La maladie de Parkinson (MP) est caractérisée par une dégénérescence des neurones dopaminergiques de la substance noire (SN) en lien avec l’agrégation de l’α-synucléine (α-Syn) sous la forme d’inclusions intraneuronales. De nombreux travaux supportent l’idée que des interactions neuro-immunes, favorisées par des altérations du système vasculaire cérébral, sont impliquées dans les mécanismes pathologiques de la MP. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à une population myéloïde particulière qui borde les vaisseaux: les macrophages périvasculaires (MPVs). Nous mettons en évidence chez des patients parkinsoniens et des souris développant une synucléinopathie dégénérative, une augmentation proliférative des MPVs. Leur ablation entraîne une aggravation du phénotype dégénératif chez les souris synucléinopathiques, suggérant un rôle protecteur qui ne serait toutefois pas lié à une régulation de la microgliose. Nous observons néanmoins que l’absence de MPVs s’associe à une augmentation vasculaire de VCAM-1 et de l’infiltrat T CD4+ et CD8+. Par ailleurs, leur absence entraîne une accélération de la diffusion de la synucléinopathie suite à l’injection de fibrilles d’α-Syn. Nous faisons l’hypothèse que les MPVs sont essentiels dans la clairance des assemblages extracellulaires d’α-Syn en raison de leur activité de phagocytose mais aussi de leur importance dans la régulation des flux paravasculaires et lymphatiques, comme le montrent nos expériences d’infusion de traceurs fluorescents. Au total, nos travaux soulignent l’importance des MPVs dans la régulation de la toxicité et la diffusion de la synucléinopathie et en font une cible thérapeutique potentielle pour la MP. / Parkinson’s disease (PD) is characterized by the progressive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra (SN) associated to the aggregation of α-synuclein (α-Syn) that forms intraneuronal inclusions. In addition, mounting evidence suggest that neuro-immune interactions, favoured by cerebrovascular alterations, are involved in the pathomechanisms of PD. In this work, we focus on a myeloid population that surrounds blood vessels: perivascular macrophages (PVMs). We show that both in PD patients and in a mouse model of degenerative synucleinopathy, there is an increased proliferative recruitment of PVMs within the SN. We also found that specific ablation of PVMs aggravates the degenerative phenotype in synucleinopathic mice. PVMs-mediated neuroprotection is not likely linked to regulatory mechanisms of microglial cell response. Interestingly, the absence of PVMs is associated with higher vascular expression of VCAM-1 and enhanced infiltration of CD4+ and CD8+ T-cells, whose pathogenic role remains to be determined. We also observe that PVMs deficiency leads to an increased spreading of α-Syn pathology following striatal injections of α-Syn fibrils. We hypothesize that PVMs might be essential for the clearance of toxic α-Syn species due to their phagocytic activity, but also to their importance in regulating interstitial and cerebrospinal fluid (CSF) circulation, as shown by analysing CSF movement via the infusion of fluorescent tracers in PVMs-deficient conditions. Overall, our data highlight the importance of PVMs in regulating the toxicity and propagation of synucleinopathy and provide a rationale for therapeutic strategies aimed at boosting PVMs functions in PD.

Le récepteur activateur de NF-κB (RANK), membre de la famille des récepteurs au TNF, est connu pour son rôle dans l’homéostasie de l’os, mais joue aussi un rôle important dans le système immunitaire. J’ai tout d’abord étudié des outils permettant de cibler RANK/RANKL. J’ai caractérisé et comparé l’activité biologique de deux anticorps anti-RANK. J’ai également criblé une librairie de petites molécules pour identifier des inhibiteurs de l’interaction RANK/RANKL. Dans une deuxième partie, je me suis intéressée au rôle du ligand de RANK (RANKL) dans l’homéostasie du ganglion lymphatique. RANKL joue un rôle dans la différenciation des ostéoclastes mais son rôle dans la différenciation d’autres macrophages n’a pas été étudié. Nous avons étudié des souris déficientes pour RANKL dans les cellules marginales réticulaires (MRC) qui expriment RANKL de manière constitutive dans le ganglion adulte. Nous avons observé une diminution de la population de macrophages sous-capsulaires (SSM). Nous avons également montré que les cellules endothéliales lymphatiques (LEC) expriment l’intégrine alpha 2b (ITGA2b) et que cette expression est sensible à la présence de RANKL. / The TNF-family member Receptor Activator of NF-κB (RANK) is known for its role in bone homeostasis and is increasingly recognized as a central player in immune regulation. Firstly I looked for new molecular tools to target RANK/RANKL axis. I characterized and compared the biological activity of two anti-RANK antibodies. Moreover, I screened the Prestwick Chemical Library® of small molecules in order to identify inhibitors of RANK/RANKL interaction. Secondly, I studied the effect of the RANK/RANKL axis in lymph node homeostasis. RANKL is known to promote osteoclast differentiation but whether it also plays a role in the differentiation of other macrophage subsets is not known. We addressed this question by conditionally deleting RANKL from marginal reticular stromal cells (MRCs) that constitutively express RANKL in the lymph node. We observed impaired differentiation of the subcapsular sinus macrophages (SSMs). We also studied lymph node lymphatic endothelial cells (LECs) and showed that integrin alpha 2b (ITGA2b) is expressed by a lymph node subset of LECs and its expression is sensitive to RANKL.

