetic media can replace the use of meat exudate to mimic field conditions. About the factors influencing the survival of L. monocytogenes, C&D procedures were found to only impact the culturability of adherent cells; however, drying surfaces were found to optimize the effectiveness of the C&D procedures, especially when performed daily

A vida moderna tem gerado mudanças importantes nos hábitos alimentares em todo o mundo e observa-se um aumento da demanda por alimentos prontos para o consumo, tais como frutas e hortaliças minimamente processadas. As condições de embalagem e armazenamento destes produtos podem favorecer a multiplicação de bactérias psicrotróficas, destacando-se o patógeno Listeria monocytogenes. Para estudos de avaliação de riscos microbiológicos relativos a L. monocytogenes, dados quantitativos são fundamentais, mas, os métodos para enumeração disponíveis atualmente são trabalhosos e morosos. Há grande interesse no desenvolvimento de métodos rápidos para a determinação das populações de L. monocytogenes, o que pode reduzir significativamente o tempo de análise. Neste trabalho, foram analisadas 162 amostras de hortaliças minimamente processadas adquiridas no comércio varejista de Ribeirão Preto/SP, no período de setembro de 2007 a agosto de 2008. Foram realizados ensaios convencionais para enumeração de coliformes totais e termotolerantes, Escherichia coli e bactérias aeróbias psicrotróficas. Foi realizada a detecção de Listeria sp. por imunoensaio (Oxoid Listeria Rapid Test) e de Salmonella por método convencional. Alíquotas congeladas de amostras positivas para L. monocytogenes e Salmonella sp. foram também avaliadas quantitativamente empregando-se métodos convencionais. Para quantificação de L. monocytogenes foi utilizado o método da Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) em tempo real, com primers de DNA baseados em 16S rRNA. Para a comparação do método de PCR em tempo real e método convencional de cultivo, foram inoculadas seis amostras de hortaliças minimamente processadas (alface, cheiro-verde, couve, almeirão, repolho e acelga) com três níveis de inoculação. Dentre as 162 amostras de hortaliças analisadas, L. monocytogenes foi detectada em uma amostra de couve e uma de cheiro-verde, com populações de 1,5 x 103 e 0,43 NMP/g, respectivamente. Salmonella sp. foi isolada de duas amostras de almeirão, com populações de 0,09 e 4,6 NMP/g. Contaminação por coliformes totais foi detectada em 132 (81,5%) amostras e por coliformes termotolerantes em 107 (66%) amostras. Escherichia coli foi confirmada em 86 (53,1%) amostras, enquanto que 158 (96,7%) amostras apresentaram população de bactérias psicrotróficas maior que 5 log UFC/g. Os resultados obtidos entre os dois métodos desenvolvidos apresentaram pouca variação e todos os resultados foram concordantes considerando-se o intervalo de confiança de 95% da técnica do NMP (SWANSON; PETRAN; HANLIN, 2001). A PCR em tempo real foi otimizada com a preparação comercial ABSOLUTETM QPCR SYBR® Green Mix (ABgene, Reino Unido) e os primers utilizados mostraram ser específicos para L. monocytogenes. As populações de microrganismos encontradas nestes alimentos indicaram a baixa qualidade microbiológica e evidenciaram a importância da implantação de programas para garantia da inocuidade de alimentos na cadeia produtiva das hortaliças minimamente processadas. A PCR em tempo real mostrou ser de fácil execução e diminuiu o tempo de obtenção de resultados para pouco mais que 48 horas em comparação com o tempo gasto (7 dias) quando as hortaliças foram analisadas por meio do método convencional de cultivo. / Modern lifestyles have deeply changed eating habits worldwide, with an increasing demand for ready-to-eat foods, including minimally processed fruits and leafy greens. Packaging and storage conditions of these products may favor the growth of psychrotrophic bacteria, such as the pathogen Listeria monocytogenes. For microbiological risk assessment, it is crucial to generate quantitative data on foodborne pathogens, but the enumeration methods currently available are labor and time consuming. There is great interest in the development of reliable and fast methods for enumeration of L. monocytogenes, in order to shorten the time needed to obtain quantitative results. In this study 162, samples of leafy vegetables minimally processed were acquired at retail market in Ribeirão Preto from September, 2007 to August 2008 and they were analysed by conventional enumerating methods for total and thermophilic coliforms, Escherichia coli and psychrotrophic aerobic bacteria. Presence or absence of Listeria spp. was evaluated by immunoassay (Oxoid Listeria Rapid test) and detection of Salmonella was performed by conventional methods. Frozen aliquots of Salmonella spp. and L. monocytogenes positive samples were quantitatively evaluated by conventional methods and L. monocytogenes was also enumerated by real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) with DNA primers based on 16S rRNA. Real-time PCR method was applied to analyze six artificially contaminated vegetables