Size exclusion chromatography (SEC) separates molecules based on their actual size rather than their molecular weight. This indicates that the smaller a molecule is, the longer it will be held in the column since it can penetrate the pores more effectively than a bigger molecule, resulting in a longer retention time, whereas the larger molecule has a shorter retention time. In order to achieve reliable and accurate results the asymmetry factor of the packed columns should be between 0.6-1.4. The aim for this project was to examine whether or not the batch variations of the base matrix used to derive WorkBeads™ 40S and 40Q displayed either hydrophobic or hydrophilic interactions by running different types of proteins through columns packed with the base matrices. The project was performed using an ÄKTA explorer equipped with an ultraviolet (UV) detector and a refractive index detector (RID). The data was gathered and analyzed with the Unicorn™ by Cytiva. The results from the first experiments showed that lysozyme did not elute as expected or not at all, thus leading to a concern that the there might be some hydrophobic interactions in the base matrix, which is a porous media in the form of spherical particles that have been selected for their physical stability and inertness (lack of reactivity and adsorptive properties), and lysozyme. With this suspicion in mind, the different batches of the base matrix underwent hydrophobic interaction chromatography (HIC), where the results may be interpreted in a way that there might electrostatic interactions instead of hydrophobic interactions. However, due to the gel not being suitable for HIC the results were unreliable. By subsequently running lysozyme and other proteins through the columns at different NaCl concentrations the results showed consistent elution at NaCl concentrations > 150 mM, yet inconsistent at a concentration of 150 mM for lysozyme. The elution order by size showed that although lysozyme has a larger hydrodynamic radius (Rh) than cytochrome c it eluted later, which is theoretically incorrect, but it might be owing to some of the base matrix's characteristics or the lysozyme's dual nature of expressing both hydrophobic and hydrophilic interactions on the base matrix. Because of the inconsistent results from lysozyme, another experiment just at 150 mM was conducted where lysozyme did elute consistently with a KD value < 1.  Lastly, a titration was performed on the base matrix where some of it was brominated and some of it was not, which was the reference. The results showed that there could be hydrophobic interactions on the brominated sample and hydrophilic interactions on the reference sample. However, what is more likely is that lysozyme is an unreliable protein to use to determine hydrophobicity on this type of gel. / Size exclusion chromatography (SEC) separerar molekyler baserat på deras faktiska storlek snarare än deras molekylvikt. Detta indikerar att ju mindre en molekyl är, desto längre kommer den att hållas i kolonnen eftersom den kan tränga sig in i porerna mer effektivt än en större molekyl, vilket resulterar i en längre retentionstid, medan den större molekylen har en kortare retentionstid. För att uppnå tillförlitliga och nogranna resultat bör asymmetrifaktorn hos de packade kolonnerna vara mellan 0.6-1.4. Syftet med detta projekt var att undersöka huruvida batchvariationerna av basmatrisen som användes för att ta fram WorkBeads™ 40S och 40Q uppvisade antingen hydrofoba eller hydrofila interaktioner genom att köra olika typer av proteiner genom kolumner packade med basmatriserna. Projektet utfördes med en ÄKTA explorer utrustad med en ultraviolett (UV) detektor och en refractive index detector (RID). Data samlades in och analyserades med Unicorn™ av Cytiva. Resultaten från de första experimenten visade att lysozym inte eluerade som förväntat eller inte alls, vilket ledde till en oro för att det kan finnas vissa hydrofoba interaktioner i basmatrisen, som är ett poröst medium i form av sfäriska partiklar som har har valts ut för deras fysikaliska stabilitet och inerthet (brist på reaktivitet och adsorptiva egenskaper), och lysozym. Med denna misstanke i åtanke genomgick de olika bactherna av basmatrisen hydrofob interaktionskromatografi (HIC), där resultaten kan tolkas på ett sätt att det kan förekomma elektrostatiska interaktioner istället för hydrofoba interaktioner. Men på grund av att gelen inte var lämplig för HIC var resultaten opålitliga. Genom att efteråt köra lysozym och andra proteiner genom kolonnerna vid olika NaCl-koncentrationer visade resultaten konsekvent eluering vid NaCl-koncentrationer > 150 mM, men ändå inkonsekventa vid en koncentration av 150 mM för lysozym. Elueringsordningen efter storlek visade att även om lysozym har en större hydrodynamisk radie (Rh) än cytokrom c, eluerade det senare, vilket är teoretiskt inkorrekt, men det kan bero på några av basmatrisens egenskaper eller lysozymets dubbla natur att uttrycka både hydrofoba och hydrofila interaktioner på basmatrisen. På grund av de inkonsekventa resultaten från lysozym, utfördes ett annat experiment enbart vid 150 mM där lysozym eluerade konsekvent med ett KD-värde < 1. Slutligen utfördes en titrering på basmatrisen där en del av den var bromerad och en del av den inte, vilket var referensen. Resultaten visade att det kunde finnas hydrofoba interaktioner på det bromerade provet och hydrofila interaktioner på referensprovet. Men vad som är mer troligt är att lysozym är ett opålitligt protein att använda för att bestämma hydrofobicitet på denna typ av gel.

