Listeria monocytogenes causa a listeriose, uma doença zoonótica grave que causa infecções do sistema nervoso central (meningite, encefalite e meningoencefalite), bacteremia primária e septicemia. A doença apresenta baixa morbidade e alta mortalidade e acomete, principalmente, grupos de risco, como mulheres grávidas, neonatos, indivíduos imunocomprometidos e idosos. L. monocytogenes tem sido encontrada com freqüência em alimentos in natura e/ou processados, como queijos e outros produtos lácteos. Esse estudo objetivou isolar bactérias lácticas a partir de leite de cabra, capazes de produzir peptídeos antimicrobianos (bacteriocinas), identificar estas cepas, caracterizar as bacteriocinas produzidas e avaliar o seu potencial de aplicação no controle da multiplicação de L. monocytogenes em queijo de cabra durante armazenamento a 8-10°C. Trabalhando-se com leite de cabra cru, foi possível isolar seis cepas produtoras de bacteriocinas (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi, DF5Mi, DF6Mi e DF60Mi). Através de testes fenotípicos apropriados e sequenciamento do 16S rRNA, essas cepas foram identificadas como Lactococcus lactis subsp. lactis (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi e DF5Mi), Leuconostoc lactis (DF6Mi) e Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (DF60Mi). A caracterização físico-química e biológica das bacteriocinas produzidas pelas cepas DF4Mi, DF6Mi e DF60Mi indicou que eram resistentes ao calor e extremos de pH, mas apresentavam características diferentes em relação ao espectro de ação, sensibilidade a agentes químicos, adsorção à células-alvo e lise das células de L. monocytogenes. O efeito do pH, temperatura e composição do meio de cultura na produção das bacteriocinas foi também cepa-dependente. A cepa DF4Mi apresentou melhor atividade antimicrobiana e foi selecionada para o estudo de inibição de L. monocytogenes em queijos. Para isso, foram preparados lotes de queijo frescal, feito com leite de cabra pasteurizado adicionado e não adicionado da cepa DF4Mi (106 UFC/mL), experimentalmente contaminado com L. monocytogenes (103 UFC/g), além dos controles positivo (queijo adicionado de nisina 12,5 mg/Kg) e negativo (leite adicionado de uma cepa de L. lactis subsp. lactis não bacteriocinogênica). Observou-se que a cepa DF4Mi apresentou efeito bacteriostático no queijo, sendo capaz de inibir a multiplicação do patógeno durante o armazenamento a 8-10°C por 10 dias. No entanto, inibição semelhante foi obtida nos queijos com a bactéria lática não bacteriocinogênica, indicando que a inibição não pode ser creditada às bacteriocinas. Nos queijos-controle com nisina, foi observada uma redução de 2 log na contagem de L. monocytogenes após 10 dias a 8-10°C. Já nos queijos preparados sem nisina e sem nenhuma bactéria lática, as contagens de L. monocytogenes atingiram contagens elevadas (106 UFC/g) após 10 dias de armazenamento a 8-10°C. / Listeria monocytogenes causes listeriosis, a serious zoonotic disease that causes infections in the central nervous system (meningitis, encephalitis and meningoencephalitis), bacteremia and septicemia. The disease presents low morbidity and high mortality and affects mainly those in the risk group, such as pregnant women, neonates, immunocompromised individuals and the elderly. L. monocytogenes has been frequently detected in in natura and processed foods. Like cheeses and other dairy products. This study aimed to isolate lactic acid bacteria capable of producing antimicrobial compounds from goat milk, identify the isolates, characterize the bacteriocins and evaluate their potential application in controlling the growth of L. monocytogenes in goat cheese during storage at 8-10°C. Six bacteriocinogenic strains (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi, DF5Mi, DF6Mi e DF60Mi) were successfully isolated from raw goat milk. Using appropriate phenotypic tests and 16S rRNA sequencing, these strains were identified as Lactococcus lactis subsp. lactis (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi e DF5Mi), Leuconostoc lactis (DF6Mi) and Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (DF60Mi). The physico-chemical and biological characterization of the bacteriocins produced by the strains DF4Mi, DF6Mi e DF60Mi indicated that they were resistant to heat and pH extremes, but presented different spectrum of activity, sensitivity to chemicals, adsorption to target cells and lysis of L. monocytogenes. The effect of pH, temperature and culture media composition in bacteriocin production was also strain-dependent. The strain DF4Mi presented the best antimicrobial activity and was selected for the studies on inhibition of L. monocytogenes in cheese. Frescal cheese was manufactured with pasteurized goat milk added of a culture of DF4Mi (106 CFU/mL), and experimentally contaminated with L. monocytogenes (103 CFU/g). Control cheeses were also prepared: those added of 12.5 mg/Kg nisin (positive control) and those added of a non-bacteriocinogenic L. lactis subsp. lactis strain. The strain presented a bacteriostatic effect, controlling the growth of the pathogen for 10 days at 8-10°C. However, a similar effect was observed in the cheeses prepared with the non-bacteriocinogenic strain, indicating that the inhibition cannot be credited to bacteriocins. In the cheeses containing nisin, a 2 log reduction in the counts of L. monocytogenes was achieved after 10 days at 8-10°C. In the cheeses with no added nisin or lactic acid bacteria, the counts of L. monocytogenes after 10 days at 8-10°C were high (106 CFU/g).

As bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos produzidos por algumas bactérias, que atuam como bio-conservantes e têm grande potencial de aplicação em produtos cárneos. Estudos mostram que as bacteriocinas de bactérias lácticas (BAL) a serem utilizadas em um determinado alimento são mais eficientes quando produzidas por bactérias lácticas isoladas do mesmo tipo de alimento. Este estudo objetivou obter novas BAL produtoras de bacteriocinas a partir de mortadela fatiada, caracterizar as bacteriocinas produzidas, obter a bacteriocina semi-purificada e verificar seu potencial de aplicação in vitro e in situ no controle de Listeria monocytogenes e na vida de prateleira (VDP) de mortadela fatiada. Foram obtidos 19 isolados de BAL comprovadamente produtoras de bacteriocinas, que foram avaliadas quanto ao espectro de ação frente a uma grande variedade de bactérias Gram positivas e Gram negativas, e estabilidade em diferentes pH. As que apresentaram melhor estabilidade e inibiram maior número de bactérias foram avaliadas quanto a estabilidade térmica e resistência a diferentes agentes químicos e concentrações de NaCl. As que apresentaram maior resistência foram submetidas a testes de otimização da produção da bacteriocina em diferentes combinações de tempo/temperatura. Com base nestes resultados, selecionou-se um isolado que identificado como Lactobacillus curvatus pelo sequenciamento do gene 16S e confirmado por reações de PCR com primers específicos. A bacteriocina produzida por este isolado foi submetida a uma purificação por extração ácida e aplicada em fatias de mortadela experimentalmente contaminadas com um pool de cepas de Listeria monocytogenes, observando-se as contagens deste patógeno durante o armazenamento em refrigeração (7°C) por 40 dias em embalagem à vácuo. Paralelamente, foi realizada contagem de bactérias láticas para avaliar o efeito da bacteriocina nesta população, responsável pela VDP deste produto. A bacteriocina parcialmente purificada foi capaz de reduzir em 1 ciclo logarítmico a população inicial de Listeria monocytogenes na mortadela fatiada, que foi mantida durante os 40 dias de análise. Durante toda a VDP, a contagem de L. monocytogenes permaneceu constante, sem multiplicação nas condições de armazenamento do produto tanto nas amostras testes quanto controle. A bacteriocina semi-purificada não teve ação inibitória contra as bactérias lácticas presentes no produto e portanto não teve impacto na VDP do produto. Os resultados indicaram que a bacteriocina produzida pelo isolado L. curvatus RJC 1 apresenta potencial de aplicação em produtos cárneos fatiados como bioconservante. / Bacteriocins are peptides with antimicrobial properties produced by some bacteria, that act as bio-preservatives with great potential of application in meat products. Several studies show that bacteriocins from lactic acid bacteria (LAB) to be used in a specific food product have a better performance when produced by LAB isolated from the same kind of product. This study aimed to obtain new bacteriocinogenic LAB from sliced Bologna, to characterize the bacteriocins produced, to obtain a semi-purified bacteriocin, and to verify its potential of application in vitro and in situ in the control of Listeria monocytogenes and in the shelf-life of sliced bologna. 19 bacteriocin producer LAB, were evaluated as to spectrum of action against a great variety of Gram positives and Gram negatives bacteria and pH stability. The ones with better stability and that inhibited a larger number of bacteria were evaluated according to its thermal stability and resistance against different chemical agents and NaCl concentrations. The ones that showed better resistance were submitted to tests to optimize the bacteriocin production in different combinations of time and temperature. Based on these results, one was selected, identified as Lactobacillus curvatus by gene 16S sequencing and confirmed by PCR reactions with specific primers. The bacteriocin produced by this strain was submitted to partial purification by acid extraction and was applied in mortadella slices experimentally contaminated with a pool of L. monocytogenes strains, observing the counts of this pathogen along refrigerated (7ºC) storage fo r 40 days in vacuum package. Parallel, it was done LAB counts to evaluate the effect of the bacteriocin on this population, responsible for limiting the shelf life of this product. The semi-purified bacteriocin was able to reduce 1 log cicle of the initial population of L. monocytogenes in the sliced mortadella, which was maintained during the 40 days of analysis. Along the whole shelf-life, the counts of L. monocytogenes remained constant, without multiplication in the storage conditions in the test samples as well as in the control samples. The semi-purified bacteriocin did not act against de LAB naturally present at the product, having no impact in the shelf life of the product. The results indicated that the bacteriocin produced by the isolated L. curvatus RJC 1 presents potential of application in sliced deli products as a bio-preservative.