and the results obtained with this methodology were similar to the ones obtained with conventional most probably number (MPN) technique with a confidence interval of 95% (SWANSON; PETRAN; HANLIN, 2001). Of the 162 samples analyzed, L. monocytogenes was detected in one sample of collard green and in one mixed bunch of parsley plus spring onion (1.5x103 and 0.43 MPN/g, respectively). Salmonella sp was detected in two samples of common chicory with populations of 0.09 and 4.6 MPN/g. One hundred and thirty two samples (81.5%) showed contamination by total coliforms and 107 (66%) by thermophilics coliforms. Escherichia coli was confirmed in 86 (53.1%) samples while 156 (96.7%) showed populations of psychrotrophic bacteria above of 5 log CFU/g. PCR was optimized with a commercial preparation ABSOLUTE TM QPCR SYBRÒ Green Mix (ABgene, UK) and the primers utilized were specific for L. monocytogenes. These results showed the low microbiologic quality of minimally processed vegetables samples studied and indicate an urge for implementation of quality programs from producer to processors of these ready-to-eat foods. Realtime In comparison with the conventional culture method, real-time PCR was more easily performed and the time required to obtain the results was reduced to ca. 48 hours, in comparison with 7 days for conventional method.

A importância da Listeria monocytogenes como patógeno veiculado por alimentos, causador de grave quadro de infecção é bem conhecida. Devido a sua grande capacidade de sobrevivência às condições adversas do ambiente, o presente trabalho teve como objetivos verificar a freqüência de L. monocytogenes em mortadelas comercializadas no município de São Paulo, SP; avaliar o comportamento de 2 níveis de inóculos de L. monocytogenes frente ao processamento térmico de mortadelas de 2 formulações em diferentes condições de estocagem e avaliar o comportamento de L. monocytogenes naturalmente presente em mortadelas fatiadas, embaladas a vácuo, comercializadas e estocadas sob refrigeração, durante sua vida de prateleira. As amostras foram analisadas pelos métodos de Presença/Ausência ou NMP/g. Verificou-se que 26,7% das amostras de mortadelas analisadas foram positivas para L. monocytogenes. O processamento térmico convencional aplicado na cocção das mortadelas (74ºC no ponto mais frio) foi suficiente para redução dos inóculos em até 3 ciclos log independente da formulação do produto. A temperatura de estocagem, refrigeração ou temperatura ambiente, não interferiu na recuperação do microrganismo. Nas mortadelas fatiadas e embaladas a vácuo foi observado aumento médio de 2,5 ciclos log do NMP de L. monocytogeneslg durante a vida de prateleira do produto, com níveis de L. monocytogenes próximos a 2,0 log NMP/g no final da vida de prateleira do produto. De acordo com os resultados obtidos concluiu-se que L. monocytogenes é um patógeno freqüente em mortadelas; o tratamento térmico de mortadelas é suficiente para redução de até 3 ciclos logarítmicos de L. monocytogenes, não tendo sido observada presença do microrganismo durante estocagem por 30 dias e que mortadelas fatiadas e embaladas a vácuo mantidas sob refrigeração são susceptíveis a multiplicação de L. monocytogenes durante sua estocagem refrigerada, representando um risco à população susceptível. / L. monocytogenes is an important foodborne pathogen that can cause life threating infections. The importance of L. monocytogenes as a foodborne pathogen is well known. Its capacity to resist to adverse environmental conditions makes this microorganism a cause of concern for the food industry. The objectives of this study were to evaluate: the incidence of L. monocytogenes in mortadella samples commercialised in São Paulo, SP, BR; the behaviour of 2 leveis of L. monocytogenes during the processing of 2 formulations of the product stored at difterent conditions and the behaviour of indigenous L. monocytogenes present in vaccum-packed sliced mortadella during the shelf life of the product. Samples were analised by the Presence/Absence technique or By MPN. 26.7% of the mortadella samples were positive for L. monocytogenes. The conventional cooking process (74°C in the coldest point) was sufficient to reduce the population of the microorganism in up to 3 log and the formulation of the product did not interfere with this reduction. L. monocytogenes was not detected during storage of the product for up to 30 days under cold storage (5-8°C) or room temperature (25°C). The vaccum-packed sliced product showed a mean increase of 2.5 log of MPN/g during its shelf life with the bacterium reaching populations around 2 log MPN/g by the end of the período It could be concluded that L. monocytogenes is very frequent in mortadellas; for this product the cooking process is sufticient to reduce up to 3 log of L. monocytogenes. This microorganism could not be recovered during storage for up to 30 days, indicating no sub-Iethal damage. The vaccum-packed sliced product stored under refrigeration is susceptible to L. monocytogenes growth and can be considered risky to susceptible population.