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont caractérisées par une inflammation anormale et récurrente du tractus digestif. De nombreuses études ont démontré des effets bénéfiques de souches probiotiques anti-inflammatoires recombinantes ou non. La première partie de cette thèse décrit différentes stratégies d'optimisation de souches de bactéries lactiques en tant que vecteurs de protéines d'intérêt santé. Nous avons ainsi démontré qu'une modification du peptidoglycane de la paroie de Lactococcus lactis influençant la lyse bactérienne ne permettait pas de moduler l'immunogénicité de l'antigène E7 délivré par L. lactis. Nous avons également démontré que la nature du vecteur bactérien était un paramètre essentiel dans la vectorisation de la protéine délivrée : ainsi l'espèce Bifidobacterium infantis induit une réponse immunitaire spécifique à l'antigène E7 supérieure à celle obtenue avec les vecteurs L. lactis et Lactobacillus plantarum. La deuxième partie de cette thèse porte sur l'étude des effets anti-inflammatoires de bactéries recombinantes ou non. Nous avons ainsi démontré que la souche Lb. casei BL23 produisant une superoxyde dismutase à manganèse permettait de diminuer significativement des colites murines induites par administration de dextran sodium sulfate. Enfin, nous avons mis en évidence des propriétés anti-inflammatoires sur divers modèles d'inflammation in vitro / in vivo de Faecalibacterium prausnitzii, première bactérie commensale anti-inflammatoire identifiée sur la base de données cliniques humaines.

A precipitação e cristalização de proteínas são operações unitárias amplamente utilizadas na indústria biotecnológica. A formação de precipitado nestas operações é muitas vezes atingida por meio da adição de um sal que diminui a solubilidade da proteína, ou seja, o chamado fenômeno de saltingout. A principal informação para o estudo da precipitação e da cristalização é o diagrama de fases, em que a solubilidade da proteína é apresentada em função das variáveis do sistema (temperatura, pH, concentração de sal). Outra medida importante é o segundo coeficiente virial, que é uma medida indireta da interação intermolecular. A combinação de ambas as informações é fundamental para a identificação das condições em que fases cristalina ou amorfa são obtidas. O equilíbrio sólido-líquido da lisozima de clara de ovo de galinha em soluções aquosas contendo sais biodegradáveis (succinato de sódio, citrato de sódio e tartarato de sódio) foi estudado por meio da determinação da solubilidade da proteína e do segundo coeficiente virial em função da força iônica. Os dados experimentais do segundo coeficiente virial em função da força iônica foram medidos por meio de cromatografia de autointeração. Estes dados foram correlacionados por modelos apropriados. As informações de solubilidade e do segundo coeficiente virial da proteína foram combinadas para gerar condições experimentais adequadas na identificação da janela de cristalização, i.e., as condições em que uma fase cristalina é obtida. Uma matriz do tipo placa de cultivo foi usada para os experimentos de cristalização. Os resultados experimentais mostraram que as regiões das fases cristalina e amorfa no diagrama de fases são funções simultâneas do segundo coeficiente virial, como parâmetro termodinâmico, e da supersaturação, como parâmetro cinético. Os três sais foram capazes de induzir o efeito salting-out, sendo o succinato de sódio o sal mais eficaz na diminuição da solubilidade da lisozima, seguido pelo tartarato de sódio e pelo citrato de sódio. No caso da lisozima, cristais foram obtidos em soluções de succinato de sódio e tartarato de sódio, e as condições nas quais a fase cristalina é formada foram identificadas; no entanto, para o citrato de sódio somente fase amorfa foi observada. Em conjunto, estes resultados mostram que estes sais biodegradáveis são agentes precipitantes promissores. / The precipitation and crystallization of proteins are unit operations widely used in the biotechnology industry. The formation of a solid phase in these operations is often achieved by adding a salt that lowers the protein solubility, the so-called salting-out phenomenon. The key information to study precipitation or crystallization is the phase diagram, in which the solubility of a protein is presented as a function of system variables (temperature, pH, salt concentration). Another important parameter is the second virial coefficient, which is an indirect measure of intermolecular interactions. The combination of both kinds of information is fundamental to identify the conditions in which crystal and amorphous phases can be formed. The solid-liquid equilibrium of hen egg-white lysozyme in aqueous solutions containing biodegradable salts, viz., sodium citrate, sodium tartrate and sodium succinate, was studied by determining both the protein solubility and the second virial coefficient as a function of ionic strength. Experimental data for second viral coefficient as a function of ionic strength were obtained through self-iteration chromatography. These data were correlated by appropriate models. The protein solubility and the second virial coefficient information were combined to generate adequate experimental conditions to identify the so-called crystallization slot, i.e., the conditions in which a crystalline solid phase is obtained. A plate matrix disposition was used for the crystallization experiments. The experimental results show that the crystal and amorphous regions in the phase diagram depend simultaneously on the second virial coefficient, as a thermodynamic parameter, and on the supersaturation ratio, as a kinetic parameter. All these salts were able to induce salting-out, being sodium succinate the most effective one in decreasing lysozyme solubility, followed by sodium tartrate and sodium citrate. For lysozyme in sodium succinate and sodium tartrate solutions, the conditions for which a crystal phase is formed were identified; however, for sodium citrate only amorphous solid phases were observed.! Overall, these results show that these biodegradable salts are promising precipitating agents.