Surtos e casos de listeriose reportados mundialmente e associados a produtos cárneos processados prontos para consumo podem ter sido causados pela contaminação cruzada com Listeria monocytogenes ocorrida durante a etapa de fatiamento destes produtos no varejo. Considerando o impacto da contaminação cruzada para a saúde pública, este trabalho teve por objetivo estudar a transferência de L. monocytogenes durante a etapa de fatiamento de rosbife do tipo \"caseiro\", simulando, em laboratório, cenários observados em estabelecimentos comerciais em relação às práticas adotadas durante o fatiamento. Objetivou-se também avaliar o papel do nível da contaminação do produto (baixo e alto) causador da contaminação experimental do fatiador na contaminação cruzada resultante, bem como avaliar se a exposição da cepa de L. monocytogenes a um sanitizante em concentração insuficiente para a sua eliminação influencia a contaminação cruzada observada. A contaminação do fatiador foi obtida por meio do fatiamento de peças de rosbife experimentalmente contaminadas com o patógeno por imersão em uma suspensão de L. monocytogenes contendo 8 log UFC/mL (alto nível de contaminação) e 4 log UFC/mL (baixo nível de contaminação). Os experimentos foram realizados até a obtenção de 200 fatias. As enumerações de L. monocytogenes nas fatias obtidas foram feitas empregando-se um método cultura-dependente (ISO 11290-2:1998) e um método qPCR, calculando-se também as taxas de transferência. Os resultados mostraram que a contaminação dos fatiadores resultou na transferência do patógeno até pelo menos a 120&#170; fatia de uma nova peça de rosbife fatiada posteriormente. Nos experimentos realizados com L. monocytogenes exposta ao sanitizante Oasis Compac 22 Quat em concentração insuficiente para sua eliminação, foi possível enumerar o patógeno até a 200ª fatia de rosbife obtida após a contaminação experimental do fatiador, independentemente do nível de contaminação da peça de rosbife usada para a contaminação do fatiador. Equações matemáticas resultantes, que descrevem os dados experimentais obtidos, apresentaram R2>0,7 e p<0,05, mostrando bom ajuste. Esses resultados ressaltam a importância de medidas para evitar a ocorrência de contaminação cruzada durante a etapa de fatiamento de produtos cárneos prontos para o consumo, bem como da higienização adequada dos equipamentos utilizados, de forma a fornecer produtos seguros para o consumidor. / Outbreaks and cases of listeriosis reported worldwide and associated to ready-to-eat meat products may have been caused by cross contamination with Listeria monocytogenes occurred during the slicing step of these products at retail. Considering the impact of cross-contamination to public health, this study aimed to study the transfer of L. monocytogenes during the slicing step of homemade type roast-beef simulating in the laboratory scenarios seen in commercial establishments. The study also aimed to evaluate the role of product contamination level (low and high) causing the experimental contamination of the slicer in the resulting cross-contamination and to evaluate if the exposure of the L. monocytogenes strain to a sanitizer in insufficient concentration for the elimination influences the observed cross-contamination. Contamination of the slicer was obtained through the slicing of roast-beef pieces experimentally contaminated with the pathogen by immersion in a suspension of L. monocytogenes containing 8 log CFU/ml (high contamination) and 4 log CFU/mL (low contamination). The experiments were carried out to obtain 200 slices. Enumerations of L. monocytogenes in the slices employed a culture-dependent method (ISO 11290-2: 1998) and qPCR method, also calculating transfer rates. The results showed that contamination of slicers resulted in the transfer of the pathogen to at least the 120th slice of a new piece of roast-beef sliced subsequently. In experiments conducted with L. monocytogenes exposed to the sanitizer Oasis Compac 22 Quat in insufficient concentration for its elimination, the pathogen could be enumerated until the 200th slice obtained after the slicer contamination, regardless of the contamination level of the roast beef used for contamination of the slicer. Mathematical equations describing the experimental data presented R2>0.7 and p<0.05, showing good fit. These results underscore the importance of measures to prevent the occurrence of cross contamination during the slicing step of ready-to-eat meat products, as well as the proper cleaning of the equipment used in order to provide safe products to the consumer.

O efeito combinado de bacteriocina produzida por Lacfobacillus sake 2ª e embalagem em atmosfera modificada sobre o controle de Lisferia monocytogenes F5069r em lingüiça frescal foi avaliado. A cepa L. sake 2a foi co-inoculada com L. monocytogenes F5069r (resistente a cloranfenicol e eritromicina) em lingüiça frescal. As lingüiças foram embaladas com ar, 100% CO2 ou 50%CO2/50%N2 e armazenadas a 6°C. A multiplicação de L. Monocytogenes F5069r e L. sake 2a foi monitorada durante 4 semanas em intervalos de 7 dias. A avaliação sensorial, por meio do teste triangular, foi realizada após 5 e 11 dias, os quais foram estipulados de acordo com a vida-de-prateleira do produto. Após 28 dias de estocagem, a população de L. monocytogenes nas amostras inoculadas com L. sake 2a e embaladas com atmosfera modificada foi 6.4 ciclos logarítmicos menor que no controle sem a bactéria lática e embalado em ar. No entanto, a influência da atmosfera modificada sobre as características sensoriais do produto foram detectáveis após cinco dias de estocagem, independente da adição de L. sake 2a. Ao final da primeira semana, a influência de L. sake 2a sobre L. monocytogenes foi menos importante (redução de 0,4 log, não significante) que a influência da embalagem em atmosfera modificada (redução de 1,4 log, significante). No décimo primeiro dia, nenhuma diferença sensorial foi encontrada entre as amostras com e sem L. sake 2a embaladas em atmosfera modificada. Após 14 dias, a população de L. monocyfogenes nas amostras com L. sake 2ª embaladas em atmosfera modificada foi 3,5 log menor que no controle sem a bactéria lática e embalado em ar. Os resultados sugerem que o uso combinado de atmosfera modificada e bacteriocina produzida por L. sake 2a apresenta um efeito sinergístico sobre o