Neste estudo foram realizados inicialmente, experimentos para avaliar a ação sinérgica do peptídeo antimicrobiano P34 com sobrenadantes de culturas de algumas bactérias lácticas selecionadas e isoladas de queijo Minas Frescal. Foi investigada a influência deste peptídeo na expressão de genes em L. monocytogenes e L. seeligeri, sua citotoxicidade em diferentes células eucarióticas e toxicidade “in vivo”. Também foram realizados alguns testes para avaliar a citotoxicidade do peptídeo antimicrobiano P40. A adição do peptídeo P34 no queijo provocou uma diminuição de até 3 ciclos logarítmicos na contagem de células viáveis de L. monocytogenes inoculada artificialmente. Um aumento significativo na expressão dos genes dltA, Imo 1695 e mptA de L. monocytogenes foi observado após 96 h com a presença do peptídeo P34 no queijo. A influência do peptídeo P34 na expressão de genes associados aos componentes do envelope celular de L. monocytogenes e L. seeligeri, promoveu um aumento não significativo nos níveis de transcrição de genes dltA, Imo1695 e mptA observados em L. monocytogenes após inoculação em placas e incubação por 24 h a 37°C ou 240 h a 4°C. Em L. seeligeri uma diminuição significativa na expressão do gene dltA foi observada. Os genes Imo1695 e mptA demonstraram uma diminuição significativa de sua expressão (2000 e 31872 vezes, respectivamente) na presença do peptídeo P34 e incubação por 24 h a 37°C. A inoculação da placa com o peptídeo P34 e incubação por 240 h a 4ºC não promoveu diminuição significativa da expressão do gene mptA. A citotoxicidade dos peptídeos P34 e P40 foi avaliada em células VERO, tratadas com diferentes concentrações (0,02 - 2,5 μg ml-1). Nos ensaios de MTT, NRU e LDH as EC50 para o peptídeo P34 foram 0.60, 1.25, 0.65 μg ml-1 e do peptídeo P40 foram 0,30, 0,51 e 0,57 μg ml-1, respectivamente. A atividade hemolítica em eritrócitos humanos foi de (5,8%) e (19%), respectivamente. Os efeitos sobre a viabilidade, motilidade e exocitose acrossomal de espermatozóides humanos também foram avaliadas para o peptídeo P34. Não houve reações de hipersensibilidade ou aumento significativo de títulos de anticorpos durante os experimentos imunogenicidade ou morte dos animais durante experimentos de toxicidade aguda ou subcrônica. A DL50 foi superior a 332,3 ± 0,76 mg/kg. Não foram observadas alterações significativas nos parâmetros bioquímicos séricos nos animais tratados com o peptídeo P34. Não foram detectados sinais de possível toxicidade nos animais do grupo tratado com 0,825 mg/ kg/dia do peptídeo P34. Neste grupo apenas alterações histológicas no baço com a presença de megacariócitos foram observadas. A partir destes resultados evidencia-se o potencial do peptídeo P34 para ser utilizado como bioconservante em alimentos. / In this study initial experiments were performed to evaluate synergistic action of the antimicrobial peptide P34 and culture supernatants of some selected lactic acid bacteria isolated from Minas Frescal cheese. The influence of this peptide in the expression of genes in L. monocytogenes and L. seeligeri, their cytotoxicity in differents eukaryotic cells and “in vivo” toxicity was investigated. Also, some tests were carried out o evaluate the cytotoxicity of the antimicrobial peptide P40. The peptide P34 caused a decrease of up to 3 log cycles in viable counts of L. monocytogenes artificially inoculated in cheese. A significant increase in expression of genes dltA, Imo1695 mptA of L. monocytogenes was observed after 96 h incubation of the peptide P34 in cheese. The influence of peptide P34 on the expression of genes associated to components of cell envelope of L. monocytogenes and L. seeligeri, promoted a non significant increase in the levels of transcription of genes dltA, Imo1695 and mptA were observed after incubation of L. monocytogenes for 24 hs at 37°C and 240 hs at 4°C in plates. In L. seeligeri a significant decrease was observed in gene expression dltA. The gene Imo1695 showed a significant decrease in its expression (2000-fold) after inoculation with the peptide P34. A significant decrease of expression was also observed for the gene mptA (31872 - times) after inoculation with the peptide P34 and incubation for 24 hours at 37°C. The inoculation of the plate with the P34 peptide and incubated for 240 hrs at 4°C, showed a non-significant decrease of gene expression. The cytotoxicity of the peptide P34 and P40 was assessed in VERO cells treated with different concentrations (0.02 - 2.5 μg ml- 1). In MTT, NRU and LDH assays the EC50 to the peptide P34 were 0.60, 1.25, 0.65 μg ml-1 and the peptide P40 were 0.30, 0.51 and 0.57 μg ml-1, respectively. The hemolytical activity on human erythrocytes was of (5.8%) and (19%), respectively. The effects on viability, motility and acrosomal exocytosis of humam sperm were also evaluated for peptideP34. There were no hypersensitivity reactions or significant increase in antibody titer during the immunogenicity experiment or death of animals during the acute or subchronic toxicity tests. The LD50 was more the 332.3 ± 0.76 mg/kg. No significant changes in the serum biochemical parameters were observed in the animals treated with the peptide P34. Signs of possible toxicity were no detected in animals in the group treated with 0.825 mg/kg day of peptide P34. In this group only histological changes in the spleen with the presence of megakaryocytes were observed. From these results show the potential o peptide P34 to be used in future as biopreservative in foods.