La compréhension de la plus grande stabilisation des molécules biologiques par un disaccharide<br />tel que le tréhalose par rapport à d'autres excipients fait l'objet de recherches accrues. Nous<br />avons étudié l'influence du tréhalose et de deux autres stéréoisomères, le maltose et le sucrose,<br />sur la structure et sur la dynamique de l'eau et d'une protéine globulaire modèle, le lysozyme. Nous<br />avons montré que le tréhalose induit une plus grande déstructuration du réseau de liaisons hydrogène (LHs)<br />de l'eau que le maltose et le sucrose, au-delà d'une concentration de 40-50 %, à laquelle le réseau<br />de LHs des sucres percole. En outre, le nombre d'hydratation des sucres et le<br />nombre de LHs sucre-sucre suggèrent que les solutions aqueuses de tréhalose sont plus "homogènes",<br />pour des concentrations entre 33 et 66 % pds. Nous avons également localisé les zones<br />d'interaction des sucres avec le lysozyme et montré par spectroscopie Raman que le tréhalose le stabilise<br />davantage.

Untersuchungen zur Reaktion von Proteinen während einer Hochdruckbehandlung (HD) ermöglichen ein besseres Verständnis der Reaktivität und Struktur auf molekularer Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Oligomerisierung von Hühnereiweißlysozym (HEWL) mithilfe der druckstabilen mikrobiellen Transglutaminase (mTGase) unter HD untersucht. Die resultierenden Oligomere wurden anschließend hinsichtlich ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit dem evolutionsbiologisch verwandten Protein, dem α-Lactalbumin durchgeführt. Abschließend erfolgten orientierende Studien zur nicht-enzymatischen Vernetzung von HEWL und ausgewählten Milchproteinen, bei welchen eine kovalente Verknüpfung über vergleichbare Isopeptide nachgewiesen werden konnte. Kompakte, globuläre Proteine, wie das untersuchte HEWL stellten unter Normaldruck keine Substrate für die mTGase dar. Auch war eine enzymatische Vernetzung nach erfolgter Hochdruckbehandlung aufgrund der Reversibilität der druckinduzierten Auffaltung nicht möglich. So wurde HEWL nur bei simultaner Behandlung mit mTGase und hohem hydrostatischem Druck zu Homooligomeren vernetzt. Neben einem geeigneten Puffersystem wurden der pH-Wert, die Inkubationszeit, die Temperatur, der hydrostatische Druck, die Enzymaktivität der mTGase und die Proteinkonzentration des Lysozyms verändert. Abhängig von den Reaktionsbedingungen wurden Produkte mit stark variierenden Vernetzungsgraden erhalten, wobei eine maximale Oligomerisierung von zirka 75% aus einer 3%igen HEWL-Probe in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 mit 160 U mTGase/g Protein über 30 min, 600 MPa und 40°C erreicht wurde. Zudem erfolgte eine Kategorisierung aller resultierenden Proben anhand ihres mittels Gelelektrophorese bestimmten Vernetzungsgrades in drei Untergruppen: LMW (niedrig vernetzt, 0 - 30%), MMW (mittel vernetzt, 30 - 60%) und HMW (hoch vernetzt, 60 - 100%). In den so vernetzten Proben wurden das reaktionsspezifisch gebildete Isopeptid N ε (γ L Glutamyl)-L-Lysin (Glu_Lys) nachgewiesen und die beteiligten reaktiven Aminosäuren identifiziert. Die Bestimmung von Glu_Lys, welches für die kovalenten Verknüpfungen verantwortlich ist, erfolgte nach enzymatischer Hydrolyse am Aminosäureanalysator mit Ninhydrin-Nachsäulen-Derivatisierung. Eine erste Abschätzung des Isopeptid¬gehaltes zeigte zudem, dass es bei der Oligomerisierung sowohl zu inter- als auch intra¬molekularer Vernetzung kam. Der minimal notwendige Gehalt an Cross-Link-Aminosäuren, [CLAA]min lag zum Teil um den Faktor zwei unter dem Gehalt des quantifizierten Glu_Lys. Anschließend konnte nach tryptischem Verdau über die RP-HPLC/ESI-TOF-MS für die gering vernetzten Proben (LMW) genau eine definierte kovalente Verknüpfungsstelle ermittelt werden. Für die MMW- und HMW-Proben wurden fünf bzw. sechs Peptidfragmente detektiert. Bei den LMW-Proben wurde Lys1 mit Gln121 vernetzt. Den höher oligomerisierten Proben konnten die Lysinreste Lys1, Lys13, Lys116 und die Glutaminreste Gln41, Gln57, Gln121 zugeordnet werden. Somit gelang eine erste strukturelle Aufklärung der Vernetzungsprodukte. Der Aufbau der Oligomere läuft demnach zuerst gerichtet und linear ab. Insbesondere bei höheren Temperaturen und Enzymaktivitäten werden jedoch ungeordnete Strukturen gebildet. Die einzelnen Vernetzungsprodukte scheinen aufgrund der Lage der reaktiven Aminosäuren im HEWL-Molekül über mehrere intermolekulare Bindungen eine variierende Struktur auszubilden. Eine Quantifizierung der einzelnen Isopeptide erfolgte nicht, orientierende MS-Untersuchungen lassen aber vermuten, dass auch hier bevorzugte Reaktionsorte existieren. Die vernetzten Proben wurden nachfolgend über Ammoniumsulfatfällung konzentriert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) fraktioniert. Die Ausbeuten der GPC waren sehr gering. Eine Fraktionierung in einzelne, selektiv verknüpfte Oligomere wurde nicht erreicht. Die enzymatisch oligomerisierten Proben sowie ausgewählte GPC-Fraktionen mit höheren Oligomeren wurden hinsichtlich funktioneller und struktureller Konsequenzen