RANKL (ligand du récepteur activateur de NF-KB) est un membre de la famille des TNF dont la signalisation passe par RANK et qui joue un rôle important dans la régulation immunitaire. Chez l'adulte, RANKL est exprimé constitutivement par des cellules réticulaires marginales (MRC) des ganglions lymphatiques. Comme les MRCs sont physiquement proches des lymphocytes B (LB) et ont été proposé d’être des précurseurs de cellules dendritiques folliculaires (FDC), RANKL pourrait jouer un rôle dans la différenciation du stroma associé aux LB et dans la réponse humorale. Afin de mieux comprendre la fonction de RANKL exprimé par les MRC, nous avons généré des souris déficitaires pour RANKL dans les cellules stromales. Nous avons constaté que la formation du follicule B était perturbée ainsi que le réseau FDC. Bien que RANKL ne soit pas requis pour la formation des MRC, il est nécessaire pour l'expression de la chimiokine CXCL13 par ces mêmes cellules. Parmi les TNFRSF dont la signalisation est requise pour l’expression de CXCL13 et la différenciation des FDC, le TNFR1 était significativement réduit dans les cellules stromales des souris dépourvues de RANKL stromal. Ainsi, RANKL pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique contre les immunopathologies des LB en agissant sur son stroma. / RANKL (receptor activator of NF-κB ligand), a member of the TNF family that signals via RANK, plays an important role for immune regulation. In the adult, RANKL is constitutively expressed by marginal reticular cells (MRCs) of the lymph nodes. Because MRCs are positioned in close vicinity to B cells and may be precursors of follicular dendritic cells (FDCs), RANKL could play a role in the differentiation of B cell-associated stroma and the humoral immune response. In order to better understand the role of RANKL expressed by the MRCs, we generated mice with conditional RANKL deficiency in the stromal compartment. We found that the B cell follicle structure was disrupted and FDC network formation was reduced. Although RANKL was not required for MRC formation, it was necessary for the expression of B cell attracting chemokine CXCL13. Among the TNFRSF members known to control CXCL13 expression and FDC formation, we found that TNFR1 was significantly reduced in the RANKL cKO mice. Thus, RANKL may present a novel therapeutic strategy against B cell-mediated immunopathologies by acting on its stroma.

Au Vietnam, malgré les succès du gouvernement dans la lutte contre le paludisme, cette maladie persiste en zones forestières, le long des frontières internationales, en particulier avec le Cambodge, et très peu de données sont disponibles sur la filariose lymphatique de Bancroft (FLB). Aucun vaccin n'étant actuellement disponible, la lutte antivectorielle ciblant les Anopheles, moustiques qui peuvent être vecteurs d'agents du paludisme et de la FLB, reste un des éléments clés pour mieux contrôler ces deux maladies. Toutefois, une meilleure connaissance des vecteurs présents en zones endémiques et l'étude de leur capacité vectorielle s'imposaient compte tenu du manque d'information sur la transmission de ces 2 maladies dans la région centre-sud du Vietnam. La capacité vectorielle étant fortement liée à la flore bactérienne de l'estomac des moustiques, sa biodiversité a été estimée afin de mieux appréhender les familles bactériennes présentes chez les moustiques de terrain, en particulier la présence d'Enterobacteriaceae qui peut avoir une influence sur la résistance des anophèles au développement de Plasmodium, agent du paludisme. Ce champ d'investigation n'avait encore jamais été étudié chez les vecteurs du paludisme au Vietnam.Cette thèse porte sur 2 objectifs principaux : (1) l'évaluation de la capacité vectorielle des espèces d'Anopheles dans la co-transmission de Plasmodium spp. et de Wuchereria bancrofti (agent de la FLB) dans la Province de Dak Nong et de Binh Phuoc du centre-sud Vietnam (à la frontière avec le Cambodge) et (2) l'estimation de la biodiversité de la flore bactérienne de l'estomac de populations d'Anopheles du centre-sud Vietnam et l'évaluation de l'influence de certaines bactéries sur la capacité vectorielle des espèces d'Anopheles. L'identification morphologique et moléculaire des spécimens d'Anopheles collectés dans les sites d'étude nous a permis d'appréhender et de mieux connaître la faune anophélienne du centre-sud Vietnam avec la présence de 24 taxa, dont des vecteurs primaires et secondaires. Les espèces dominantes sont Anopheles dirus (48,2%), An. maculatus (19,1%) et An. minimus (9,8%), trois vecteurs majeurs du paludisme et de la FLB. Pour la première fois au Vietnam, la présence d'An. scanloni, une des 8 espèces du Complexe Dirus et vecteur du paludisme en Thaïlande, a été montrée et confirmée après son identification par techniques moléculaires et séquençage. La relation taxonomique entre An. crawfordi et An. dangi, une espèce nommée de façon informelle au Vietnam en 1987, est clarifiée grâce à une étude phylogénétique qui nous a permis d'établir qu'An. dangi est un variant morphologique