controle de L. monocytogenes F5069r em lingüiça frescal refrigerada. / Lactobacillus sake 2a is a bacteriocinogenic strain isolated from \"lingüiça frescal\", a Brazilian sausage. The combined effect of modified-atmosphere packaging and addition of L. sake 2a on inhibition of L. monocyfogenes in \"lingüiça\" was evaluated. Samples were inoculated with L. monocytogenes and/or L. sake 2a, packed with oxygen-permeable film, 100%CO2 or 50%CO2+50%N2 and stored at 6°C. Microbial counts were performed weekly. Sensorial evaluation (triangle tests with 16 subjects) was performed after 5 and 11 days (shelf-life). After the fourth week, L. monocytogenes population in samples packed with modified atmosphere containing L. sake 2a was 6.4 log lower than in samples without any treatment. However, the influence of the modified atmosphere on the sensorial characteristics of the product was already detectable on the fifth day (a risk of 5%), regardless the addition of L. sake 2a. By the end of the first week, the influence of L. sake 2a on the inhibition of L. Monocytogenes was less important (reduction of 0.4 log, non significant) than the influence of the packaging (reduction of 1.4 log, significant). On the 11th day, no significant sensorial difference was found between the samples with and without L. sake 2a packed with modified atmosphere. By the end of the second week, L.monocytogenes counts in samples packed with modified atmosphere containing L. sake 2a were 3.5 log lower than counts in samples without any treatment. Combination of results suggests that modified atmosphere and L. sake 2a act synergistically on inhibition of L. monocytogenes in \"lingüiça frescal\".

Listeria monocytogenes é conhecida como um importante patógeno causador de doenças transmitidas por alimentos na última década. Apesar do número de casos por ano ser relativamente baixo, a infecção pode ser grave, com mortalidades acima de 30%. Pesquisas realizadas no Brasil relataram uma incidência de 32% em amostras de produtos cárneos, e o microrganismo foi encontrado em 80% das amostras lingüiças frescal de carne suína. Apesar dos recentes avanços nas tecnologias de controle de patógenos em alimentos, os consumidores têm procurado alimentos \"naturais\", isto é, submetidos a tratamentos menos agressivos e isentos de conservadores químicos. Antimicrobianos naturais são uma opção interessante, mas sua aplicação requer uma melhor compreensão de sua funcionalidade nos alimentos. Os óleos essenciais e seus compostos fenólicos estão se tornando agentes antimicrobianos naturais bastante populares, assim como a nisina, uma bacteriocina produzida por Lactococcus lactis subsp. lactis. Esta pesquisa foi desenvolvida para avaliar o efeito de óleo essencial de orégano (O.E.O.) e de nisina, individualmente ou em combinação, na inibição da multiplicação de Listeria monocytogenes Scott A in vitro (meio de cultura) e in situ -(lingüiça frescal suína). A atividade inibitória foi testada pela metodologia de difusão em poços, e os halos de inibição foram medidos 24 horas após a incubação à 37ºC. Foram testadas as concentrações 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% e 0,5% (v/v) de O.E.O. e 0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 e 2000 ppm de nisina. Quando o óleo essencial foi usado em combinação com a nisina foi observado um efeito sinérgico na inibição de L. monocytogenes. As concentrações que apresentaram o maior efeito contra o patógeno nos testes in vitro, ou seja 0,5% (v/v) O.E.O. com 200 ppm de nisina, foram utilizadas nos experimentos com três formulações diferentes lingüiça frescal, contendo pernil de porco, sal (2%), nitrito (0,015%), condimentos, emulsificantes e antioxidantes, experimentalmente contaminadas com L. monocytogenes Scott A (106 UFC/g). A multiplicação do patógeno foi monitorada no produto refrigerado a 5oC por até 10 dias, através da contagem em placas. Controles sem antimicrobianos também foram estudados. Os resultados indicaram que o O.E.O., usado isoladamente, não conferiu proteção ao alimento. A nisina causou uma redução de 2 log imediatamente após o contato com o microrganismo, mas durante o armazenamento, as células sobreviventes apresentaram a mesma taxa de multiplicação que na lingüiça controle (??0,05), mantendo as contagens 2 log inferiores as do controle por até 9 dias. Quando os dois antimicrobianos foram usados em combinação, a redução imediata após o contato foi de 4 log, e, quando comparado ao controle, a taxa de multiplicação durante o armazenamento a 5oC foi significativamente mais altas que no controle (??0,05). Entretanto, as amostras de lingüiça contendo esses antimicrobianos nas concentrações testadas não foram aprovadas nos testes sensoriais de aceitação (??0,05). Esses resultados indicam que a combinação desses antimicrobianos pode ser utilizada como uma barreira adicional para a multiplicação de L.monocytogenes em lingüiça frescal suína, mas os atributos sensoriais que conferem ao produto podem limitar sua aplicação. / Listeria monocytogenes has been recognized as an important foodborne pathogen for the past decade. Although the number of cases per annum is relatively low, the infections can be acute, with mortality up to 30%. In Brazil, some works reported that 32% of dairy meat products were contaminated with L. monocytogenes, and this organism was found in 80% of fresh pork sausage. In spite of modern improvements in food production techniques, the consumers are seeking for \"natural\" food products, i.e., not submitted to aggressive treatments or added of chemical preservatives. Natural antimicrobials are a promising option, but their application requires a better understanding of their functionality in foods. Naturally occurring antimicrobial agents, such as essential oils and their phenolic components, are becoming increasingly popular as preservation agents. Other compound with increased application in foods is nisin, a bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp. lactis. This study aimed to evaluate the antimicrobial effect of oregano essential oil (O.E.O.) and nisin, individually or in combination, on the inhibition of growth of Listeria monocytogenes Scott A in vitro (agar culture medium) and in situ (fresh pork sausage). The inhibitory activity was tested by the well diffusion method, measuring the inhibition halos after 24hours incubation