 Keywords: Lung Tx, EVLP, NHBD, IR injury, ROS, hypercapnia, gender differences This dissertation thesis deals with a very topical issue of the lack of donor organs for lung transplants. As with other organs, the number of patients on waiting lists in terminal stages of their diseases is also constantly rising but there is not an adequate increase in donor organs. We focused our experimental work on the development of research concerning the solution which is most successful in a long-term perspective, i.e. organ transplants from non- heart-beating donors (NHBDs), in an ex vivo lung transplant protocol (EVLP) on an animal model (Wistar rats). This is a method which is clinically established worldwide (in the Czech Republic only experimentally) and is constantly subject to further research. Based on earlier studies, we focused the first experimental part of this work on the potential protective effect of hypercapnic ventilation on ischemia-reperfusion (IR) lung injury in EVLP. The study proved that the hypercapnic ventilation has a protective effect on the generation of reactive oxygen species (ROS) in IR lung injury, but only when used in the period of reperfusion. In the second experimental study, we followed up a very topical issue of the effect of gender on IR lung injury in EVLP in...

INTRODUÇÃO: O transplante pulmonar é terapia reconhecida de tratamento de doenças terminais pulmonares. Os pulmões, entretanto, são muito susceptíveis às transformações hormonais e hidroeletrolíticas ocorridas no doador após a morte encefálica. As baixas taxas de aproveitamento dos pulmões alavancam pesquisas e meios de utilizar pulmões considerados nãoideais. Um desses modelos é o recondicionamento pulmonar ex-vivo concebido por Steen, no qual se utiliza uma solução hiperosmolar (Steen Solution®) para avaliação e melhora dos pulmões doados. Consideramos que o desenvolvimento de uma solução de recondicionamento pulmonar produzida no Brasil seria conveniente aos serviços de transplante e aos pacientes. Foram comparadas a solução de recondicionamento Steen Solution® e uma solução de fabricação nacional em modelo de ex vivo de pulmões humanos não aceitos para transplante, através da avaliação da mecânica ventilatória, hemodinâmica, trocas gasosas e histologia. MÉTODOS: Foram utilizados 16 pulmões de doadores em morte encefálica, considerados inadequados para o transplante pulmonar. Os pulmões foram submetidos à captação habitual e acondicionados sob isquemia fria por 10 horas. Após este período, os pulmões foram designados, por sorteio, para reperfusão com a solução padrão (Steen solution®) ou a solução nacional por 1h em modelo ex vivo. A lesão pulmonar foi estudada através de parâmetros gasométricos, resistência pulmonar e complacência pulmonar. Foram medidos os pesos em três tempos e relação peso úmido/peso seco após a reperfusão para avaliação de edema. A partir de biópsias seriadas era calculado um score de lesão tecidual e grau de apoptose. RESULTADOS: A capacidade de oxigenação foi de 498,00 ± 37,53 mmHg no grupo STEEN e 521,00 ± 55,43 mmHg no grupo SRNac (p = 0,348). A capacidade relativa de oxigenação calculada ao final do recondicionamento foi 501,37 ± 207,77 no grupo STEEN e 470,30 ± 232,41 no grupo SRNac (p=0,782). Os pesos dos pulmões nos três momentos de avaliação foram: início da isquemia: STEEN = 1.026 ± 451 g, SRNac = 745 ± 282 g (p = 0,180); fim da isquemia: STEEN = 998 ± 391 g, SRNac = 738 ± 316 g (p = 0,184); e fim da reperfusão: STEEN = 1.097 ± 526 g, SRNac = 743 ± 248 g (p = 0,163). A relação peso úmido/peso seco foi 3,63 ± 1,26 no grupo SRNac e 2,06 ± 0,28 no grupo STEEN (p = 0,009). A resistência vascular pulmonar foi 787,99 ± 367,23 dina.s.cm-5 no grupo STEEN e 1.026,81 ± 1.112,53 dina.s.cm-5 no grupo SRNac (p = 0,575). A complacência pulmonar média foi 46,75 ± 20,99 mL/cmH2O no grupo STEEN e 49,74 ± 26,11 cmH2O no grupo SRNac (p = 0,809). O Escore de Lesão Pulmonar foi: STEEN = 4,38 ± 1,51 e SRNac = 4,50 ± 1,77 (p = 0,881). O número de células apoptóticas foi: STEEN = 2,4 ± 2,0 cel/mm2 e SRNac = 4,8 ± 6,9 cel/mm2 (p = 0,361). CONCLUSÕES: Os pulmões reperfundidos com a solução de recondicionamento de fabricação nacional apresentaram características morfológicas e funcionais similares aos que foram reperfundidos com a solução STEEN®, apesar do maior edema encontrado no grupo da solução nacional / INTRODUCTION: Lung transplantation is routine treatment of end-stage lung diseases. The lungs, however, are very susceptible to hormonal and electrolyte changes occurred in the donor after brain death. The low recovery rates of the lungs leverage researches and ways to use lungs considered non-ideal. One such model is the lung ex vivo reconditioning designed by Steen, in which using a hyperosmolar solution (Steen Solution®) for