d'An. crawfordi.Le taux d'infection parasitaire des anophèles a été analysé grâce à des approches PCR, en temps réel et conventionnelle, afin de déterminer la capacité vectorielle des espèces collectées. Parmi les 765 spécimens d'Anopheles étudiés, 2 spécimens dont 1 An. dirus et 1 An. pampanai, ont été trouvés infectés par P. vivax. Les taux d'infection sont de 0,26% sur l'ensemble de l'échantillon, de 0,41% pour la Province de Binh Phuoc et de 0,28% chez An. dirus et 20% chez An. pampanai. Aucun moustique n'a été trouvé infecté ni par P. falciparum, ni par P. knowlesi et ni par Wuchereria bancrofti. La flore bactérienne de l'estomac des anophèles a été analysée après application de 2 méthodes d'identification basées à la fois sur la culture et la PCR du gène 16S sur 200 abdomens d'anophèles de 11 espèces différentes. Les résultats montrent la présence de 116 genres bactériens, dont 18 genres communs, classés taxonomiquement dans 7 phyla dont Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Planctomycetes, Proteobacteria et Synergistetes. Le genre dominant de Dak Nong est Acinetobacter et celui de Binh Phuoc est Staphyloccocus. Acinetobacter est aussi dominant dans la communauté bactérienne de tous les spécimens d'Anopheles étudiés. / In Vietnam, despite the success of the Government in controlling malaria, the disease persists in forest areas along the international borders, especially with Cambodia, and few data are available on the Bancroftian lymphatic filariasis (BLF). No vaccine is currently available to protect from these two diseases, then vector control of Anopheles mosquitoes, that may transmit both malarial and BLF agents, remains one of the key element to control these two diseases. As there is a real lack of information on the transmission of these two diseases in south-central region of Vietnam, it was necessary to apprehend the vectors occurring in endemic areas and to study their vectorial capacity. As bacterial flora in Anopheles midgut may have a strong influence on the vectorial capacity of the mosquito, its biodiversity was estimated in order to better understand bacterial families present in mosquitoes from the field, in particular the presence of Enterobacteriaceae that can have an influence on the development of Plasmodium, agent of malaria. This field of investigation of bacteria has never studied in malaria vectors of Vietnam.This thesis focuses on two main objectives: (1) to evaluate the vectorial capacity of Anopheles species in the co-transmission of Plasmodium spp. and Wuchereria bancrofti (BLF agent) in the Provinces of Dak Nong and Binh Phuoc in south-central Vietnam (near the border with Cambodia), and (2) to estimate the biodiversity of the bacterial flora in the midgut of Anopheles populations of south-central Vietnam and evaluate the influence of certain bacteria on the vectorial capacity of Anopheles species.Morphological and molecular identification of Anopheles specimens collected in the study sites allowed us to apprehend and better understand the Anopheles fauna in south-central Vietnam composed of 24 taxa, including primary and secondary vectors. The dominant species were Anopheles dirus (48.2%), An. maculatus (19.1%) and An. minimus (9.8%), three major vectors of malaria and the BLF. For the first time, An. scanloni, one of the 8 species of Dirus Complex and malaria vector in Thailand, was collected in Vietnam and confirmed by molecular and sequencing techniques. The relationship between An. crawfordi and An. dangi, a species informally named in Vietnam in 1987, was clarified through a phylogenetic study that allows us to establish that An. dangi is a morphological variation of An. crawfordi.The parasites infection rate of Anopheles was investigated using both real-time PCR and conventional PCR to determine the vectorial capacity of the collected species. Of the 765 Anopheles specimens, 2 individuals, such as 1 An. dirus and 1 An. pampanai, were found infected by P. vivax. Then, the infection rates were of 0.26% on the total sample, 0.41% in Binh Phuoc, 0.28% for An. dirus, and 20% for An. pampanai. No mosquito was found infected by either P. falciparum, P. knowlesi or Wuchereria bancrofti.The bacterial flora in Anopheles midguts was analyzed using 2 identification methods based on culture and on 16S PCR-TTGE processed on 200 abdomens of 11 different Anopheles species. The results obtained showed the presence of 116 bacterial genera, including 18 common genera, belonging to 7 phyla such as Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Planctomycetes, Proteobacteria, and Synergistetes. The dominant genus in Dak Nong was Acinetobacter and Staphyloccocus in Binh Phuoc. Acinetobacter was dominant in the bacterial community of all studied Anopheles. The genus Enterobacter, which can influence the development of the Plasmodium, represented a prevalence of 1.7% of the microbiome of our specimens compared to 39.2% for the predominant genus Acinetobacter. This latter genus was significantly associated to Anopheles infected with Plasmodium vivax.