A formação de biofilmes é um fator preocupante para indústria de alimentos, pois pode comprometer a sanitização de superfícies de contato e aumentar o risco de contaminação por patógeno em alimentos processados. L. monocytogenes é uma bactéria de ampla distribuição no ambiente e com capacidade de formar biofilmes e sobreviver por longos períodos em condições adversas. Esta bactéria pode causar doenças em pessoas imunocomprometidas e mulheres grávidas manifestando-se por infecções do sistema nervoso central, abortos e nascimentos prematuros. Vários estudos têm demonstrado que algumas bactérias podem sofrer transição para o estado viável mas não cultivável em resposta ao estresse. Considerando-se a importância da garantia da segurança e qualidade dos alimentos, há necessidade de desenvolvimento e de padronização de técnicas rápidas para a quantificação de células viáveis de L. monocytogenes em alimentos e biofilmes. Neste estudo foi avaliada a formação de biofilmes e viabilidade celular de Listeria monocytogenes em condições de estresse. Foram utilizadas técnicas de semeadura em placa e quantificação direta por microscopia de fluorescência com os corantes cloreto de 5-ciano-2,3-di-(p-tolil) tetrazólio (CTC) e 4,6-diamino-2- fenilindol (DAPI). Foram também realizados ensaios preliminares para padronização da Reação da Polimerase em Cadeia em tempo real (PCR em tempo real) com amostras previamente tratadas com brometo de etídio monoazídico (EMA). Os resultados obtidos demonstraram que o método de semeadura em placa foi adequado somente para a enumeração de células viáveis de L. monocytogenes em biofilmes enquanto que o método de enumeração por microscopia de fluorescência com CTC-DAPI permitiu quantificar bactérias no estado viável e viável mas não cultivável. Também foi observado que a presença de bacteriocinas de L. sakei 1 e L. mensenteroides 11 causou a diminuição na viabilidade e formação de biofilmes por L. monocytogenes. Os resultados preliminares utilizando culturas puras de L. monocytogenes demonstraram que o tratamento com brometo de etídio monoazídico (EMA) antes da análise por PCR em tempo real reduziu a amplificação do DNA de células mortas em 1 log de UFC por mL. No entanto dependendo da concentração utilizada, pode ocorrer também a inibição da amplificação de células viáveis de L. monocytogenes. Os resultados do presente trabalho indicaram que a microscopia de fluorescência é comparável à placa para análise de células de L. monocytogenes não estressadas. Entretanto, para a quantificação de L. monocytogenes submetida a estresse, é desejável a utilização de corantes de viabilidade celular. O método de PCR em tempo real com pré-tratamento com EMA é promissor mas, ainda necessita de maior padronização para avaliação de sua aplicabilidade na determinação seletiva de células viáveis de L. monocytogenes. / Biofilm formation is of great concern for food industry because it may compromise sanitization of surfaces and increase contamination risk of processed foods by bacterial pathogens. L. monocytogenes is an ubiquitous bacterium which is able to form biofilms and to survive for long periods under adverse conditions. L. monocytogenes may cause disease in immunocomprommised people and pregnant women, manifesting as central nervous system infections, abortion and premature birth. Some bacteria can undergo transition to viable but non-cultivable state in response to stress and it is important to study techniques for rapid quantification of viable cells of L. monocytogenes in foods. In this study biofilm formation and cell viability of Listeria monocytogenes were studied in stress conditions by plate counting, direct quantification by fluorescence microscopy with double staining dyes 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)/4\'-6 diamino-2 phenylindole (DAPI). Preliminary experiments with real time polymerase chain reaction and treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) were also performed. The results showed that plate count method was suitable for enumeration only of viable cells of L. monocytogenes in biofilms since, fluorescence microscopy with CTC-DAPI yielded higher counts, probably due to the presence of viable but nonculturable cells. It was also observed that the presence of bacteriocins of L. sakei 1 and L. mensenteroides 11 decreased viability and formation of biofilm by L. monocytogenes. Results obtained with pure cultures of L. monocytogenes showed that the treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) before real time PCR detection, reduced DNA amplification of dead cells in 1 log CFU per mL, but depending on the concentration used, EMA also inhibited amplification of viable cells of L. monocytogenes. The results indicated that plate counting and fluorescence microscopy are equivalent for enumeration of non-stressed L. monocytogenes cells. However, the use of double staining with fluorescence microscopy is a more suitable method if stressed cells are present. The EMA-real time PCR is a promissing tool for rapid evaluation of viable L. monocytogenes, but it needs further standartization.