evaluation and improvement of donor lungs. We believe that the development of a pulmonary reconditioning solution produced in Brazil would be convenient to transplantation service and patients. Were compared the standard Steen Solution® and a national manufacturing solution in ex vivo model with human lungs not accepted for transplant, through the evaluation of respiratory mechanics, hemodynamics, gas exchange and histology. METHODS: 16 brain-dead donors lungs, considered unsuitable for lung transplantation, were used. The lungs were harvest as usual, packed and stored in cold ischemia for 10 hours. After this period, the lungs were appointed by randomization to reperfusion with the standard solution (Steen Solution®) or national solution for 1 h in ex vivo model. Lung injury was accessed by blood gas parameters, lung resistance and lung compliance. The weights were measured in three times and the after reperfusion wet weight / dry weight ratio for evaluation of edema. The degree of apoptosis and tissue injury score was calculated from serial biopsies. RESULTS: The oxygenation capacity was 498.00 ± 37.53mmHg in STEEN group and 521.00 ± 55.43mmHg in SRNac group (p = 0.348). The relative oxygenation capacity calculated at the end of the reconditioning was 501.37 ± 207.77 in the STEEN group and 470.30 ± 232.41 in the SRNac group (p = 0.782). The weights of lungs in the three stages of evaluation were: onset of ischemia: STEEN = 1,026 ± 451g, SRNac = 745 ± 282g (p = 0.180); end of ischemia: STEEN = 998 ± 391g, SRNac = 738 ± 316g (p = 0.184); and the end of reperfusion: STEEN = 1,097 ± 526g, SRNac = 743 ± 248g (p = 0.163). The wet weight / dry weight ratio was 3.63 ± 1.26 in SRNac group and 2.06 ± 0.28 in STEEN group (p = 0.009). Pulmonary vascular resistance was 787.99 ± 367.23dina.s.cm-5 in STEEN group and 1026.81 ± 1112.53dina.s.cm-5 in SRNac group (p = 0.575). The Lung Injury Score was: STEEN = 4.38 ± 1.51 and SRNac = 4.50 ± 1.77 (p = 0.881). The number of apoptotic cells was: STEEN = 2.4 ± 2.0 cells / mm 2 and SRNac = 4.8 ± 6.9 cells / mm2 (p = 0.361). CONCLUSIONS: The lungs reperfused with national manufacturing reconditioning solution presented morphological and functional characteristics similar to those reperfused with STEEN® solution despite the greater edema found in the group of national solution

INTRODUÇÃO: Em contraste aos bons resultados do transplante pulmonar no tratamento de pacientes com doença supurativa pulmonar avançada, a colonização por Burkholderia cepacia complex (BCC), sobretudo o genomovar III, vem sendo relacionada a pior prognóstico e, por conseguinte, uma contraindicação ao procedimento em alguns centros transplantadores. O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto em sobrevida após o transplante pulmonar de pacientes com doença pulmonar supurativa colonizados por BCC, além de determinar a incidência da colonização e suas variantes genômicas no Instituto do Coração/HC-FMUSP. MÉTODOS: Foram analisados prospectivamente dados clínicos e amostras de culturas do trato respiratório dos pacientes que realizaram transplante pulmonar por doença supurativa entre janeiro de 2008 e dezembro de 2013. A tipagem molecular para estudar os diferentes genótipos da BCC foi realizada a partir de janeiro de 2012 por método de sequenciamento genético e análise do gene RecA. RESULTADOS: Foram realizados 132 transplantes pulmonares, 62 pacientes com doença pulmonar supurativa, sendo 28 em pacientes com Bronquiectasias e 34 com Fibrose Cística. Observou-se a colonização por BCC em 16 pacientes; em 7 amostras identificados os seguintes subtipos: três cepas B. metallica e quatro cepas B. cenocepacia. A incidência de BCC nos pacientes com Fibrose Cística foi de 38,2%, enquanto nos pacientes com Bronquiectasias foi 10,7%. Dentre os 16 pacientes colonizados por BCC, ocorreram 2 óbitos, nenhum deles relacionados à infecção pelo agente. Um óbito foi atribuído a sepse por Acinetobacter baumannii resistente a múltiplas drogas e o outro, a disfunção orgânica múltipla. O estudo desenvolvido demostrou que a colonização por BCC não gerou impacto em mortalidade nos pacientes após o transplante pulmonar, mesmo quando colonizados pelo subtipo B. cenocepacia / INTRODUCTION: Notwithstanding the good results of lung transplantation for treatment of patients with advanced lung suppurative disease, colonization by Burkholderia cepacia complex (BCC), especially genomovar III has been related to a worse prognosis in these patients and therefore contraindication to the procedure certain centers. The aim of this study was to evaluate the impact on survival after lung transplantation in patients with suppurative lung disease colonized with BCC to determine the incidence of colonization and its genomic variants at the Heart Institute / HC -FMUSP. METHODS: We prospectively analyzed clinical data and respiratory tract samples of suppurative lung disease patients that performed lung transplantation from January-2008 through November-2013. From January-2012 through December-2013, we also subtyed the different B. cepacia genotypes by DNA sequencing primers of the gene RecA. RESULTS: 132 lung transplantation were performed, 62 patients with suppurative lung disease, 28 patients with Bronchiectasis and 34 with Cystic Fibrosis. BCC was observed in 16 patients; in 7 samples we identified the following subtypes: three strains B. metallica and four strains B. cenocepacia. The incidence of BCC in patients with Cystic Fibrosis was 38.2% while in patients with Bronchiectasis was only 10.7%. Among the 16 patients colonized with BCC, there were two deaths, none of them related to infection by the agent. One death due to sepsis Acinetobacter baumannii resistant to multiple drugs and the other, multiple organ dysfunction. The study demonstrated that colonization by BCC developed no impact on the mortality rate of patients after lung transplantation, even when colonized by the subtype B. cenocepacia

Introdução: O transplante de pulmão é uma opção terapêutica bem estabelecida para o tratamento de pneumopatias em estágio final. Uma complicação frequente relacionada aos transplantes é a lesão de isquemia e reperfusão (IR), estando o estresse oxidativo envolvido no processo. O azul de metileno (AM) é um inibidor da produção de espécies reativas de oxigênio, atuando como receptor alternativo de elétrons da xantina oxidase. Objetivo: Avaliar a eficácia do AM como inibidor da lesão de IR em transplante pulmonar de ratos. Métodos: Quarenta ratos fêmea Sprague Dawley (300g - 350g) foram divididas em quatro grupos de dez animais. Os animais foram submetidos a transplante pulmonar unilateral esquerdo. Os enxertos foram expostos a 3 ou 6 horas de isquemia fria seguido de 2 horas de reperfusão. Nos animais do grupo controle, 2 mL de solução salina foram injetados na cavidade peritoneal e, nos animais do grupo experimento, 2 mL de AM a 1% foram injetados da mesma forma. Resultados: A dosagem da PaO2 foi significativamente superior no grupo AM entre os animais submetidos a isquemia de 3 horas (AM = 150,2 ± 50,1 vs Salina = 102,6 ± 40,4 mmHg; p = 0,028), assim como a dosagem do óxido nítrico exalado foi significativamente inferior no mesmo grupo (AM = 3,2 ± 2,0 vs Salina = 5,2 ± 2,3 ppb; p = 0,05). O infiltrado neutrofílico foi menor nos animais do grupo AM submetidos a 6 horas de isquemia no lavado broncoalveolar (LBA); (AM = 11,8 ± 7,4 vs Salina = 30 ± 19,2 X 104/mL; p = 0,023). A análise histopatológica mostrou menor formação de edema perivascular no grupo AM submetido a 6 horas de isquemia (AM = 35,2 ± 7,65 vs Salina = 44,8 ± 6,39%; p = 0,001) e perialveolar no grupo AM submetido a 3 horas de isquemia (AM = 18,4 ± 14,2 vs Salina = 28,1 ± 18,2%; p = 0,041) e menor infiltrado neutrofílico perialveolar na comparação entre os grupos submetidos a 6 horas de isquemia (AM = 2,8 ± 2,2 vs Salina = 5,1 ± 3,1%; p = 0,046). Os níveis de IL-6 no LBA foram inferiores no grupo AM em ambos os tempos de isquemia (3 h - AM = 122,4 ± 24,9 vs Salina = 175.6 ± 50.3 pg/mL; p = 0.008; 6 h - AM = 142 ± 38,7 vs Salina = 351,3 ± 80,7 pg/mL; p = 0,002); Os níveis de TNF-? foram menores no grupo AM submetido a 6 horas de isquemia (AM = 189,5 ± 93,3 vs Salina = 342,9 ± 130,4 pg/mL, p = 0.007). A dosagem do ácido úrico foi significativamente maior no grupo AM em ambos os tempos de isquemia (3 h - AM = 4,7 ± 0,9 vs Salina = 2,7 ± 0,7 mg/dL; p = 0,003; 6 h - AM = 5,3 ± 2,4 vs Salina = 2,3 ± 0,9 mg/dL; p < 0,001). Não houve diferença entre os grupos em relação a apoptose. Conclusão: O AM demonstrou ser uma droga eficaz na prevenção da lesão de isquemia e reperfusão no transplante pulmonar de ratos / Introduction: Lung transplantation (LTx) has become an established therapeutic option for end-stage pulmonary disease. Ischemia reperfusion injury (IR) is a major cause of organ dysfunction after LTx and oxidative stress is involved in this process. Methylene blue (MB) is an inhibitor of reactive oxygen species production. Objective:To investigate the effects of MB on the IR in a rodent model of LTx. Methods: Forty female Sprague Dawley rats (300g - 350g) were divided into four groups (n = 10) according to treatment (saline solution or MB) and graft cold ischemic time (3 or 6 hours). Animals underwent a left-sided unilateral lung transplantation. Recipients received 2mL of intraperitoneal saline or MB 1%. After 2 hours of reperfusion, animals were killed and blood gas, exhaled nitric oxide, cell count and cytokines leves in bronchoalveolar lavage (BAL) as well as histopathology, serum uric acid and apoptosis were evaluated. Results: PaO2 was significantly higher in MB group undergoing 3 hour ischemic time (MB =150.2 ± 50.1 vs Saline = 102.6 ± 40.4 mmHg; p = 0.028). Exhaled nitric oxide values showed differences only between groups with 3 hour of ischemia (MB = 3.2 ± 2.0 vs Saline = 5.2 ± 2.3 ppb; p = 0.05). Neutrophils in BAL were different between groups subjected to 6 hours of ischemia (MB = 11.8 ± 7.4 vs Saline = 30.0 ± 19.2 x 104/mL; p = 0.023). IL-6 levels in BAL were lower in MB group in both ischemic time (3 h - MB = 122.4 ± 24.9 vs Saline = 175.6 ± 50.3 pg/mL; p = 0.008; 6 h - MB = 142 ± 38.7 vs Saline = 351.3 ± 80.7 pg/mL; p = 0.002); TNF-? levels were also lower in MB group undergoing 6 hour of ischemia (MB = 189.5 ± 93.3 vs Saline = 342.9 ± 130.4 pg/mL; p = 0.007). The number of neutrophils in lung parenchyma were reduced in MB group (6 h - MB = 2.8 ± 2.2 vs Saline = 5.1 ± 3.1%; p = 0.046) and also decreased edema in perivascular (6 h - MB = 35.2 ± 7.65 vs Saline = 44.8 ± 6.39%, p = 0.001) and perialveolar tissues (3 h - MB = 18.4 ± 14.2 vs Saline = 28.1 ± 18.2% p = 0,041) were observed. Uric acid levels were higher in MB group in both ischemic time (3 h - MB = 4.7 ± 0.9 vs Saline = 2.7 ± 0.7 mg/dL; p = 0.003; 6 h - MB = 5.3 ± 2.4 vs Saline = 2.3 ± 0.9 mg/dL; p < 0.001).There were no difference in the expression of apoptosis. Conclusion: MB was able to prevent ischemia-reperfusion injury in this lung transplantation model and represent a new option for further studies

This work discusses the role of CT in the etection and quantification of chronic allograft rejection in patients after lung transplantation and provides solutions to the technical challenges involved with this approach. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le rejet chronique se manifeste dans le poumon par la bronchiolite oblitérante (BO), une pathologie inflammatoire et fibrotique menant à l’oblitération des bronchioles. L’étiologie exacte de cette maladie demeure inconnue. Certaines études suggèrent qu'un déséquilibre des leucotriènes (LT) sur les prostaglandines (PG) favorise la fibrose pulmonaire. Les taux des LT et des PG dans le poumon humain post-transplantation sont inconnus. Nous proposons qu'un déséquilibre de cystéinyl leucotriènes (CysLT) sur la PGE2 existe dans le poumon transplanté et pourrait être impliqué dans la pathogenèse de la BO. Aussi, les leucotriènes contribueraient à la fibrose par la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). Afin de vérifier ces hypothèses, nous avons déterminé les taux de CysLT et de PGE2 dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) provenant de poumons transplantés chez l'homme ainsi que leurs corrélations cliniques. Nous avons également déterminé la capacité des CysLT à induire l’expression des marqueurs de la TEM in vitro. Nous avons découvert des taux de CysLT et PGE2 supérieurs à la normale dans les LBA des greffés. Un pic prédominant de CysLT sur PGE2 est observée à 52 semaines postgreffe et deux facteurs de risque de la BO, les infections au CMV et à l’Aspergillus, sont associés au ratio CysLT/PGE2> 1. In vitro, les CysLT induisent une répression des marqueurs épithéliaux mais n’induisent pas l’expression de marqueurs mésenchymateux chez les cellules épithéliales bronchiolaires. / Chronic rejection occurs, in the lung, in the form of bronchiolitis obliterans (BO), an inflammatory and fibroproliferative disease that leads to the obliteration of the bronchioles. A concept of the pathogenesis of BO has been suggested and several risk factors are associated to it, however, the exact etiology of this disease remains unknown. Studies have suggested that an imbalance of leukotrienes (LT) over prostaglandins (PG) promotes pulmonary fibrosis. The levels of LT and PG in the human lung post-transplantation are unknown. We propose that an imbalance of cysteinyl leukotrienes (CysLT) on PGE2 exists in the transplanted lung and may be implicated in the pathogenesis of BO. We also suggest that leukotrienes contribute to fibrosis through epithelial-mesenchymal transition (EMT). In order to test these hypotheses, we have determined the levels of CysLTs and PGE2 in human transplanted lung bronchoalveolar lavage fluid (BALf) samples and their clinical correlations. We have also determined the capacity of CysLT to induce the expression of EMT markers in vitro. We found high average levels of CysLT and PGE2 in the BAL of transplant patients. A predominant peak of CysLT over PGE2 was observed at 52 weeks post-transplantation and two risk factors for BO, CMV infections and Aspergillus were associated with CysLT/PGE2 ratio> 1. According to our experimental parameters, CysLT can induce the repression of epithelial markers but do not induce the expression of mesenchymal markers in vitro in small airway epithelial cells.