Afin d'accélérer et automatiser l'analyse par ultrasons quantitatifs de ganglions lymphatiques de patients atteints d'un cancer, plusieurs segmentations automatiques des trois milieux rencontrés (le parenchyme du ganglion, la graisse périnodale et le sérum physiologique) sont étudiées. Une analyse statistique du signal d'enveloppe a permis d'identifier la distribution gamma comme le meilleur compromis en termes de qualité de la modélisation, simplicité du modèle et rapidité de l'estimation des paramètres. Deux nouvelles méthodes de segmentation basées sur l'approche par ensemble de niveaux et la distribution gamma sont décrites. Des statistiques locales du signal d'enveloppe permettent de tenir compte des inhomogénéités du signal dues à l'atténuation et la focalisation des ultrasons. La méthode appelée LRGDF modélise les statistiques du speckle dans des régions dont la taille est contrôlable par une fonction lisse à support compact. La seconde, appelée STS-LS, considère des coupes transverses, perpendiculaires au faisceau, pour gagner en efficacité. Une troisième méthode basée sur la classification par forêt aléatoire a été conçue pour initialiser et accélérer les deux précédentes. Ces méthodes automatiques sont comparées à une segmentation manuelle effectuée par un expert. Elles fournissent des résultats satisfaisants aussi bien sur des données simulées que sur des données acquises sur des ganglions lymphatiques de patients atteints d'un cancer colorectal ou du sein. Les paramètres ultrasonores quantitatifs estimés après segmentation automatique ou après segmentation manuelle par un expert sont comparables. / This work investigates approaches to obtain automatic segmentation of three media (i.e., lymph node parenchyma, perinodal fat and normal saline) in lymph node (LN) envelope data to expedite quantitative ultrasound (QUS) in dissected LNs from cancer patients. A statistical modeling study identified a two-parameter gamma distribution as the best model for data from the three media based on its high fitting accuracy, its analytically less-complex probability density function (PDF), and closed-form expressions for its parameter estimation. Two novel level-set segmentation methods that made use of localized statistics of envelope data to handle data inhomogeneities caused by attenuation and focusing effects were developed. The first, local region-based gamma distribution fitting (LRGDF), employed the gamma PDFs to model speckle statistics of envelope data in local regions at a controllable scale using a smooth function with a compact support. The second, statistical transverse-slice-based level-set (STS-LS), used gamma PDFs to locally model speckle statistics in consecutive transverse slices. A novel method was then designed and evaluated to automatically initialize the LRGDF and STS-LS methods using random forest classification with new proposed features. Methods developed in this research provided accurate, automatic and efficient segmentation results on simulated envelope data and data acquired for LNs from colorectal- and breast-cancer patients as compared with manual expert segmentation. Results also demonstrated that accurate QUS estimates are maintained when automatic segmentation is applied to evaluate excised LN data.

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A key step in the development of an adaptive immune response is the activation of naive T cells by dendritic cells (DCs). DCs sample antigens in the periphery and migrate to the lymphoid organs were they provide different signals to T cells: they present antigenic peptides in the context of MHC molecules, express costimulatory or coinhibitory ligands and produce cytokines that influence T cell fate. The integration of these signals will either induce tolerance or lead to the activation and expansion of effector T cells which will mediate the immune response.<p>The costimulatory CD70/CD27 pathway plays important roles in the development of pro-inflammatory Th1 and CTL responses. CD70 expression on DCs has also been described as a molecular switch from tolerance to immunity. Accordingly, its activity is tightly regulated in vivo. The aim of this work was to investigate the mechanisms controlling the expression of CD70 on dendritic cells and CD27 on T lymphocytes.<p>First, we described a cell-extrinsic mechanism of inhibition exerted on DCs by regulatory T cells (Tregs). Indeed, Tregs controlled Th1 priming in vivo and in vitro by downregulating CD70 on DCs. This control involved a transfer of the CD27 receptor to DCs, possibly via the production of CD27-bearing microvesicles by T cells at the immunological synapse. Acquisition of CD27 by DCs induced the internalization of both CD27 and CD70 and probably their lysosomal degradation. As a consequence, DCs were impaired in their ability to efficiently prime Th1 cells. Second, we analyzed CD70 and CD27 expression in the periphery and provided evidence for a cell-intrinsic control of CD27 expression by ectodomain shedding in the gastrointestinal tract.<p>While they efficiently clear infections, inflammatory responses can also be deleterious to the organism. By restraining CD70 expression on DCs, Tregs would promote tolerance and limit inflammation. Interestingly, tolerance is particularly important in the intestines, which are in constant contact with dietary antigens and the commensal microbiota. Accordingly, we propose that a second layer of control of CD27-driven costimulation takes place in the gut :by shedding CD27, T cells would be desensitized for any potential CD70-dependent costimulation.