untersucht. Begonnen wurde dabei mit der lytischen Enzymaktivität des HEWL gegen Zellwände des Micrococcus lysodeikticus. Eine abnehmende bzw. verbleibende Lyseaktivität korrelierte mit einer zunehmenden Oberflächen¬hydrophobität der Oligomerengemische. Beide Größen verhielten sich indirekt proportional zueinander. Während der hydrophobe Kern des Moleküls mit steigender Oligomerisierungsrate freigelegt wurde, senkte sich die Lyseaktivität bis auf null ab. Eine räumliche Deformation oder Barriere entstand mutmaßlich im oder in der Nähe des reaktiven Zentrums (Glu35 und Asp52) des Lysozyms, so dass der Enzym-Substrat-Komplex nicht mehr ausgebildet werden konnte. Die Untersuchung der Veränderung sekundärer und tertiärer Strukturbestandteilte erfolgte mithilfe der Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie. Gleichwohl für die Tertiärstruktur keine großen Veränderungen aufgezeigt wurden, ist für die Sekundärstruktur mit zunehmendem Vernetzungsgrad eine Abnahme der α-Helices und eine Zunahme von ungeordneten und β Faltblatt-Bereichen detektiert worden. Es konnte daher die unter Hochdruck bekannte Auffaltung des HEWL über die enzymatische Vernetzung derart stabilisiert werden, dass eine vollständige Rückfaltung nicht mehr gegeben war. Das Fibrillierungsverhalten der oligomerisierten Proben im Sauren im Vergleich zum unbehandelten HEWL stellte eine weitere Charakterisierungsmöglichkeit dar. Die Analyse der inkubierten Proben erfolgte mithilfe dreier photometrischer Methoden (Umsetzung mit den Reagenzien 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure, Kongorot oder Thioflavin T). Die fibrillierten Proben wurden zudem transmissionselektronenmikroskopisch (TEM) untersucht. Mit zunehmender Vernetzung war dabei eine abnehmende Fibrillierungsneigung zu beobachten, welche gut strukturell zu erklären ist, da die zusätzlichen, kovalenten Isopeptidbindungen die Proteinmoleküle gegen eine saure Auffaltung stabilisieren. Eine Auffaltung ist jedoch die Grundvoraussetzung für eine Assoziation und Bildung in-vitro-induzierter, amyloider Strukturen. Ferner wurde das antimikrobielle Verhalten der Präparate gegen grampositive und -negative Mikroorganismen getestet. Unbehandeltes Lysozym zeigt grundsätzlich gegenüber grampositiven Mikroorganismen eine gute antimikrobielle Aktivität. Eingesetzt wurden der Agardiffusions- und der bakterielle Hemmtest (Trübungsassay). Hierbei zeigten alle geprüften Proben keine Wirkung gegenüber gramnegativen Bakterien. Die antimikrobielle Wirkung gegenüber den grampositiven Mikroorganismen variierte stark. Das Phänomen der erhöhten Sensibilität gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen im niederkonzentrierten Bereich wurde für Bacillus subtilis (grampositiv) und die mittel- bzw. hochvernetzten Proben im Vergleich zu unbehandelten HEWL (je 0,00625% Probe, w/v) reproduzierbar nachgewiesen. Auf die umfassende Charakterisierung der enzymatisch vernetzten HEWL-Proben folgten orientierende Vergleichsstudien mit dem evolutionsbiologisch verwandten α Lactalbumin (α-LA). Die enzymatische Oligomerisierung konnte für das Molkenprotein dabei im Gegensatz zum HEWL bereits unter Atmosphärendruck erzielt werden. Die Vernetzungsraten betrugen, unabhängig von den untersuchten Rahmenparametern aber abhängig vom Calciumgehalt, zirka 35% (mit Ca) bis 72% (ohne Ca). Das α-LA als Calcium-bindendes Protein wurde somit durch die Abwesenheit des Metallions derart destabilisiert, dass es für die mTGase besser umsetzbar wurde. Die im Vergleich zum Lysozym vermehrt enthaltenen potentiell reaktiven Aminosäuren (doppelt so viel Lys und Gln) trugen ebenfalls zu einer stärkeren Oligomerisierung bei. Abschließend erfolgten Studien zu nicht-enzymatischen, vakuuminduzierten Kondensations-reaktionen. Dabei wurde trockenes HEWL im Vakuum thermisch induziert vernetzt. Die Methode ist in der Literatur als Zero-Length-Cross-Linking (ZLCL) beschrieben. Die Untersuchung der Parameter Vakuum, Temperatur, pH-Wert und Zyklenzahl erfolgte an dem globulären Protein. Dieses konnte unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zum Di- und Trimer vernetzt werden. Weitere Milchproteinproben (ein Molkenproteinisolat und β-Casein) wurden nur exemplarisch unter Standardbedingungen untersucht. Hierbei wurde das Molkenproteinisolat deutlich besser als HEWL und das β-Casein bei 85°C über je 24 h und Einsatz von Vakuum am stärksten oligomerisiert. Die gute Umsetzung des β-Caseins ist dabei auf die fehlende Tertiär- und Sekundärstruktur zurückzuführen. Zum Teil entstanden auch Casein-Polymere, welche nicht mehr elektrophoresegängig waren. Die beteiligten Isopeptide wurden analog zu den enzymatisch vernetzten Proben über die Aminosäureanalytik nachgewiesen. Es konnte das Isopeptid N-ε-(β-Aspartyl-)Lysin (Asp_Lys) neben Lysinoalanin (LAL), aber kein Glu_Lys in HEWL nachgewiesen werden. Beide Isopeptide (Asp_Lys und Glu_Lys) sowie LAL sind dagegen im β Casein gebildet worden. Der Einfluss struktureller Gegebenheiten auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine konnte folglich eindeutig belegt werden.