espera por transplante pulmonar. A baixa taxa de aproveitamento do pulmão nas captações de órgãos figura como questão de destaque. Como causas, listamos a rigidez nos critérios de seleção, vulnerabilidade do órgão, cuidados inadequados com os pacientes em morte encefálica, edema pulmonar neurogênico pela morte encefálica e trauma com choque hemorrágico, que leva à hipoperfusão dos pulmões, acidose metabólica e inflamação tecidual. Morte encefálica e choque representam importantes causas de deterioração pulmonar, levando à recusa do órgão na captação ou à disfunção primária do enxerto pós-transplante. Na tentativa de melhorar a condição do enxerto pulmonar para se obter maior número de pulmões viáveis para o transplante, e para reduzir os índices de rejeição, algumas estratégias foram adotadas pelas equipes transplantadoras. O uso de células tronco mesenquimais (Mesenchymal Stem Cells - MSCs) para tratamento de afecções inflamatórias é objeto de estudo de alguns grupos, dadas as propriedades anti-inflamatórias e imunomodulatórias já conhecidas. Nossa hipótese baseia-se na realização de tratamento com MSCs ou seus fatores solúveis (FS-MSCs) em doadores com choque hemorrágico. O objetivo deste trabalho é avaliar inflamação pulmonar em ratos, após o tratamento do choque hemorrágico com reposição sanguínea, associada à infusão in vivo de MSCs ou FS-MSCs. Quarenta e oito ratos foram divididos em 4 grupos: Sham (Sham n=12); Choque (Choque n=12); FS (Choque + FS-MSCs n=12) e MSC (Choque + MSCs n=12). Após anestesia, os animais foram submetidos à cateterização da artéria e veia femoral para registro de pressão arterial média (PAM), indução de choque hemorrágico e infusão de MSCs ou FS-MSC nos grupos de tratamento. No grupo Sham foi realizada apenas a monitorização dos parâmetros hemodinâmicos. Nos grupos Choque, FS e MSC foi realizado o choque hemorrágico (40 mmHg), e tratamento com FS-MSCs (1ml de secretoma em dose única) no grupo FS ou MSCs humanas (1x107células em dose única) no grupo MSC. Após 190 minutos, o experimento foi finalizado e o bloco pulmonar extraído. Foram analisadas: a histopatologia do tecido pulmonar e a concentração de marcadores inflamatórios (Tnf-alfa, IL1-beta, IL-6, IL-10, iCAM e vCAM) no lavado broncoalveolar e no tecido pulmonar. Na análise histológica a densidade de neutrófilos apresentou diferença estatística significante com o grupo FS apresentando a menor densidade quando comparado aos grupos Choque e MSC (p < 0,001). A dosagem de IL-10 no grupo FS foi superior aos demais grupos (p=0,044). Concluímos que os pulmões de ratos submetidos ao choque hemorrágico tratados com FS-MSCs apresentam redução de inflamação pela redução do infiltrado neutrofílico / Many factors are responsible for the large number of patients on waiting list for a lung transplant. The low rate of lung utilization in organ uptakes appears as a critical issue. As causes, we highlight the rigorous selection criteria, organ vulnerability, inadequate care for patients in brain death, neurogenic pulmonary edema due to brain death and trauma with hemorrhagic shock, that leads to hypoperfusion of the lungs, metabolic acidosis and tissue inflammation. Brain death and shock represents important causes of pulmonary deterioration, leading to organ rejection at the uptake or primary graft dysfunction in post-transplantation. To improve the pulmonary graft condition in order to obtain a larger number of viable lungs for transplantation and to reduce rejection rates, some strategies were adopted by transplantation teams. The use of mesenchymal stem cells (MSCs) for treatment of inflammatory conditions is the object of study of many groups, due to the anti-inflammatory and immunomodulatory properties of these cells previously described. Our hypothesis is based on treatment with MSCs or their soluble factors (FS-MSCs) in donors with hemorrhagic shock. The aim of this work is to evaluate pulmonary inflammation in rats, after hemorrhagic shock treatment with blood replacement, associated with in vivo infusion of MSCs or FS-MSCs. Forty-eight rats were divided into 4 groups: Sham (Sham n = 12); Shock (Shock n = 12); FS (Shock + FS-MSCs n = 12) and MSC (Shock + MSCs n = 12). After anesthesia, animals were submitted to femoral artery and vein catheterization for monitoring of mean arterial pressure (MAP), induction of hemorrhagic shock and MSCs or FS-MSC infusion in treatment groups. At Sham group, only hemodynamic parameters were monitored. Hemorrhagic shock (40 mmHg) was performed in Shock, FS and MSC groups, and treatment with FS-MSCs (1ml secretome in single dose) were performed in the FS group or human MSCs (1x107 cells in single dose) in the MSC group. After 190 minutes, the experiment was terminated and the lung block was removed. The histopathology of lung tissue and the concentration of inflammatory markers (Tnf-alpha, IL-1Beta, IL-6, IL-10, ICAM and vCAM) in the bronchoalveolar lavage fluid and tissue were analyzed. In histological analysis, the neutrophil density showed a statistically significant difference with FS group presenting the lowest density when compared to Shock and MSC groups (p < 0.001). IL-10 dosage in FS group was higher than all other groups (p = 0.044). We conclude that the lungs of rats submitted to hemorrhagic shock treated with FS-MSCs present reduction of inflammation by the reduction of neutrophilic infiltrate