<p>To further investigate the physiological significance of the mechanisms described above, the immune response will be monitored in animals specifically lacking CD27 expression in the Treg population or expressing a nonsheddable CD27 receptor.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La prise en charge de l’insuffisance veineuse chronique (IVC) et du lymphœdème repose, traditionnellement, sur des méthodes de compression fondées sur des concepts généralement admis mais insuffisamment éprouvés. Le Projet « Phlébosthène », initié en 2010, comporte le développement et l’application d’outils d’étude biomécanique quantitative de l’œdème et des troubles fonctionnels veineux. Les études n°1 et 2 reposaient sur la volumétrie par mesures étagées de circonférence du membre supérieur chez des patientes présentant un lymphœdème. Elles ont montré la valeur prédictive des variations de volume obtenues par la phase intensive du traitement décongestif quant à l’évolution du lymphœdème à moyen terme et au risque de phénomène de rebond. L’étude n°3 a validé la volumétrie de membre par caméra laser 3D chez des sujets sains et des patients souffrant d’insuffisance veineuse chronique du membre inférieur, en comparaison à la volumétrie par déplacement d’eau, méthode de référence, avec l’avantage majeur de quantifier le volume du pied et de la main. L’étude n°4 comportait, au membre inférieur, la mesure des pressions d’interface, intraveineuse, et intramusculaire sans et avec orthèse de compression dégressive de force 2 et 3, et avec orthèse de compression progressive, au repos, lors d’une manœuvre de flexion-extension du pied en position allongée, et lors d’une manœuvre de haussement sur la pointe des pieds en position debout. L’échographie avec mesure de la force d’appui sur la sonde et analyse automatique d’image calculant l’aire veineuse permettait de déterminer la courbe force / aire d’une veine superficielle et d’une veine profonde du mollet en position allongée et debout. Nous avons inclus 57 patients souffrant d’IVC (21 au stade C1s, 18 au stade C3, et 18 au stade C5 selon la classification CEAP), et 54 sujets sains témoins (18 sédentaires, 18 actifs, 18 sportifs) appariés. Les mesures de pression intraveineuse et intramusculaire ont été réalisées chez un tiers des patients et sujets sains. Le traitement des données échographiques (1776 séquences) étant en cours, nous ne pouvons présenter que des résultats préliminaires et partiels. Les pressions d’interface évoluaient conformément aux attentes, atteignant des valeurs plus élevées sous compression de force 2 que sans compression, sous compression de force 3 que de force 2, et sous compression progressive que sous compression de force 2 ou 3. La compression progressive ne se distinguait nettement des compressions dégressives qu’au niveau du mollet et non de la cheville. Les pressions d’interface étaient généralement plus élevées, sous compression, chez les témoins et les patients au stade C5, et, à un moindre degré, au stade C3, que chez les patients au stade C1s. La pression intraveineuse variait en fonction de la posture et du mouvement et était corrélée à la taille du sujet et sa longueur de jambe en orthostatisme ainsi qu’avec le stade clinique d’IVC. La pression intramusculaire évoluait parallèlement à la compression. Les boucles force / aire veineuse montraient une hystérésis caractéristique, décrivant donc la viscoélasticité des veines examinées. L’analyse complète des résultats permettra de comparer les différentes orthèses de compression et leur effet sur la biomécanique veineuse des sujets sains et pathologiques, avec des données quantitatives sur les caractéristiques viscoélastiques des veines. Nous pourrons évaluer l’effet de l’activité physique en comparant les sujets sédentaires, actifs, et sportifs. L’objectif est, à terme, de produire un modèle mathématique permettant, à partir d’un ensemble limité de données obtenues de façon non-vulnérante, de prédire l’effet des différentes modalités de compression sur la biomécanique veineuse de façon à pouvoir déterminer, grâce à la description géométrique tridimensionnelle du membre, les paramètres individuels optimaux de compression. / The conventional treatment of chronic venous insufficiency (CVI) and lymphedema is based upon mechanical compression, relying on generally admitted but insufficiently proven concepts. The " Phlebosthene " project, initiated in 2010, involves the development and implementation of innovative tools for the quantitative biomechanical evaluation of edema and venous disorders. Studies #1 and #2 were based on the calculation of the upper limb volume by serial circumference measurements in patients with lymphedema. They demonstrated the predictive value of volume variations during the intensive phase of decongestive therapy as for the medium-term outcome and the risk of rebound phenomenon. Study #3 validated segmental limb volumetry by 3D laser scanning in healthy subjects and in patients with lower limb CVI, in comparison with water displacement (reference method), with the major advantage of quantifying the volume of the foot and toes. Study #4 included the measurement, at the lower limb, of interface, intravenous, and intramuscular pressure without and with compression stockings, comparing