The thesis concerns polyelectrolyte gels in contact with oppositely charged proteins and surfactant micelles, and includes of four papers (I-IV). In paper I confocal Raman spectroscopy was introduced as a method to trace micelles and investigate the structure of gel-surfactant complexes, in phase separated gel spheres. In paper II, the binding of surfactants to microspheres (~50-100 µm) was investigated by means of a micromanipulator-assisted microscopy method. The two surfactants were found to display qualitative difference respect to degree of swelling, surfactant distribution in the gels, and the difference is discussed in terms of absence/presence of hydrophobic attraction to the polyelectrolyte gel network. Kinetics of volume change in gels were analyzed. Aggregation numbers of micelles in polystyrenesulfonate (PSS) solutions, obtained from fluorescence quenching measurements, are presented. In paper III, phase behaviour, protein assembly and diffusion, was studied in PSS gel microspheres. Interpretation of results was aided by measurements of osmotic swelling of individual gel networks, and by combining the results with studies of protein diffusion in macroscopic (cm-sized) gel spheres. Complexes formed were further analyzed with small angle x-ray spectroscopy. In paper IV phase behaviour of mixed ionic/nonionic surfactant micelles is investigated in cm-sized gel spheres. The coexistence of three phases, the formation of dense shells in the bulk of the gels and other phenomena are described for the first time, and the results are presented along with discussion on the charge-density of spherical micelles and of  network induced hysteresis effects in gels. The composition and microstructure of phases are investigated by confocal Raman spectroscopy and small-angle x-ray scattering respectively. The results are interpreted with aid of highly detailed theoretical model calculations.

Im Rahmen dieser Arbeit ist es durch die kombinierte Anwendung von P-31 Flüssigkeits (HR)- NMR-Spektroskopie sowie dynamischer Lichtstreuung (DLS) gelungen, die supramolekulare Struktur von mizellarem Casein aus ultrahocherhitzter (UHT) Milch unter dem Einfluss einer enzymatischen Vernetzung mittels mikrobieller Transglutaminase (mTG) zu charakterisieren. Die P-31 HR NMR-Spektroskopie erweist sich dabei als hervorragende Methode, um sowohl den Einbau von Casein aus dem Milchserum in die mizellaren Aggregate durch die enzymatische Reaktion als auch die bevorzugte mTG Vernetzung des beta-Caseins nachzuweisen. Durch die Kombination von P-31 HR NMR-Spektroskopie und Messungen der dynamischen Lichtstreuung war es weiterhin möglich, das Vorliegen vernetzter Caseinaggregate in Dispersionen mTG-behandelter Caseine zu belegen und besonders den Anteil an nicht vernetztem Casein „sichtbar“ zu machen, der durch EDTA-Zugabe aus den mTG-vernetzten Caseinnetzwerken freigesetzt wird. Es zeigt sich, dass die Caseinnetzwerke nach der EDTA-Behandlung eine geringere Proteindichte als mizellares Casein aufweisen, da sie nur ca. 20 % des Serinphosphats des mizellaren Caseins enthalten. P-31 Festkörper-NMR-spektroskopische Messungen legen außerdem nahe, dass die Beweglichkeit des phosphorylierten Ser149-Restes des kappa-Caseins in der äußeren Schicht der mizellaren Caseinaggregate durch die mTG-Behandlung nicht wesentlich verändert wird. Um die erhaltenen Caseinnetzwerke im Hinblick auf ihr Anwendungspotential zu untersuchen, wurden sie als Proteinkomponente bei der biomimetischen Calciumphosphatfällung sowie als Trägerstrukturen für bioaktives Lysozym verwendet. Durch den Einsatz von Caseinnetzwerken als Fällungsmedium während der Präzipitation von Calciumphosphat (CaP) ist es gelungen, eine hydratisierte, apatitische Phase zu stabilisieren, die sowohl ungeordnete als auch kristalline Bereiche enthält und damit strukturelle Ähnlichkeit zu biologisch und besonders biomimetisch gebildetem Apatit besitzt. Die in den Präzipitaten ebenfalls vorhandenen Phosphoratome in einer relativ ungeordneten OCP (Octacalciumphosphat)-ähnlichen Umgebung stehen höchstwahrscheinlich mit der apatitischen Phase in räumlich engem Kontakt und sind damit entweder Bestandteil dieser Phase oder befinden sich in einer getrennten Phase, die jedoch mit der apatitischen Phase in Form eines Nanokomposits mit sehr kleinen, eng benachbarten Kristalliten vorliegt. Bei der Fällung des Caseinnetzwerk/CaP-Präzipitats wird ebenfalls eine Dicalciumphosphat-Dihydrat (DCPD)-Phase gebildet. Diese ist separiert von den anderen CaP-Phasen und tritt in wesentlich geringerem Maße auf als in einem reinen CaP-Präzipitat, das ohne Proteinkomponente gefällt wurde. Damit konnte gezeigt werden, dass unter Bedingungen, bei denen ohne Proteinkomponente größtenteils DCPD entsteht, die Caseinnetzwerke eine apatitische Phase stabilisieren, die strukturelle Ähnlichkeit zu biologisch und biomimetisch gebildetem Apatit aufweist. Die qualitativ gleichen Ergebnisse konnten für vergleichsweise untersuchtes unvernetztes Casein gefunden werden. Die Caseinnetzwerke zeigen jedoch in Bezug auf die apatitische Phase einen stärkeren Stabilisierungseffekt als unvernetztes Casein. Es ist denkbar, dass dies unter anderem darauf zurückzuführen ist, dass die Phosphatzentren in den Caseinnetzwerken im Gegensatz zu Casein frei von CaP-Brücken sind, da diese durch die EDTA-Behandlung entfernt wurden. Da die Caseinnetzwerke zudem eine geringere Proteindichte und damit eine höhere „Porosität“ als die mizellaren Caseinaggregate aufweisen, kann sich die apatitische Phase möglicherweise auch innerhalb der