at 37ºC. The concentrations tested were 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5% (v/v) for OEO and 0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 and 2000 ppm for nisin. When the essential oil was used in combination with nisin, a synergistic effect was observed for L. monocytogenes, i.e., the oil enhanced the activity of the bacteriocin. The combination 0.5% (v/v) O.E.O. with 200 ppm nisin presented the best results and was used to test the functionality in fresh pork sausage prepared with three different formulations, containing deboned minced pork meat, 2% salt and 0.015% nitrite, plus spices, emulsifier and antioxidant, and experimentally contaminated with L. monocytogenes Scott A (106 CFU/g). The growth of the pathogen was monitored in the refrigerated product (5oC) up to 10 days, by means of plate counting. Controls without antimicrobials were included in the experiments. Results indicated that O.E.O., used alone, was not effective. Nisin alone caused a 2-log reduction immediately after contact, but during storage the surviving cells presented the same multiplication rate as in the control (? ? 0.5), keeping the counts 2 log lower up to 9 days. When used in combination, the two antimicrobials caused a 4-log count reduction immediately after addition and, when compared to the control, the multiplication rate of the surviving cells during storage under refrigeration up to 10 days was significantly higher (? ? 0.5). However, samples containing these antimicrobials in the tested concentrations failed the sensorial acceptance tests (? ? 0.5). These results indicate that the combination of these antimicrobials can be an additional hurdle for the control of L. monocytogenes in fresh pork sausages, but the final sensorial attributes of the product may hamper their application.

Não consta resumo na publicação. / Abstract not available.

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo responsável por listeriose, uma doença de origem alimentar. Dentre os 13 sorotipos de L. monocytogenes existentes, o sorotipo 4b é o mais freqüentemente isolado de humanos, enquanto os sorotipos 1/2a, 1/2b e 1/2c são mais freqüentes em alimentos e amostras ambientais. O estudo da variabilidade de virulência de quatro cepas de L. monocytogenes recentemente isoladas (1/2B - alimento; 1/2C e 4BENV - ambiente de processamento de alimento; 4BCLIN - sangue), além de duas outras cepas de casos de listeriose (P14 e P14A), foi o objetivo deste trabalho. Avaliou-se a capacidade de invasão, proliferação intracelular, citotoxicidade, disseminação intercelular, polimerização de filamentos de actina e transcrição gênica dos genes de virulência actA, plcA e plcB das cepas em modelos celulares eucarióticos MDBK, HeLa e L929. A cepa de origem alimentar 1/2B apresentou características de invasão, taxa de multiplicação (IGC), assim como a disseminação intercelular, semelhantes às cepas clínicas P14 e 4BCLIN em células HeLa. As cepas de origem ambiental (1/2C e 4BENV), apesar da baixa capacidade de invasão em todas linhagens celulares empregadas, apresentaram IGC superior às demais cepas estudadas e disseminação intercelular superior ou similar às cepas clínicas, dependendo da célula eucariótica. As cepas de origem clínica 4BCLIN, P14, P14A tiveram maiores porcentagens de invasão nas linhagens MDBK e L929, porém, em relação à população intracelular (UFC/mL), as cepas 4BCLIN e P14A foram superiores às demais. Estas últimas também foram citotóxicas às células HeLa, induzindo à liberação de LDH e à morte por necrose. Já as cepas de origem alimentar, ambiental e a cepa clínica P14 não foram citotóxicas às células HeLa e MDBK. Em relação à polimerização dos filamentos de actina não houve diferença estatística entre as cepas. Todos os genes de virulência estudados apresentaram maior número de transcritos para as cepas de origem não clínica (1/2B, 1/2C e 4BENV). Sendo assim, todas as cepas de L. monocytogenes estudadas possuem potencial patogênico, por apresentar pelo menos duas características relacionadas à virulência da espécie. Alimentos possivelmente contaminados com estas cepas representam risco à saúde pública. / Listeria monocytogenes is a facultative intracellular pathogen responsible for listeriose, a foodborne disease. Amongst the 13 serotypes of L. monocytogenes, the serotype 4b is more frequently isolated from clinical samples while the serotypes 1/2a, 1/2b and 1/2c are associated with food and food processing environment. The study of the virulence variability of four L. monocytogenes strains recently isolated (1/2B - food; 1/2C and 4BENV - food processing environment; 4BCLIN blood), as well as two strains of listeriosis (P14 and P14A) was the aim of this work. Eukaryotic cellular models HeLa, MDBK and L929 were used to evaluate the invasion capacity, intracellular proliferation, cytotoxicity, intercellular dissemination and polymerization of actin tails of L. monocytogenes strains. Gene transcription of the virulence genes actA, plcA and plcB was also conducted. The food isolate 1/2B presented invasion characteristics, multiplication index (IGC), as well as the intercellular dissemination, similar to the clinical strains P14 and 4BCLIN in HeLa cells. Environmental strains (1/2C and 4BENV), although showing a low capacity of invasion in all cellular models, had the highest IGC comparing to the other isolates. They also showed similar to or higher intercellular dissemination than the clinical ones, depending on the cell line used. The clinical strains 4BCLIN, P14, P14A presented greater invasion capacity in MDBK and L929 cells than all other isolates. However, in relation to the intracellular population (CFU/mL) the isolates 4BCLIN and P14A showed superior results. These strains were also cytotoxic to HeLa cells, inducing LDH release and death due to necrosis. The food, environmental and P14 isolates were not cytotoxic to HeLa and MDBK cells. There was no statistical difference in actin tail polymerization between the strains. The non-clinical isolates (1/2B, 1/2C and 4BENV) presented higher number of transcripts for than the clinical ones. In conclusion, all L. monocytogenes strains studied showed pathogenic potential, based on expression of at least two characteristics related to the virulence of the species. The presence of these strains in food represents public health risk.