force 2 and force 3 graduated stockings with so-called progressive compression. Measurements were performed at rest, during flexion-extension movements of the foot while the subject was lying supine, and during a tip-toe test in the standing position. Synchronously recorded B-mode sonography with automatic image analysis allowed calculating the venous area and provided force / area curves of superficial and deep calf veins in the supine and in the standing position. We included 57 patients with CVI (21 at the C1s, 18 at the C3 and 18 at the C5 stage of CVI according to the CEAP classification), and 54 matched healthy controls (18 sedentary, 18 active, 18 sportive). Intravenous and intramuscular pressure measurements were performed in one third of patients. As the processing of the 1776 B-mode sonographic sequences is still underway, we can only offer here partial and preliminary results. Interface pressures evolved as expected, reaching higher values under graduated force 2 compression stockings than without compression, under graduated force 3 than force 2 compression, and under progressive than under graduated compression. Progressive compression clearly distinguished itself from graduated compression only at the calf but not at the ankle level. Interface pressures were generally higher, under compression, in controls and in patients with IVC at the C5 stage, and, to a lesser degree, at the C3 stage, than in patients at the C1s stage. Intravenous pressure varied with posture and movement and correlated with the subject’s size and leg length in orthostatic position, and with the CVI stage. The force / area curves of superficial and deep calf veins exhibited a characteristic hysteresis, yielding viscoelasticity information. When the database will be complete and consolidated, we will be able to compare different compression stockings and their effect on the venous biomechanics of healthy and pathological subjects, providing quantitative data on the viscoelastic characteristics of superficial and deep veins. We will also be able to assess the effect of physical activity on venous biomechanics by comparing sedentary, active, and sportive subjects. The confrontation of interface, intravenous, and intramuscular pressures with these biomechanical data will provide a mathematical model using a limited set of data obtained by simple and non-invasive measurements to predict the effect of compression stockings on the biomechanics of superficial and deep veins, in order to determine, with the help of 3D laser scanning, the optimal individual compression settings.

<p>Over the past decade, studies using murine models have led to the demonstration that CD4+ T helper (Th) cells play a critical role in the control of cancer progression. Additional support for their importance comes from the growing body of recent clinical/translational research data demonstrating the importance of tumor-infiltrating T and B lymphocytes in long-term patient survival for various types of cancer, including breast cancer (BC). As the key population coordinating adaptive immune responses, the role(s) played by individual Th subsets in cancer immunity remains largely controversial. The Th1 subset has uniquely been shown to have a clear anti-tumor effect, guiding CD8+ cytotoxic T cells-mediated direct tumor cell lysis through IFN-γ secretion. Although the negative regulatory role played by Treg cells has been extensively studied in cancer, its prognostic value along with that of Th2 and Th17 cells have not been clearly demonstrated in patients. T follicular helper (Tfh) cells, a recently characterized Th subset that plays a primary role in the generation of B cell memory in secondary lymphoid organs, have not been previously described infiltrating solid tumors. The principal objective of this thesis was to perform an in-depth characterization of tumor-infiltrating CD4+ T cells (TIL) and Th subsets in human BC, where very little is currently known.<p>Using whole genome microarrays, we analyzed the gene expression profiles of TIL relative to their counterparts from the axillary lymph nodes and peripheral blood. Applying a novel approach, we compared TIL profiles with public microarray data for Th subsets, demonstrating: 1) the presence of all major Th subsets (Th1, Th2, Th17, Treg as well as Tfh) in the TIL, 2) the TIL are effector memory rather than central memory cells, 3) the TIL are concomitantly activated and suppressed and 4) TIL from tumors with extensive lymphoid infiltrates are more activated/less suppressed in the TCR/CD3 signaling pathway, producing higher levels and a wider panel of Th cytokines than TIL from minimally-infiltrated tumors.<p>We also performed in vitro experiments to study tumor microenvironment effects on TIL by treating normal CD4+ T cells from healthy donor blood with primary tumor supernatants (SN). Tumor SN largely reproduces the TIL profile in normal Th cells, totally suppressing their activation and inhibiting their cytokine production. Intriguingly, the highly restricted number of cytokines induced by tumor SN included several tumor-promoting factors, such as IL-8 and TNF. SN from an extensively-infiltrated tumor was found to be less immune-suppressive than SN from minimally-infiltrated tumors. In line with this, TIL from minimally-infiltrated tumors are closer to SN-treated (suppressed) activated donor cells whereas TIL from extensively-infiltrated tumors are more similar to activated cells without SN treatment.