Netzwerke bilden, während dies für die mizellaren Caseinaggregate wahrscheinlich nur begrenzt möglich ist. In der vorliegenden Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich Caseinnetzwerke grundsätzlich als Transportsysteme für Lysozym eignen, da sie eine hohe Stabilität aufweisen und erfolgreich mit Lysozym beladen werden können. Während die Assoziation von Lysozym mit mizellaren Caseinaggregaten, die aus UHT-Milch gewonnenen wurden, zu einem fast vollständigen Verlust der Lysozymaktivität führt, bleibt die Aktivität des Enzyms bei der Bindung an Caseinnetzwerke erhalten. Das Anwendungspotential der Caseinnetzwerk/Lysozym-Assoziate wurde im Rahmen von zahnmedizinischen Versuchen in vitro und in situ untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Caseinnetzwerk/Lysozym-Assoziate in vitro eine dauerhafte Immobilisierung des Lysozyms in der in situ gebildeten Pellikel bewirken. Eine deutliche Anreicherung des Enzyms in situ wird mithilfe der Caseinnetzwerke allerdings nicht beobachtet. Dies könnte darin begründet sein, dass die im Vergleich zu den in vitro vorgefundenen Verhältnissen deutlich komplexeren Bedingungen in situ zu einem selektiveren Anreicherungsprozess von Enzymen in der Pellikel führen.

It is widely known that surfaces play an important role in numerous biological processes and technological applications. Thus, being able to modify surface properties provides an opportunity to control many phenomena occurring at interfaces. One way of controlling surface properties is to adsorb a polymer film onto the surface, for example through layer-by-layer (LbL) deposition of polyelectrolytes. This simple but versatile technique enables various polymers, proteins, colloidal particles etc. to be incorporated into the film, resulting in a multifunctional coating. Due to recent legislations and a consumer demand for more environmentally friendly products, we have chosen to use natural polymers (biopolymers) from renewable resources. The focus of this thesis has been on the adsorption of biopolymers and their layer-by-layer formation at solid-liquid interfaces; these processes have been studied by a wide range of techniques. The main method was the quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which measures the adsorbed mass, including trapped solvent and the viscoelastic properties of an adsorbed film. This technique was often complemented with an optical method, such as ellipsometry or dual polarization interferometry (DPI), which provided information about the “dry” polymer or protein adsorbed mass. From this combination, the solvent content and density of the layers was evaluated. In addition, the surface force apparatus (SFA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), total internal reflection fluorescence (TIRF), and fluorescence resonance energy transfer (FRET) were utilized, providing further information about the film structure, chemical composition, and polymer inter-layer diffusion. Adsorption studies of the glycoprotein mucin, which has a key role in the mucousal function, showed that despite the net negative charge of mucin, it adsorbed on negatively charged substrates. The adsorbed layer was highly hydrated and the segment density on the substrate was low. We showed the importance of characterizing the mucin used, since differences in purity, such as the presence of albumin, gave rise to different adsorption behaviours in terms of both adsorbed amount and structure. The adsorbed mucin layer was to a large extent desorbed upon exposure to the anionic surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS). In order to prevent desorption, we demonstrated that a protective layer of the cationic polysaccharide chitosan could be adsorbed onto the mucin layer and that the mucin-chitosan complexes resisted the desorption normally induced by association with SDS. Moreover, the association between chitosan and SDS was examined at the solid-liquid interface, in the bulk, and at the air-water interface. In all these environments chitosan-SDS complexes were formed and a net charge reversal of the complexes from positive to negative was observed when the concentration of SDS was increased. Furthermore, the LbL deposition method could be used to form a multilayer-like film by alternate adsorption of mucin and chitosan on silica substrates. The LbL technique was also applied to two proteins, lysozyme and β-casein with the aim of building a multilayer film consisting entirely of proteins. These proteins formed complexes at the solid-liquid interface, resulting in a proteinaceous layer, but the build-up was highly irregular with an increase in adsorbed amount per protein deposition cycle that was far less than a monolayer.Continuing with chitosan, known to have antibacterial properties we assembled multilayers with an anti-adhesive biopolymer, heparin, to evaluate the potential of this system as a coating for medical implants. Multilayers were assembled under various solution deposition conditions and the film structure and dynamics were studied in detail. The chitosan-heparin film was highly hydrated, in the range 60-80 wt-% depending on the deposition conditions. The adsorbed amount and thickness of the film increased exponential-like with the number of deposition steps, which was explained by inter-diffusion of chitosan molecules in the film during the build-up. In a novel approach, we used the distant dependent FRET technique to prove the inter-layer diffusion of fluorescent-labelled chitosan molecules within the film. The diffusion coefficient