INTRODUÇÃO: As técnicas de preservação pulmonar visam a melhorar a qualidade do enxerto e aumentar sua tolerância ao período de isquemia fria. A técnica mais usada atualmente consiste na perfusão da artéria pulmonar com Perfadex. O alto custo associado à importação dessa solução e as dificuldades logísticas dos portos e aeroportos brasileiros com relação a materiais médicohospitalares têm causado problemas para os centros de transplante pulmonar brasileiros. Daí a necessidade de uma solução de preservação pulmonar produzida no Brasil. O objetivo desse estudo é comparar a solução Perfadex com a solução de fabricação nacional LPD-G, quanto ao grau de lesão de isquemia-reperfusão, em um modelo de perfusão pulmonar ex vivo (PPEV). MÉTODOS: Foram usados doadores em morte cerebral, cujos pulmões foram recusados. Cada caso era incluído aleatoriamente em um dos grupos: Grupo 1, a preservação pulmonar era realizada com Perfadex, e Grupo 2, era usado o LPD-G, solução fabricada no Brasil com composição idêntica a do Perfadex. Após a captação, os pulmões eram armazenados a 4 °C por 10 horas. A reperfusão ocorria em um sistema de PPEV, no qual o bloco pulmonar era ventilado e perfundido por uma solução acelular a 37 °C por 60 minutos. A lesão de isquemia-reperfusão era medida através de parâmetros funcionais (gasometria, resistência vascular pulmonar, complacência pulmonar, relação peso úmido/peso seco) e histológicos. Foram feitas biópsias pulmonares em 3 tempos: antes da captação, após o período de isquemia fria e depois da reperfusão. Vários critérios foram usados (edema alveolar, edema intersticial, hemorragia etc.) para criar um Escore de Lesão Pulmonar (ELP). A contagem de células apoptóticas foi feita usando a metodologia TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling). RESULTADOS: Após a reperfusão, a capacidade de oxigenação média foi de 405,3 mmHg no Grupo 1 e 406,0 mmHg no Grupo 2 (p = 0,98). A mediana da resistência vascular pulmonar nos pulmões do Grupo 1 foi de 697,6 dina.s.cm-5, enquanto no Grupo 2, esse valor foi de 378,3 dina.s.cm-5 (p = 0,035). A complacência pulmonar média ao final da reperfusão foi de 46,8 cmH2O no Grupo 1 e de 49,3 ml/cmH2O no Grupo 2 (p = 0,816). A razão entre o peso úmido e o peso seco foi em média 2,06 e 2,02 nos Grupos 1 e 2, respectivamente (p = 0,87). Na biópsia realizada após reperfusão, o ELP médio foi de 4,37 e 4,37 nos Grupos 1 e 2, respectivamente (p = 1,0); a contagem de células apoptóticas foi de 118,75/mm2 e 137,50/mm2 nos Grupos 1 e 2, respectivamente (p = 0,71). CONCLUSÕES: A qualidade da preservação pulmonar obtida com a solução LPD-G nacional é semelhante a obtida com o Perfadex. A aplicação clínica da nova solução pode reduzir custos, facilitando a manutenção e a abertura de centros de transplante pulmonar / INTRODUCTION: Pulmonary preservation techniques aim at improving graft quality and increasing tolerance during reperfusion and cold ischemia times. Currently, the most used technique consists of pulmonary artery anterograde perfusion with Perfadex. The high cost associated with the importation of this solution and the logistical difficulties of our ports and airports regarding medical supplies have caused problems for lung transplant centers in Brazil. Therefore there is need for a preservation solution manufactured in Brazil. The aim of this study is to compare the pulmonary preservation solutions Perfadex and LPD-G manufactured in Brazil in an ex vivo lung perfusion (EVLP) model. METHODS: Donors with brain death, whose lungs had been declined by transplantation teams were used. Cases were randomized into two groups: in Group 1, Perfadex was used for pulmonary preservation. In Group 2, LPDnac, a solution manufactured in Brazil and whose compositon is identical to Perfadex, was used. After harvesting, lungs were stored at 4 °C for 10 hours. An EVLP system was used and the pulmonary block was ventilated and perfused by an acellular solution at 37 °C for 60 minutes. Ischemic-reperfusion injury was measured by functional (blood gas, pulmonary vascular resistance, lung compliance, wet/dry weight ratio) and histological parameters. Pulmonary biopsies were performed at three time points: before harvesting, 10 hours after cold ischemia and 60 minutes after reperfusion. Samples were prepared for light microscopy analysis. Several criteria were used (alveolar edema, interstitial edema, hemorrhage etc.) to create a lung injury score (LIS). Apoptotic cell count was carried out using the TUNEL methodology (TdT-mediated dUTP nick end labeling). RESULTS: After reperfusion, mean oxygenation capacity was 406.0 mmHg in Group 2 and 405.3 mmHg in Group 1 (p = 0.98). Mean pulmonary vascular resistance in Group 2 lungs was 378.3 dina.s.cm-5, whereas in Group 1 it was 697.6 dina.s.cm-5 (p = 0.035). Mean pulmonary compliance by the end of reperfusion was 49.3 ml/cmH2O in Group 2 and 46.8 cmH2O in Group 1 (p = 0.816). Mean wet/dry weight ratio was 2.02 and 2.06 in Groups 2 and 1, respectively (p = 0.87). Mean LIS for the biopsy performed after reperfusion was 4.37 and 4.37 in Groups 2 and 1, respectively (p= 1.0); apoptotic cell count was 137.50/mm2 and 118.75/mm2 in Groups 2 and 1, respectively (p = 0.71). CONCLUSION: The preservation solution manufactured in Brazil proved to be as good as Perfadex. The clinical application for the new solution may reduce costs, favoring the maintenance and opening of pulmonary transplantation centers