<p>These results led us to further investigate the observed differences between TIL from extensive and minimally-infiltrated tumors. Genes characterizing Th1 and Tfh cells were enriched in the extensively-infiltrated tumors. PD-1hiCD200hi Tfh cells were specifically detected in extensively-infiltrated tumors by flow cytometry and these cells were determined to be the major source of the chemokine CXCL13. Immunohistochemical analysis demonstrated highly-organized tertiary lymphoid structures (TLS) within the tumor, containing a CD4+/CD8+ T cell zone and a B cell zone with reactive germinal centers where Tfh cells and follicular dendritic cells (FDC) are resident. Their presence suggests the origin of an effective memory anti-tumor immune response.<p>Finally, we generated Tfh- and Th1-specific gene signatures reflecting differences between extensive and minimal TIL and tested their prognostic value in large-patient-scale public data sets. Our Tfh signature predicts better 10-year disease-free survival for all BC subtypes, outperforming the Th1 signature, suggesting that Tfh cells play a more central role than Th1 cells in anti-tumor immunity. CXCL13 is the determinant gene of our Tfh signature, showing particularly strong prognostic power for the HER2+ subtype. Additionally, these signatures also predict a better response to neoadjuvant chemotherapy.<p>This thesis research has demonstrated that a previously undetected Th subset, Tfh cells, infiltrates solid tumors and shown that their presence signals enhanced anti-tumor immunity.<p><p> <p>Durant cette dernière décennie, des travaux menés dans des modèles murins ont permis de mettre en évidence le rôle crucial joué par les lymphocytes T auxiliaires CD4+ (Th) dans le contrôle de la progression des cancers. De plus, de nombreuses études cliniques et/ou translationnelles récentes corroborent ces observations en montrant une corrélation entre l’importance de l’infiltration intra-tumorale par les lymphocytes T et B et la survie à long terme des patients atteints de différents types de cancer, dont le cancer du sein. En tant que chefs d’orchestre de la réponse immune adaptative, les rôles spécifiques des sous-populations des cellules Th restent controversés. Les Th1 sont la seule population exerçant une claire réponse anti-tumorale, qui est liée à la sécrétion d’IFN-γ, une cytokine primordiale à l’action des lymphocytes T cytotoxiques CD8+. Bien que le rôle néfaste des T régulateurs (Treg) a été largement étudié dans le cancer, leur implication pronostique ainsi que celle des Th2 et Th17 n’ont pas encore été clairement démontrées. La présence d’une sous-population de CD4, les T auxiliaires folliculaires (Tfh), cellules clés dans la différenciation des lymphocytes B mémoires au sein des organes lymphoïdes secondaires, n’a jamais été décrite dans les cancers solides. Le but principal de ce travail est de caractériser les sous-populations des lymphocytes T CD4+ infiltrant la tumeur (TIL) en prenant comme modèle le cancer du sein humain. A l’heure actuelle, il existe très peu de données sur les TIL CD4 dans ce type de cancer.<p>Nous avons d’abord établi le profil génique des TIL en les comparant avec ceux provenant des ganglions axillaires ou du sang périphérique. En appliquant une nouvelle approche, nous avons comparé les profils des TIL avec les données publiques de sous-populations de Th et démontré que :1) toutes les sous-populations de cellules Th (Th1, Th2, Th17, Treg et Tfh) infiltrent la tumeur, 2) les TIL ont un phénotype plus proche de celui des cellules mémoires effectrices que des cellules mémoires centrales, 3) les TIL sont simultanément activés et supprimés et 4) les TIL provenant des tumeurs massivement infiltrées («extensives») par des lymphocytes sont mieux activés et moins supprimés que les TIL des tumeurs peu infiltrées («minimales») dans la voie de signalisation TCR et produisent des cytokines d’une quantité plus élevée et d’une répertoire plus large.<p>Nous avons également effectué des expériences in vitro pour étudier l’effet de l’environnement tumoral sur les TIL en traitant des CD4 normaux (provenant des donneuses saines) par le surnageant (SN) extrait des tumeurs fraiches. Le SN tumoral induit un profil génique proche de celui des TIL en inhibant l’activation et la production de cytokines de ces cellules stimulées. Curieusement, parmi le peu de cytokines induites par le SN tumoral, des facteurs pro-tumoraux comme IL-8 et TNF sont détectés. Le surnageant provenant d’une tumeur «extensive» est moins immunosuppresseur que ceux des tumeurs «minimales». Conformément, les TIL provenant des tumeurs «minimales» ont un profil génique proche des cellules normales activées et traitées (supprimées) par le SN tumoral tandis que les TIL des tumeurs «extensives» ressemblent aux cellules activées non traitées.<p>Ces résultats nous avaient guidés à investiguer plus profondément les différences observées entre les TIL des tumeurs «extensives» et «minimales». Les gènes caractéristiques des Th1 et Tfh sont enrichis dans les tumeurs «extensives». Les cellules Tfh PD1hiCD200hi sont spécifiquement détectées par cytométrie de flux dans les tumeurs «extensives» et sont identifiées comme les producteurs principaux de la chimiokine CXCL13. L’examen par immunohistochimie a permis de détecter des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans la tumeur, composées d’une zone T (CD4 et CD8) et d’une zone B au sein de laquelle se trouve parfois un centre germinatif actif contenant des Tfh et des cellules dendritiques folliculaires (FDC). La présence de ces structures suggère l’origine d’une réponse immune mémoire anti-tumorale.