was insignificantly dependent on the deposition pH and ionic strength, and hence on the film structure. With the use of a pH sensitive dye buried under seven chitosan-heparin bilayers, we showed that the dye remained highly sensitive to the charge of the outermost layer. From complementary QCM-D data, we suggested that an increase in the energy dissipation does not necessarily indicate that the layer structure becomes less rigid. / Det är välkänt att ytor spelar en viktig roll i många biologiska processer och tekniska tillämpningar. Att kunna modifiera en ytas egenskaper ger därför en möjlighet att kunna kontrollera många fenomen som sker på ytor. Ett sätt att kontrollera ytegenskaperna är genom att adsorbera en polymerfilm på ytan, till exempel genom att växelvis adsorbera olika polyelektrolyter (LbL-teknik). Denna enkla men mångsidiga teknik möjliggör att många olika material kan införlivas i filmen, vilket resulterar i en multifunktionell beläggning. På grund av dagens lagstiftning och konsumenters ökade efterfrågan på miljövänliga material beslutade vi oss för att använda biologiska polymerer (biopolymerer) i detta projekt. Fokus i den här avhandlingen har varit på adsorption av biopolymerer och deras LbL-formation på gränsytan vätska-fast fas, där adsorptionsförloppet och det adsorberade skiktet bestående av biopolymerer studerats med en mängd olika tekniker. Huvudtekniken var kvartskristallmikrovåg med energidissipations-registrering (QCM-D), som mäter massan inklusive inkorporerat vatten, samt de viskoelastiska egenskaperna hos ett adsorberat skikt. Som komplement till denna teknik användes ofta optiska metoder, till exempel ellipsometri och ”dubbel polarisationsinterferometri (DPI)”, två tekniker som endast mäter massan av de adsorberade biopolymererna. Genom denna kombination av metoder kunde massan av inkorporerat vatten i filmen och filmens densitet bestämmas. Dessutom användes ytkraftsapparaten (SFA), röntgenfotoelektronspektrometri (XPS), och fluorescens-spektroskopiteknikerna TIRF och FRET i några undersökningar för att erhålla information om skiktens struktur, kemiska sammansättning och polymerernas diffusion inom skiktet.Adsorptionsstudier av glycoproteinet mucin, som har en central roll i funktionen av slemhinnan, avslöjade att trots att mucinet har en negativ nettoladdning adsorberade det ändå på negativt laddade substrat. Det adsorberade lagret var väldigt hydratiserat och hade en låg andel mucin i direkt kontakt med ytan. Vi påvisade vikten av att noga undersöka mucinet som användes, eftersom olika renhet, till exempel i form av förekomsten av albumin gav upphov till olika adsorptionsbeteende gällande både adsorberad mängd och struktur. En stor andel av det adsorberade mucinlagret desorberade när det exponerades för den anjoniska tensiden natriumdodecylsulfat, SDS. Vi visade att ett skyddande lager av den katjoniska polysackariden chitosan kunde adsorberas på mucinet och att mucin-chitosan-komplexen inte desorberade när SDS tillsattes. Därtill studerades växelverkan mellan chitosan och SDS på gränsytan vätska-fast fas, i bulken och på luft-vattengränsytan. Komplex av chitosan-SDS bildades i samtliga miljöer och en nettoladdningsomsvängning från positiv till negativ observerades när koncentrationen av SDS ökades.Vidare kunde LbL-tekniken nyttjas för att skapa ett multilagerlikt skikt genom att alternerande adsorbera mucin och chitosan på kiseldioxidsubstrat. Denna teknik användes även med två proteiner, lysozym och β-kasein, med målet att skapa ett multilager bestående av endast proteiner. Dessa proteiner bildade komplex på gränsytan vätska-fast fas i form av ett blandat proteinlager, men uppbyggnaden var väldigt oregelbunden med en ökning i adsorberad mängd per proteindeponeringscykel som var avsevärt mindre än ett monolager.Inom området för biomaterial utgör de antibakteriella och antihäftande egenskaperna hos chitosan respektive heparin en lovande blandning för beläggningar av medicinska implantat. Baserat på detta konstruerade vi multilagerfilmer av chitosan och heparin med olika deponeringslösningar och undersökte dynamiken och filmens struktur i detalj. Chitosan-heparin-filmen var starkt hydratiserad, bestående av cirka 60-80 vikt-% vatten beroende på deponeringsbetingelserna. Den adsorberade mängden och tjockleken på filmen ökade nästan exponentiellt med antal deponeringar, vilket förklarades med chitosanets förmåga att diffundera genom filmen under uppbyggnaden. Med ett nytt angreppssätt använde vi FRET för att bevisa diffusionen av fluorescerande färgmärkt chitosan i filmen under uppbyggnaden. Diffusionskoefficienten var i princip oberoende av pH och jonstyrka under deponeringen och följaktligen av filmens struktur. Genom att använda ett pH-känsligt färgämne begravt under sju biskikt av chitosan-heparin visade vi att färgämnet i hög grad påverkades av laddningen på det yttersta lagret. Från QCM-D-data lade vi fram teorin om att en ökning av energidissipationen för ett lager inte nödvändigtvis indikerar att lagrets struktur har blivit mindre styvt. / QC 20100729