Listeria monocytogenes é um microrganismo conhecido como causador de enfermidades transmitidas por alimentos desde a década de 80 quando foram descritos surtos de listeriose ocorridos na América do Norte e Europa. Dentre os alimentos de origem animal que veiculam esse patógeno, as aves e seus produtos têm merecido atenção especial por parte de alguns pesquisadores devido à associação feita entre aves e uma possível contaminação durante o processamento, acarretando a contaminação dos produtos finais. Os objetivos desta pesquisa foram avaliar a ocorrência de L. monocytogenes em diferentes etapas da produção de carcaça de frango em um matadouro frigorífico situado no Estado de São Paulo; avaliar a diversidade genética e sorológica das cepas de L. monocytogenes isoladas; correlacionar a diversidade genética das cepas isoladas com a distribuição nas diferentes etapas da linha de processamento, avaliar a persistência das cepas isoladas nesse matadouro e comparar os perfis genéticos de cepas de L. monocytogenes obtidos em nosso país com aqueles obtidos em um matadouro de aves com capacidade similar na Espanha. Foram realizadas 4 amostragens nos meses de julho e novembro de 2005, e março e maio de 2006 em um matadouro situado no Estado de São Paulo. Foi examinado um total de 178 amostras de carcaças de frango, pele de pescoço e de superfícies de contato e superfícies sem contato com o alimento. Os isolados foram submetidos à caracterização de sorogrupos por Reação de Polimerização em Cadeia (multiplex PCR) e à subtipagem por Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE). Das 178 amostras analisadas, 28 (15,7%) foram positivas para L. Monocytogenes. Dentre as amostras positivas, 12 (42,9%) foram oriundas de superfícies sem contato com o produto, 9 (32,1%) de superfícies de contato com o produto e 7 (25%) da carcaça inteira de frango, não sendo detectada L. monocytogenes em pele de pescoço de frango. Dos 41 isolados de L. monocytogenes avaliados, 11 (26,8%) pertencem ao grupo 1 (1/2a ou 3a), 5 (12,2%) ao grupo 3 (1/2b, 3b ou 7) e vinte e cinco (61%) ao grupo 4 (4b, 4d ou 4e). A análise por PFGE forneceu 9 pulsotipos AscI, 6 ApaI e 14 perfis combinados, caracterizando quatro grupos clonais. Estes grupos clonais estavam amplamente disseminados ao longo das etapas de processamento. Quando comparado com dados de estudo prévio realizado no mesmo matadouro, verifica-se a existência de cepas persistentes de L. monocytogenes no ambiente. A comparação entre os pulsotipos de L. monocytogenes isolados no Brasil e aqueles da Espanha mostrou que não há correlação genética entre as cepas, sendo gerado dos grupos distintos. Isto é uma indicação de que o comércio de carcaças de frango entre os dois países não está ocasionando a disseminação de L. monocytogenes no país importador. / Listeria monocytogenes is a well-known microorganism as cause of foodborne illness since the occurrence of the first outbreak in 1980. Among foods of animal origin that serve as vehicle of this pathogen, poultry and their products are receiving special attention due to their association with outbreaks. The aims of this research were to evaluate the occurrence of L. monocytogenes in different steps of production of chicken carcasses in an abattoir in São Paulo state; to evaluate the genetic and serological diversity of L. monocytogenes isolates; to correlate the isolates with their distribution along processing line and to evaluate the persistence of strains of L. monocytogenes in the environment and evaluate the occurrence of L. monocytogenes in different steps of production of chicken carcasses in an abattoir in Brazil and at genetically correlate our data with the ones obtained in an equivalent abattoir in Spain. Samples were collected in July and November 2005, and March and May 2006. A total of 178 samples comprising chicken carcasses, neck skin, surfaces that enter in contact with the product and surfaces that not enter in contact with product were analysed. The isolates were submitted to characterization of serogroup through multiplex PCR and subtyping using PFGE. Among 178 samples, 28 (15.7%) were positive for L. monocytogenes: 12 (42.9%) were from the surfaces that do not enter in contact with the product, 9 (32.1%) from the surfaces that enter in contact with the product and 7 (25%) from the carcasses samples. No L. monocytogenes was detected among the neck skin samples. The 41 isolates were classified as group 1 [11 (26.8%)]; group 3 [5 (12.2%)] and group 4 [25 (61%)]. The molecular typing by PFGE resulted in 9 AscI and 6 ApaI profiles, and 14 composite profiles, resulting in four clonal groups. These clonal groups were spread throughout the processing line. When these results were compared with the results obtained in a previous study, persistent strains could be observed. The comparison between pulsotypes of L. monocytogenes isolated in Brazil and those isolated in Spain showed that there is no genetic correlation between strains. Two distinct clonal groups were obtained. This results indicates that chicken carcasses trade between Brazil and Spain is not disseminating L. monocytogenes in the importer country.