L’utilisation de bactéries lactiques (BL), telle que Lactococcus lactis (LL), comme vecteur de transfert d’ADN, constitue une stratégie prometteuse dans la mesure où elles sont considérées sans risque pour la santé. Des souches sauvages (wt) ou recombinantes de LL ont été décrites comme capables de transférer un plasmide dans des cellules épithéliales in vitro et in vivo. Cependant, les mécanismes d'action grâce auxquels certaines souches de LL ont la capacité de transférer de l’ADN plasmidique sont toujours inconnus. C’est pourquoi, nous avons décidé de construire une nouvelle souche recombinante de LL exprimant l’internaline mutée (mlnlA,) à partir de la souche pathogène Listeria monocytogenes, de manière à comprendre par quel procédé l’ADN est transféré à des cellules eucaryotes. Nous avons détecté l’expression de mInIA par FACS et montré que la souche LLmInIA était plus invasive que la souche sauvage wt après co-incubation avec des cellules épithéliales intestinales (IECs) non confluentes ou polarisées. La microscopie confocale confirme ces propriétés d’invasivité de la souche LL-mLnLA capable de transférer plus efficacement le vecteur d’expression eucaryote codant pour l’allergène de la β-lactoglobuline, pValac :BLG, in vitro dans des IECs et dans des cellules dendritiques (DCs). La souche LL-mInIA a aussi la capacité de transférer le vecteur pValac:BLG à des DCs à travers une monocouche de IECs différenciées. Des essais in vivo montrent que des bactéries invasives du genre Lactococcus ont tendance à augmenter l’expression de BLG chez la souris. De plus, il est montré qu’une souche non invasive de LL, ou la souche invasive LL-mInIA, stimulent la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire IL-12 dans des DCs, et que, in vivo, après des essais d’immunisation oraux ou intra nasaux, la souche LL non invasive oriente la réponse immunitaire plutôt vers le type 1, alors que la souche LL invasive génère une réponse de type 2 chez des animaux immunisés. Tous ces résultats apportent un nouvel éclairage sur le mécanisme d’assimilation des lactocoques en tant que vecteurs de transfert de molécules actives. / The use of Lactic Acid Bacteria (LAB), such as Lactococcus lactis (LL), as DNA delivery vehicles represents an interesting strategy as they are regarded as safe. Wild type (wt) LL or recombinant invasive LL, were able to trigger DNA expression by epithelial cells both in vitro and in vivo. However, important information about how LL can transfer DNA plasmids is still missing. Therefore, we decided to construct a new recombinant invasive LL strain expressing mutated Internalin A (mInlA) from the pathogen Listeria monocytogenes to understand the manner by which the DNA is transferred to mammalian cells. mInlA expression was detected by FACS analysis and LL-mInlA strain showed to be more invasive than the wt strain after co-incubation assays with non-confluent or polarized intestinal epithelial cells (IECs). Confocal microscopy confirmed the invasive status of LL-mInlA which demonstrated to deliver more efficiently the eukaryotic expression vector coding the allergen β-lactoglobulin, pValac:BLG, in vitro to IECs and to dendritic cells (DCs). LL-mInlA was also capable to transfer pValac:BLG to DCs across a monolayer of differentiated IECs. In vivo, invasive lactococci tended to increase the number of mice expressing BLG. Moreover, noninvasive or invasive LL-mInlA stimulated the secretion of the pro-inflammatory cytokine IL-12 in DCs and, in vivo, after oral or intranasal immunization trials, non-invasive LL polarized the immune response more in the type 1 direction while invasive LL generated a Th2-type response in immunized animals. All these data gives new insights on the mechanism of lactococci uptake for delivery of therapeutics.

As bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos produzidos por algumas bactérias, que atuam como bio-conservantes e têm grande potencial de aplicação em produtos cárneos. Estudos mostram que as bacteriocinas de bactérias lácticas (BAL) a serem utilizadas em um determinado alimento são mais eficientes quando produzidas por bactérias lácticas isoladas do mesmo tipo de alimento. Este estudo objetivou obter novas BAL produtoras de bacteriocinas a partir de mortadela fatiada, caracterizar as bacteriocinas produzidas, obter a bacteriocina semi-purificada e verificar seu potencial de aplicação in vitro e in situ no controle de Listeria monocytogenes e na vida de prateleira (VDP) de mortadela fatiada. Foram obtidos 19 isolados de BAL comprovadamente produtoras de bacteriocinas, que foram avaliadas quanto ao espectro de ação frente a uma grande variedade de bactérias Gram positivas e Gram negativas, e estabilidade em diferentes pH. As que apresentaram melhor estabilidade e inibiram maior número de bactérias foram avaliadas quanto a estabilidade térmica e resistência a diferentes agentes químicos e concentrações de NaCl. As que apresentaram maior resistência foram submetidas a testes de otimização da produção da bacteriocina em diferentes combinações de tempo/temperatura. Com base nestes resultados, selecionou-se um isolado que identificado como Lactobacillus curvatus pelo sequenciamento do gene 16S e confirmado por reações de PCR com primers específicos. A bacteriocina produzida por este isolado foi submetida a uma purificação por extração ácida e aplicada em fatias de mortadela experimentalmente contaminadas com um pool de cepas de Listeria monocytogenes, observando-se as contagens deste patógeno durante o armazenamento em refrigeração (7°C) por 40 dias em embalagem à vácuo. Paralelamente, foi realizada contagem de bactérias láticas para avaliar o efeito da bacteriocina nesta população, responsável pela VDP deste produto. A bacteriocina parcialmente purificada foi capaz de reduzir em 1 ciclo logarítmico a população inicial de Listeria monocytogenes na mortadela fatiada, que foi mantida durante os 40 dias de análise. Durante toda a VDP, a contagem de L. monocytogenes permaneceu constante, sem multiplicação nas condições de armazenamento do produto tanto nas amostras testes quanto controle. A bacteriocina semi-purificada não teve ação inibitória contra as bactérias lácticas presentes no produto e portanto não teve impacto na VDP do produto. Os resultados indicaram que a bacteriocina produzida pelo isolado L. curvatus RJC 1 apresenta potencial de aplicação em produtos cárneos fatiados como bioconservante. / Bacteriocins are peptides with antimicrobial properties produced by some bacteria, that act as bio-preservatives with great potential of application in meat products. Several studies show that bacteriocins from lactic acid bacteria (LAB) to be used in a specific food product have a better performance when produced by LAB isolated from the same kind of product. This study aimed to obtain new bacteriocinogenic LAB from sliced Bologna, to characterize the bacteriocins produced, to obtain a semi-purified bacteriocin, and to verify its potential of application in vitro and in situ in the control of Listeria monocytogenes and in the shelf-life of sliced bologna. 19 bacteriocin producer LAB, were evaluated as to spectrum of action against a great variety of Gram positives and Gram negatives bacteria and pH stability. The ones with better stability and that inhibited a larger number of bacteria were evaluated according to its thermal stability and resistance against different chemical agents and NaCl concentrations. The ones that showed better resistance were submitted to tests to optimize the bacteriocin production in different combinations of time and temperature. Based on these results, one was selected, identified as Lactobacillus curvatus by gene 16S sequencing and confirmed by PCR reactions with specific primers. The bacteriocin produced by this strain was submitted to partial purification by acid extraction and was applied in mortadella slices experimentally contaminated with a pool of L. monocytogenes strains, observing the counts of this pathogen along refrigerated (7ºC) storage fo r 40 days in vacuum package. Parallel, it was done LAB counts to evaluate the effect of the bacteriocin on this population, responsible for limiting the shelf life of this product. The semi-purified bacteriocin was able to reduce 1 log cicle of the initial population of L. monocytogenes in the sliced mortadella, which was maintained during the 40 days of analysis. Along the whole shelf-life, the counts of L. monocytogenes remained constant, without multiplication in the storage conditions in the test samples as well as in the control samples. The semi-purified bacteriocin did not act against de LAB naturally present at the product, having no impact in the shelf life of the product. The results indicated that the bacteriocin produced by the isolated L. curvatus RJC 1 presents potential of application in sliced deli products as a bio-preservative.