A precipitação e cristalização de proteínas são operações unitárias amplamente utilizadas na indústria biotecnológica. A formação de precipitado nestas operações é muitas vezes atingida por meio da adição de um sal que diminui a solubilidade da proteína, ou seja, o chamado fenômeno de saltingout. A principal informação para o estudo da precipitação e da cristalização é o diagrama de fases, em que a solubilidade da proteína é apresentada em função das variáveis do sistema (temperatura, pH, concentração de sal). Outra medida importante é o segundo coeficiente virial, que é uma medida indireta da interação intermolecular. A combinação de ambas as informações é fundamental para a identificação das condições em que fases cristalina ou amorfa são obtidas. O equilíbrio sólido-líquido da lisozima de clara de ovo de galinha em soluções aquosas contendo sais biodegradáveis (succinato de sódio, citrato de sódio e tartarato de sódio) foi estudado por meio da determinação da solubilidade da proteína e do segundo coeficiente virial em função da força iônica. Os dados experimentais do segundo coeficiente virial em função da força iônica foram medidos por meio de cromatografia de autointeração. Estes dados foram correlacionados por modelos apropriados. As informações de solubilidade e do segundo coeficiente virial da proteína foram combinadas para gerar condições experimentais adequadas na identificação da janela de cristalização, i.e., as condições em que uma fase cristalina é obtida. Uma matriz do tipo placa de cultivo foi usada para os experimentos de cristalização. Os resultados experimentais mostraram que as regiões das fases cristalina e amorfa no diagrama de fases são funções simultâneas do segundo coeficiente virial, como parâmetro termodinâmico, e da supersaturação, como parâmetro cinético. Os três sais foram capazes de induzir o efeito salting-out, sendo o succinato de sódio o sal mais eficaz na diminuição da solubilidade da lisozima, seguido pelo tartarato de sódio e pelo citrato de sódio. No caso da lisozima, cristais foram obtidos em soluções de succinato de sódio e tartarato de sódio, e as condições nas quais a fase cristalina é formada foram identificadas; no entanto, para o citrato de sódio somente fase amorfa foi observada. Em conjunto, estes resultados mostram que estes sais biodegradáveis são agentes precipitantes promissores. / The precipitation and crystallization of proteins are unit operations widely used in the biotechnology industry. The formation of a solid phase in these operations is often achieved by adding a salt that lowers the protein solubility, the so-called salting-out phenomenon. The key information to study precipitation or crystallization is the phase diagram, in which the solubility of a protein is presented as a function of system variables (temperature, pH, salt concentration). Another important parameter is the second virial coefficient, which is an indirect measure of intermolecular interactions. The combination of both kinds of information is fundamental to identify the conditions in which crystal and amorphous phases can be formed. The solid-liquid equilibrium of hen egg-white lysozyme in aqueous solutions containing biodegradable salts, viz., sodium citrate, sodium tartrate and sodium succinate, was studied by determining both the protein solubility and the second virial coefficient as a function of ionic strength. Experimental data for second viral coefficient as a function of ionic strength were obtained through self-iteration chromatography. These data were correlated by appropriate models. The protein solubility and the second virial coefficient information were combined to generate adequate experimental conditions to identify the so-called crystallization slot, i.e., the conditions in which a crystalline solid phase is obtained. A plate matrix disposition was used for the crystallization experiments. The experimental results show that the crystal and amorphous regions in the phase diagram depend simultaneously on the second virial coefficient, as a thermodynamic parameter, and on the supersaturation ratio, as a kinetic parameter. All these salts were able to induce salting-out, being sodium succinate the most effective one in decreasing lysozyme solubility, followed by sodium tartrate and sodium citrate. For lysozyme in sodium succinate and sodium tartrate solutions, the conditions for which a crystal phase is formed were identified; however, for sodium citrate only amorphous solid phases were observed.! Overall, these results show that these biodegradable salts are promising precipitating agents.

In these days are probiotic lactic acid bacteria (LAB) very often used in food processing industry, such as milk products, cheese and fermented salami production. As well as the food conservation agent. Except of the industry usage of the LAB there are microbiological aspects. Identification of the bacterial species methods based on the isolation and amplification of DNA are very often used last few years. Diploma thesis deal with the bacterial cell of Lactobacillus species lysis and it´s optimalization. At first it was tested the optimal concentration of lysozyme (3mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml) and the exposure times (3, 5 a 10 hours). Another testing was aimed to the use and suitability of washing powder to the bacterial cell of Lactobacillus species lysis. I tested the Amway washing powder optimal concentration (1%, 2%, 3% a 4%). Four of another comercial washing powders were tested too. All these tests were performed at the pure Lactobacillus bacterial culture. To ensure the results I tested the washing powders at the real food matrix (Acidified milk, yogurt mango, yogurt white). All the methods were evaluated at the amplification method PCR with specific primers for the Lactobacillus genus. The DNA isolation was performed with the paramagnetic microsperes P(HEMA-co-GMA) and the amount of the DNA was quantified spectrophotometrically. The PCR products detection was performed with the agarose gel electrophoresis.