A incorporação de substâncias antimicrobianas, entre elas os óleos essenciais, em embalagens tem como objetivo minimizar a contaminação microbiana em alimentos. No entanto, essa utilização é limitada por critérios sensoriais, sendo necessário determinar a concentração mínima necessária para inibir o desenvolvimento de micro-organismos sem afetar sensorialmente as características do alimento. Assim, os objetivos dessa pesquisa foram: determinar a concentração inibitória mínima (CIM) de óleos essenciais (OE) para Listeria monocytogenes (LM); avaliar do efeito da combinação de óleos essenciais para a redução da população de LM; avaliar a combinação de compostos ativos presentes em óleos essenciais para a inibição de LM, Pseudomonas spp e Salmonella spp; avaliar in vitro e in situ a eficiência antimicrobiana do filme à base de alginato incorporado de compostos ativos presentes em óleos essenciais; determinar a disponibilidade dos compostos ativos incorporados ao filme pela determinação dos compostos fenólicos totais; caracterizar o filme frente às propriedades mecânicas e propriedades de barreira, e verificar a aceitação pelo consumidor, através da análise sensorial, de fatias de salame embaladas com o filme antimicrobiano. Constatou-se que a combinação de eugenol (0,01%) e limoneno (0,04%) apresentou um maior efeito para a redução da população de LM comparado ao uso individual desses compostos, confirmando, portanto, a existência de sinergismo entre esses dois compostos. Em relação à Pseudomonas spp, o sinergismo foi constatado quando as concentrações de eugenol (0,15%) e de limoneno (0,30%) foram utilizadas, no entanto, para Salmonella spp o mesmo efeito não foi observado. Em ensaios in vitro apesar do aumento na concentração de eugenol e limoneno incorporados à matriz do filme, não houve diferença significativa para os valores de zona de inibição antimicrobiana porém, em ensaios in situ, a utilização desse filme como embalagem primária promoveu a redução de 2 log UFC/g da população de LM até o 10º dia de análise permanecendo constante até o 30º dia o que não ocorreu com a combinação de eugenol (0,15%) e limoneno (0,3%). A quantificação dos compostos fenólicos totais nas amostras mostrou que há correlação entre o teor de compostos fenólicos extraídos da amostra do filme e o comportamento de LM. As propriedades mecânicas e de barreira do filme à base de alginato não foram significativamente afetadas pelas concentrações de eugenol e limoneno avaliadas neste estudo. O sabor, o aroma e a aparência das amostras de salame foram aceitos pelos provadores mostrando que o uso do filme à base de alginato incorporado com eugenol e limoneno é viável para a aplicação como embalagem antimicrobiana para o controle de L. monocytogenes em salame fatiado. Este resultado é considerado importante, pois em alimentos com atividade de água e valores de pH adequados à multiplicação desse patógeno e armazenados sob refrigeração, a temperatura é capaz de selecionar a microbiota presente no alimento, favorecendo a multiplicação de micro-organismos psicrotróficos, como L. monocytogenes. / The incorporation of antimicrobial substances in packages aims at reducing food microbial contamination among which the phenolic compounds extract from plants have received special attention being natural and attending consumer demand. However, the use of these compounds is limited by sensory criteria and it is necessary to determine the minimum concentration required to inhibit the growth of microorganisms without affecting the sensory characteristics of the food. The aim of this research were: to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of essential oils (EO) for Listeria monocytogenes (LM); to evaluate effect of the combination of essential oils in order to reduce LM population; to evaluate the active compounds combination for the inhibition of LM, Pseudomonas spp, and Salmonella spp; to evaluate the antimicrobial efficiency in vitro and in situ of the alginate film incorporated with the active compounds; to determine the availability of the active compounds incorporated into the film for the determination of total phenolic compounds; to characterize the mechanical and barrier properties of the film, and to verify consumer acceptance of slices of salami packaged with the antimicrobial film. The combination of eugenol (0.01%) and limonene (0.04%) showed a greater effect for reducing LM population compared to the individual use of these compounds, confirming the existence of synergism between these two compounds. Regarding Pseudomonas spp, synergism was observed when the concentrations of eugenol (0.15%) and limonene (0.30%) were used, however, the same effect was not observed for Salmonella spp. In in vitro tests, despite of the increase in the concentration of limonene and eugenol incorporated in the film matrix, no significant difference for the antimicrobial inhibition zone values was observed. In in situ tests, the film containing eugenol (0.3%) and limonene (0.6%) promoted the reduction of 2 log CFU/g of LM population in sliced salami, while the combination of eugenol (0.15%) and limonene (0.3%) did not have the same effect. The quantification of the phenolic compounds in the film samples showed that there is correlation between the content of phenolic compounds extracted from the film sample and LM behavior. The mechanical properties of the barrier film and the alginate were not significantly affected by eugenol, and limonene concentrations evaluated in this study. The taste, flavor and appearance of the salami samples were accepted by the panel showing that the use of the alginate-based film incorporated with limonene and eugenol are feasible for use as antimicrobial packaging for the control of L. monocytogenes in sliced salami. This is an important result, because in food matrix with water activity and pH suitable for the pathogen growth, the storage under refrigerated condition is able to select the psycrothophic microorganisms, such as L. monocytogenes.