As bactérias patogênicas são os principais agentes que contaminam alimentos e podem prejudicar a saúde humana. Para tentar combater e controlar a contaminação de alimentos investigam-se novos compostos que apresentam atividade antimicrobiana. O ramnolipídeo (RL) é um biossurfatante (BS) produzido por Pseudomonas spp. que apresenta elevada biodegradabilidade e, baixa toxicidade além de potencial antimicrobiano. O objetivo desse trabalho foi estudar a atividade antimicrobiana do RL frente às bactérias patogênicas Gram positivas, Bacillus cereus (ATCC 33018), Listeria monocytogenes (ATCC 19112), Staphylococcus aureus (ATCC 8095) e Gram negativas, Escherichia coli (EHEC) (ATCC 43895) e Salmonella enterica (ATCC 13076) além de contribuir na elucidação do mecanismo de ação destes compostos. Os testes de susceptibilidade ao RL foram realizados a partir da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) utilizando a técnica de micro-diluição. O efeito do pH sobre a atividade antimicrobiana foi avaliado na faixa de pH 5 a 9. Para avaliação do mecanismo de ação foram realizados ensaios de permeabilidade celular, espectroscopia de infravermelho e hidrofobicidade celular. O RL apresentou atividade antimicrobiana para as bactérias B. cereus em CIM 19,5 &#956g/mL e CBM 39,1 &#956g/mL, e para L. monocytogenes CIM 156,2 &#956g/mL e CBM 312,5 &#956g/mL. Para B. cereus apresentou efeito bactericida a partir de 30 minutos na CBM, e para L. monocytogenes em 8 horas de incubação com o RL na CBM. As bactérias Gram negativas E. coli e S. enterica mostraram-se resistentes ao RL. O pH influenciou a ação antimicrobiana do RL sendo mais efetivo em pH mais ácidos. O tratamento com RL promoveu redução da hidrofobicidade da superfície celular das bactérias sensíveis. Os espectros infravermelhos evidenciaram alterações na composição química da membrana/parede celular principalmente para bactérias Gram positivas. A permeabilidade da membrana celular aumentou de acordo com o aumento da concentração de RL. A atividade antimicrobiana do RL foi evidenciada para as bactérias Gram positivas sendo mais sensíveis B. cereus e L. monocytogenes. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que o RL promove alterações na permeabilidade e composição química da membrana celular bacteriana sendo um agente potencial para controle de bactérias Gram positivas de importância alimentar. / Pathogenic bacteria are main agents that contaminate food and are harmful to human health. The search for new compounds to combat and control food pathogens is of increasing interest. Rhamnolipid (RL) is a biosurfactant (BS) typically produced by Pseudomonas spp., showing high biodegradability, low toxicity and antimicrobial activity. This study aimed to evaluate the antimicrobial activity of RL against the food pathogenic Gram positive bacteria Bacillus cereus (ATCC 33018), Listeria monocytogenes (ATCC 19112), Staphylococcus aureus (ATCC 8095) and Gram negative, Escherichia coli (EHEC) (ATCC 43895) and Salmonella enterica (ATCC 13076) and also contribute to the elucidation of RL mechanism of action. Susceptibility tests were performed by determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) using the broth microdilution method. The effect of pH on antimicrobial action was also investigated ranging from 5 to 9. Mechanism of action was studied using membrane permeability, infrared spectroscopy and cell hydrophobicity assays. The MIC value for B. cereus was 19.5 &#956g/mL and MBC was 39.1 &#956g/mL. L. monocytogenes was inhibited at concentration 156.2 &#956g/mL showing MBC of 312.5 &#956g/mL. B. cereus presented bactericidal effect after 30 minutes and for L. monocytogenes after 8 hours. The Gram-negative E. coli and S. enterica were resistant to RL. The pH influence antimicrobial activity of the RL showing decreasing MIC values at acidic conditions. Cell hydrophobicity was reduced by RL for the sensitive bacteria. Infrared spectroscopy showed that RL induced changes in chemical composition of cell membrane/ wall especially for the Gram positive bacteria. Cell permeability also increases as RL concentration increases. Antimicrobial activity of RL was evidenced for Gram positive bacteria and the most sensitive were B. cereus and L. monocytogenes. The results of this study suggest that rhamnolipid biosurfactant promotes changes in the permeability and membrane chemical composition showing potential to control foodborne Gram positive bacteria.