<p>Finalement, nous avons établi des signatures géniques spécifiques aux Tfh et Th1 et recherché leur impact pronostique dans deux bases de données publiques à grande échelle. Notre signature Tfh est positivement corrélée avec la survie à 10 ans des patientes de tous les sous-types de cancer du sein, et est plus performante que la signature Th1. Ceci suggère que les Tfh pourraient jouer un rôle plus crucial que les Th1 dans la réponse immune anti-tumorale. CXCL13 est le gène déterminant de notre signature Tfh et son expression est fortement associée à une meilleure survie chez les patientes du sous-type HER2+. De plus, ces signatures prévoient également une meilleure réponse à la chimiothérapie néoadjuvante (préopératoire).<p>Cette étude a démontré qu’une nouvelle sous-population de CD4, les Tfh, infiltre la tumeur solide et leur présence indique l’existence d’une immunité anti-tumorale renforcée.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Toutes les cellules libèrent plusieurs types de vésicules extracellulaires (VEs) qui transportent protéines, lipides et acides nucléiques. Ces vésicules de petite taille se retrouvent dans tous les fluides biologiques tel que le sang et la lymphe et interagissent avec les cellules environnantes. Le système lymphatique constitue une voie de prédilection pour la mobilisation des accepteurs de cholestérol à partir de la paroi artérielle. Nous avons démontré dans un modèle murin qu’une dysfonction lymphatique précède la formation de la plaque d’athérome et que cette dysfonction touche a priori la capacité de contraction des vaisseaux collecteurs. À la base de toutes ces observations, nous avons émis l’hypothèse que les VEs contribuent à la dysfonction lymphatique liée à l’athérosclérose. Pour répondre à ceci, nous avons mis en place un projet translationnel composé de deux groupes de sujets sains, sans maladie cardiovasculaire, qui se distinguent par la présence d’antécédents familiaux d’accidents cardiovasculaires prématurés chez un parent du premier degré. Nous avons quantifié plusieurs sous-types d’intérêt de VEs en circulation à partir du plasma exempt de plaquettes, par cytométrie en flux ultraspécialisés dans la détection de petites particules (> 100 nm) combiné à d’autres techniques complémentaires standardisées. Ensuite, nous avons évalué la fonction lymphatique grâce à l’imagerie par proche infrarouge après injection du vert indocyanine (ICG). Nos résultats préliminaires sont prometteurs quant aux rôles des VEs et de la dysfonction lymphatique dans le développement de l’athérosclérose et corroborent avec nos observations faites chez la souris. Les sujets avec antécédents familiaux de maladie cardiovasculaire (MCV) présentent des signes de dysfonction lymphatique avant même l’apparition de plaques d’athérome subcliniques. La réponse mécano-sensible de leurs vaisseaux collecteurs paraît défectueuse et est observable de concert avec un profil de VEs qui présument une atteinte lymphatique. Ces résultats restent à être confirmer avec le recrutement de sujets additionnels et l'évaluation de la corrélation avec le score de risque polygénique de développer une MCV, dans l’objectif ultime de faire des VEs et de la fonction lymphatique de nouveaux biomarqueurs dans l’identification précoce des MCV. / All cell types release extracellular vesicles (EVs) that carry different types of cellular cargo, such as proteins, lipids and nucleic acids. These small vesicles are found in all biological fluids including blood and lymph and can interact with neighboring cells. The lymphatic system is a preferred route for the mobilization of cholesterol from the arterial wall. We have demonstrated in a mouse model that lymphatic dysfunction precedes the development of atherosclerosis and that that this dysfunction affects the contraction capacity of the collecting vessels. Based on these observations, we hypothesized that EVs contribute to atherosclerosis-associated lymphatic dysfunction. Therefore, we have initiated a translational study involving two groups of healthy subjects that differ in their risk of cardiovascular disease (CVD). We quantified several subtypes of circulating EVs on platelet-free plasma by ultraspecialized flow cytometry in the detection of small particles (> 100 nm) combined to other state-of-the art complementary techniques. Next, we assessed the lymphatic function using near-infrared imaging and injection of indocyanine green (ICG). Our preliminary results are promising for the role of EVs and lymphatic dysfunction in the development of atherosclerosis and corroborate with our observations made in mice. Individuals at high risk of CVD have signs of lymphatic dysfunction even before the onset of subclinical atherosclerosis. The mechano-sensitive response of their collecting vessels appears to be defective and is observable in concert with a profile of EVs that presume lymphatic damage. These results remain to be confirmed with the recruitment of additional subjects and the assessment of the correlation with the polygenic risk score of developing a CVD, in the hope of making these specific EV subsets and lymphatic function new biomarkers in the early detection of CVD.