Listeria monocytogenes é de grande preocupação para a sande pública e para indústrias de alimentos, pois pode causar meningite, septicemia e aborto. Trabalhos desenvolvidos em diversos países, bem como no Brasil, indicam que a presenca de L. monocytogenes nas indústrias processadoras de pescado é freqüente. Corn a finalidade de monitorar a contaminação por L. monocytogenes em plantas processadoras de alimentos e identificar as fontes de contaminação do produto têm-se empregado técnicas de biologia molecular. Dentre elas cabe destacar a PFGE (pulsed field gel electrophoresis - eletroforese em gel de campo pulsado), técnica baseada em macrorestrição genômica, através da utilização de uma enzima de restrição de baixa freqüncia de corte, como a SmaI , AscI e ApaI, seguido de uma eletroforese em gel em campo pulsado. Neste estudo foram utilizadas 181 cepas de L. monocytogenes isoladas a partir de amostras de salmão \"gravlax\" colhidas nas diferentes etapas de processamento, além de amostras de manipuladores, ambientes e utensílios, coletadas em uma usina de processamento industrial a fim de verificar a diversidade antigênica e genética. Estas cepas foram sorogrupadas corn os antissoros 0 tipo 1 e 4 e subtipadas após PFGE seguindo o protocolo preconizado pelo Center for Disease Control and Prevention e empregando as enzimas ApaI e AscI. Das cepas, 132 (72,9%) pertenceram ao sorogrupo 1 e 49 (27,1%) ao sorogrupo 4. Corn as enzimas ApaI e AscI foram obtidos, respectivamente, 30 e 28 perfis de macrorestriçãoo diferentes. Os perfis de ambas as enzimas foram combinados obtendo-se 60 perfis combinados de macrorestrição. A combinação dos perfis de macrorestrição à sorologia permitiu separar as cepas em 8 subtipos e a distribuição destes subtipos na linha de processamento foi avaliada. Notou-se que um mesmo perfil de macrorestrição foi encontrado no salmão desde o início do processamento até o produto final, já embalado, utensílios e nas mãos de manipuladores. Também verificou-se que alguns perfis estavam adaptados ao ambiente de processamento e utensílios não sendo transmitidos ao produto. Na planta em questão há necessidade de aplicação inicialmente de Boas Práticas de Fabricação (BPF) e posteriormente Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (HACCP). / Listeria monocytogenes is a great concern for the public health and for the food industry, because it can cause serious illness such as meningitis, septicemia and abortion. Lots of studies in many countries, including Brazil, point to the frequent presence of L. monocytogenes in the fish industries. Molecular biology techniques have been applied to trace the contamination of L. monocytogenes and identify the sources of contamination of the food processing lines. One of them is the PFGE (pulsed-field gel electrophoresis), which is based on a genomic macrorestriction with low frequency restriction enzymes (SmaI, AscI and Apal), followed by a pulsed electrophoresis. 181 strains of L. monocytogenes were isolated from \"gravlax\" salmon processing line in several stages of the industrial processing, handworkers, environmental and food contact surfaces samples and the antigenic and genetic diversity were evaluated. They were serogrouped with antiserum 0 type 1 and 4, and subtyped using PFGE according to Center for Disease Control and Prevention protocol using the enzymes ApaI and AscI. 132 strains (72,9%) belonged to serogroup 1, 49 (27,1%) to serogroup 4. Visual comparison for macrorestriction patterns revealed 30 distinct ApaI restriction endonuclease digestion profiles (REDP) and 28 AscI REDP. When the composite profile from both enzymes was generated, there were 60 profiles. The combined macrorestriction profiles were joined to the serology resulting in 8 subtypes and the subtypes distribution along the processing line was evaluated. It\'s interesting to note that one specific profile found in the raw material was also found in different processing steps up to the final product (readyto-eat \"gravlax\" salmon) and also in food contact and non food contac surfaces, as well as food handlers. Some profiles were well adapted to the processing environment and were not found in fish. Our results strongly suggest that this industry needs to apply the Good (GMP) and Analysis of Hazards and Critical Points of Control (HACCP) to produce safer products.