A formação de biofilmes é um fator preocupante para indústria de alimentos, pois pode comprometer a sanitização de superfícies de contato e aumentar o risco de contaminação por patógeno em alimentos processados. L. monocytogenes é uma bactéria de ampla distribuição no ambiente e com capacidade de formar biofilmes e sobreviver por longos períodos em condições adversas. Esta bactéria pode causar doenças em pessoas imunocomprometidas e mulheres grávidas manifestando-se por infecções do sistema nervoso central, abortos e nascimentos prematuros. Vários estudos têm demonstrado que algumas bactérias podem sofrer transição para o estado viável mas não cultivável em resposta ao estresse. Considerando-se a importância da garantia da segurança e qualidade dos alimentos, há necessidade de desenvolvimento e de padronização de técnicas rápidas para a quantificação de células viáveis de L. monocytogenes em alimentos e biofilmes. Neste estudo foi avaliada a formação de biofilmes e viabilidade celular de Listeria monocytogenes em condições de estresse. Foram utilizadas técnicas de semeadura em placa e quantificação direta por microscopia de fluorescência com os corantes cloreto de 5-ciano-2,3-di-(p-tolil) tetrazólio (CTC) e 4,6-diamino-2- fenilindol (DAPI). Foram também realizados ensaios preliminares para padronização da Reação da Polimerase em Cadeia em tempo real (PCR em tempo real) com amostras previamente tratadas com brometo de etídio monoazídico (EMA). Os resultados obtidos demonstraram que o método de semeadura em placa foi adequado somente para a enumeração de células viáveis de L. monocytogenes em biofilmes enquanto que o método de enumeração por microscopia de fluorescência com CTC-DAPI permitiu quantificar bactérias no estado viável e viável mas não cultivável. Também foi observado que a presença de bacteriocinas de L. sakei 1 e L. mensenteroides 11 causou a diminuição na viabilidade e formação de biofilmes por L. monocytogenes. Os resultados preliminares utilizando culturas puras de L. monocytogenes demonstraram que o tratamento com brometo de etídio monoazídico (EMA) antes da análise por PCR em tempo real reduziu a amplificação do DNA de células mortas em 1 log de UFC por mL. No entanto dependendo da concentração utilizada, pode ocorrer também a inibição da amplificação de células viáveis de L. monocytogenes. Os resultados do presente trabalho indicaram que a microscopia de fluorescência é comparável à placa para análise de células de L. monocytogenes não estressadas. Entretanto, para a quantificação de L. monocytogenes submetida a estresse, é desejável a utilização de corantes de viabilidade celular. O método de PCR em tempo real com pré-tratamento com EMA é promissor mas, ainda necessita de maior padronização para avaliação de sua aplicabilidade na determinação seletiva de células viáveis de L. monocytogenes. / Biofilm formation is of great concern for food industry because it may compromise sanitization of surfaces and increase contamination risk of processed foods by bacterial pathogens. L. monocytogenes is an ubiquitous bacterium which is able to form biofilms and to survive for long periods under adverse conditions. L. monocytogenes may cause disease in immunocomprommised people and pregnant women, manifesting as central nervous system infections, abortion and premature birth. Some bacteria can undergo transition to viable but non-cultivable state in response to stress and it is important to study techniques for rapid quantification of viable cells of L. monocytogenes in foods. In this study biofilm formation and cell viability of Listeria monocytogenes were studied in stress conditions by plate counting, direct quantification by fluorescence microscopy with double staining dyes 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)/4\'-6 diamino-2 phenylindole (DAPI). Preliminary experiments with real time polymerase chain reaction and treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) were also performed. The results showed that plate count method was suitable for enumeration only of viable cells of L. monocytogenes in biofilms since, fluorescence microscopy with CTC-DAPI yielded higher counts, probably due to the presence of viable but nonculturable cells. It was also observed that the presence of bacteriocins of L. sakei 1 and L. mensenteroides 11 decreased viability and formation of biofilm by L. monocytogenes. Results obtained with pure cultures of L. monocytogenes showed that the treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) before real time PCR detection, reduced DNA amplification of dead cells in 1 log CFU per mL, but depending on the concentration used, EMA also inhibited amplification of viable cells of L. monocytogenes. The results indicated that plate counting and fluorescence microscopy are equivalent for enumeration of non-stressed L. monocytogenes cells. However, the use of double staining with fluorescence microscopy is a more suitable method if stressed cells are present. The EMA-real time PCR is a promissing tool for rapid evaluation of viable L. monocytogenes, but it needs further standartization.