INTRODUÇÃO: O transplante de pulmão é parte fundamental no tratamento das doenças terminais do pulmão, constituindo uma modalidade terapêutica eficaz para pacientes com doença pulmonar incapacitante, progressiva e em estágio final. No entanto, as drogas imunossupressoras usadas para evitar a rejeição do enxerto podem causar efeitos colaterais em diversos tecidos. O sistema mucociliar, presente nas vias aéreas, é um dos principais mecanismos de defesa do trato respiratório e pode ser alterado por ação das drogas imunossupressoras. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o sistema mucociliar traqueobrônquico de ratos submetidos a dois esquemas de terapia tríplice imunossupressora. MÉTODOS: Foram utilizados 90 ratos machos Wistar distribuídos em 3 grupos conforme o tratamento: controle (C) = solução salina; terapia 1 (TI) = tacrolimus + micofenolato de mofetil + prednisona; terapia 2 (TII) = ciclosporina + azatioprina + prednisona. Após o período de tratamento (7, 15 ou 30 dias), os animais foram sacrificados e realizadas as seguintes medidas: transportabilidade do muco (TM), frequência de batimento ciliar (FBC), quantificação de muco neutro e ácido, velocidade de transporte mucociliar (VTMC), e contagem total e diferencial de células no lavado broncoalveolar (LBA). RESULTADOS: A TM não foi afetada pelas terapias em nenhum dos tempos estudados. Ambas as terapias causaram significativa redução da FBC dos animais tratados por 7 e 15 dias. A produção de muco neutro foi menor nos animais tratados com a TI por 7, 15 e 30 dias. Porém, com a TII, essa redução ocorreu apenas aos 7 dias. Por outro lado, a quantidade de muco ácido foi significativamente maior em todos os animais tratados com as duas terapias. Todos os animais tratados com as terapias imunossupressoras apresentaram redução da VTMC nos três tempos. Houve aumento do número total de células e de macrófagos e neutrófilos no grupo TI em 7 dias. CONCLUSÕES: Ambas as terapias imunossupressoras foram prejudiciais ao transporte mucociliar das vias aéreas de ratos, tanto pela redução da FBC e da VTMC, quanto pela maior produção de muco ácido e menor produção de muco neutro. A TI foi mais prejudicial ao sistema mucociliar em comparação à TII / INTRODUCTION: Lung transplantation is an essential part in the treatment of terminal lung diseases, providing an effective therapeutic modality for patients with disabling, progressive and final stage lung disease. However, the immunosuppressant drugs used to prevent graft rejection may cause side effects in several tissues. The mucociliary system, present in the airways, is a major defense mechanism of the respiratory tract and can be changed by action of immunosuppressive drugs. Thus, the aim of this study was to evaluate the tracheobronchial mucociliary system of rats submitted to two triple immunosuppressive therapy regimens. METHODS: We used 90 male Wistar rats divided into 3 groups according to treatment: control (C) = saline solution; therapy 1 (TI) = tacrolimus + mycophenolate mofetil + prednisone therapy; therapy 2 (TII) = cyclosporine + azathioprine + prednisone. After the period of treatment (7, 15, or 30 days), the animals were sacrificed and the following measures taken: mucus transportability (MT), ciliary beating frequency (CBF), quantification of neutral and acid mucus, mucociliary transport velocity (MCTV), and total and differential counting of cells in bronchoalveolar lavage (BAL). RESULTS: MT was not affected by treatments in any of the periods studied. Both therapies have caused significant reduction of CBF of animals treated for 7 and 15 days. The neutral mucus production was lower in animals treated with TI for 7, 15 and 30 days. But with TII, this reduction occurred only at 7 days. Moreover, the amount of acid mucus was significantly higher in all animals treated with both therapies. All animals treated with immunosuppressive therapies had reduced MCTV at the three times. There was an increase of total cells and macrophages and neutrophils in the TI group in 7 days. CONCLUSIONS: Both immunosuppressive therapies were harmful to the mucociliary clearance of the airways of rats, either by reducing the CBF and MCTV, as by the increased production of acid mucus and decreased production of neutral mucus. TI was more harmful to the mucociliary system in comparison to TII

[Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2015. A escassez dos doadores e a má qualidade dos órgãos associados à falta de cuidado em sua manutenção são um grave problema para os grupos de transplante, especialmente para o transplante pulmonar. Um dos principais motivos de recusa para a doação é o edema pulmonar, que pode estar associado a excessiva administração de fluídos no tratamento do choque hemorrágico. Dentre as causa de choque, o choque hemorrágico está frequentemente associado aos doadores vítimas de traumatismo. Uma das estratégias clínicas aplicadas para a recuperação do choque hemorrágico é a administração precoce de fluídos e produtos sanguíneos. O uso de soluções cristalóides como Soluções Isotônicas e Hipertônicas promove a expansão volêmica intravascular restabelecendo a pressão arterial média. A ressuscitação volêmica com cristalóide isotônico requer administração de alta quantidade de volume, em contrapartida a solução hipertônica a 7,5% mostra uma redução de três a quatro vezes no volume. Na tentativa de aumentar a oferta de doadores de pulmão nossa hipótese baseia-se na realização de um tratamento com solução Salina Hipertônica em doadores com choque hemorrágico. O objetivo deste trabalho é avaliar pulmões de ratos submetidos ao choque hemorrágico tratados com solução hipertônica comparando com a solução salina. Oitenta ratos foram divididos em 4 grupos: Sham (Sham n=20); Choque (Choque n=20); SS ( Choque + Solução Salina n=20) e SH ( Choque + Solução Hipertônica n=20). Após anestesia, os animais foram submetidos à cateterização da artéria e veia femoral para registro de pressão arterial média (PAM) e obtenção do choque hemorrágico. No grupo Sham foi realizada a monitorização dos parâmetros, nos grupos Choque, SS e SH obtenção do choque hemorrágico (40 mmHg), e tratamento de solução hipertônica (4 ml/Kg) no grupo SH e solução salina (33 ml/kg) no grupo SS. Após 120 minutos, 10 blocos cardiopulmonares de cada grupo foram encaminhados ao sistema de perfusão ex vivo Harvard Apparatus IL-2 Isolated Perfused e avaliados durante 60 minutos, os outros 10 blocos dos grupo foram destinados a dosagem de citocinaTnf-alfa, IL 1-beta e quantificação de neutrófilo. Na avaliação ex vivo o parâmetro que apresentou diferença estatística significante foi a Pressão da artéria Pulmonar (PAP) do grupo Choque em relação aos demais grupos (p < 0,05). A dosagem de Tnf-alfa no grupo choque foi superior a todos os grupo (p < 0,05). Em relação a contagem de neutrófilos o grupo tratado com solução hipertônica e solução isotônica apresentaram resultado igual ao grupo Sham,o grupo choque apresentou infiltrado neutrofílico superior aos demais grupos (p < 0,05). Concluímos que os pulmões de ratos submetidos ao choque hemorrágico tratados com solução hipertônica apresentam parâmetros de mecânica ventilatória semelhante e recuperação hemodinâmica melhor do que os animais tratados com solução salina a 0,9%. Além disso, reduz os parâmetros inflamatórios dos animais submetidos ao choque hemorrágico / The lack of donors and poor quality of organs associated to poor organ handling is a serious problem for transplantation groups, especially for lung transplantation. Pulmonary edema is one of the main reasons for donation rejection, which may be associated to excessive fluid administration in the treatment of hemorrhagic shock. Of the causes of shock, hemorrhagic shock is frequently associated to donors who are victims of trauma. One of the clinical strategies used in the recovery of hemorrhagic shock is the early administration of fluids and blood products. The use of crystalloid solutions such as Isotonic and Hypertonic Solutions promote intravascular volume expansion thus reestablishing mean blood pressure. Volume resuscitation with isotonic crystalloid requires the administration of a high amount of volume, whereas hypertonic solution 7.5% produces a three or four fold volume reduction. In an attempt to increase the offer of lung donors, our hypothesis is based on a treatment with hypertonic saline solution in donors with hemorrhagic shock. The objective of this study is to evaluate the lungs of rats undergoing hemorrhagic shock treated with hypertonic solution compared to saline solution. Eighty rats were divided into 4 groups: Sham (Sham, n=20); Shock (Shock, n=20); SS (Shock + Saline Solution, n=20) and SH ( Shock + Hypertonic Solution, n=20). After anesthesia, animals were submitted to catheterization of the femoral artery and vein to record mean arterial pressure (MAP) andto obtain hemorrhagic shock. In the Sham group the different parameters were monitored, in the Shock, SS and SH groups hemorrhagic shock was obtained (40 mmHg). The SH group received the hypertonic solution (4 ml/Kg) and the SS group received saline solution (33 ml/kg). After 120 minutes, 10 cardiopulmonary blocks of each group were evaluated by the ex vivo Harvard Apparatus IL-2 Isolated Perfused system for 60 minutes, the other 10 blocks were had cytokine TNF-alpha and IL 1-beta measurement and neutrophil quantification performed. In the ex vivo evaluation, pulmonary artery pressure (PAP) was the variable with statistically significant difference (p < 0.05) in the shock group when compared to the other groups. TNF-alfa measurement in the shock group was higher than in all of the other groups (p < 0.05). Neutrophil counts in the groups treated with hypertonic solution and isotonic solution were similar to the Sham group. The shock group had higher neutrophil infiltrate values than the other groups (p < 0.05). We conclude that the lungs of rats undergoing hemorrhagic shock treated with hypertonic solution had similar mechanical ventilation parameters and better hemodynamic recovery than the animals treated with 0.9% saline solution. Furthermore, it reduced the inflammatory parameters of animals undergoing hemorrhagic shock